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As a front-line treatment for cardiovascular disease, statins are among some of the most widely prescribed drugs worldwide. Statins are effective at lowering cholesterol, but approximately 7-29% of patients report some form of adverse muscle effect during the course of treatment. The severity of these side effects ranges from low-level to life-threatening myopathy. The mechanism of statin myopathy remains ill-defined, but muscle-specific E3 ubiquitin ligases have been implicated. In addition, statins have been shown to activate caspase-1 (and increase IL-1β) in immune cells, which is a key effector of the NLRP3 inflammasome. The relevance of this inflammatory response in statin myopathy remains unknown. Using C2C12 myotubes, an in vitro model of statin-induced myopathy was developed to test the impact of NLRP3 inflammasome activation on markers of statin myopathy. Gene expression of the muscle-specific E3 ubiquitin ligases atrogin-1 and MuRF-1 (atrogenes) were used as markers of statin-induced myopathy. Lipopolysaccharide priming of the NLRP3 inflammasome was found to lower the effective dose of fluvastatin required to augment atrogene expression. This effect correlated with reduced phosphorylation of Akt and FOXO3a, a transcription factor regulating atrogene expression. Statin-induced atrogene expression was also found to be dependent on an isoprenoid that is required for protein prenylation rather than cholesterol biosynthesis pathways. Fluvastatin increased caspase-1 activity in a prenylation-dependent manner and selective inhibitors of NLRP3 and caspase-1 were able to prevent increased atrogene expression with fluvastatin treatment. Therefore, the NLRP3 inflammasome contributes to markers of statin-induced myopathy through a prenylation-dependant pathway in muscle cells. This work presents a novel mechanism involved in statin myopathy, and has shown that the inflammasome may represent a new drug target to mitigate muscle symptoms in patients taking statins. / Thesis / Master of Science (MSc) / Statins are a class of widely prescribed cholesterol-lowering drugs that reduce the risk of heart attack and stroke. However, many patients often complain of statin-induced muscle side effects (myopathy) that impact their quality of life. Symptoms of this statin-induced myopathy can manifest as muscle pain and weakness. The underlying biology causing this condition is still not well understood. Independent of its cholesterol-lowering effect, statins can activate an immune receptor called the NLRP3 inflammasome, indicating that inflammation may contribute to myopathy. Therefore, the primary goal of this study was to determine if this immune response contributes to statin-induced myopathy. It was found that inhibition of the NLRP3 inflammasome lowers markers of statin myopathy. Results from this study will provide further insight into mechanisms regulating this myopathy, and may lead to new treatments that can help alleviate statin side effects in muscle.

The innate immune system is integral for defense against infectious diseases. Characterized by Pattern Recognition Receptors (PRRs), which sense conserved molecular motifs known as Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs), the innate immune system sets a system of checks and balances to regulate inflammation in host defense. In this dissertation, we focus on one class of PRRs known as the NOD-like Receptors (NLRs) in response to bacterial diseases. This class consists of pro-inflammatory receptors that form a multi-protein complex termed the inflammasome, as well as regulatory NLRs that modulate inflammation. Here, we investigated the roles of inflammasomes and negative regulatory NLRX1 in response to bacterial diseases. First, we studied brucellosis, a zoonotic, chronic disease often transmitted in unpasteurized dairy products from livestock. Using murine models and bone marrow-derived macrophages (BMDMs) challenged with Brucella abortus, we found that canonical inflammasomes in murine models were protective against brucellosis through the initiation of inflammatory cell death called pyroptosis. In contrast, the inhibition of inflammation by NLRX1 adversely led to increased pathology in the spleen and liver in infected murine models. Despite these contrasting results, Brucella genomic DNA was an effective PAMP for NLR recognition. These results suggest the importance of DNA recognition by NLRs during brucellosis. Second, we investigated NLRX1 regulation of Borrelia burgdorferi in Lyme arthritis using murine models. Characterized by persistent inflammation of the joints, Lyme arthritis is an enigmatic and difficult inflammatory condition to resolve. We found that NLRX1 was protective against arthritis. By characterizing changes in gene and protein expression of infected ankle joints, in addition to in vitro studies in BMDMs and fibroblasts, we found that NLRX1 enhances cell migration and regulates cell metabolism. Our results suggest that NLRX1 may metabolically shift macrophages toward a more favorable wound-healing environment for arthritis resolution. Ultimately, this work emphasizes the importance of balance in NLR signaling, which occurs within NLRs and from crosstalk with other inflammatory pathways. Further, NLR signaling is highly multifaceted and context-specific for the cell type and bacterial disease, showcasing the complexity of host-pathogen interactions when battling bacteria. / National Institute of Health/National Institute of Allergy & Infectious Diseases: R03AI151494, R21AI159800 Virginia Tech/University of Maryland Joint Seed Grant VMCVM Office of Research and Graduate Studies and DVM/PhD Student Support / Doctor of Philosophy / The immune system consists of two arms: a specialized adaptive response that forms long-lasting defense and a generalized innate response that provokes immediate protection. Consequently, the innate immune system is our first line of defense against infectious diseases. It operates in part through proteins called Pattern Recognition Receptors (PRRs), which work by recognizing foreign signals in the body, known as Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs). The innate immune system’s job is to enforce a system of checks and balances to regulate inflammation in host defense. In this dissertation, we focus on the NOD-like Receptor (NLR) class of PRRs. NLRs consist of a group of pro-inflammatory proteins that form a complex called the inflammasome, as well as NLRs like NLRX1 that instead control and change inflammation. Here, we investigated the role that inflammasomes and anti-inflammatory NLRX1 play in response to bacterial diseases. First, we studied brucellosis, a chronic bacterial disease often transmitted in unpasteurized dairy products from livestock. We found that inflammasome-forming NLRs in murine models were protective against brucellosis through the initiation of inflammation and inflammatory cell death. In contrast, NLRX1 in mouse models adversely led to increased disease in the spleen and liver and decreased inflammation. Despite these contrasting results, Brucella DNA was an effective signal, or PAMP, for the activation of both NLRs in cells. These results suggest the importance of DNA recognition by NLRs, and that inflammation is protective during brucellosis. Second, we investigated NLRX1 regulation of the bacterium Borrelia burgdorferi in Lyme arthritis. Characterized by persistent inflammation of the joints, Lyme arthritis is a difficult inflammatory condition to resolve. We found that in mouse models, NLRX1 was protective against arthritis. Using immune and wound healing cells, we found that NLRX1 promotes faster cell migration and regulates cell metabolism. Encouragingly, our results suggest that NLRX1 may change cell metabolism in joints to provide enhanced energy in order to increase wound healing and resolve arthritis. Ultimately, this work emphasizes the importance of balance in NLR signaling. Further, NLR signaling is highly dependent on the specific cell type and bacterial disease, showcasing the complexity of host-pathogen interactions when battling bacteria.

Physiologiquement, l’ADN, séquestré dans les noyaux, n’est pas détecté par les récepteurs de danger du système immunitaire. En revanche, au cours d’inflammations chroniques, une rupture de la tolérance vis-à-vis de l’ADN du soi, consécutivement à sa libération dans le milieu extracellulaire par les cellules mortes, a été démontrée. L’accès de l’ADN extracellulaire aux récepteurs intracellulaires est médié par des molécules cargo capables de s’associer à l’ADN extracellulaire et d’induire sont internalisation.L’IL-26, qui est un membre de la famille de l’IL-10, a été décrite comme une cytokine pro-inflammatoire, dont les mécanismes moléculaires restent mal connus. Nous avons démontré que l’IL-26 se lie à l’ADN, permet son internalisation dans le cytosol des cellules myéloïdes et la sécrétion de cytokines pro inflammatoires via la voie STING et la voie des inflammasomes. La modélisation informatique de l’IL-26, basée sur la structure de l’IL-10,met en évidence des caractéristiques structurales similaires aux molécules cargo : un domaine de liaison à l’ADN, deux hélices amphipathiques et un motif d’ancrage à la membrane. De plus, des complexes circulants d’IL-26-ADN sont retrouvés dans les sérums de patients en poussée aigues de vascularite à ANCA,une pathologie inflammatoire chronique. L’IL-26 est détectée dans les lésions de glomérulonéphrite aigue nécrosante à croissants, ainsi qu’au niveau des cellules musculaires lisses artérielles de ces patients. Ces dernières sécrètent de l’IL-26 en présence de cytokinespro-inflammatoires. En conclusion, l’IL-26 établit d’une boucle d’autoamplification entre une mort cellulaire intense et l’inflammation. / In physiological conditions, self-DNA released by dying cells is not detected by intracellular DNA sensors. Inchronic inflammatory disorders, unabated inflammation has been associated with a break in innate immune tolerance to self-DNA. However, to gain access to intracellular DNA sensors, extracellular DNA has to complex with DNA-binding molecules. IL-26 is a member of the IL-10 cytokine family, overexpressed in numerous chronic inflammatory diseases, which biological activity remains unclear. We demonstrate here that IL-26 binds to DNA and shuttles it in the cytosol of human myeloid cells. As a consequence, IL-26 allows extracellular DNA to trigger proinflammatory cytokine secretion by monocytes, in a STING- and inflammasome-dependent manner. Supporting these biological properties, IL-10-based modelling predicts two DNA-binding domains, two amphipathic helices, and an in-plane membrane anchor in IL-26, structural features of cationic amphipathic cell penetrating peptides. In line with these properties, patients with active autoantibody-associated vasculitis, a chronic relapsing autoimmune inflammatory disease associated with extensive cell death, exhibit high levels of both circulating IL-26 and IL-26-DNA complexes. Moreover, in patients with crescentic glomerulonephritis, IL-26 is expressed by renal arterial smooth muscle cells and deposits in necrotizing lesions. Accordingly, human primary smooth cells secrete IL-26 in response to proinflammatory cytokines. In conclusion, IL-26 expressed in lesions confers proinflammatory properties to DNA released by dying cells, setting up a positive amplification loop between extensive cell death and unabated inflammation.

Les mécanismes de défense de l’organisme contre des pathogènes ou des particules toxiques sont regroupés sous le terme d’Immunité. L’Immunité a développé plusieurs familles de récepteurs dont les NLR (Nod Like Receptors) spécialisés dans la reconnaissance de motifs de pathogènes (PAMP), de signaux de danger endogènes (DAMP) et de désordres métaboliques et capables d’engager une réponse inflammatoire. L’inflammation est dite stérile si elle n’est pas déclenchée par des agents infectieux mais par des molécules endogènes en excès comme l’acide urique et l’ATP ou par des polluants environnementaux tels que la silice et les nanoparticules. Nous nous sommes d’une part intéressés aux mécanismes d’activation de l’inflammasome NLRP3 qui permet la maturation d’une cytokine pro-inflammatoire, l’Interleukine (IL)-1β. Nous montrons que les cristaux d’acide urique, de silice et d’Alum ainsi que les nanoparticules de titane et de silice induisent une libération active d’ATP dépendante d’hémicanaux par les cellules. Nous mettons en évidence un nouveau mécanisme d’activation de l’inflammasome NLRP3 qui fait intervenir l’ATP et ses différents métabolites, en particulier l’adénosine, via des familles de récepteurs purinergiques. Nous nous sommes d’autre part focalisés sur l’inflammation pulmonaire induite par l’administration de nanoparticules dans un modèle murin. Nous avions montré dans une étude précédente que cette inflammation est dépendante des IL-1α et IL-1β et de leur récepteur IL-1R1. Nos résultats montrent que l’adénosine est impliquée in vivo dans la réponse inflammatoire aux nanoparticules et que l’inflammation des voies respiratoires est modulée par l’IL-33 et son récepteur ST2. / The mechanisms of defense of the organism against pathogens or oxious particles are termed Immunity. The Immunity developed several receptors’ families among which the NLR (Nod-Like Receptors), specialized in the recognition of pathogen patterns (PAMPs), of endogenous danger signals (DAMPs) and of metabolic disorders, and capable of triggering an inflammatory response. The inflammation is named “sterile” if it is not activated by infectious agents but by endogenous molecules in excess, as uric acid and ATP, or by environmental pollutants, such as silica and nanoparticles. We first became interested in the mechanisms of activation of the NLRP3 inflammasome which allows the maturation of a pro-inflammatory cytokine, the Interleukine (IL) -1β. We show that uric acid, silica or Alum crystals but also titanium and silica nanoparticles induce an active release of ATP by cells, dependent of hemichannels. We highlight an innovative mechanism of activation of the NLRP3 inflammasome which involves ATP and its metabolites, in particular adenosine, through purinergic receptor families. We then focused on the nanoparticle-induced lung inflammation in a murine model. We had shown in a previous study that this inflammation is dependent on IL-1α, IL-1β and their common receptor IL-1R1. Our in vivo results show that adenosine is involved in nanoparticle-induced inflammatory response and that airway inflammation is modulated by IL-33 and its receptor ST2.

Le lipopolysaccharide (LPS), un composant de la membrane des bactéries à Gram-négatif, active l’inflammasome non-canonique constitué chez l’homme des caspase-4/5 et chez la souris de la caspase-11 ainsi que de la protéine effectrice GasderminD. Chez l’homme nous ne savons toujours pas si il y a d’autres acteurs impliqués dans cette voie de signalisation. Notre équipe a précédemment démontré que le LPS sous-acylé de Francisella novicida active la caspase-4 humaine mais pas la caspase-11 murine. Cette différence inexpliquée nous a fait émettre l’hypothèse qu’un cofacteur pourrait faciliter la détection du LPS de F. novicida dans les cellules humaines. Afin de tester notre hypothèse, et de manière générale d'identifier de nouvelles protéines impliquées dans cette voie de signalisation, nous avons réalisé un crible CRISPR/Cas9 pan-génomique sur la base de la survie de monocytes humains de la lignée U937 après transfection de LPS. Notre crible a identifié IRF2 comme étant l’unique protéine impliquée en plus de GasderminD et caspase-4. Les monocytes IRF2-/- étaient complètement résistants à la transfection de LPS et affichaient un niveau de caspase-4 très diminué. Nos résultats démontrent qu’IRF2 est le principal régulateur de l’expression de caspase-4 à l’état basal. De manière intéressante, après un traitement par l’interféron ou une différentiation en macrophages IRF2 n’est plus requis pour la pyroptose. A la place IRF1 et IRF2 coopèrent pour réguler le niveau de caspase-4 et donc la sensibilité au LPS dans le cytosol. Nos travaux ont permis d’identifier les mécanismes de régulation de caspase-4 à l’état basal, en présence d’interféron, et dans des macrophages différenciés. Nous avons montré que IRF1/IRF2 sont des régulateurs clés de la détection du LPS cytosolique et donc du choc septique TLR-4 indépendant / Lipopolysaccharide (LPS), a component of Gram-negative bacteria membrane activates the non-canonical inflammasome involving human caspase-4/5 or its murine ortholog caspase-11 and the cell death effector GasderminD. It is still unclear whether other players act in this cascade especially in human cells. Our lab previously demonstrated that the under-acylated LPS from Francisella novicida activates human caspase-4 but not caspase-11. This difference remains unexplained and led us to hypothesize that a co-factor could assist caspase-4 in the sensing of F. novicida LPS in human cells. To test this hypothesis, and in a more general manner identify new proteins involved in this pathway, we performed a genome wide CRISPR/Cas9 screen based on the survival of human U937 monocytes after LPS delivery into the cytosol. Our screen identified interferon regulatory factor 2 (IRF2) as the only protein beside caspase-4 and GasderminD involved in cell death following under-acylated or E. coli LPS transfection. IRF2-/- monocytes were fully resistant to LPS transfection-mediated death and displayed a large reduction in caspase-4 levels. Our results demonstrate that IRF2 is the master transcriptional regulator of caspase-4 at steady state. Interestingly, upon IFN treatment or macrophage differentiation, IRF2 is no longer fully required for pyroptosis. Instead, IRF1 and IRF2 cooperate to regulate caspase-4 level and LPS susceptibility. Our work identified the caspase-4 regulatory network at steady state and during IFN exposure or macrophage differentiation and IRF1/2 as key regulators of the cytosolic detection of LPS, which plays a role in TLR4-independent endotoxic shock

La voie de signalisation de l’inflammasome est impliquée dans plusieurs pathologies inflammatoires dont la fibrose pulmonaire et plus récemment, elle a été mise en lumière dans le développement de la fibrose hépatique. L’activation de ce complexe permet la maturation et la libération de la cytokine pro-inflammatoire IL-1β par les cellules immunitaires telles les macrophages, après reconnaissance de motifs bactériens ou de signaux de danger. L’objectif de cette thèse était de montrer les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquelles l’inflammasome est impliqué dans la fibrose hépatique. Par une première approche avec un hepatotoxique, le CCl4, chez la souris, nous avons observé que nos stratégies bloquantes de la signalisation de l’inflammasome ne permettent pas de faire le lien direct avec le développement de la fibrogénèse. Dans une seconde approche in vitro, nous avons montré que les fibroblastes hépatiques répondent à des médiateurs pro-inflammatoires comme l’IL-1β, le TNF-α et l’IL-8 par un déséquilibre de la balance MMP/TIMP favorable à la fibrolyse, une exacerbation de la réponse inflammatoire et la diminution de l’expression d’un marqueur d’activation des fibroblastes, l’α-SMA. Enfin, la mise en co-culture de ces fibroblastes avec différents macrophages a montré des effets similaires après activation de l’inflammasome par le LPS et les cristaux de MSU dans les cellules immunitaires, suggérant ainsi un rôle indirect de l’activation de l’inflammasome sur la réponse des fibroblastes hépatiques activés. / Inflammasome pathway is implicated in several inflammatory diseases such as pulmonary fibrosis. Nowadays, several data exist and suggest the implication of this pathway in liver fibrosis development. Once activated, the inflammasone pathway leads to the production and the release of IL-1β, a pro-inflammatory cytokine, by immune cells such as macrophages. The aim of this thesis was to describe the molecular and the cellular mechanism underlining the implication of the inflammasome pathway in liver fibrosis development. To assess this hypothesis, we have firstly inhibited inflammasome pathway in CCl4 hepatotoxicity mouse model. However, this approach did not clearly establish the implication of this pathway in liver fibrosis development. Thus in a second part, we have used an in vitro approach and demonstrate that liver fibroblasts response to pro-inflammatory mediators such as IL-1β, TNF-α and IL-8, and lead to a change in MMP/TIMP balance. The changes conduce to fibrosolysis, an exacerbation of the inflammatory response and the decrease in the expression of α-SMA, an activation marker of fibroblasts. Finally, by co-culturing the fibroblasts with different macrophages, we showed similar effects after inflammasome activation by LPS and the MSU crystals in immune cells, suggesting an indirect role of the activation of inflammasome on the response of activated liver fibroblasts.

Les adénovirus humains (HAdV) provoquent un large spectre de maladies cliniques chez les patients immunodéprimés et immunocompétents et sont également des outils polyvalents pour le transfert de gènes et la vaccination. L’immunité humorale acquise peut être en partie responsable des réactions indésirables envers les vecteurs AdV révélées dans plusieurs essais cliniques de vaccination. De plus, plusieurs protéines de l'hôte comme le facteur X de coagulation de la souris (FX) ou les immunoglobulines de type G se lient aux HAdV et exacerbent la réponse pro-inflammatoire. L’évaluation des risques précliniques se fait souvent chez la souris, même s’il existe plusieurs différences entre les humains et les souris dans l'interaction avec les HAdV. La liaison de FX aux HAdV active une réponse pro-inflammatoire chez la souris par l'intermédiaire des récepteurs Toll-like 4. Dans un autre scénario clinique pertinent, le complexe immun HAdV (IC-HAdV-C5) induit une activation plus forte de l’inflammasome dans les phagocytes humains que l’HAdV-C5 non complexé, mais par un mécanisme inconnu. Dans ce contexte, j’ai participé à deux études. Premièrement, nous avons étudié le rôle potentiel de FX et de TLR4 dans la réponse innée à l ‘HAdV-C5 en utilisant uniquement des cellules et des protéines d’origine humaine. Nous avons constaté qu'il n'y a pas d’activation de la voie de signalisation via TLR4 chez l’homme en présence de FX-HAdV. De plus, le FX n'a pas affecté la forte réponse immunitaire innée induite par IC-HAdV-C5 dans les phagocytes humains. Deuxièmement, nous avons abordé le mécanisme sous-jacent de l'inflammation induite par IC-HAdV-C5. Nous avons démontré que l‘IC-HAdV-C5 induit la formation de l’inflammasome dans les cellules dendritiques dérivées de monocytes et cela dépend de l’échappement endosomal dépendant de la protéine VI et de l'activation des récepteurs cytosoliques de l’inflammasome. Nos résultats nous aident à mieux comprendre les différences entre les tests précliniques réalisés chez la souris et les essais cliniques réalisés chez l'homme. De plus, cela nous permet de mieux comprendre comment l’immunité préexistante façonne la réponse immunitaire innée face aux HAdV, afin d’améliorer le traitement des maladies liées aux HAdV ainsi que l’efficacité des vecteurs HAdV. / Human adenoviruses (HAdV) cause a broad spectrum of clinical diseases in immunocompromised and –competent patients and are also versatile tools for gene transfer and vaccination. Pre-existing humoral immunity may be in part responsible for the adverse responses towards AdV vectors seen in several clinical vaccine trials. Furthermore, a variety of host proteins like mouse coagulation factor X (FX) or immunoglobulin G bind HAdV exacerbate the pro-inflammatory response. Pre-clinical risk assessment is often done in mice, albeit there are multiple differences between human and mice in the interaction with HAdV. The binding of FX to HAdV activates a pro-inflammatory response in mouse via Toll-like receptor 4. In another clinical relevant scenario, immune complexed-HAdV (IC-HAdV-C5) induces more inflammasome activation in human phagocytes than HAdV-C5 alone but by unknown mechanism. In this regard, I participated in two studies. First, we investigated a potential role of FX and TLR4 in the innate response to HAdV-C5 by using only human components. We found that there is no detectable FX-HAdV-TLR4 axis in human and FX did not affect the innate immune response elevated by IC-HAdV-C5 in human phagocytes.Second, we addressed the underlying mechanism of IC-HAdV-C5-induced inflammation. We found that IC-HAdV-C5 induces inflammasome formation in monocyte-derived dendritic cells and this is dependent on pVI-mediated endosomal escape and activation of cytosolic inflammasome sensors. Our findings help us to better understand the differences in preclinical testing in mice and clinical use in humans and how pre-existing immunity shapes the innate immune response to HAdV to improve treatment for HAdV diseases and HAdV vector effectiveness.

Les fièvres récurrentes héréditaires (FRH) sont des maladies auto-inflammatoires transmises selon un mode mendélien. Elles se caractérisent par des accès fébriles récurrents spontanément résolutifs accompagnés d'une inflammation systémique et d'une atteinte des séreuses. La complication la plus grave réside dans le risque de survenue d'une amylose inflammatoire, essentiellement rénale. Le diagnostic clinique des FRH est difficile à établir du fait d'une part d'une grande variabilité inter et intra familiale des phénotypes complexes qui peuvent combiner des signes évocateurs de plusieurs FRH, et d'autre part de l'absence, dans la majorité des cas, de critères objectifs de diagnostic. Alors que le diagnostic de certitude repose essentiellement sur l'identification de défauts moléculaires dans des gènes de l'immunité innée (comme NLRP3, NLRP12, ou MEFV), ces mutations ne rendent compte de la pathologie que chez moins de 30% des cas. Le retentissement fonctionnel de ces variations de séquence, qui sont essentiellement des mutations faux-sens, souvent conservatives, n'a été étudié que dans des lignées cellulaires qui n'expriment pas plusieurs acteurs clés de l'inflammasome, un complexe multiprotéique activé chez les patients présentant une FRH. Au cours de cette thèse, nous avons développé un modèle cellulaire pertinent des FRH à partir de cultures primaires de macrophages humains, dans le but d'étudier les conséquences fonctionnelles des mutations identifiées dans les gènes de FRH et de caractériser les réseaux moléculaires auxquels appartiennent les protéines codées par ces gènes. En parallèle, nous avons cherché à identifier de nouveaux gènes impliqués dans les FRH. / Hereditary recurrent fevers (HRF) define a group of auto-inflammatory diseases transmitted in a Mendelian fashion. They are characterized by recurrent episodes of fever spontaneously resolved, accompanied by systemic inflammation, usually revealed by sterile arthritis, peritonitis, and/or pleurisy. The most serious complication in HRFs is the risk of inflammatory amyloidosis, mainly renal. The clinical diagnosis of HRF is challenging due on the one hand to the inter- and intra- family variability and to complex phenotypes, which combine signs suggestive of different HRFs, and on the other hand, to the absence of objective diagnostic criteria in the majority of cases. While definitive diagnosis is mainly based on the identification of molecular defects in genes of innate immunity (as NLRP3, NLRP12 or MEFV), mutations in these genes account for the pathology in a limited number of patients (30% of cases in our experience). The functional impact of these sequence variations, which are mainly conserved missense mutations, has been studied mainly in heterologous cell lines that do not express several key players of the inflammasome, a multiprotein complex active in patients with HRF. In this thesis, we developed a physiologically relevant cell model of HRF using primary human macrophages in order to assess the functional consequences of the disease-causing mutations and to characterize the molecular networks to which the involved proteins belong. In parallel, we sought to identify novel genes involved in HRF.

Notre système immunitaire détecte les microorganismes via des molécules absentes de l’hôte appelées MAMPs. Mais étant donné que les MAMPs sont exprimés par tous les microorganismes indépendamment de leur potentiel pathogène, ce mécanisme n’explique pas comment le système immunitaire distingue les microorganismes pathogènes des non-pathogènes. De récents travaux ont mis en évidence un mécanisme de détection de l’activité des facteurs de virulence bactériens. En utilisant la drosophile, notre laboratoire a précédemment démontré que l’activation de la Rho GTPase Rac2 par la toxine CNF1 d’Escherichia coli induisait une réponse immunitaire innée conservée au cours de l’évolution chez le mammifère et similaire à l’immunité induite par les effecteurs chez la plante. Par la suite, nous avons évalué l’importance de cette réponse immunitaire au cours de la bactériémie chez la souris et démontré le rôle central de la cytokine IL-1β dans l’élimination des bactéries en réponse à la détection de CNF1. Des expériences in vitro nous ont permis d’identifier les mécanismes moléculaires mis en jeu et l’inflammasome responsable de l’activation de la caspase-1 et du clivage de l’IL-1β. De manière intéressante, CNF1 est toujours co-exprimée avec la toxine hémolysine-α (HlyA) dans les souches pathogènes d’E. coli. En outre, nous avons découvert que l’HlyA bloquait l’élimination des bactéries induite par CNF1 au cours de la bactériémie et inhibait la sécrétion de l’IL-1β. Ici, nous avons rapporté le premier exemple d’immunité induite par une toxine (CNF1) et contrecarrée par une autre (HlyA). / Our immune system detects microorganisms via molecules absent from the host called MAMPs. Since MAMPs are shared by all microorganisms regardless of their pathogenic potential, this mechanism does not explain how the immune system distinguishes between pathogenic and non pathogenic microorganisms. The detection of the activities of pathogen-encoded virulence factors has emerged as a new paradigm of pathogen recognition. Using Drosophila we previously demonstrated that the Escherichia coli CNF1 toxin-induced activation of the Rho GTPase Rac2 is sufficient to initiate a defense signal evolutionarily conserved from flies to mammals and similar to Effector-Triggered Immunity in plants. We further addressed the importance of this innate immune mechanism during bacteremia in mice and demonstrated the central role of the IL-1β cytokine in the clearance of bacteria in response to the detection of CNF1. In vitro experiments allowed us to identify the involved molecular mechanisms and the inflammasome responsible of caspase-1 activation and IL-1β maturation. Interestingly, CNF1 is always co-expressed with α-hemolysin toxin in pathogenic E. coli. In addition, we found that HlyA blocked the elimination of bacteria induced by CNF1 during bacteremia and inhibited the secretion of IL-1β. Here, we have reported the first example of immunity induced by a toxin (CNF1) and counteracted by another (HlyA).