Les nématodes à galles du genre Meloidogyne peuvent provoquer des pertes de récolte importantes chez de nombreuses plantes d’intérêt agronomique, comme le caféier (Coffea arabica). Dans ce travail, une variété de C. arabica (UFV 408-28) résistante à M. incognita a été identifiée et les réponses de résistance de la plante ont été caractérisées aux plans histologique et moléculaire. La résistance du génotype UFV 408-28 s’exprime par une réaction de type hypersensibilité (RH), avec mort cellulaire au site d’infection. L’infection par M. incognita est stoppée avant la formation des sites nourriciers. Chez la plante sensible (IAC15), le développement du nématode se poursuit jusqu’à la production d’oeufs dans les galles, le cycle complet durant environ 45 jours. L’étude comparative des réponses moléculaires des deux génotypes entre 4 et 6 jai montre une spécificité de l’expression des gènes associée à la RH ou à la sensibilité. Dans le génotype résistant, l’expression de gènes liés à la voie de résistance dépendante du acide salicylique, ou à la voie des composés phénylpropanoides, est particulièrement modifiée. L’identification de gènes impliqués dans l'expression de la résistance, et pouvant être utilisés comme marqueurs de sélection offre de nouvelles perspectives pour améliorer les variétés commerciales de café. En parallèle, la transformation génétique de C. arabica a été développée à l’aide du gène rapporteur uidA (GUS), permettant désormais d’envisager le transfert de gènes d’intérêt pour étudier leur rôle dans la résistance aux nématodes. / Os nematoides da galha do gênero Meloidogyne provocam perdas importantes na produção de numerosas plantas de interesse agronômico, como o cafeeiro (Coffea arabica). Neste trabalho foi identificado o acesso UFV 408-28 de C. arabica resistente à M. incognita e foram caracterizadas as respostas de resistência da planta nos níveis histológico e molecular. A resistência do genótipo UFV 408-28 se exprime por uma reação do tipo hipersensível (RH), com morte celular no local da infecção. A infecção por M. incognita é bloqueada antes de haver a formação de sítios de alimentação. Na planta suscetível (IAC15), o desenvolvimento do nematoide prossegue até a produção de ovos nas galhas, sendo que o ciclo se completa em aproximadamente 45 dias. O estudo comparativo das respostas moleculares dos dois genótipos entre 4 e 6 dias após infecção mostraram uma especificidade da expressão dos genes associados à RH ou à suscetibilidade. No genótipo resistente, a expressão de genes ligados à via de resistência dependente do ácido salicílico, ou à via dos compostos fenilpropanoides, é particularmente modificada. A identificação dos genes implicados na expressão da resistência pode ser utilizada no desenvolvimento de marcadores de seleção para o melhoramento de variedades comerciais de cafeeiro. Em paralelo, a transformação genética de C. arabica foi desenvolvida com o auxílio do gene repórter uidA (GUS), permitindo assim a possibilidade de transferência de genes para o estudo do seu respectivo envolvimento na resistência aos nematoides.

Les nématodes à galle du genre Meloidogyne sont des parasites telluriques provoquant de graves pertes agricoles dans presque tous les systèmes de culture des plantes, et en particulier affectent la production de riz (Oryza sativa L.) dans toutes les régions cultivées. Ces parasites biotrophes obligatoires établissent une interaction compatible avec leur hôte grâce à des effecteurs protéiques produits par leurs glandes œsophagiennes et sécrétés dans la cellule végétale à travers leur stylet. L'objectif de ce travail était d'identifier parmi les protéines sécrétées celles qui jouent un rôle dans la virulence du nématode. L'interaction compatible entre la variété de riz Nipponbare et deux espèces de RKN (Meloidogyne incognita et Meloidogyne graminicola) a été choisie comme modèle et décryptée par des approches d'histologie et de transcriptomique. Trois nouvelles protéines de M. incognita spécifiquement exprimées dans les phases précoces de l'interaction ont été identifiées. Les deux gènes Mi-SP1 (Minc17980) et Mi-SP5 (Minc14137) sont exprimés dans les glandes subventrales alors que Mi-SP4 (Minc16281) s'exprime dans la glande dorsale de la larve parasitaire dite « juvénile au stade 2 (J2) ». Mi-SP1 et Mi-SP4 sont des gènes pionniers (sans homologue dans les bases de données publiques) et Mi-SP5 code potentiellement pour une déstabilase, de la famille des lysozymes. Les deux protéines pionnières Mi-SP1 et Mi-SP4 sont adressées dans le noyau et le cytoplasme de cellules de tabac après expression hétérologue en fusion avec la protéine GFP. La protéine Mi-SP5 exprimée en fusion GFP dans les cellules épidermiques d'oignon est localisée dans la paroi cellulaire. L'atténuation de l'expression des trois gènes Mi-SPs chez les J2s, induite par l'absorption de petits ARN interférants (siRNA), entraine une baisse significative de la reproduction du nématode chez le riz. De plus, la protéine Mi-SP1 permet de réprimer les défenses basales de la plante induites par le facteur bactérien flg22, telles que la production de composés réactifs d'oxygène. L'expression dans le riz de micro-ARNs artificiels (amiRNA) définis pour spécifiquement éteindre l'expression de Mi-SP5 entraine également une baisse significative de la reproduction du nématode chez le riz. L'analyse fonctionnelle de Mi-SP1 et de Mi-SP5 a montré que ces deux protéines sont capables de jouer un rôle important dans l'interaction compatible riz-nématode. / Root-knot nematode, Meloidogyne sp., are telluric pests causing severe agricultural lost in almost all plants growing system including cereals. These obligate biotrophic parasites affect the rice production in all cultivated countries. Meloidogyne incognita establishes a compatible interaction with the plant host thanks to effectors produced by esophageal glands and secreted in the plant cell through the stylet. The objective of this work was to identify secreted proteins involved in the virulence of the nematode. The compatible interaction between rice variety Nipponbare and two species of RKN (Meloidogyne incognita and Meloidogyne graminicola) was chosen as a model and decrypted by histology and transcriptomic approaches. Three new proteins of M. incognita which were specifically expressed during early stages of interaction have been identified. Two genes Mi-SP1 (Minc17980) and Mi-SP4 (Minc16281) were pioneers with no homolog in databanks and Mi-SP5 (Minc14137) encodes for a putative destabilase, belongs to lysozyme family. Mi-SP1 and Mi-SP5 were expressed in the subventral glands whereas Mi-SP4 was expressed in the dorsal gland of the parasitic larva called “juvenile stage 2 (J2)". The two pioneer proteins Mi-SP1 and Mi-SP4 were localized in both the nucleus and the cytoplasm of tobacco cell after heterologous expression whereas Mi-SP5 was located in the onion epidermal cell wall. The silencing of three effectors by soaking approach using siRNAs leads to a significant reduction in nematode reproduction in rice. In addition, Mi-SP1 can suppress the plant defences PTI triggered by the PAMP flg22. Knock-down Mi-SP5 by host-delivered RNAi also causes a significant reduction in nematode reproduction in rice. The functional analysis of Mi-SP1 and Mi-SP5 showed that these two effectors are able to play important roles in rice-nematode interaction.

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:37:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vanessa Aparecida Antes.pdf: 571702 bytes, checksum: c629643a9f77bdb02f4dd1641cbecf68 (MD5) Previous issue date: 2008-08-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this work was to study the parasitism of Meloidogyne incognita on native plants from Western Paraná, Brazil, as well as to assess the genetic variability among different populations belonging to the race 3 of this nematode by RAPD technique. Natural infection was studied in thirty six native plant species, which were identified on the basis of the perineal pattern from mature females and esterase phenotype. Native species that showed no infestation on the root system were inoculated with 1.000 eggs and/or J2 of M. incognita. After 60 days, the inoculated plants were evaluated regarding the number of galls and the number of eggs/or J2 per root. The genetic variability from different single female populations of M. incognita race 3 was studied by RAPD technique, having been tested 10 primers. The native plants that were susceptible to M. incognita parasitism were Rabo-de-Bugio (Lonchocarpus muehlbergianus Hassl.), Ipê Roxo (Tabebuia impetiginosa Mart. Ex DC. Standl), Sanga D água (Croton urucurana Boill), Ipê Amarelo (Tabebuia ahrysotricha Mart ex DC. Standl.), Genipapo (Genipa americana L.), Ariticum Comum (Rollinia mucosa (Jacq.) Baill.) and Aroeira Vermelha (Schinus terebinthifolius Raddi.). On the other hand, M. javanica was found parasiting Café de Bugre (Cordia ecalyculata Vell.), Guatambu Vermelho (Aspidosperma subincanun Mart.) and Tarumã Branco (Cytrarexllum myruanthum Cham.). The DNA polymorphism showed that there was genetic variability among populations from a same race (3) of M. incognita, allowing the separation of them into five genetic groups, through reactions with the primers (O)AK20, A10, AQ12, AS08 and (OP)F01 / Objetivou-se com o presente trabalho estudar o parasitismo de Meloidogyne incognita em plantas nativas do oeste paranaense, bem como a variabilidade genética de populações de M. incognita raça 3 pela técnica RAPD. Trinta e seis espécies de plantas nativas foram analisadas com relação à infecção natural por Meloidogyne spp. A identificação de Meloidogyne foi feita com base na configuração perineal de fêmeas maduras e no fenótipo para a isoenzima esterase. Espécies nativas com ausência de galhas no sistema radicular foram inoculadas com 1.000 ovos e/ou J2 de uma população de campo de M. incognita. Após 60 dias da inoculação, as plantas foram avaliadas com relação ao número de galhas e número de ovos e/ou juvenis por raiz. A variabilidade genética de diferentes populações monoespecíficas de M. incognita raça 3 do noroeste paranaense foi estudada pela técnica RAPD com o teste de 10 primers. As plantas nativas hospedeiras de M. incognita foram Rabo-de-Bugio (Lonchocarpus muehlbergianus Hassl.), Ipê Roxo (Tabebuia impetiginosa Mart. Ex DC. Standl), Sanga D água (Croton urucurana Boill), Ipê Amarelo (Tabebuia ahrysotricha Mart ex DC. Standl.), Genipapo (Genipa americana L.), Ariticum Comum (Rollinia mucosa (Jacq.) Baill.) e Aroeira Vermelha (Schinus terebinthifolius Raddi.). Já M. javanica foi encontrado parasitando Café de Bugre (Cordia ecalyculata Vell.), Guatambu Vermelho (Aspidosperma subincanun Mart.) e Tarumã Branco (Cytrarexllum myruanthum Cham.). A análise do polimorfismo do DNA possibilitou a detecção de variabilidade genética para diferentes populações de uma mesma raça (3) de M. incognita, permitindo a separação das populações em 5 grupos genéticos, através de reações com os primers AK20, A10, AQ12, AS08 e F01

Les nématodes à galles du genre Meloidogyne peuvent provoquer des pertes de récolte importantes chez de nombreuses plantes d’intérêt agronomique, comme le caféier (Coffea arabica). Dans ce travail, une variété de C. arabica (UFV 408-28) résistante à M. incognita a été identifiée et les réponses de résistance de la plante ont été caractérisées aux plans histologique et moléculaire. La résistance du génotype UFV 408-28 s’exprime par une réaction de type hypersensibilité (RH), avec mort cellulaire au site d’infection. L’infection par M. incognita est stoppée avant la formation des sites nourriciers. Chez la plante sensible (IAC15), le développement du nématode se poursuit jusqu’à la production d’oeufs dans les galles, le cycle complet durant environ 45 jours. L’étude comparative des réponses moléculaires des deux génotypes entre 4 et 6 jai montre une spécificité de l’expression des gènes associée à la RH ou à la sensibilité. Dans le génotype résistant, l’expression de gènes liés à la voie de résistance dépendante du acide salicylique, ou à la voie des composés phénylpropanoides, est particulièrement modifiée. L’identification de gènes impliqués dans l'expression de la résistance, et pouvant être utilisés comme marqueurs de sélection offre de nouvelles perspectives pour améliorer les variétés commerciales de café. En parallèle, la transformation génétique de C. arabica a été développée à l’aide du gène rapporteur uidA (GUS), permettant désormais d’envisager le transfert de gènes d’intérêt pour étudier leur rôle dans la résistance aux nématodes. / Os nematoides da galha do gênero Meloidogyne provocam perdas importantes na produção de numerosas plantas de interesse agronômico, como o cafeeiro (Coffea arabica). Neste trabalho foi identificado o acesso UFV 408-28 de C. arabica resistente à M. incognita e foram caracterizadas as respostas de resistência da planta nos níveis histológico e molecular. A resistência do genótipo UFV 408-28 se exprime por uma reação do tipo hipersensível (RH), com morte celular no local da infecção. A infecção por M. incognita é bloqueada antes de haver a formação de sítios de alimentação. Na planta suscetível (IAC15), o desenvolvimento do nematoide prossegue até a produção de ovos nas galhas, sendo que o ciclo se completa em aproximadamente 45 dias. O estudo comparativo das respostas moleculares dos dois genótipos entre 4 e 6 dias após infecção mostraram uma especificidade da expressão dos genes associados à RH ou à suscetibilidade. No genótipo resistente, a expressão de genes ligados à via de resistência dependente do ácido salicílico, ou à via dos compostos fenilpropanoides, é particularmente modificada. A identificação dos genes implicados na expressão da resistência pode ser utilizada no desenvolvimento de marcadores de seleção para o melhoramento de variedades comerciais de cafeeiro. Em paralelo, a transformação genética de C. arabica foi desenvolvida com o auxílio do gene repórter uidA (GUS), permitindo assim a possibilidade de transferência de genes para o estudo do seu respectivo envolvimento na resistência aos nematoides.

Les nématodes à galles du genre Meloidogyne peuvent provoquer des pertes de récolte importantes chez de nombreuses plantes d’intérêt agronomique, comme le caféier (Coffea arabica). Dans ce travail, une variété de C. arabica (UFV 408-28) résistante à M. incognita a été identifiée et les réponses de résistance de la plante ont été caractérisées aux plans histologique et moléculaire. La résistance du génotype UFV 408-28 s’exprime par une réaction de type hypersensibilité (RH), avec mort cellulaire au site d’infection. L’infection par M. incognita est stoppée avant la formation des sites nourriciers. Chez la plante sensible (IAC15), le développement du nématode se poursuit jusqu’à la production d’oeufs dans les galles, le cycle complet durant environ 45 jours. L’étude comparative des réponses moléculaires des deux génotypes entre 4 et 6 jai montre une spécificité de l’expression des gènes associée à la RH ou à la sensibilité. Dans le génotype résistant, l’expression de gènes liés à la voie de résistance dépendante du acide salicylique, ou à la voie des composés phénylpropanoides, est particulièrement modifiée. L’identification de gènes impliqués dans l'expression de la résistance, et pouvant être utilisés comme marqueurs de sélection offre de nouvelles perspectives pour améliorer les variétés commerciales de café. En parallèle, la transformation génétique de C. arabica a été développée à l’aide du gène rapporteur uidA (GUS), permettant désormais d’envisager le transfert de gènes d’intérêt pour étudier leur rôle dans la résistance aux nématodes. / Os nematoides da galha do gênero Meloidogyne provocam perdas importantes na produção de numerosas plantas de interesse agronômico, como o cafeeiro (Coffea arabica). Neste trabalho foi identificado o acesso UFV 408-28 de C. arabica resistente à M. incognita e foram caracterizadas as respostas de resistência da planta nos níveis histológico e molecular. A resistência do genótipo UFV 408-28 se exprime por uma reação do tipo hipersensível (RH), com morte celular no local da infecção. A infecção por M. incognita é bloqueada antes de haver a formação de sítios de alimentação. Na planta suscetível (IAC15), o desenvolvimento do nematoide prossegue até a produção de ovos nas galhas, sendo que o ciclo se completa em aproximadamente 45 dias. O estudo comparativo das respostas moleculares dos dois genótipos entre 4 e 6 dias após infecção mostraram uma especificidade da expressão dos genes associados à RH ou à suscetibilidade. No genótipo resistente, a expressão de genes ligados à via de resistência dependente do ácido salicílico, ou à via dos compostos fenilpropanoides, é particularmente modificada. A identificação dos genes implicados na expressão da resistência pode ser utilizada no desenvolvimento de marcadores de seleção para o melhoramento de variedades comerciais de cafeeiro. Em paralelo, a transformação genética de C. arabica foi desenvolvida com o auxílio do gene repórter uidA (GUS), permitindo assim a possibilidade de transferência de genes para o estudo do seu respectivo envolvimento na resistência aos nematoides.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2017-10-02T17:16:52Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jordana de Jesus Santos Pereira - 2017.pdf: 2005975 bytes, checksum: 1d53cfdb916b2f188eb7ed3980d23ed4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-10-03T13:19:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jordana de Jesus Santos Pereira - 2017.pdf: 2005975 bytes, checksum: 1d53cfdb916b2f188eb7ed3980d23ed4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-03T13:19:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jordana de Jesus Santos Pereira - 2017.pdf: 2005975 bytes, checksum: 1d53cfdb916b2f188eb7ed3980d23ed4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-08-29 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The fig (Ficus carica L.) is a fruitful species with great worldwide expansion, since it is considered a species of temperate climate, but that presents / displays good adaptation to a great diversity of climates and solos. Among the phytosanitary problems occurring in ficiculture, nematodes are the most important. The objective of the present study is to evaluate the influence of the application of different doses of organic compost and the intercropping with Crotalaria spectabilis on nematode population density and fig yield. The experiment was conducted in the orchard already installed, from September of the year 2015 to September 2016. The plants were arranged in a spacing of 4 m between rows and 2 m between plants. The treatments were five doses of organic compound, having as reference the recommended amount of nitrogen for the fig tree crop, combined with the presence or absence of Crotalaria spectabilis in a consortium. Five phytoematoid species were identified in the orchard, being Meloidogyne incognita, Pratylenchus sp., Helicotylenchus sp., Criconemoide sp. and Rotylenchulus sp .. M. incognita was present in higher population densities and with dominance over 90% in the three evaluation periods. This species was not affected by the doses of organic compound nor by the use of C. spectabilis. The productivity of the fig trees increased with the increase of the dose of applied organic compound. / O figo (Ficus carica L.) é uma espécie frutífera com grande expansão mundial, pois é considerada uma espécie de clima temperado, mas que apresenta boa adaptação a uma grande diversidade de climas e solos. Dentre os problemas fitossanitários ocorrentes na ficicultura, o de maior importância são os nematoides. O objetivo do presente estudo é avaliar a influência da aplicação de diferentes doses de composto orgânico e da consorciação com Crotalaria spectabilis sobre a densidade populacional de nematoides e a produtividade de figueira. O experimento foi conduzido no pomar já instalado, a partir de setembro do ano de 2015 até setembro de 2016. As plantas estavam dispostas em um espaçamento de 4 m entrelinhas e 2 m entre plantas. Os tratamentos foram cinco doses de composto orgânico, tendo elas como referência a quantidade recomendada de nitrogênio para a cultura da figueira, combinadas com a presença ou a ausência de Crotalaria spectabilis em consórcio. Foram identificados cinco espécies de fitonematoides no pomar sendo, Meloidogyne incognita, Pratylenchus sp., Helicotylenchus sp., Criconemoide sp. e Rotylenchulus sp.. M. incognita apresentou-se em maiores densidades populacionais e com dominância acima de 90% nas três épocas de avaliação. Esta espécie não foi afetada pelas doses de composto orgânico nem pelo uso de C. spectabilis. A produtividade das figueiras aumentou com o aumento da dose de composto orgânico aplicado.

O feijão-comum (Phaseolus vulgaris) é atacado por uma gama de patógenos que afetam a produtividade das lavouras e a qualidade dos grãos. Dentre os patógenos de importância econômica para a cultura no Brasil, destaca-se o nematoide das galhas (Meloidogyne incognita). Embora haja relatos sobre a avaliação de cultivares na presença de M. incognita, as fontes de resistência tem se mostrado pouco efetivas. Por isso, pesquisas que possibilitem um melhor entendimento sobre a interação planta-nematoide são de extrema valia e devem nortear novas estratégias para o melhoramento do feijoeiro. Assim, no presente estudo, 18 cultivares de P. vulgaris foram avaliadas quanto à resistência a M. incognita raça 3, sendo que quatro comportaram-se como pouco suscetíveis, 11 como moderadamente suscetíveis e três altamente suscetíveis. A cultivar IPR Saracura mostrou menor grau de suscetibilidade e foi, então, usada na construção de 12 bibliotecas de RNAseq, visando à identificação dos genes envolvidos na reposta à infecção pelo nematoide. Foram adotados dois tratamentos, 4 e 10 DAI (dias após inoculação), compostos de plantas inoculadas e controles. Primeiramente, realizou-se o mapeamento dos transcritos de cada biblioteca, tomando como referência o genoma de P. vulgaris (G19833), o que resultou na identificação de 27.195 unigenes. Em seguida, foi realizada a quantificação da expressão dos transcritos mapeados e genes diferencialmente expressos foram identificados. No total, 191 genes do hospedeiro apresentaram expressão diferencial, considerando-se: i) o tratamento inoculado em relação ao controle; ii) a razão de expressão (Fold Change - FC) mínima absoluta igual a 4; iii) o nível de significância ? = 0,05. Do total, 120 genes foram identificados aos 4 DAI e 71 aos 10 DAI. As sequências mapeadas foram contrastadas àquelas dos bancos de dados NCBI e TAIR, usando a ferramenta BLASTx e, posteriormente, anotadas usando os softwares Blast2GO e MapMan. Detectou-se similaridade com genes codificadores de proteínas conhecidas para 90% (24.604/27.195) dos unigenes, sendo que 69% (16.991/24.604) deles foram anotados. Quanto à expressão diferencial, 98% (188/191) dos transcritos mostraram similaridade com proteínas conhecidas e 67% (127/188) puderam ser anotados. Os transcritos foram atribuídos a diferentes categorias funcionais putativas, predominando o termo ontológico \'processos metabólicos\', em ambas as plataformas. A anotação dos genes na plataforma MapMan mostrou abundância das categorias da via de resposta a estresse, com predominância de genes de defesa superexpressos aos 4 DAI e reprimidos aos 10 DAI. Por fim, 10 genes mostraram expressão diferencial tanto aos 4 como aos 10 DAI: sete deles foram estáveis, sendo superexpressos nas plantas inoculadas, e três apresentaram comportamentos opostos nos momentos avaliados. Ênfase foi dada a um gene que codifica uma \'probable inactive ADP-ribosyltransferase\' e a quatro genes de resposta a ferimento. / The common bean (Phaseolus vulgaris) is attacked by a range of pathogens, which affect crop yield and the quality of grains. Among the pathogens of economic significance to the crop in Brazil, the root-knot nematodes (Meloidogyne incognita) deserve attention. Though there are some reports on cultivar evaluation in presence of M. incognita, the resistance sources have not being effective. Therefore, it is of valuable importance research projects that could lead to a better understanding of plant-nematode interaction and to indicate new strategies for common bean breeding. In the present study, 18 cultivars of P. vulgaris were evaluated in regard to their resistance to M. incognita race 3; four were less susceptible, 11 moderately susceptible, and three were highly susceptible. \'IPR Saracura\' behaved as the less susceptible cultivar and then was selected for the construction of 12 RNAseq libraries, aiming at the identification of genes differentially expressed in response to nematode infection. Two treatments were adopted, 4 and 10 days after inoculation (DAI), each comprised of inoculated and control plants. Firstly, the transcripts were mapped to the reference genome of P. vulgaris (G19833), resulting in the identification of 27,195 unigenes. Then, the mapped transcript\'s expression was quantified and differentially expressed genes were identified. In total, 191 genes of the host plant showed differential expression taking into consideration: i) the inoculated treatments in relation to their control; ii) an absolute fold change (FC) >= 4; iii) a level of significance ? = 0,05. Of the total, 120 genes were detected at 4 DAI and 71 at 10 DAI. The mapped sequences were compared against those deposited in NCBI and TAIR databanks using BLASTx and subsequently annotated using Blast2GO and MapMan softwares. Similarity to known proteins was detected for 90% of the unigenes (24,604/27,195) and 69% (16,991/24,604) of them were annotated. Regarding assessing differential expression, 98% (188/191) of the transcripts showed similarity to known proteins and 67% (127/188) were annotated. Transcripts were attributed to different putative functional categories and the ontological term \'metabolic process\' was predominant within both platforms. Gene annotation within MapMan platform showed predominance of stress-related pathway categories, with prevalence of defense genes overexpressed at 4 DAI and repressed at 10 DAI. Finally, 10 genes showed differential expression at both 4 and 10 DAI: seven were stably overexpressed in the inoculated plants, and three showed an opposite behavior regarding the evaluation periods. Attention was given to a gene encoding a probable inactive ADP-ribosyltransferase and four genes related to wound response.

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:37:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ely_Pires.pdf: 515209 bytes, checksum: eb35fb697192367ccb2283da6cfd8b93 (MD5) Previous issue date: 2007-08-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Among the pathogens that reduce the cotton productivity in Brazil, Meloidogyne incognita is one of the most important by causing yield losses and for being widespread. The most recommended control methods to this species are the use of resistant cultivars and crop rotation systems. In Paraná, M. incognita races 3 and 4 have already been reported as cotton parasites. The present work aimed at knowing the distribution of M. incognita on cotton at the northwest of Paraná State, as well as to find out about the prevalent race in this region. This work also aimed at selecting sources of resistance to M. incognita race 3 in cotton genotypes. A survey was carried out in order to know the distribution of M. incognita in cotton areas at the northwest of Paraná State. Cotton plants showing galls on the root system were sampled in infested areas from the cities of Altônia, Iporã, Moreira Sales, Mariluz, Pérola and Umuarama. Single egg masses were settled and reproduced on tomato plants cultivar Rutgers and left in a greenhouse at 25oC. The race identification was carried out based on the infection developed on differential hosts, inoculated with 5.000 j2 and cultivated in pots at 25oC. The evaluation of the race tests occurred 60 days after the inoculation. To assess the resistance of cotton genotypes to M. incognita, essays were developed from both greenhouse condition and field and contained 31 treatments and 10 replications. The greenhouse essays followed a completely randomized design while the field experiment was taken in randomized blocks. Regarding the greenhouse tests, it was inoculated 5.000 J2/cotton genotype containing two leaves. The evaluation was taken at 70 and 120 days after inoculation and focused on the parameters number of galls and reproduction factor (RF). The field experiment was assessed taking into account the gall index scored by notes. The results showed that M. incognita race 3 was detected from cotton plants in all the cities. The parameter Reproduction Factor (RF) was the most suitable to the selection of cotton genotypes in greenhouse at 120 days after inoculation. The assessment, taken from scoring notes in the field experiment, mixed genotypes with different levels of resistance and should be carried out only to confirm the resistance of cotton genotypes previously evaluated in greenhouse by the RF. The three monospecific isolates were important to the screening of resistant cotton genotypes to M. incognita race 3. The genotypes CD 05-419, CD 05-1222, CD 05-1087, CD 05-1323 e CD 05-1170 were resistant against M. incognita race 3, in greenhouse conditions and also in the field experiment. The screened genotypes will be tested against other specific cotton pathogens and also against multiple cotton diseases / Dos patógenos que afetam a produtividade do algodoeiro no Brasil, Meloidogyne incognita destaca-se pelas perdas de produção ocasionadas e pela ampla disseminação. Os métodos de controle mais recomendados para esta espécie são o uso de cultivares resistentes e a rotação de culturas. No Paraná, as raças 3 e 4 de M. incognita já foram relatadas como parasitas do algodoeiro. O presente trabalho teve como objetivo conhecer a distribuição de M. incognita em lavouras de algodão no nororeste do Paraná, bem como a raça prevalecente nesta região. Objetivou-se também selecionar fontes de resistência à M. incognita raça 3 em genótipos de algodoeiro. A distribuição de M. incognita em lavouras de algodão foi realizada com base em levantamento feito nos municípios de Altônia, Iporã, Moreira Sales, Mariluz, Pérola e Umuarama. Plantas de algodão com galhas no sistema radicular foram coletadas e isolados monoespecíficos estabelecidos e multiplicados em plantas de tomate Rutgers. A determinação de raça fisiológica foi realizada com base em testes em plantas hospedeiro-diferenciadoras, inoculadas com 5.000 ovos e J2. A avaliação ocorreu aos 60 dias após a inoculação com base na reação (+) ou suscetível e (-) ou resistente, das diferenciadoras frente ao parasitismo de diferentes isolados monoespecíficos de M. incognita. Para a avaliação da resistência de genótipos de algodoeiro à M. incognita, foram conduzidos ensaios em casa-de-vegetação e a campo, constituídos de 31 tratamentos e 10 repetições. Os ensaios de casa-de-vegetação seguiram o delineamento inteiramente casualisado, enquanto que o ensaio a campo foi conduzido em blocos ao acaso. Para os testes de resistência em casa-de-vegetação foram inoculados 5.000 ovos e J2/genótipo de algodoeiro no estádio duas folhas definitivas. As avaliações ocorreram aos 70 e 120 dias após a inoculação e os parâmetros avaliados foram número de galhas e fator de reprodução (FR). Os ensaios em casa-de-vegetação foram realizados a temperatura média de 27oC e UR 60%. Para os ensaios de campo avaliou-se o índice de galhas com base em escala de notas. Os resultados encontrados mostraram que a raça 3 de M. incognita foi detectada em todos os municípios amostrados. O parâmetro (FR) foi o mais viável na seleção de genótipos de algodoeiro em casa-de-vegetação. A avaliação por escala de notas a campo, no entanto, agrupou genótipos com diferentes níveis de resistência, devendo ser realizada somente para genótipos previamente avaliados em casa-de-vegetação pelo FR. Os 3 isolados monoespecíficos testados foram importantes na seleção de genótipos de algodoeiro com resistência à M. incognita raça 3. Os genótipos CD 05-419, CD 05-1222, CD 05-1087, CD 05-1323 e CD 05-1170 mostraram-se resistentes à M. incognita raça 3, tanto para ensaios de casa-de-vegetação quanto para ensaios de campo. Estes genótipos deverão ser testados com relação à resistência específica a outros patógenos e também à resistência múltipla a doenças do algodoeiro

OLIVEIRA, Hermógenes David de. Toxinas protéicas de sementes de soja [Glycine Max (L.) Merr.]: aspectos moleculares e funcionais. 2009. 179 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2009. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-20T13:47:53Z No. of bitstreams: 1 2009_tese_hdoliveira.pdf: 22424370 bytes, checksum: c91e302e7e8a350dc5032a3db4a9415d (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:35:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_tese_hdoliveira.pdf: 22424370 bytes, checksum: c91e302e7e8a350dc5032a3db4a9415d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:35:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_tese_hdoliveira.pdf: 22424370 bytes, checksum: c91e302e7e8a350dc5032a3db4a9415d (MD5) Previous issue date: 2009 / Soybean provides significant sources of fatty acids and proteins for human and animal nutrition and also has non-food uses. Conditions in almost all cultivated land are sub-optimal for plant growth as a result of the increasing incidence of diseases, even in developed agricultural systems. To meet these challenges, genes and proteins that control their resistance to a wide range of pathogens need to be identified and characterized to facilitate improvements in crop productivity. The main focus in this thesis has been to characterize (providing basic information about biochemical characteristics) and study the functional role of SYTX-2 (28 kDa) and SBTX (44 kDa), two toxic proteins isolated from soybean seeds, in plant defense against pathogens. The SYTX-2 was purified by a combination of ammonium sulphate fractionation and two chromatographic steps. Bidimensional electrophoresis of this protein revealed the presence of two spots (27.3 e 27.2 kDa), with isoeletric points values corresponding to 5.11 and 5.24, respectively, exhibiting the same N-terminal sequence (KTISSEDSPFFNCREK). SYTX-2 has also ribonuclease activity (1821.42 ± 3.34 UA. h-1 mgP), similar to that described in Vigna unguiculata leaves. The CD spectrum of SYTX-2 presents an alpha-beta profile spectrum, similar to the structure described to SBTX. Regarding to the temperature exposure, monitored by CD, it was observed that the structure of SYTX-2 is vulnerable to the temperatures above 40 ºC. The fluorescence spectra of Soyatoxin-2 marked a maximum emission of fluorescence at 323-333 nm and confirmed that the tertiary structure of this protein was correctly folded. SYTX-2 behaves as a hemilectin: it does not directly promote agglutination of red blood cells, but toxin-treated erythrocytes are readily agglutinated in the presence of anti-SYTX-2 antibodies. ELISA assays showed that SYTX-2 was exuded during seed imbibition, the maximum level of exuded toxin (6.16 ± 0.08 µg/seed) detected being at 18 h after the start of imbibition. The expression profiles of SYTX-2 in various soybean tissues were investigated with ELISA assay or Dot Blot analysis. The expression analysis suggested that SYTX-2 was clearly detected in seed coat, leaves, roots and also in stems. However, expression of SYTX-2 in roots is higher than that in leaves and stems. A strong induction of SYTX-2 expression was also observed in wounded leaves 6 h after treatment and it decreased thereafter. In vitro, antifungal activity of SYTX-2 was not detected against R. solani, Phomopsis sp. and F. solani f.sp glycines, but this protein inhibits C. albicans growth. Nematicidal effects of SYTX-2 were studied in vitro against Meloidogyne incognita nematode and the toxin (11µg/nematode) showed a high nematicidal activity, with the mortality of 85%, after six hours contact and of 100%, after 24 h of incubation. This work also describes the isolation, sequencing and functional analysis of cDNA (815 pb) encoding 27 kDa subunit of soybean toxin (SBTX). CDNA was amplified using a forward primer designed based on the N-terminal sequence of the toxin in combination of primer AP. The genomic location of the 27 kDa SBTX subunit SBTX was preliminarily determined with the mapped soybean ESTs database (www.phytozome.net) at Gm04 and Gm06 chromosome of soybean and thus may have two copies per genome. The deduced protein sequence of 219 amino acids (MW of mature protein 21.7 kDa, pI 9.3) included an N-terminal signal peptide. EST’s encoding 27 kDa subunit SBTX were present in cotyledons, leaves, and seedlings and the expression of 27 kDa subunit SBTX was also induced in tissues by P. sojae and F. solani f. sp. glycines infection and by abiotic stress. In addition to these blocks, the 27 kDa deduced protein sequence contains a putative Ser/Tyr/Thr phosphorylation and also contains eight potential N-linked glycosylation sites and a threonine/serine-rich region which is a potential site for attachment of O-linked carbohydrate. Potential sites for pepsin, trypsin and chymotrypsin hydrolysis were also detected. The results add a new dimension to toxins SBTX and SYTX functionalities and support the concept that these proteins act protecting soybean against pathogens / A soja (Glycine max) é uma espécie de grande valor econômico para o Brasil dada a multiplicidade de uso de seus grãos na alimentação animal e na indústria. Embora o Brasil seja o segundo maior produtor mundial dos grãos, as perdas na produtividade em campo ainda são consideráveis, principalmente àquelas causadas por nematóides do gênero Meloidogyne e por fungos fitopatogênicos. Mesmo com a existência de alternativas químicas para o controle dessas espécies, bem como com a existência de genótipos resistentes, as perdas agrícolas ainda são consideráveis, mostrando que a busca por mecanismos naturais de resistência ambientalmente seguros são práticas necessárias para o controle de pragas e patógenos e para a melhoria na produtividade. Este trabalho objetivou caracterizar bioquímica e funcionalmente duas toxinas protéicas isoladas de sementes de soja, bem como avaliar os seus papéis na defesa contra patógenos de importância agronômica para essa espécie. Foi mostrado experimentalmente que SYTX-2 (28 kDa) é uma proteína ácida encontrada em duas isoformas (27,3 e 27,2 kDa) de pI’s 5,11 e 5,24, as quais apresentam a mesma extremidade NH2-Terminal (KTISSEDSPFFNCREK). A análise por dicroísmo circular mostrou que a SYTX-2 apresenta um espectro típico de proteínas que apresentam α-hélice e folhas-β, sendo essa estrutura semelhante àquela já descrita para a SBTX. Esses padrões são gradualmente perdidos quando a proteína é aquecida de 25 a 95 ºC. Os espectros de emissão em 280 e 295 nm (323 e 313 nm, máximo) mostraram padrões típicos de resíduos de triptofano presentes no interior da estrutura terciária. SYTX-2 é uma hemilectina capaz de aglutinar indiretamente eritrócitos de coelho em presença de anticorpos policlonais anti-SYTX-2, sendo essa atividade inibida por D-manose. Além disso, in vitro, SYTX-2 apresentou atividade ribonucleásica, cuja atividade específica (1821,42 ± 3,34 UA. h-1 mgP) foi semelhante àquela descrita para a ribonuclease de raízes de V. unguiculata. Foi observado que SYTX-2 está presente na casca das sementes em teores menores do que os observados para os cotilédones, além de se distribuir também em raízes, caules e folhas. As raízes jovens apresentam os maiores teores de SYTX-2 (62,62 ± 10,10 µg de SYTX-2/g de tecido) sendo essa expressão triplicada em tecidos adultos (195,12 ± 35,54 µg/g de tecido). Em pH 5,0 essa proteína é exsudada das sementes ao longo de 24 h, sendo o pico de exsudação mostrado 18 h após o contato com o tampão (6,16 ± 0,08 µgP de SYTX-2/semente ). Tal como descrito para muitas proteínas de defesa, SYTX-2 foi induzida 6 h após a injúria mecânica de folhas (de 6,7 para 10,46 µg de SYTX-2/ g de tecido), retornando aos valores normais 24 h após a lesão. In vitro SYTX-2 apresentou uma potente atividade nematicida contra M. incognita Raça 4, induzindo a mortalidade de 85% dos J2 6h após incubação com a proteína, e de 100% após 24 h. Essa toxina também foi capaz de inibir (20%) o crescimento de C. albicans, embora não tenha sido efetiva em inibir a germinação de esporos de fungos fitopatogênicos (R. solani, Phomopsis sp. e F. solani f.sp glycines). Este trabalho também descreve o isolamento, a clonagem e a caracterização do cDNA da subunidade de 27 kDa da SBTX (44 kDa). O cDNA foi isolado a partir de um pool de RNA extraído de sementes 15, 25 e 35 dias após a antese, utilizando iniciadores desenhados a partir do NH2-terminal das duas subunidades da proteína (27 e 17 kDa). Evidências experimentais sugerem fortemente que as duas subunidades da proteína são codificadas por genes diferentes. A subunidade de 27 kDa da SBTX apresenta um cDNA de 815 pb, composto por uma ORF de 660 nucleotídeos, codificante para uma proteína com 219 resíduos de aminoácidos. A sequência do cDNA da SBTX foi detectada em dois cromossomos (04 e 06) e a busca por EST’s para essa proteína, mostrou que além de ser expressa em todo o vegetal, níveis elevados de transcritos são observados após a infecção contra P. sojae e F. solani f. sp. glycines, evidenciando seu importante papel na defesa contra fungos fitopatogênicos. A sequência deduzida de aminoácidos da subunidade de 27 kDa apresenta um peptídeo sinal de 26 resíduos de aminoácidos, clivado para a produção da proteína madura, que apresenta, portanto, massa molecular de 21,7 kDa e pI 9,3, sendo uma proteína básica. Na sequência de aminoácidos da subunidade de 27 kDa também foram identificados: um resíduo de cisteína, envolvido na formação de uma ponte dissulfeto com a subunidade de 17 kDa, 11 sítios de fosforilação em Ser, Thr ou Tyr, 8 sítios de glicosilação para GlcNAc e um sítio para adição de oligossacarídeos tipo mucina (GalNAc). A toxina também apresenta sítios de clivagem para pepsina, tripsina e quimiotripsina que podem justificar a ausência de toxicidade observada em camundongos após administração oral. SYTX-2 e SBTX foram mostradas através de uma caracterização estrutural ainda mais completa que as descritas por Sousa (2006) e Siebra (2004) e as informações obtidas permitiram definir que essas proteínas são parte importante da defesa da soja contra fungos fitopatogênicos e nematóides. Além de inéditos e de extrema relevância, todos esses dados darão subsídios para estudos posteriores que objetivem, para SYTX-2, determinar sua microestrutura protéica e isolamento gênico e, para SBTX, realização de projetos futuros, visando o desenvolvimento de plantas transgênicas com uma maior resistência a fungos

Les nématodes à galles (RKN), Meloidogyne spp. sont des petits vers parasites qui infectent les racines des plantes où ils induisent la formation de sites nourriciers. Les RKN sont des endoparasites à large gamme d'hôtes, englobant les principales espèces de plantes cultivées. Meloidogyne javanica, M. graminicola et M. incognita sont les principales espèces parasitant le riz (Oryza sativa). Le succès infectieux des RKN repose sur la production de protéines effecteurs de virulence, secrétées dans leurs glandes oesophagiennes et libérées dans les cellules de la plante hôte par leur stylet. La caractéristique principale des RKN est leur capacité à déréguler des cellules du parenchyme vasculaire pour induire la formation de cellules géantes multinucléées, à haute activité métabolique. Les processus moléculaires sous-jacents restent encore mal connus, alors que l’identification d’effecteurs de virulence et de leurs cibles végétales pourrait fournir de nouvelles perspectives pour le contrôle des RKN. Ainsi, les objectifs de cette étude étaient (1) d’évaluer le rôle de protéines de Meloidogyne sécrétées (MSP) au cours des interactions riz - RKN et (2) d'identifier des cibles des MSP parmi les principales protéines Hub d’Arabidopsis thaliana impliquées dans l'immunité des plantes, afin d'évaluer la fonction putative des MSP dans les cellules hôtes. Pour la première partie de notre étude, nous avons sélectionné trois MSP exprimées dans les glandes oesophagiennes et possiblement sécrétées. L’analyse de l’expression des gènes par RT-qPCR a montré que MSP2 est fortement exprimé dans les premiers stades du cycle du nématode, tandis que MSP18 et MSP19 sont activés au cours du parasitisme dans les racines du riz. Les essais de localisation subcellulaire dans les cellules d'oignon ont identifié le noyau (pour MSP2) et le cytoplasme (pour MSP7 et MSP18) comme compartiments cellulaires ciblés par les protéines du nématode. Des plants de riz (O. sativa Nipponbare) transgéniques ont été produits pour évaluer le rôle des MSP au cours des interactions riz-RKN. Des lignées de riz surexprimant MSP18 ont permis un taux de reproduction plus élevé de M. javanica et M. graminicola. Au contraire, des retards de développement et de reproduction de M. javanica ont été observés sur des lignées de riz exprimant des micro-RNAs capables de supprimer l’expression des gènes MSP2 ou MSP19. Ces données ont montré que MSP2, MSP18 et MSP19 peuvent être des gènes importants pour le parasitisme ou le développement du nématode. Les tests d'expression transitoire dans le tabac (Nicotiana benthamiana) ont montré que MSP18 peut interférer avec la mort cellulaire programmée déclenchée par INF1, ce qui suggère que MSP18 pourrait supprimer les voies de défense des plantes pour faciliter l’infection. Dans une deuxième partie de ce travail, des analyses systématiques en double-hybride chez la levure ont été menées pour vérifier les interactions protéine-protéine entre 6 MSP et 18 protéines Hub d’A. thaliana. Chez la levure, la protéine du nématode MSP400 interagit avec trois protéines Hub, l’Anaphase-Promoting-complex 8 (At-APC8) et les facteurs de transcription At-TCP14 et At-TCP15. L'interaction physique de MSP400 avec At-APC8, un régulateur clé du cycle cellulaire de la plante, a été confirmée in planta par complémentation bimoléculaire de fluorescence (BiFC). Ces résultats démontrent pour la première fois qu'un effecteur de nématode est capable d'interagir directement avec une protéine régulatrice du cycle cellulaire chez la plante, révélant un nouveau mécanisme utilisé par les RKN pour commander la machinerie du cycle de la cellule hôte et induire ainsi la formation du site d'alimentation. Les données obtenues dans cette étude élargissent considérablement notre connaissance des acteurs moléculaires qui contribuent à la pathogénicité des nématodes, mettant en évidence les différents mécanismes exploités par les RKN pour promouvoir la sensibilité des plantes. / Root-knot nematodes (RKN), Meloidogyne spp. are small parasitic worms that infect plant roots where they induce the formation of highly specialized nutrient feeding sites. RKN are endoparasites with a wide host range encompassing major plant crops, impairing effective specific control. Meloidogyne javanica, M. graminicola, and M. incognita are the principal RKN species responsible for rice (Oryza sativa) production losses. Successful plant infection is likely achieved by nematode effector proteins produced in their esophageal gland cells and released into the host plant cells through their stylet. In particular, one of the striking features of RKN is their ability to deregulate vascular parenchyma cells to induce the formation of multinucleated giant cells with a high metabolic activity in the roots. The molecular processes underlying plant-RKN interactions still remain poorly understood. Identification of nematode virulence effectors and their plant targets may provide new insights for developing control strategies towards RKN. Thus, the aims of this study were to (1) assess the role of Meloidogyne secreted proteins (MSP) in rice – RKN interactions and (2) identify MSP targets among the major Arabidopsis thaliana Hub proteins involved in plant immunity, to assess the putative MSP function into host cells. For the first part of our study, we selected three Meloidogyne-genus specific proteins expressed in esophageal glands and predicted to be secreted. Gene expression analysis by RT-qPCR showed that MSP2 is highly expressed in the early stages of the nematode cycle, while MSP18 and MSP19 are up-regulated during parasitism in rice roots. Subcellular localization assays in onion cells identified the nucleus (for MSP2) and cytoplasm (for MSP7 and MSP18) as the main cellular compartments targeted by nematode proteins. Transgenic rice (O. sativa Nipponbare) plants expressing the MSP cDNAs or artificial micro-RNAs (amiRNAs) able to silence MSP genes were used to assess the role of MSPs during rice-RKN interactions. Homozygous transgenic lines were inoculated with pre-parasitic juveniles (J2) and (i) the number and developmental stage of nematodes present in roots after 21 days, (ii) the number of egg masses laid after 28 days and, (iii) the number of next-generation hatched J2 after 45 days were assessed. Rice lines overexpressing MSP18 allowed a higher reproduction rate of M. javanica and M. graminicola. On the contrary, impaired M. javanica development and reproduction was observed in rice lines expressing amiRNAs against MSP2 or MSP19 genes. These data showed that MSP2, MSP18, and MSP19 genes might be important genes for nematode parasitism or development. Transient expression assays in tobacco (Nicotiana benthamiana) revealed that MSP18 interfered with the INF1-triggered programmed cell death, suggesting that MSP18 could suppress the plant defense pathways to facilitate nematode parasitism. In the second part of this work, systematic yeast-two-hybrid paired assays were conducted to check for protein-protein interactions between 6 MSP and 18 A. thaliana Hub proteins. In yeast, the nematode MSP400 protein interacts with three Hub proteins, the Anaphase-Promoting-Complex 8 (At-APC8) and the transcription factors At-TCP14 and At-TCP15. Physical interaction of MSP400 with At-APC8, a key plant cell cycle regulator, was confirmed in planta by bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays. These results demonstrated for the first time that a plant parasitic nematode effector is able to directly interact with a cell cycle regulatory protein, revealing a novel mechanism utilized by RKN to control the host cell cycle machinery and thereby induce feeding site formation. The data obtained in this study significantly broaden our knowledge of the molecular players contributing to nematode pathogenicity, highlighting the different mechanisms exploited by RKN to promote plant susceptibility.