Orientador: Egle Cristina Couto de Carvalho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T14:08:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simoni_RenataZaccaria_D.pdf: 2332845 bytes, checksum: fc29ed8709fbdf31408d1968e76a01a0 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Contexto e objetivo: Algumas malformações congênitas têm origem vascular, e a trombose durante a organogênese já foi aventada como possível mecanismo para esta ocorrência. O objetivo deste estudo foi avaliar a associação entre trombofilia fetal e malformações de origem vascular. Tipo de estudo e local: Foi realizado um estudo caso-controle, desenvolvido no ambulatório de Medicina Fetal do CAISM UNICAMP, de 2005 a 2010. Métodos: Foram incluídos no estudo 100 fetos com malformações de sistema nervoso central (SNC), gastrosquise, limb body wall e redução de membros (casos), submetidos a cordocentese como rotina do serviço, cujos resultados de cariótipo foram normais. Como controles, foram incluídos 100 fetos sem malformações cujo sangue de cordão fora previamente doado para o Banco de Sangue de Cordão do HEMOCENTRO UNICAMP. A pesquisa das mutações Fator V de Leiden, G20210A-FII e C677T-MTHFR foi realizada no sangue fetal dos dois grupos, e os resultados foram comparados. A análise descritiva foi feita utilizando Qui-quadrado e Teste Exato de Fisher. Para avaliar a associaçãoo entre as variáveis, foram utilizados o teste de Wilcoxon e a regressão logística. Resultados: Foram incluídos 78 fetos com malformações de SNC, 14 com gastrosquise, 3 com redução de membros e 2 com limb body wall. As mutações fator V de Leiden e G20210A-FII não foram encontradas nos casos e nos controles. A mutação C677T-MTHFR foi encontrada na forma heterozigota (CT) em 24 casos (24,8%) e em 6 controles. A mutação homozigota (TT) foi encontrada em 7 casos (7,2%) e em 1 controle. Estas diferenças foram estatisticamente significativas (p<0,0001). Quando avaliados os fetos com malformações de SNC (Artigo 1), a mutação CT foi encontrada com frequência significativamente maior nos casos do que nos controles (OR 10.309 IC95% 3.344-32.258), e a mutação TT também mostrou diferença significativa (OR 12.346 IC95% 1.388-111.11). A avaliação dos 14 fetos com gastrosquise (Artigo 2) não mostrou diferenças significativas quanto à presença da mutação CT ou TT entre os casos e os controles. Conclusão: A presença da mutação C677T-MTHFR no sangue fetal mostrou associação com malformações de SNC, tanto na forma homozigota quanto heterozigota / Abstract: Context and objective: Some congenital malformations have vascular origin, and a thrombosis during organogenesis is a possible mechanism for them. The aim of this study was to evaluate the association between fetal thrombophilia and malformations of vascular origin. Study type and location: A case-control study was performed at the Fetal Medicine Outpatient Clinic of CAISM UNICAMP, from 2005 to 2010. Methods: Ninety-seven fetuses with central nervous system malformations, gastroschisis, limb body wall and limb reduction were included in the study (cases), after routine cordocentesis showed normal karyotype results. A hundred fetuses without malformations were included as controls. These fetuses' cord blood had been donated to the Cord Blood Bank of HEMOCENTRO UNICAMP. DNA was extracted from fetal cord blood to study the mutations Factor V Leiden, G20210A-FII and MTHFR-C677T in both groups. Descriptive analysis was realized using Chi-square and Fisher's Exact Test. Wilcoxon test and logistic regression were used to analise the associations among variables. Results: We found 78 fetuses with central nervous system malformations, 14 with gastroschisis, 3 with member reduction and 2 with limb body wall. The mutations Factor V Leiden and G20210A-FII were not detected in cases nor in controls. The mutation MTHFR-C677T was encountered in 24 cases (24.8%) and in 6 controls its heterozygous form (CT). The homozygous mutation (TT) was found in 7 cases (7.2%) and in one control. These differences were statistically significant (p <0.0001). When the fetuses with central nervous system malformations were evaluated separately (Article 1), the frequency of the CT mutation was significantly higher in cases than in controls (OR 10.309 95% CI 3.344-32.258), as did the TT mutation (OR 12.346 95% CI 1.388-111.11). The 14 fetuses with gastroschisis were also evaluated separately (Article 2), and the results showed no statistically significant differences between cases and controls when concerning to the presence of the mutation MTHFR-C677T. Conclusion: The presence of the mutation MTHFR-C677T in fetal blood was associated with central nervous system malformations, both in homozygous and heterozygous form / Doutorado / Saúde Materna e Perinatal / Doutora em Ciências da Saúde

Abstract The mitochondrial oxidative phosphorylation system is composed of five multisubunit enzyme complexes. Complex I is the first and largest of these, containing 46 subunits, seven encoded by mitochondrial DNA (mtDNA) and the rest by nuclear DNA. Isolated complex I deficiency is a major cause of metabolic errors in infancy and childhood, presenting as encephalomyopathies or multisystem disorders. Due to the bigenomic origin of complex I, the genetic causes of these defects can be either mitochondrial or nuclear. The object of the present work was to identify the underlying genetic cause in cases of children with complex I deficiency and to obtain more information on the structurally and functionally important sites of complex I subunits. The complete coding region of mtDNA was analysed by conformation-sensitive gel electrophoresis and subsequent sequencing. In addition, nine nuclear genes encoding conserved subunits of complex I were sequenced. The structural and functional consequences of the new sequence variants were further elucidated using mutagenesis of homologous residue in bacterial NDH-1 or by studying complex I assembly and expression in patient cell lines. Analysis of the mtDNA coding region in 50 children revealed four definitely pathogenic mutations, 3460G>A, 10191T>C, 11778G>A and 14487T>C, in seven patients. In addition, two novel mtDNA base pair substitutions were identified, 3866T>C in a patient with muscle weakness and short stature and 4681T>C in a patient with Leigh syndrome. The latter mutation causes a Leu71Pro amino acid exchange in the ND2 subunit. Cybrid clones harbouring this mutation retained the complex I defect, and reduced amounts of fully assembled complex I were detected in patient cell lines. The 3866T>C mutation leads to a Ile187Thr amino acid substitution in the ND1 subunit, and functional studies of the homologous amino acid substitution in E. coli showed that this had an effect on the assembly or stability of the NDH-1 holoenzyme. Sequencing of the nine nuclear-encoded complex I genes revealed only one novel base pair substitution with pathogenic potential. Further studies are needed, however, to establish the role of the Arg18Cys substitution in the mitochondrial leading peptide of the TYKY subunit. The above findings emphasize the contribution of mtDNA mutations to the aetiology of pediatric patients with complex I deficiency. Furthermore, two LHON primary mutations were identified in the present cohort of patients, although the clinical signs differed considerably from the classical symptoms of LHON. This suggests that the phenotype caused by primary LHON mutations is more variable than has so far been thought.

Orientador: Denise Pontes Cavalcanti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T09:53:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moreno_CarolinaAraujo_M.pdf: 4072523 bytes, checksum: 09921eee06d7c1098048c98a3f891b33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A hidropisia fetal não-imune (HFNI) é causada por um grupo heterogêneo de condições e atualmente corresponde à maior parte dos casos de hidropisia fetal. Em função da ampla diversidade etiopatogênica, a investigação dos casos de HFNI constitui um desafio diagnóstico. Esse estudo teve como objetivo a avaliação prospectiva e sistemática de uma série de casos de HFNI a partir de um protocolo de investigação ampliado, que incluiu a pesquisa de doenças metabólicas. O presente estudo também incluiu a revisão dos casos de HFNI registrados previamente pelo Programa de Genética Perinatal na maternidade da Unicamp. Durante aproximadamente dois anos (2010-2012), foram identificados 53 casos de HFNI. Nesse período, ocorreram 6.129 nascimentos na maternidade local, com registro de HFNI em 37 recém-nascidos, conferindo uma prevalência de 60 por 10.000 nascimentos, valor maior do que o observado no período anterior ao estudo (1987 a 2009). Para o restante da análise, quatro casos foram excluídos devido à impossibilidade de estudá-los adequadamente. A maioria dos hidrópicos nasceu pré-termo (43 - 73,5%). Houve registro de 23 nativivos (47%), 10 óbitos no período neonatal e 26 óbitos durante a gestação (53%), resultado em uma mortalidade geral (pré-natal e neonatal) de 73,4%. A hidropisia foi identificada no pré-natal na maioria dos casos (44 - 89,8%) e, apesar da condição ser comumente associada a mau prognóstico, em três pacientes (6,1%) houve resolução completa e espontânea da hidropisia durante a gestação. Os principais grupos diagnósticos encontrados foram: anomalias cromossômicas (17 casos - 34,7%), quadros sindrômicos (16,4% - oito casos), cardiopatias e infecções congênitas (8,2% - quatro casos cada). Os erros inatos do metabolismo (EIM) corresponderam a 6,1% da amostra (três casos de doenças de depósito lisossômico). Três casos (6,1%) foram classificados como idiopáticos. Comparando os diagnósticos da casuística prospectiva com aqueles observados no período 1987-2009, observou-se que os grupos diagnósticos mais frequentes, ou seja, anomalias cromossômicas, quadros sindrômicos e cardiopatias, foram os mesmos. No entanto, algumas diferenças foram observadas na casuística prospectiva, como a frequência maior de anomalias cromossômicas e de EIM, que podem ser explicadas respectivamente pela inclusão de abortos e pesquisa sistemática de doenças metabólicas. Por outro lado, a menor frequência do grupo de idiopáticos foi decorrente da ampliação do protocolo de investigação e da eliminação de casos inadequadamente estudados. Ressalta-se também que a frequência de EIM registrada no trabalho prospectivo (6%) foi superior à usualmente descrita na literatura e provavelmente aproxima-se da frequência real das doenças metabólicas em HFNI, justificando desse modo a pesquisa das mesmas na investigação de hidrópicos de causa não-imune após exclusão das condições mais comuns, como as anomalias cromossômicas, cardiopatias isoladas, infecções congênitas e síndromes conhecidas. Sendo assim, observou-se que o protocolo de investigação proposto permitiu o diagnóstico clínico-etiológico ou patogênico de mais de 90% dos casos, evidenciando que uma avaliação ampla e sistemática é capaz de identificar a maior parte dos fatores etiopatogênicos envolvidos na HFNI / Abstract: Non-immune hydrops fetalis (NIHF) is caused by a hetereogenous group of conditions, currently accounting for the most cases of hydrops fetalis. Because of the wide etiopathogenic diversity, the investigation of NIHF cases constitutes a real diagnostic challenge. This study aimed to evaluate prospectively and systematically a series of NIHF cases from an expanded research protocol including the investigation of metabolic diseases. The present study also aimed to revise the NIHF cases previously recorded by Perinatal Genetics Program (PGP) in the maternity hospital of Unicamp. During approximately two years (2010-2012), 53 cases were identified. In this period, among 6,129 births that occurred in our hospital, NIHF was identified in 37 newborns, given a birth prevalence of 60 per 10,000, higher than that was observed in the previous period - 23:10,000 (1987-2009). For purpose of all other analysis, four of the 53 cases evaluated had to be excluded due to inability to assess them correctly. Most hydropic individuals were born preterm (43 - 73.5%). Twenty-three patients (47%) were live births, 10 of them died before hospital discharge; and 26 (53%) died in the prenatal period, given an overall mortality of 73.4%. The hydrops were identified in prenatal period in most cases (44 - 89.8%), and despite being commonly associated with poor prognosis, three cases (6.1%) had complete and spontaneous resolution of hydrops during pregnancy. The main diagnostic groups were chromosomal abnormalities (17 - 34.7%), syndromic (8 - 16.4%), isolated heart defects (4 - 8.2%), and congenital infections (4 - 8.2%). Inborn errors of metabolism (IEM) occurred in three cases (6.1%), all represented by lysosomal storage diseases. Three cases (6.1%) were classified as idiopathic. The comparison of these diagnostic groups with those found during the retrospective period (1987-2009) showed that the most frequent groups, i.e. chromosomal abnormalities, syndromic and isolated cardiopathy, were the same. However, some differences were observed in the prospective series. For instance, the higher frequency of chromosomal abnormalities and IEM can be respectively explained because of the inclusion of abortions and due to systematic investigation of metabolic diseases. The lower frequency of idiopathic group, by the other hand, can be regarded as close related, first, to the expanded investigation and, second, to the exclusion of cases poorly studied. It is noteworthy that the recorded IEM frequency in the present prospective series (6%) was higher than the usually reported in the literature and seems to be more realistic, thus, justifying the inclusion of a systematic approach of these conditions in NIHF. This investigation, however, should be initiated after the exclusion of the more common causes, i.e., chromosomal abnormalities, isolated cardiopathy, congenital infections and known syndromes. In conclusion, the proposed investigation protocol allowed the clinical-etiological or pathogenic diagnosis in more than 90% of the cases, suggesting that the most etiopathogenic factors related to NIHF can be identified if a wide and systematic evaluation is performed / Mestrado / Genetica Medica / Mestra em Ciências Médicas

The role of biological markers (biomarkers) in public health, pediatric medicine and clinical toxicology cannot be understated. Clinically validated biomarkers used in newborn screening (NBS) serve to detect individuals at risk for a disease in the population, pre-symptomatically diagnose affected neonates early in life and/or accurately predict disease progression and treatment responses to therapy. However, there is urgent need for the discovery of more specific biomarkers that can improve screening accuracy in a high throughput, cost-effective yet ethical manner. The major objectives of this thesis were to develop innovative nontargeted metabolite profiling methodologies based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS) for early detection of treatable genetic diseases, as well as comprehensive surveillance of drugs of abuse (DoA) in high risk subjects. Chapter II introduces a multiplexed MSI-CE-MS strategy for confirmatory testing of known biomarkers for various inborn errors of metabolism from a dried blood spot (DBS) that was rigorously validated using proficiency test specimens from Centres for Disease Control and Prevention (CDC) and authentic neonatal samples from Newborn Screening Ontario (NSO) with quality assurance. Additionally, MSI-CE-MS together with temporal signal pattern recognition revealed for the first time a novel class of pathognomonic marker elevated in galactosemia, namely N-galactated amino acids. Chapter III describes an untargeted metabolomic study to discover biomarkers of cystic fibrosis (CF) to reduce the high false positive rate and widespread carrier identification by current two-tiered NBS algorithms that rely on genetic testing. A panel of metabolites from retrospective DBS specimens, including several amino acids, ophthalmic acid and an unknown peptide, allowed for differentiation of asymptomatic CF neonates from screen-positive yet unaffected carriers and transient hypertrypsinogenemic cases. Chapter IV develops and validates a high throughput MSI-CE-MS assay for rapid screening for DoA and their metabolites in human urine with improved specificity and broad spectrum coverage as compared to classic targeted immunoassays. This method can also applied to ensure compliance, drug efficacy and patient safety while detecting for potential substitution or adulteration when using high resolution MS/MS. In summary, this thesis contributes an innovative methodology and data workflow for biomarker discovery for improved neonatal screening of rare genetic diseases in the population, which was also applied for more effective drug surveillance strategies in public health given the alarming worldwide opioid crisis. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)

Introdução: A Doença da Urina do Xarope de Bordo é uma doença hereditária do metabolismo dos aminoácidos de cadeia ramificada, de caráter autossômico recessivo. O diagnóstico precoce é fundamental na prevenção da deterioração neurológica, que se dá pela ausência da implementação do tratamento nutricional adequado. Objetivo: Realizar triagem das mutações em todos os éxons dos três genes envolvidos na Doença da Urina do Xarope de Bordo (BCKDHA, BCKDHB e DBT) através do sequenciamento gênico direto e correlacionar com a heterogeneidade fenotípica. Métodos: Estudo clínico transversal com pacientes chilenos diagnosticados com Doença da Urina do Xarope de Bordo. A genotipagem foi realizada com produtos purificados de reação em cadeia da polimerase (PCR) de DNA.Foi realizada análise in silico das substituições de nucleotídeos através dos softwares MutPred® v1.2, Polyphen-2® - Polymorphism Phenotyping v2 e SIFT®. As características clínicas dos pacientes foram fornecidas pela equipe de nutrição do Instituto de Nutrição e Tecnologia da Universidade de Chile (INTA). Foi realizado um teste exato de Fisher no grupo de pacientes portadores da mutação mais prevalente na amostragem, a I214K com a intenção de avaliar o grau de correlação entre algumas variáveis clínicas e genéticas para verificar a possibilidade de se estabelecer uma relação fenótipo/genótipo. Resultados: Dos 18 pacientes 88% apresentaram mutação no gene BCKDHB, 1 pacientes 5% apresentou mutação no gene BCKDHA e 1 (5%) paciente apresentou mutação no gene DBT. Foram encontradas um total de 8 mutações na amostra e 4 novas mutações (50%). Não se pode afirmar que há correlação de nenhuma das variáveis clínicas com os genótipos encontrados nessa amostragem. Conclusão: Este estudo reportou 4 novas mutações em pacientes portadores de DXB na população chilena, o que pode ajudar em futuros diagnósticos genéticos da doença. Se a DXB fosse diagnosticada de forma mais rápida, na triagem neonatal, talvez fosse possível estabelecer uma relação genótipo-fenótipo de forma mais eficiente / Introduction: Maple Syrup Urine Disease (MSUD) is an autossomal recessive hereditary disease of the branched-chain amino acid metabolism. Early diagnosis is essential in preventing neurological deterioration, which occurs due to inadequate nutritional implametation treatment. Purpose: Screen mutations in all exons from the three genes involved in MSUD (BCKDHA, BCKDHB and DBT) through direct gene sequencing and correlation with phenotypic heterogeneity. Methods: A cross-sectional study with Chilean patients diagnosed with Maple Syrup Urine Disease. Genotyping was performed using purified polymerase chain reaction (PCR) DNA. Nucleotide substitutions In Silico analysis was performed using MutPred® v1.2, Polyphen-2® - Polymorphism Phenotyping v2 and SIFT® softwares. Patients clinical characteristics were provided by the nutrition team from Chile University, Nutriton and Technology Institute (INTA). Results: Of the 18 patients, 88% presented mutation in BCKDHB gene, 1 patient had mutation in BCKDHA gene and 1 patient (5%) presented a mutation in DBT gene. A total of 8 mutations in the sample and 4 new mutations (50%) were found. It can not be affirmed that there is correlation between clinical variables and genotypes in this sample. Conclusion: This study reported 4 new mutations in patients with MSUD in Chilean population, which may help in future genetic diagnosis. If MSUD was diagnosed more rapidly in neonatal screening, it might be possible to establish a genotype-phenotype relationship more efficiently

As mucopolissacaridoses (MPS) são um grupo de doenças metabólicas hereditárias causadas pela deficiência de enzimas lisossomais específicas, que causam alterações físicas e/ou comportamentais crônicas e progressivas. Um fenótipo comportamental é um padrão característico de observações motoras, cognitivas, linguísticas e sociais consistentemente associado a uma condição biológica. Tal fenótipo pode ser um transtorno mental ou outras características de comportamento não necessariamente associadas a transtornos. No caso específico das mucopolissacaridoses, embora haja diversos relatos na literatura sobre as altas taxas de ocorrência de problemas de comportamento na síndrome de Sanfilippo (MPS III), muito pouco é conhecido sobre as características comportamentais das outras entidades (MPS I, II, IV, VI e VII). Este trabalho pretendeu avaliar e descrever as alterações psiquiátricas encontradas em 22 pacientes com MPS atendidos em três serviços de genética clínica (4 MPS I, 5 MPS II, 1 MPS III, 4 MPS IV, 7 MPS VI, 1 MPS VII). As avaliações foram feitas através de instrumentos específicos, traduzidos e validados para nossa população, a saber: K-SADS PL, ATA, CARS, CGAS; e um instrumento traduzido, mas ainda sem validação brasileira: Escalas de Comportamento Adaptativo de Vineland. Os resultados mostraram que esses indivíduos apresentam altas taxas de transtornos mentais ao longo da vida, comportamento adaptativo deficitário e funcionamento global prejudicado. Além disso, observou-se um grande impacto familiar da doença, abandono escolar por falta de condições de acesso e de preparo da própria escola, grande dependência dos indivíduos avaliados e sobrecarga de um único cuidador, geralmente a mãe. Também ficou evidente o peso trazido pelo próprio tratamento, traduzido em uma recusa em aceitar novas propostas clínicas oferecidas. Concluiu-se que a população estudada é altamente vulnerável dos pontos de vista pessoal, familiar e social, sendo necessários mais estudos para seu melhor conhecimento e elaboração de programas e políticas de atendimento mais direcionados para suas necessidades / Mucopolysaccharidoses (MPS) are a group of hereditary metabolic diseases caused by deficient lysossomal enzymes, that lead to progressive physic and/or behavioral abnormalities. A behavioral phenotype is a characteristic pattern of motor, cognitive, linguistic and social observations, consistently associated to a biological condition. That phenotype may be a mental disorder or other behavioral characteristics not necessarily associated to any specific disorder. Referring to MPS, altohugh there are several descriptions of high ocurrence of behavioral problems in patients with Sanfilippo Syndrome (MPS III), the knowledge about behavioral characteristics of the other types of MPS is scarce. This work intended to analyse and describe psychiatric alterations in 22 patients with MPS from three services of medical genetics. Evaluation was made using specific instruments, translated and validated for use with brazilian population: K-SADS-PL, ATA, CARS, CGAS; and one instrument translated but not validated for brazilian population: Vineland Adaptive Behavior Scales. Results showed high lifetime prevalence of mental disorders, deficient adaptive behavior, and poor global functioning. Besides, it was observed intense familiar impact, high drop out rates from school, highly dependent individuals, and excessive burden for the caretaker. It was also evidenced the burden of the treatment itself. The conclusion was that this population is extremely vulnerable, and that it is necessary the realization of more studies for the better understanding of its specific necessitites

Orientador: Roger Frigerio Castilho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T10:41:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mirandola_SandraRegina_D.pdf: 3705031 bytes, checksum: e1e34dd5e1b3949d9c308b3c20a19787 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A acidemia metilmalônica (MMAemia) é uma desordem metabólica hereditária do metabolismo de aminoácidos com cadeia ramificada e de ácidos graxos com cadeia ímpar, envolvendo um defeito na conversão de metilmalonil-CoA a succinil-CoA. Manifestações sistêmicas e neurológicas nesta doença são relacionadas com o acúmulo de metilmalonato (MMA) em tecidos e fluidos biológicos e com o comprometimento do metabolismo energético. Neste trabalho, verificou-se que o MMA inibiu com grande intensidade a conversão de lactato a piruvato catalisada pela enzima lactato desidrogenase (LDH) em homogenatos de fígado e cérebro de rato. A conversão de piruvato a lactato, catalisada pela LDH, foi menos sensível à inibição por MMA. Estudos de cinética enzimática sobre a inibição da LDH de cérebro, utilizando-se lactato como substrato, indicaram que o MMA inibe esta enzima competitivamente (Ki = 3,02 ± 0,59 mM). Propôs-se que a inibição da conversão lactato/piruvato por MMA contribui para a fisiopatologia da MMAemia, resultando, dentre outras alterações, em acúmulo de lactato e acidemia metabólica. Mostrou-se que, em mitocôndrias isoladas de cérebro e músculo de rato, concentrações milimolares de MMA inibiram o consumo de O2 mantido por succinato, enquanto nenhum efeito inibitório foi observado quando substratos para os complexos I ou IV foram utilizados. Notadamente, o efeito inibitório de MMA, mas não de malonato, no consumo mitocondrial de O2 mantido por succinato foi minimizado quando uma permeabilização não-seletiva das mitocôndrias foi induzida por alameticina. Em adição, o MMA apresentou apenas um pequeno efeito inibitório no consumo de O2 por partículas submitocondriais invertidas na presença de succinato. Não se obteve evidência de produção de malonato nas mitocôndrias tratadas com MMA. Conclui-se que o MMA inibe o consumo mitocondrial de O2 na presença de succinato por interferir na captação deste substrato pela mitocôndria. A inibição do transporte mitocondrial de substratos, induzida pelo MMA, através do carreador de dicarboxilatos, pode ter importantes implicações fisiopatológicas na MMAemia. Comparou-se a suscetibilidade de mitocôndrias isoladas de fígado, rim e coração de rato, assim como de diferentes subregiões cerebrais quanto à transição de permeabilidade mitocondrial (MPT) induzida por 3-nitropropionato (3-NP) e Ca2+. A MPT foi estimada pela queda do potencial elétrico transmembrana e inchamento mitocondrial sensíveis à ciclosporina A. Mitocôndrias de cérebro e coração foram mais suscetíveis à MPT induzida por 3-NP e Ca2+ que organelas isoladas de fígado e rim. A comparação de mitocôndrias de diferentes regiões cerebrais indicou que uma inibição parcial da respiração por 3-NP resultou em MPT mais rapidamente em organelas estriatais que corticais ou cerebelares. Em ratos tratados sistemicamente com 3-NP, verificou-se uma inibição de mesma magnitude da succinato desidrogenase em todos os tecidos estudados. Notadamente, mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos tratados sistemicamente com 3-NP apresentaram uma maior suscetibilidade à MPT induzida por Ca2+ quanto comparadas a controles. Propôs-se que a maior suscetibilidade do estriado à neurodegeneração induzida por 3-NP pode ser, pelo menos em parte, explicada por uma maior vulnerabilidade desta região cerebral à MPT, juntamente com a vulnerabilidade desta região ao influxo de Ca2+ citosólico mediado pelo estímulo de receptores de glutamato / Abstract: Methylmalonic acidemia (MMAemia) is an inherited metabolic disorder of branched amino acid and odd-chain fatty acid metabolism, involving a defect in the conversion of methylmalonyl-coenzyme A to succinyl-coenzyme A. Systemic and neurological manifestations in this disease are thought to be associated with the accumulation of methylmalonate (MMA) in tissues and biological fluids with consequent impairment of energy metabolism. In the present work it was observed that MMA potently inhibited lactate dehydrogenase (LDH)-catalyzed conversion of lactate to pyruvate in liver and brain homogenates. LDH was about one order of magnitude less sensitive to inhibition by MMA when catalyzing the conversion of pyruvate to lactate. Kinetic studies on the inhibition of brain LDH indicated that MMA inhibits this enzyme competitively with lactate as a substrate (Ki = 3.02 ± ?0.59 mM). We proposed that inhibition of the lactate/pyruvate conversion by MMA contributes to the MMAemia physiophatology, leading to lactate accumulation and metabolic acidemia. While millimolar concentrations of MMA inhibit succinate-supported O2 consumption by isolated rat brain or muscle mitochondria, there is no effect when either a pool of NADH-linked substrates or N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylendiamine (TMPD)/ascorbate were used as electron donors. Interestingly, the inhibitory effect of MMA, but not of malonate, on succinate-supported brain mitochondrial O2 consumption was minimized when nonselective permeabilization of mitochondrial membranes was induced by alamethicin. In addition, only a slight inhibitory effect of MMA was observed on succinate-supported O2 consumption by inside-out submitochondrial particles. Under our experimental conditions, there was no evidence of malonate production in MMA-treated mitochondria. We conclude that MMA inhibits succinate-supported mitochondrial O2 consumption by interfering with the uptake of this substrate. MMA-induced inhibition of substrate transport by the mitochondrial dicarboxylate carrier may have important physiopatological implications. The susceptibility of isolated mitochondria from liver, kidney and heart and different rat brain regions (striatum, cortex and cerebellum) was compared regarding to mitochondrial permeability transition (MPT) evoked by 3-nitropropionate (3-NP) and Ca2+ ions. In general, isolated brain mitochondria from different regions were more sensitive to 3-NP and Ca2+ toxicity than mitochondria from liver and kidney as estimated by decrease in the transmembrane electrical potential and mitochondrial swelling. The comparision of different brain regions revealed that the inhibition of 50% of the mitochondrial succinate-supported respiration elicited by 3-NP resulted in a Ca2+-induced MPT pore opening, inhibited by cyclosporin A, faster in striatal than in cortical and cerebellar mitochondria. It was verified an inhibition of succinate dehydrogenase activity from the same magnitude in all tissues studied after a 3-NP systemic treatment. Interestingly, isolated forebrain mitochondria obtained from rats systemically treated with 3-NP showed a more pronounced susceptibility to Ca2+-induced MPT pore opening when compared to control rats. We proposed that the increased susceptibility of rat striatum to 3-NP-induced neurodegeneration could be in part explain by a region-specific susceptibility to MPT together with increase vulnerability of this brain region to glutamate receptors-mediated cytosolic Ca2+ influx / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

As mucopolissacaridoses (MPS) são um grupo de doenças metabólicas hereditárias causadas pela deficiência de enzimas lisossomais específicas, que causam alterações físicas e/ou comportamentais crônicas e progressivas. Um fenótipo comportamental é um padrão característico de observações motoras, cognitivas, linguísticas e sociais consistentemente associado a uma condição biológica. Tal fenótipo pode ser um transtorno mental ou outras características de comportamento não necessariamente associadas a transtornos. No caso específico das mucopolissacaridoses, embora haja diversos relatos na literatura sobre as altas taxas de ocorrência de problemas de comportamento na síndrome de Sanfilippo (MPS III), muito pouco é conhecido sobre as características comportamentais das outras entidades (MPS I, II, IV, VI e VII). Este trabalho pretendeu avaliar e descrever as alterações psiquiátricas encontradas em 22 pacientes com MPS atendidos em três serviços de genética clínica (4 MPS I, 5 MPS II, 1 MPS III, 4 MPS IV, 7 MPS VI, 1 MPS VII). As avaliações foram feitas através de instrumentos específicos, traduzidos e validados para nossa população, a saber: K-SADS PL, ATA, CARS, CGAS; e um instrumento traduzido, mas ainda sem validação brasileira: Escalas de Comportamento Adaptativo de Vineland. Os resultados mostraram que esses indivíduos apresentam altas taxas de transtornos mentais ao longo da vida, comportamento adaptativo deficitário e funcionamento global prejudicado. Além disso, observou-se um grande impacto familiar da doença, abandono escolar por falta de condições de acesso e de preparo da própria escola, grande dependência dos indivíduos avaliados e sobrecarga de um único cuidador, geralmente a mãe. Também ficou evidente o peso trazido pelo próprio tratamento, traduzido em uma recusa em aceitar novas propostas clínicas oferecidas. Concluiu-se que a população estudada é altamente vulnerável dos pontos de vista pessoal, familiar e social, sendo necessários mais estudos para seu melhor conhecimento e elaboração de programas e políticas de atendimento mais direcionados para suas necessidades / Mucopolysaccharidoses (MPS) are a group of hereditary metabolic diseases caused by deficient lysossomal enzymes, that lead to progressive physic and/or behavioral abnormalities. A behavioral phenotype is a characteristic pattern of motor, cognitive, linguistic and social observations, consistently associated to a biological condition. That phenotype may be a mental disorder or other behavioral characteristics not necessarily associated to any specific disorder. Referring to MPS, altohugh there are several descriptions of high ocurrence of behavioral problems in patients with Sanfilippo Syndrome (MPS III), the knowledge about behavioral characteristics of the other types of MPS is scarce. This work intended to analyse and describe psychiatric alterations in 22 patients with MPS from three services of medical genetics. Evaluation was made using specific instruments, translated and validated for use with brazilian population: K-SADS-PL, ATA, CARS, CGAS; and one instrument translated but not validated for brazilian population: Vineland Adaptive Behavior Scales. Results showed high lifetime prevalence of mental disorders, deficient adaptive behavior, and poor global functioning. Besides, it was observed intense familiar impact, high drop out rates from school, highly dependent individuals, and excessive burden for the caretaker. It was also evidenced the burden of the treatment itself. The conclusion was that this population is extremely vulnerable, and that it is necessary the realization of more studies for the better understanding of its specific necessitites

Orientador: Edi Lúcia Sartorato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T22:58:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Miranda_PauloMauriciodoAmorDivino_D.pdf: 3949549 bytes, checksum: 8cd1e0647087ac34cd2bc0ed5d096d0b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A Neuropatia Óptica Hereditária de Leber (LHON) e a Atrofia Óptica Autossômica Dominante (ADOA ou OPA1) são doenças caracterizadas pela perda da visão bilateral, devido a uma degeneração do nervo óptico. Ambas as doenças apresentam também acuidade visual reduzida, discromatopsia, palidez do nervo óptico e escotoma central ou centrocecal. A LHON é causada por mutações no DNA mitocondrial (mtDNA), onde três dessas mutações representam 95% dos casos (mutações primárias principais G11778A, T14484C e G3460A) e as mutações subsequentes representam apenas 5% do total (mutações raras). A ADOA é causada por mutações (mais de 300) no gene nuclear OPA1. Embora os mecanismos moleculares precisos envolvidos no desenvolvimento das duas doenças ainda não são bem compreendidos, foi demonstrado que LHON e ADOA possuem um defeito comum de acoplamento da fosforilação oxidativa. Nesses dois casos, a hipótese é de que as mutações no mtDNA e no gene OPA1 afetariam a integridade mitocondrial, resultando em uma diminuição do fornecimento de energia para os neurônios do nervo óptico. É possível que no Brasil a presença e frequência das alterações da relacionadas à LHON e ADOA sejam diferentes das encontradas em outras partes do mundo. Por isso, o presente estudo teve como principais objetivos rastrear mutações e haplogrupos associadas à LHON e detectar mutações no gene OPA1 em pacientes brasileiros com hipótese diagnóstica de LHON e com Neuropatia Óptica de etiologia a esclarecer. Também foi objetivo otimizar o método de PCR Multiplex Alelo-Específico e padronizar as plataformas de alto rendimento TaqMan® OpenArray® e Iplex Gold/Maldi TOF MS para o rastreamento da LHON. Foram avaliados 101 pacientes, sendo 67 com hipótese diagnóstica de LHON e 34 com neuropatia óptica de etiologia a esclarecer. As mutações da LHON foram detectadas por meio de PCR-RFLP e PCR Multiplex Alelo-Específico. As mutações raras da LHON e do gene nuclear OPA1 (10 principais éxons) foram rastreadas por sequenciamento direto. Foram encontradas mutações da LHON em 36 casos (83.3% com a mutação G11778A e 16.7% com a mutação T14484C). Não foi encontrada a mutação G3460A. Também não foram encontradas mutações raras da LHON e nem mutações relacionadas à ADOA. Haplogrupos de origem africana (L1/L2 e L3) foram mais frequentes no estudo. Foi otimizado o método de PCR Multiplex Alelo-Específico e padronizadas as plataformas TaqMan® OpenArray® e Iplex Gold/Maldi TOF, os quais se mostraram reprodutivos, eficientes e eficazes. A análise molecular das mutações da LHON e do OPA1 foi importante para a confirmação do diagnóstico de 35% dos casos clínicos típicos de LHON e para a elucidação 35% casos de neuropatia óptica de etiologia a esclarecer / Abstract: The Leber Hereditary Optic Neuropathy (LHON) and Autosomal Dominant Optic Atrophy (ADOA) are diseases characterized by loss of vision in both eyes due a degeneration of the optic nerve. Both diseases also exhibit reduced visual acuity, dyschromatopsia, optic nerve and central scotoma or centrocecal. The LHON is caused by mutations in mitochondrial DNA (mtDNA), where three of these mutations account for 95% of cases (major primary mutations G11778A, T14484C and G3460A) and subsequent mutations account for only 5% of the total (rare mutations). The ADOA is caused by mutations (more than 300) in the nuclear gene OPA1. Although the precise molecular mechanisms involved in the development of the two diseases are not well understood, it was shown that LHON and ADOA have a common defect coupling of oxidative phosphorylation. In both cases, the hypothesis is that mutations in mtDNA and OPA1 gene affect mitochondrial integrity, resulting in a decrease in the supply of energy to the neurons of the optic nerve. It is possible that in Brazil the presence and frequency of changes related to LHON and ADOA be different from those found in other parts of the world. Therefore, the present study had two main objectives track haplogroups and mutations associated with LHON and detect mutations in the OPA1 gene in Brazilian patients with a diagnosis of LHON and optic neuropathy of unknown etiology. Another objective was to optimize the method of PCR Multiplex allele-specific and standardize platforms high throughput TaqMan® OpenArray® and Iplex Gold/Maldi TOF MS for screening of LHON. 101 patients were evaluated, 67 with a diagnosis of LHON and 34 with optic neuropathy of unknown etiology. LHON mutations were detected by PCR-RFLP and allele-specific multiplex PCR. Rare mutations of LHON and nuclear gene OPA1 (top 10 éxons) were screened by direct sequencing. LHON mutations were found in 36 cases (83.3% with the G11778A mutation and 16.7% with the T14484C mutation). Not the G3460A mutation. Nor rare mutations of LHON and ADOA or related mutations were found. Haplogroups of African origin (L1/L2 and L3) were more frequent in the study. The method of allele-specific multiplex PCR was optimized and standardized the TaqMan® OpenArray® and iPLEX Gold/Maldi TOF platforms which are shown reproductive, efficient and effective. Molecular analysis of mutations of LHON and ADOA was important to confirm the diagnosis of 35% of the typical clinical cases of LHON and to elucidate 35% cases of optic neuropathy of unknown etiology. Besides being useful also in the prognosis of each patient, for the phenotypic expression of the LHON and ADOA may vary with different genetic background in our population of individuals / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

La médecine de précision (MP) est un nouveau paradigme qui révolutionne la pratique médicale actuelle et remodèle complètement la médecine de demain. La MP aspire à placer le patient au centre du parcours de soins en y intégrant les données médicales et biologiques individuelles tout en tenant compte de la grande diversité interindividuelle. La prédiction des états pathologiques chez les patients nécessite une compréhension dynamique et systémique. Les erreurs innées du métabolisme (EIM) sont des troubles génétiques résultant de défauts dans une voie biochimique donnée en raison de la déficience d'une enzyme, de son cofacteur ou d’un transporteur. Les EIM ne sont plus considérées comme des maladies monogéniques mais tendent à être plus complexes et multifactorielles. Le profil métabolomique permet le dépistage d’une pathologie, la recherche de biomarqueurs et l’exploration des voies métaboliques mises en jeu. Dans ce travail de thèse, nous avons utilisé l’approche métabolomique qui est particulièrement pertinente pour les EIM compte tenu de leur physiopathologie de base qui est étroitement liée au métabolisme. Ce travail a permis la mise en place d’une méthodologie métabolomique non ciblée basée sur une stratégie analytique multidimensionnelle comportant la spectrométrie de masse à haute résolution couplée à la chromatographie liquide ultra-haute performance et la mobilité ionique. La mise en place de la méthodologie de prétraitement, d’analyse et d’exploitation des données générées avec des outils de design expérimental et d’analyses multivariées ont été aussi établies. Enfin, cette approche a été appliquée pour l’exploration des EIM avec les mucopolysaccharidoses comme preuve de concept. Les résultats obtenus suggèrent un remodelage majeur du métabolisme des acides aminés dans la mucopolysaccharidose de type I. En résumé, la métabolomique pourrait être un outil complémentaire pertinent en appui à l’approche génomique dans l’exploration des EIM. / The new field of precision medicine is revolutionizing current medical practice and reshaping future medicine. Precision medicine intends to put the patient as the central driver of healthcare by broadening biological knowledge and acknowledging the great diversity of individuals. The prediction of physiological and pathological states in patients requires a dynamic and systemic understanding of these interactions. Inborn errors of metabolism (IEM) are genetic disorders resulting from defects in a given biochemical pathway due to the deficiency of an enzyme, its cofactor or a transporter. IEM are no longer considered to be monogenic diseases, which adds another layer of complexity to their characterization and diagnosis. To meet this need for faster screening, the metabolic profile can be a promising candidate given its ability in disease screening, biomarker discovery and metabolic pathway investigation. In this thesis, we used a metabolomic approach which is particularly relevant for IEM given their basic pathophysiology that is tightly related to metabolism. This thesis allowed the implementation of an untargeted metabolomic methodology based on a multidimensional analytical strategy including high-resolution mass spectrometry coupled with ultra-high-performance liquid chromatography and ion mobility. This work also set a methodology for preprocessing, analysis and interpretation of the generated data using experimental design and multivariate data analysis. Finally, the strategy is applied to the exploration of IEM with mucopolysaccharidoses as a proof of concept. The results suggest a major remodeling of the amino acid metabolisms in mucopolysaccharidosis type I. In summary, metabolomic is a relevant complementary tool to support the genomic approach in the functional investigations and diagnosis of IEM.