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Perfil dos esteroides gonadais e expressão dos hormônios folículo estimulante (FSH) e luteinizante (LH) durante a inversão sexual de Epinephelus marginatus (Teleostei: Serranidae), hermafrodita protogínico, utilizando-se inibidor de aromatase / Gonadal steroids profile and expression of follicle-stimulating (FSH) and luteinizing (LH) hormones during the sex reversal of Epinephelus marginatus (Teleostei: Serranidae) hermaphroditic protogynous, using aromatase inhibitorCarlos Eduardo de Oliveira Garcia 03 August 2012 (has links)
A plasticidade do desenvolvimento gonadal em peixes, que contrasta com os padrões mais estáveis encontrados nos demais vertebrados, deu origem a várias questões intrigantes relativas tanto ao seu significado adaptativo quanto aos fatores genéticos e fisiológicos que modulam o processo. A inversão do sexo em peixes hermafroditas seqüenciais (protândricos ou protogínicos) ocorre em decorrência de diversos fatores, dentre eles, fisiológicos, genéticos e comportamentais podendo ser ainda decorrente do comportamento social. A garoupa verdadeira, Epinephelus marginatus é um peixe teleósteo, hermafrodita protogínico característico do litoral rochoso, maturando primeiramente como fêmeas, e posteriormente, na vida adulta, os ovários são substituídos por testículos, transformando-os em machos reprodutivamente ativos. No presente trabalho foram realizados três experimentos de inversão sexual em condições assistidas, em diferentes estações do ano, utilizando a mesma dose do inibidor de aromatase (IA) letrozole (100μg/Kg) para promover a inversão sexual de E. marginatus visando contribuir e aprimorar o conhecimento dos mecanismos fisiológicos envolvidos nesse processo. O primeiro e o terceiro experimentos foram iniciados na primavera e início da primavera respectivamente e promoveram a inversão sexual com uma diminuição no índice gonadossomático (IGS) nos animais do grupo experimental que apresentaram uma desorganização gonadal peculiar, com lamelas características de ovário, no entanto em seu interior observou-se o compartimento intersticial desenvolvido com cistos de células germinativas masculinas em estágios avançados da espermatogênese, (espermatócitos, espermátides) células de Sertoli e grande quantidade de cistos rompidos com a liberação de espermatozoides no lúmen. Após trinta dias do início do experimento obteve-se um aumento significativo de 11 ceto-testosterona (11KT) e a concentração de estradiol (E2) permaneceu inalterada; com setenta e sete dias após o início do experimento constatou-se uma elevação na concentração de testosterona (T), uma queda nos níveis de 11KT, persistindo a manutenção na concentração de E2. Neste cenário, principalmente as concentrações de andrógenos podem ter ativado a alça de feedback negativo e juntamente com a ativação do sistema da kisspeptina podem ter promovido a ação do GnRH desviando a produção de FSH para LH. Nesse momento o número de cópias obtidas de βFSH na hipófise foi significativamente menor que o número encontrado no grupo controle. Ao observarmos o aumento significativo da concentração plasmática de 17-alfaOHprogesterona podemos sugerir que a ação do GnRH tenha aumentado a secreção do LH, principal gonadotropina que estimula a produção de progestágenos. Os machos invertidos produziram um volume médio de sêmen de 118,20 ± 24,83 μL com motilidade de 90% e densidade espermática de 8,94 ± 4,34 x 109 células mL-1. Não foram obtidas diferenças nas concentrações de proteínas totais plasmática, hepática e musculares. No experimento implantado no verão de 2010 o tratamento não promoveu a inversão sexual, o IGS não apresentou diferença significativa entre os animais tratados com inibidor de aromatase e os animais do grupo controle. Nas gônadas dos animais do grupo experimental foi observada uma ligeira desorganização da arquitetura gonadal com cistos em formação e um número grande de ovócitos em degeneração demonstrando que ao longo do processo de inversão sexual pode haver uma fase de intersexo. Após trinta dias do início do experimento obteve-se um aumento significativo de T e a concentração de E2 permaneceu inalterada. Não foram observadas diferenças significativas entre o número de cópias de βFSH e βLH ao longo do experimento. O resultado obtido para a concentração de proteínas totais do músculo dos animais do grupo experimental apresentou um aumento significativo em relação à concentração encontrada nos animais do grupo controle. Não ocorreu espermiação e a inversão se deu de forma incompleta promovendo indivíduos intersexo. De uma forma geral podemos concluir que o uso de inibidor de aromatase é um método eficaz para promover a inversão sexual em hermafroditas protogínicos como a garoupa verdadeira. O aumento dos andrógenos pode ser o gatilho da inversão sexual com papel fundamental na reestruturação gonadal e formação do tecido germinativo masculino neste processo / The plasticity of gonadal development in fish, which contrasts with the more stable patterns found in other vertebrates, has given rise to several thrilling questions concerning both, its adaptive significance regarding the genetic and physiological factors that modulate the process. The sex inversion in sequential hermaphrodites fish (protandrous or protogynuos) occurs due to several factors, including, physiological, genetic and behavioral, and may also be due to social behavior. The dusky grouper, Epinephelus marginatus is a teleost fish, protogynous hermaphrodite characteristic of rocky bottoms, maturing first as females and later in adult life, the ovaries are replaced by the testes, turning them into reproductively males. In this work three sex inversion experiments were performed in captivity in different seasons of the year, using the same dose of aromatase inhibitor (AI) letrozole (100μg/Kg) to promote sexual inversion in E. marginatus, to contribute and improve the knowledge of the physiological mechanisms involved in this process. The first and third experiments started in the spring and early spring, respectively and promoted sexual inversion with a decrease in the gonadosomatic index (GSI) in the animals from the experimental group, that showed a peculiar disorganized gonadal, with lamellae, characteristic from ovaries, however with an interstitial compartment developed with cysts of male germ cells in advanced stages of spermatogenesis (spermatocytes, spermatids), Sertoli cells and a large amount of cysts ruptured with the release of sperm in the lumen. After thirty days from the beginning of the experiment, there was an increase in 11- ketotestosterone (11KT) levels and an unchanged concentration of estradiol (E2); after seventy-seven days, there was a significant increase in testosterone (T) levels, a decrease in the 11KT levels and the maintenance of E2 plasma concentration. In this point of view, mainly the concentration of androgens may have activated the negative feedback loop and with the activation of the kisspeptin system may have promoted the action of GnRH diverting the production of FSH to LH. At this moment the number of copies of pituitary βFSH produced was ignificantly lower than the number of control group copies. The significant increase in plasma 17- alfaOHprogesterona concentration observed could suggest that the action of GnRH has increased the secretion of LH, the main gonadotropin that stimulates the production of progestogen. Inverted males produced an average volume of semen of 118.20 ± 24.83 μl with 90% motility and sperm density of 8.94 ± 4.34 x 109 cells.ml-1. No differences were obtained at the concentrations of total protein in plasma, liver and muscle. In the experiment established in the summer of 2010, the treatment did not promote sexual inversion, the GSI was not significantly different between animals treated with aromatase inhibitor and the control group. In the gonads of the animals from the experimental group there was a slight disruption of gonadal architecture with cysts in formation and a large number of degenerating oocytes showing that during the process of sex inversion may be a phase of intersex. Thirty days after the beginning of the experiment there was a significant increase of T and E2 concentration remained unchanged. No significant differences were observed between the number of copies of βFSH and βLH throughout this experiment. The result obtained for the total protein concentration of the muscle in experimental group showed a significant increase compared with the control animals. There was no spermiation and the sex inversion occurred incompletely, with the presence of intersex individuals. In general we could conclude that the use of an aromatase inhibitor is an effective method to promote the sex inversion in hermaphroditic protogynous as the groupers. The increase of androgens could trigger the sex inversion exerting an important role in gonadal restructuring and the development of male germ tissue in the process
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Análise imunoendocrinológica da administração de inibidor de DPP-4 no diabetes mellitus tipo 1 experimental / Immunoendocrinological analyses after administration of dipeptidyl-peptidase-4 inhibitor on experimental type 1 diabetesMariana Rodrigues Davanso 18 May 2012 (has links)
O diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune caracterizada pela destruição seletiva de células pancreáticas produtoras de insulina. Existem diversas formas de tratamento do DM1, tais como administração de insulina, imunossupressores, transplantes de pâncreas ou de ilhotas pancreáticas, porém todos se mostram ineficientes em algum aspecto. Recentemente, uma nova classe de medicamentos, os inibidores da enzima dipeptidil peptidase 4 (iDPP-4), demonstrou eficiência terapêutica e segurança no tratamento de pacientes com diabetes mellitus do tipo 2 devido ao aumento do hormônio peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1, do inglês glucagon-like peptide-1). Além disso, o uso de inibidores de DPP-4 em modelos experimentais de DM1 demonstrou proteção das células pancreáticas contra apoptose, estimulação de neogênese de ilhotas pancreáticas e melhora do controle homeostático da glicose. Esse presente projeto teve como objetivo avaliar o perfil imunológico e endocrinológico da administração do inibidor de DPP-4 (MK0431) em DM1 experimental quimicamente induzido por estreptozotocina em camundongos C57Bl/6. Os animais diabéticos foram tratados com ração controle ou ração contendo inibidor de DPP-4 (4g MK0431/Kg de ração) ad libitum durante 30 e 90 dias. Durante o tratamento os animais tiveram glicemia, peso e teste de tolerância oral à glicose avaliados. Ao final do tratamento, os animais foram eutanasiados e o sangue, baço, timo, linfonodos pancreáticos e pâncreas foram coletados. Após 30 dias de tratamento com inibidor, foi observado um aumento do hormônio GLP-1 no soro, além de um padrão imunológico favorável. Dentre os mecanismos imunológicos, foi possível observar um aumento de células T reguladoras (CD4+CD25+Foxp3+) no baço e uma diminuição da citocina IFN- no homogenato pancreático. Após 90 dias de tratamento com inibidor, também foi detectado um aumento de insulina e GLP-1 séricos e uma diminuição nos níveis glicêmicos dos animais tratados. Observou-se uma redução no padrão inflamatório no microambiente pancreático, caracterizado pela diminuição das citocinas TNF- e IFN- no homogenato pancreático e por uma redução da freqüência de macrófagos CD11b+ nos linfonodos pancreáticos. Os resultados obtidos neste projeto contribuíram para validar a eficácia terapêutica da administração de inibidor de DPP-4 no tratamento do DM1 experimental, bem como os mecanismos imunológicos e endocrinológicos envolvidos. Sem a ocorrência de efeitos tóxicos relevantes, o uso de inibidores de DPP-4 pode se tornar uma alternativa terapêutica para o tratamento do DM1 em humanos, que constitui uma doença crônica associada à baixa qualidade de vida em longo prazo e necessidade de tratamento de alto custo. / Davanso, M.R. Immunoendocrinological analyses after administration of dipeptidyl-peptidase-4 inhibitor on experimental type 1 diabetes. 2012. 105p. Thesis (Masters Degree) School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. Type 1 Diabetes Mellitus (DM1) is an autoimmune disease characterized by the selective destruction of the insulin-producing pancreatic cells. Several forms of treatment for DM1 are current known such as insulin administration, immunosuppressors, pancreas or pancreatic islets transplantation, however, they all are inefficient in some aspect. Recently, a new class of drugs, the dipeptidyl-peptidase-4 inhibitors (iDPP-4) showed therapeutic efficacy and safety in the treatment with type 2 diabetes mellitus patients due to an increase in the glucagon-like peptide-1 (GLP-1). In addition, the use of DPP-4 inhibitors in experimental models of DM1 has demonstrated a protection of pancreatic cells against apoptosis, stimulation of pancreatic islets neogenesis and improvement in the glucose homeostatic control. This project evaluated the immunological and endocrinological profile of the DPP-4 (MK0431) inhibitor administration in experimental chemically induced DM1 by streptozotocin in C57BI/6 mice. The diabetic animals were treated with either a normal chow diet or diet containing DPP-4 inhibitor (4g MK0431/Kg of diet) ad libitum during 30 and 90 days. During the treatment the animals were evaluated regarding glycemia, weight, and oral glucose tolerance test. At the end of the treatment, the animals were killed and the blood, spleen, thymus, pancreatic lymph nodes and pancreas were collected. After 30 days of treatment with inhibitor, it was observed an increase in the hormone GLP-1 in the serum, besides a favorable immunological pattern. Among the immunologic mechanisms, it was possible to observe an increase in the regulator T cells (CD4+CD25+Foxp3+) of the spleen and a decrease in the cytokine IFN- in the pancreatic homogenate. After 90 days of treatment with inhibitor, it was also noticed an increase in the insulin and serum GLP-1 levels as well as a decrease in the glycemic levels in the treated animals. It was observed a reduction in the inflammatory pattern in the pancreatic microenvironment characterized by a decrease in the cytokines TNF- and IFN- in the pancreatic homogenate and by a reduction in the frequency of CD11b+ macrophages in the pancreatic lymph nodes. The results obtained in this project contributed to validate the therapeutic efficacy of the DPP-4 inhibitor administration in the treatment of experimental DM1, as well as the immunological and endocrinological mechanisms involved. Without the occurrence of relevant toxic effects, the use of DPP-4 inhibitors may become a therapeutic alternative for the treatment of DM1 in humans, which constitutes a chronic disease associated to low life quality and need for high cost treatment.
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Papel do p21 e do estresse oxidativo na resistência renal isquêmica / Role of p21 and oxidative stress on renal tubular resistance after acute ischemic injuryFlavia Kfouri 12 December 2007 (has links)
A resistência tubular renal tem sido estudada a fim de se ampliar a compreensão da fisiopatologia da Insuficiência renal aguda (IRA). A isquemia renal induz à resistência a um subseqüente insulto isquêmico sendo que os mecanismos de resistência parecem depender de alterações celulares. O p21 é um inibidor do ciclo celular, o qual pode ser induzido por radicais livres de oxigênio e parece ter um efeito protetor na IRA isquêmica. O objetivo deste estudo é avaliar o papel do p21 e do estresse oxidativo em modelo de resistência adquirida após episódio de IRA isquêmica, e em túbulos proximais isolados após isquemia. Ratos Wistar foram divididos em 3 grupos: grupo 1- sham, grupo 2- submetido a procedimento sham e após 2 dias submetido à isquemia de 45 min e grupo 3- submetido à isquemia de 45 min e após 2 dias submetido à segunda isquemia de 45 min. Os valores de uréia plasmática (114±60 vs. 136±44 mg/dL, n.s.), a creatinina sérica (0,86±0,2 vs. 0,98±0,1mg/dL, n.s.) e o clearance de creatinina (0,21±0,1vs. 0,24±0,1mL/min/100g, n.s.), avaliados 48 h após o segundo procedimento (Dia 4), foram semelhantes entre os grupos 2 e 3. O tempo de recuperação da IRA também foi semelhante entre os grupos 2 e 3. A histologia mostrou necrose tubular aguda aparentemente de grau semelhante entre os grupos 2 e 3. O infiltrado linfocitário foi semelhante entre os 3 grupos, entretanto houve aumento no infiltrado de macrófagos no grupo 3. Foi observado aumento na proliferação celular no grupo 2 e grupo 3, quando comparados ao grupo 1(125±28 cél./mm2, p<0,05), entretanto, a proliferação foi mais intensa no grupo 2 (1.262±440 cél /mm2) que no grupo 3 (653±300 cél /mm2, p<0,05 vs. group 2). O grau de apoptose encontrado foi semelhante entre o grupo 2 e o grupo 3. Houve aumento na expressão do p21 apenas no grupo 3 sendo que esta expressão foi semelhante nos grupos 1 e 2. Foi estudada também a resistência celular em túbulos proximais (TP) isolados de ratos normais (grupo Controle) e ratos submetidos à isquemia de 35 min, 24 h antes do estudo (grupo Isquemia). TP do grupo Isquemia foram susceptíveis à hipóxia, porém, resistentes à lesão de reoxigenação. Além disto, apresentaram menor produção de hidroperóxidos. Portanto, a resistência renal isquêmica aparentemente está associada a mecanismos celulares, o estresse oxidativo e o aumento na expressão do p21 são possíveis mediadores destes mecanismos. / Renal tubular resistance has been studied for the understanding of ischemic acute renal failure (ARF). Subsequent ischemic episodes may induce renal resistance whose mechanisms seem to be related to cell alterations. P21 is a cell cycle inhibitor that may be induced by oxygen free radicals and may have a protective effect in ischemic ARF. This study aimed at evaluating the role of oxidative stress and p21 on tubular resistance in isolated renal tubules and in a model of acquired resistance after renal ischemia. Wistar rats were divided into 3 groups: group 1 - sham; group 2 - submitted to sham procedure and after 2 days submitted to 45 min ischemia and group 3 - submitted to ischemia of 45 min followed by a second 45 min ischemia after 2 days. Plasma urea levels (114±60 vs. 136±44 mg/dL), serum creatinine (0.86±0.2 vs. 0.98±0.1mg/dL) and creatinine clearance (0.21±0.1vs. 0.24±0.1mL/min/100g.) evaluated at 48 hours after the second procedure were similar between groups 2 and 3 (all NS). ARF recovery time was also similar between groups 2 and 3. Histology disclosed the same degree of acute tubular necrosis between groups 2 and 3. Lymphocytes infiltrate was similar among all groups whereas macrophages infiltrate was greater in group 3. Enhanced cell proliferation was observed in groups 2 and 3 when compared with group 1 (125±28 cel/mm2, p<0.05), however it was greater in group 2 (1,262±440 cel/mm2) than group 3 (653±300 cel/mm2, p<0.05 vs. group 2). Degree of apoptosis was similar between groups 2 and 3. The p21 expression was increased only in group 3 whereas it was similar in groups 1 and 2. Cell resistance was also evaluated in isolated renal proximal tubules (PT) from control and ischemia groups. In the latter group, animals were submitted to 35 min ischemia and PT were isolated one day later. PT from the ischemia group were sensitive to hypoxia but resistant to reoxygenation injury which was followed by lower hydroperoxides production. In conclusion, renal resistance obtained by an ischemia was associated with cell mechanisms involving oxidative stress and increased p21 expression as mediators of this protection.
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Efeito do inibidor de α-amilase do feijão (Phaseolus vulgaris L.) em Animais normais e diabéticos / Effect of α-amylase inhibitor of the bean (Phaseolus vulgaris L.) in normal and diabetic animalsElizabete Wenzel de Menezes 30 September 1985 (has links)
Não consta resumo na publicação. / An α-amylase inhibitor purified from black beans (Phaseolus vulgaris L.) prevents the utilization of starch either in normal or diabetic rats during short-time starch loading tests. It causes hypoglycaemia and alters accordingly the serum insulin and non esterified fatty acids levels. These effects are dose dependent and doses higher than 31 mg of the inhibitor can promote the complete smoothing on serum glucose level. The existence of starch in the presence of the inhibitor in the intestine doesn\'t alter the secretion or production of α-amylase by the pancreas.
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Inibidores de proteinase do tipo Bowman-Birk: evolução molecular, expressão na superfície de fagos filamentosos e seu papel na interação planta-inseto. / Bowman-birk proteinase inhibitors: molecular evolution, phage-display and its role on plant-insect interactions.Márcia Ometto de Mello Alves José 27 November 2002 (has links)
Os inibidores inibidores de serino proteinases do tipo Bowman-Birk (BBI) possuem dois sítios ativos e são encontrados em plantas das famílias Fabaceae e Poaceae. Neste trabalho foi apresentada a estrutura primária e o padrão de expressão de 14 seqüências expressas (EST, expressed sequence tags) de BBI putativos encontradas no banco de dados do "Projeto Transcriptoma da Cana-de-açúcar" (SUCEST). Estas quatorze seqüências foram utilizadas em conjunto com outras 87 seqüências de BBI previamente descritas e depositadas no banco de dados "GenBank" para a construção de árvores filogenéticas da família BBI. A análise filogenética mostrou que os BBI de monocotiledôneas e dicotiledôneas podem ser claramente separados em diferentes grupos e a topologia das árvores filogenéticas sugere um padrão evolutivo diferente das famílias de BBI em plantas. Os inibidores de dicotiledôneas são bem conservados e acumularam diferenças sutis durante a evolução. Em contrapartida, os inibidores de monocotiledôneas são altamente variáveis, indicando a ocorrência de um processo evolutivo interessante, baseado em eventos de duplicação intragênica e mutação. Dois inibidores de serino proteinases, um de tripsina e outro de quimotripsina, derivados do gene que codifica o inibidor Bowman-Birk de soja, foram expressos na superfície do fago filamentoso M13 e utilizados para a construção de bibliotecas de variantes. Para tal foram feitas mutações em quatro aminoácidos do sítio ativo destes inibidores e duas bibliotecas de expressão na superfície de fagos filamentosos foram construídas. Posteriormente, estas bibliotecas foram utilizadas para a seleção de variantes que melhor interagiam com a tripsina bovina e de Diatraea saccharalis e com as enzimas digestivas presentes no extrato intestinal desta praga. Os variantes selecionados foram seqüenciados, analisados e caracterizados. Os resultados mostraram que a técnica de expressão na superfície de fagos filamentosos foi eficiente para selecionar novos inibidores. Além disto, com as mutações realizadas, foi possível transformar a alça de inibição de quimotripsina em uma alça de inibição de tripsina. / The Bowman-Birk inhibitors (BBIs) are double headed inhibitors of serine proteinase found in plants from Fabaceae and Poaceae families. We describe the primary structure and the gene expression profile of 14 putative BBIs from the sugarcane expressed sequence tag (SUCEST) database and show how we used these newly discovered sequences together with 87 previously described BBI sequences from the "GenBank" database to construct phylogenetic trees for the BBI family. Phylogenetic analysis revealed that BBI-type inhibitors from monocotyledonous and dicotyledonous plants could be clearly separated into different groups, while the overall topology of the BBI tree suggests a different pattern of evolution for BBI families in flowering plants. We also found that BBI proteinase inhibitors from dicotyledonous plants were well conserved, accumulating only slight differences during their evolution. In addition, we found that BBIs from monocotyledonous plants were highly variable, indicating an interesting process of evolution based on internal gene duplications and mutation events. Two serine-type proteinase inhibitors, a trypsin and a chymotrypsin, both derived from the soybean Bowman-Birk inhibitor, were expressed on the surface of a filamentous phage. Site mutations were made in four positions of the reactive sites of these inhibitors and two phage-display libraries were constructed. Later, these libraries were used to select better ligands to the bovine and Diatraea saccharalis trypsin and to the midgut enzymes of this insect pest. The selected variants were sequenced, analyzed and characterized. The results showed that the phage-display technique is efficient to select new proteinase inhibitors. Furthermore, it was possible to modify the chymotrypsin loop into a trypsin loop using the library constructed by the insertion of a degenerated primer.
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Caracterização da comunidade bacteriana associada ao trato intestinal de Spodoptera frugiperda provenientes de diferentes dietas / Characterization of bacterial community associated to Spodoptera frugiperda intestinal tract from different dietsPoliene Martins Costa 19 February 2016 (has links)
A importância da praga Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) deve-se não somente aos danos provocados às lavouras de milho, mas a capacidade de se alimentar de uma ampla variedade de famílias de plantas. Lagartas desta espécie são capazes de se adaptar a dietas contendo inibidores de peptidase de soja (IPS). Há uma hipótese de que a microbiota intestinal neste inseto poderia estar envolvida com estes mecanismos de adaptação. Neste contexto, um dos objetivos do trabalho foi verificar se estas bactérias poderiam alterar a expressão gênica de serino peptidases e atividade enzimática nestes lepidópteros em ensaios in vitro. Observouse que no tratamento com tetraciclina, não houve influência na alteração da expressão gênica e da atividade quantitativa das respectivas serino peptidases nas lagartas provenientes dos ambientes diferentes. Ao mesmo tempo, objetivou-se estudar se haveria uma contribuição das bactérias na atividade proteolítica intestinal de S. frugiperda ao longo do processo digestivo de insetos, analisando se influenciam no perfil qualitativo das serino peptidases intestinais destas lagartas em zimograma. As lagartas de campo que sofreram a primeira exposição à uma dieta com antibiótico aumentaram a atividade de duas peptidases provavelmente trípticas, também sintetizadas nos tratamentos com IPS e IPS com antibiótico provavelmente como provável resposta adaptativa. Para analisar o efeito do IPS e da tetraciclina em folhas ingeridas por lagartas criadas em laboratório e coletadas em campo, além da influência da dieta natural (cartucho de milho) e da dieta artificial sobre a composição e diversidade da microbiota fecal de S. frugiperda, foi feito o sequenciamento das regiões V3-V4 do gene 16S rRNA de procariotos utilizando a plataforma de alto desempenho Illumina Miseq. Os valores médios de diversidade de UTOs do índice Shannon detectados nas fezes de S. frugiperda foram mais baixos nas amostras de dieta artificial e o segundo índice médio mais baixo foi calculado naquelas provenientes de cartucho de milho no campo, revelando que ambas as amostras apresentaram menor diversidade de espécies na composição da comunidade bacteriana. A abundância relativa em nível de filo bacteriano gerada para todos os conjuntos de amostras fecais demonstrou que os filos mais predominantes foram Proteobacteria (73,3%) e Firmicutes (24,2%), sendo ambos os filotipos mais abundantes nos grupos de insetos. Os quatro filotipos mais abundantes em nível de gênero corresponderam a Enterococcus (23,5%), Acinetobacter (20,5%), Stenotrophomonas (11,4%) e Klebsiella (10,4%). Verificamos que a dieta foi a principal variável que modulou a estrutura das comunidades bacterianas das fezes de S. frugiperda. Entretanto, não é possível afirmar se haveria uma contribuição das peptidases das bactérias simbiontes ao processo digestivo de insetos. Com estes novos dados taxonômicos, poderemos isolar as bactérias a partir das fezes destas lagartas e estudar a significância funcional destes simbiontes tais como, detoxificação de compostos tóxicos como inibidores de peptidases de plantas, papel digestivo e nutricional destas bactérias para as lagartas desta espécie. / The importance of the pest Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) is due not only to corn crops damage, but the ability to attack a wide variety of plant families. Caterpillars of this species are able to circumvent diets containing soybean peptidase inhibitors (SPI). There is a hypothesis that this insect gut microbiota might be involved in these adaptation mechanisms. One of the goals of this study was to determine whether these bacteria could alter the serine peptidase gene expression or enzymatic activity in vitro assays in these Lepidoptera. It was observed that there was no alteration of the gene expression and the quantitative activity of serine peptidases in the caterpillars collected from both different environments fed with tetracycline leaves. At the same time, other objective was to study if there was a contribution from bacteria in the gut proteolytic activity of S. frugiperda in the digestive process of insects, analyzing its influence in the qualitative profile of serine peptidase gut worms in zymogram. The field caterpillars that suffered the first exposure to a diet with antibiotic increased the activity of two probably tryptic type peptidases which were also synthesized in IPS and IPS plus antibiotic treatments, probably as likely adaptive response. In order to analyze the effect of IPS and tetracycline in leaves eaten by caterpillars reared in the laboratory and collected in the field, beyond the influence of the natural diet (maize cartridge) and artificial diet on the composition and diversity of fecal microbiota of S. frugiperda, the sequencing using high performance Miseq Illumina platform was done in V3-V4 regions of 16S rRNA gene typical of prokaryotes. The average values of Shannon index related to OTUs diversity detected in the feces of S. frugiperda were lower in artificial diet samples and second lower mean index was calculated from those collected in the field, showing that both samples showed lower species diversity in the composition of bacterial communities. The relative abundance of bacterial phylum level generated for all fecal samples showed that the most prevalent phyla were Proteobacteria (73.3%) and Firmicutes (24.2%). Both phylotypes are predominant in insect groups. The four most abundant phylotypes at genus level accounted for Enterococcus (23.5%), Acinetobacter (20.5%), Stenotrophomonas (11.4%) and Klebsiella (10.4%). We found that the diet was the main variable that modulated the bacterial communities structure in the feces of S. frugiperda. However, it is not possible to state that there would be a contribution of peptidase bacterial symbionts to the digestive process of insects. With these new taxonomic data, we may isolate bacteria from S. frugiperda feces and study the functional significance of these symbionts such as detoxification of toxic plant compounds as inhibitors of peptidases, the digestive and nutrition role of these bacteria for the caterpillars species.
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Mecanismos moleculares envolvidos no fenótipo endotelial em resposta a estímulos físicos e químicos / Molecular mechanisms involved in endothelial phenotype in response to physical and chemical stimuliThaís Girão da Silva 01 August 2018 (has links)
O endotélio reveste a parede vascular e possui função essencial na manutenção da homeostase. A célula endotelial é capaz de perceber estímulos extracelulares, como fatores químicos e mecânicos, transmitir a informação para dentro da célula e regular sua função e fenótipo. Neste sentido, investigamos os mecanismos moleculares associados as células endoteliais em dois contextos importantes de intervenções vasculares 1) nos stents farmacológicos, onde a rapamicina exerce funções antiproliferativas e pró-trombogênicas, e 2) na revascularização cardíaca por ponte de safena, onde o alto estiramento mecânico exerce grande impacto no remodelamento vascular e no fenótipo da célula endotelial. A rapamicina pertence à classe de drogas limus, bastante utilizadas nos stents farmacológicos usados no procedimento de desobstrução vascular. Além de sua função antiproliferativa, exploramos os efeitos deletérios associados a pró-trombogênese. Os dados demonstraram que a rapamicina ativa o receptor de TGF independentemente de seu ligante TGFbeta, promovendo aumento na expressão da PAI-1 (pró-trombogênica), alteração no fenótipo endotelial (Transição endotélio-mesenquimal - EndMT) e na formação de fibras de estresse. Os efeitos observados são dependentes da ativação de Smad2 e independentes da via clássica antiproliferativa por mTOR. Experimentos in vivo mostraram que o tratamento com inibidor do receptor de TGF diminui os efeitos pró-trombogênicos e a expressão de PAI-1 induzidos pela rapamicina em artérias carótidas de camundongos. A ponte de safena é um procedimento bastante utilizado na cirurgia de revascularização cardíaca e a arterialização do segmento venoso submetido ao estresse hemodinâmico arterial resulta em remodelamento vascular, que influencia o sucesso do procedimento. Nossos dados demonstram que a célula endotelial humana de veia safena humana (hSVEC), susceptível as modificações do tipo EndMT induzido quimicamente (estímulo pró-fibrótico e pró-inflamatório), não expressou o mesmo comportamento em resposta ao aumento de estiramento mecânico que ocorre durante a arterialização venosa. Entretanto, detectamos uma pronunciada redução dos filamentos de actina, modulação no padrão de ativação da cofilina e na proporção de actina glomerular (G-actina) entre citoplasma e núcleo, com redução da biodisponibilidade de NO. De modo interessante, demonstramos que a redução no filamento de actina é específica para a célula endotelial venosa, não sendo observado em células endoteliais de origem arterial de aorta e coronária. Em conjunto, os dados mostram que 1) efeitos pró-trombogênicos associados a rapamicina são mediados por ativação do receptor de TGF independente do seu ligante e da atividade antiproliferativa da droga e 2) a adaptação da célula endotelial venosa ao estiramento mecânico envolve modulação da síntese/degradação de filamentos de actina e redução na biodisponibilidade de NO. Estes novos elementos sobre o mecanismo de transdução de estímulos químicos e físicos pelo endotélio poderão ser explorados terapeuticamente para modular a plasticidade endotelial em disfunções cardiovasculares / Endothelium is the inner layer in vascular wall and displays an essential role in the maintenance of cardiovascular homeostasis. Endothelial cell senses the extracellular stimuli, such as chemical and mechanical factors, transduce and process these signals to regulate cell function and phenotype. Here, we investigated molecular underpinning of the endothelial cells under two important scenarios: 1) in drug-eluting stents, where rapamycin exerts antiproliferative and undesirable prothrombogenic functions, and 2) in vein graft bypass surgery, where increased stretch modulates vascular remodeling and endothelial cell phenotype. Rapamycin belongs to the class of limus drugs and is widely used in drug eluting stents (DES) to vascular restenosis. In addition to its antiproliferative function, we explore the deleterious effects associated with prothrombogenesis. Our data demonstrated that rapamycin activates TGF receptor independent of its ligand TGFbeta, in concert with promotion of PAI-1 expression (prothrombogenic), changes in endothelial phenotype (Endothelial to Mesenchymal Transition - EndMT) and stress fibers induction. These effects are Smad2 dependent and independent of the classical antiproliferative mTOR pathway of rapamycin. Our in vivo experiments showed that TGF receptor inhibitor treatment decreases prothrombogenic effects and PAI-1 expression induced by rapamycin in mice carotid arteries. Saphenous vein is widely used in coronary artery bypass surgery (CABG) and the vein arterialization remodeling in response to the increased stress influences graft patency. Our data demonstrated that human saphenous vein endothelial cell (hSVEC) is susceptible to chemically induced endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) by pro-fibrotic and pro-inflammatory stimuli. On the other hand, physical stimulus associated with high stretch failed to induce EndMT. However, we detected a pronounced decrease of actin filaments, modulation of the cofilin activation, changes in the proportion of glomerular actin (G-actin) between cytoplasm and nucleus, and reduction of NO bioavailability. Interestingly, the reduction of actin fibers by high stretch is specific to venous endothelial cell since arterial endothelial cells from aorta, and coronary artery failed to display the response. Altogether, our data show that 1) the thrombogenic effects of rapamycin are mediated by TGF receptor activation independent of its ligand and independent of the antiproliferative pathway of the drug, and 2) the adaptation of venous endothelial cell to mechanical stretch involves synthesis/degradation of actin filaments and reduced NO bioavailability. These new elements on signal transduction of endothelial cells in response to chemical and physical stimuli may be therapeutically explored to modulate endothelial plasticity in cardiovascular disorders
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Avaliação dos mecanismos moleculares das vias de p53/ARF e IFNbeta envolvidos com a resposta de células de melanoma ao tratamento com os transgenes p19Arf e IFNbeta / Evaluation of molecular mechanisms of p53/ARF and IFNbeta pathways involved int the response of molecuar cells to treatment with p19Arf and IFNbeta transgenesAline Hunger Ribeiro 24 August 2016 (has links)
O melanoma é uma forma de câncer com alto índice de morte devido, em parte, à sua tendência de formar metástases. Esse tipo tumoral apresenta deleção de CDKN2A e amplificação de HDM2 em aproximadamente 50 % dos casos, mas apenas 10 % apresentam mutação em p53. Aproveitando-se do fato de a maioria dos casos de melanoma retêm p53 selvagem, uma proteína supressora tumoral e fator de transcrição, utilizamos vetores adenovirais nos quais a expressão dos transgenes é controlada pelo p53 endógeno. Estes vetores foram aperfeiçoados com a inclusão de uma modificação na proteína fibra que permite a eficiente transdução de um amplo espectro de células. Utilizando estes vetores, nosso laboratório mostrou que o tratamento combinado, mas não individual, de vetores virais codificando p19Arf e IFNbeta (interferon-beta) induziu elevados níveis de morte em células de melanoma de camundongo, B16F10. Assim, iniciamos novos estudos que têm como alvo explorar os mecanismos de morte celular e identificar genes críticos cuja expressão é alterada frente o tratamento combinado e que agem como mediadores da resposta celular para a estratégia de transferência gênica. Com este projeto, transferimos a combinação gênica (p19Arf + IFNbeta) para células B16F10 e analisamos o tipo de morte celular induzido. Assim, detectamos o aumento da presença de marcadores de morte celular conhecidos, tais como de apoptose (atividade de caspases e exposição de fosfatidilserina) e de necroptose (expressão de RIPK3 e TNFR1), e a diminuição de um marcador de autofagia (expressão de LC3-II). Além disso, mostramos que a detecção dos três marcadores clássicos de morte imunogênica (ATP, calreticulina e HMGB1) foi possível somente quando as células B16F10 foram tratadas com a combinacao de p19Arf + IFNbeta. Por fim, a avaliação do perfil de expressão gênica através de microarray de cDNA das células B16F10 tratadas com p19Arf + IFNbeta revelou expressão diferenciada de 1054 genes em comparação com células que receberam apenas somente um ou outro transgene. Em seguida, a expressão dos genes Nr3c1, RanBP9, Sin3A, Wdr46, FoxO1, Phlda3 e tp73 foi validada por qPCR e estudos funcionais foram iniciados para revelar a participação destes na resposta celular. Dessa forma, desvendamos importantes aspectos da resposta de células B16F10 frente ao tratamento com p19Arf e IFNbeta / Melanoma is a form of cancer with a high death rate due, in part, to its tendency to generate metastasis. These tumors carry deletion of CDKN2A and amplification of HDM2 in nearly 50 % of cases, but only 10 % have mutations in p53. Taking advantage of the fact that most melanoma cases retain wild type p53, a transcription factor and tumor suppressor protein, we used adenoviral vectors in which transgene expression is controlled by endogenous p53. These vectors were improved with a modification of the fiber protein that allows efficient transduction of a broad spectrum of cells. Using these vectors, our laboratory showed that the combined treatment with viral vectors encoding p19Arf and IFNbeta (interferon-beta) induced high levels of B16F10 (mouse melanoma) cell death, but not when treated with these vectors individually. Thus, we initiated studies to explore the mechanisms of cell death and to identify critical genes involved in the response of B16F10 cells to treatment with p19Arf + IFNbeta. Here, we transferred p19Arf + IFNbeta genes to B16F10 cells and analyzed the type of cell death induced. In this regard, we detected an increase of cell death markers, such as apoptosis (caspase activity and exposure of phosphatidylserine) and necroptosis (RIPK3 and TNFR1 expression) and a decrease of an autophagy marker (LC3-II expression). Furthermore, we showed that the detection of three classic immunogenic cell death markers (ATP, calreticulin and HMGB1) was possible only when B16F10 cells were treated with p19Arf + IFNbeta combination. Lastly, assessment of gene expression profile using cDNA microarray analysis of B16F10 cells treated with p19Arf + IFNbeta revealed differential expression of 1054 genes compared to cells that received only one of the transgenes. Expression of Nr3c1, RanBP9, Sin3a, Wdr46, FoxO1, Phlda3 and TP73 genes was validated by qPCR and functional studies were started to reveal participation of these genes in the cellular response. Thus, we exposed important aspects of the B16F10 cellular response to treatment with p19Arf and IFNbeta
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Participação de proteínas tirosina quinase ativada por mitógenos (MAPKs) na indução do fator inibidor de leucemia (LIF) em células estromais da medula óssea de crianças com sindromes mielodisplásicas (SMD) / Participation of protein tyrosine kinase activated by mitógenos (MAPKs) in the induction of the inhibitory factor for leukemia (LIF) stromal cells in the bone marrow of children with Myelodysplastic Syndromes (MDS)Simone Vieira da Costa 22 September 2008 (has links)
Em nosso trabalho anterior mostramos que dentre as citocinas analisadas, os níveis do mRNA de LIF nas células estromais pediátricas, de SMD e de SMD-LMA foram maiores quando comparados às células estromais de crianças saudáveis. No presente estudo, observamos um aumento tempo dependente nos níveis da proteína LIF após adição de SFB em todas as células analisadas (células estromais de crianças saudáveis, de SMD e de SMD-LMA). O envolvimento de p38, ERK e JNK na expressão LIF nestas células foi determinado pelo uso de inibidores dos membros das proteínas quinase ativadas por mitógenos: ERK (PD98059), p38 (SB302580) e JNK (SP600125) os quais inibiram a produção de LIF nas células estromais de crianças saudáveis, após estas serem estimuladas por SFB. No entanto, os níveis da expressão de LIF-induzido por soro nas células estromais de SMD e de SMD-LMA tratadas com SB302580 (p38) foram significativamente diminuídos, em comparação com a inibição observada no tratamento com PD98059 e SP600125 (p <0001, teste ANOVA). Em adição analisamos as formas fosforiladas de p38 e ERK, após 48hs na ausência ou na presença de soro por diferentes tempos. Níveis de atividade de ERK e do p38 foram inicialmente elevados na ausência de soro. A atividade de p38 foi sustentada após tratamento com SFB, entretanto, ERK apresentou uma variação de atividade durante o tratamento. Sugerimos que a sinalização das MAPKs (p38, ERK e JNK), em resposta a fatores de crescimento presentes no soro, parece desempenhar um papel importante na expressão da LIF em células estromais de crianças saudáveis, mas a sinalização do p38 parece ser funcionalmente mais importante nas mielodisplasias ou naquelas associadas à LMA / Our previous report showed that among the cytokines analysed, LIF mRNA levels in stromal cells from pediatric MDS and MDS-AML were higher as compared to those found in healthy stromal cells. In the present study, we have observed an increased protein LIF levels in a time dependent manner after FCS stimulation in all stromal cells analysed (MDS, MDS-AML and healthy children) and the involvement of p38, ERK and JNK pathways in the LIF expression in these cells was determined. In stromal cells from two healthy children, LIF production was equally inhibited in a dose dependent manner after FCS stimulation by mitogen-activated protein kinase (MAPKs) members inhibitors: ERK (PD98059), p38 (SB302580) and JNK (SP600125). However, in MDS and MDS-AML stromal cells, the levels of LIF-induced by serum, were significantly decreased by SB302580, as compared with the inhibition observed by treatment with PD98059 and SP600125 (p <0,001, ANOVA test). In addition we have analysed the presence of p38 and ERK phosphorylated forms in stromal cells, after 48hs of serum starvation or in the presence of FCS for different times. Activated ERK and p38MAPK levels were initially elevated in the absence of serum. p38MAPK activation was sustained after treatment with FCS, whereas ERK presented a variation of the activated forms during treatment. We suggest that the signalling of the MAPKs (p38, ERK and JNK) in response to growth factors present in the serum, seems to play an important role in the LIF expression by stromal cells of healthy children, but p38 MAPK signalling appears to be functionally more important in MDS and MDS-AML
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Expressão dos fatores LIF (Fator Inibitório de Leucemia), IL-6 (Interleucina-6), STAT-3 (Ativador de Transcrição-3) e telomerase em coriocarcinomas / Expression of LIF (Leukemia Inhibitory Factor), IL-6 (Interleukin-6), STAT-3 (Activator of Transcription-3) and telomerase in choriocarcinomasPietro, Luciana, 1981- 12 November 2013 (has links)
Orientadores: Liliana Aparecida Lucci de Angelo Andrade, Fatima Aparecida Böttcher-Luiz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T02:59:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2013 / Resumo: A invasão do endométrio pelo trofoblasto extraviloso é fundamental no desenvolvimento do feto e da placenta, processo este controlado por fatores ligados à atividade imunológica e hormonal que, quando alterada, pode resultar em interrupção da gestação e/ou geração das chamadas doenças trofoblásticas gestacionais. Em algumas situações, pode haver evolução para o coriocarcinoma, neoplasia maligna do trofoblasto, em que há evidências da atuação das moléculas ligadas ao processo de fusão celular e inflamação. Porém, os estudos neste tema são incipientes e inconclusivos. Considerando essas informações, o objetivo deste trabalho é estudar de forma comparativa a expressão das citocinas LIF, IL-6 e do ativador de transcrição STAT-3, além da telomerase, em material de aborto, de placenta normal a termo e de coriocarcinoma. Métodos: a expressão destas moléculas foi avaliada pelos métodos: imunoistoquímica (IHQ), imunofluorescência (IF), Western Blotting (WB) e Real-Time PCR (RT-PCR), em amostras de material de aborto, placenta normal a termo e coriocarcinoma (N=12 cada um). Os ensaios de WB e Real-Time PCR empregaram material a fresco de placenta normal a termo e seu cultivo celular e cultura da linhagem BeWo. Resultados: no material de aborto, as reações de IHQs evidenciaram expressão moderada de IL-6 em 58,4% dos casos e intensa de STAT-3 em 33,3%. Na placenta normal, observou-se intensa marcação de IL-6 em 50% e de STAT- 3 em 16,7% dos casos, enquanto que, no coriocarcinoma, houve expressão intensa de IL-6 em 50% e de STAT-3 em 75% dos casos. Por outro lado, as reações para LIF tiveram expressão nula em todos os três grupos. Pelo WB houve expressão proteica de IL-6 apenas no material fresco de placenta normal e ausência de expressão na sua cultura primária e na linhagem BeWo; LIF não foi expresso em todos os grupos estudados. STAT-3 foi detectado no citoplasma em todos os grupos, entretanto, a expressão nuclear da STAT-3 fosforilada (pSTAT-3) não foi observada na IF e nem pelo WB. Na análise gênica pelo RTPCR houve forte expressão de IL-6 e STAT-3 no material fresco de placenta normal e expressão muito fraca na cultura primária de placenta normal e na linhagem BeWo; a expressão de LIF foi muito fraca em todos os grupos. Apenas a linhagem BeWo demonstrou forte expressão gênica da telomerase, contrastando com a completa falta de expressão no material fresco de placenta normal e em sua cultura primária. Conclusão: A intensa expressão IHQ de IL-6 e STAT-3 no coriocarcinoma indica a atuação de ambas na carcinogênese. A expressão proteica de IL-6 no material fresco de placenta normal e sua ausência no material de cultura primária e na linhagem BeWo pode ser ocasionado pelo contato célula-a-célula nas culturas aderentes, inibindo o crescimento celular e, consequentemente, as vias de sinalização. A falta de expressão da pSTAT-3 tanto na IF como por WB demonstra que a via JAK-STAT está sendo desativada. A ausência de expressão de LIF, em todos os métodos estudados, sugere que esta citocina poderia estar sendo inibida por meio de proteínas SOCS3 ou, atuando, de modo indireto, na proliferação celular do coriocarcinoma. O aumento da atividade da telomerase nas células BeWo reforça sua relação com o fenótipo maligno e a aponta como um bom marcador para progressão da doença / Abstract: The invasion of the endometrium by extravillous trophoblast is a fundamental process in the growth of the fetus and placenta. The process is controlled by factors related to the immune and hormonal activity that, when changed, may result in termination of pregnancy and development of so-called gestational trophoblastic diseases. In some cases, changes can result in malignancy, in which some molecules play a role in cell fusion process and inflammation, although studies in this area are inconclusive. Considering this information, the study had the aim of investigating the expression of cytokines LIF, IL-6, STAT- 3 and the function of telomerase to understand their participation in abortion, in normal at term placenta and choriocarcinoma. Methods: The expression of the molecules was assessed by immunohistochemical assay (IHC), immunofluorescence (IF), Western Blotting (WB) and Real-Time PCR (RT - PCR) using fixed material from biopsies of abortions, normal at term placentas and choriocarcinoma along with fresh tissue of normal at term placenta and their primary culture and BeWo cell line. Paraffin embedded material used in IHC and IF assays were obtained from the Department of Pathology files. Tests of WB and Real-Time PCR employed fresh material, obtained from cell cultures of normal at term placenta and the BeWo line. Results: IHC reactions to abortion biopsies showed moderate staining for IL-6 in 58.4% of cases and intense for STAT-3 in 33.3 % of cases. In biopsies of normal placenta, there was intense reaction for IL-6 in 50% of cases, intense for STAT-3 in 16.7%; choriocarcinoma showed intense staining for IL- 6 in 50% of cases and also for STAT-3 in 75% of cases. On the other hand, LIF expression was missing in all three groups. WB analyses showed IL-6 protein in fresh material from normal placentas, but no expression in placenta primary cultures and BeWo line. LIF was absent in all groups. Cytoplasmic STAT-3 was observed in all groups, while the nuclear expression of phosphorylated STAT-3 was absent. On gene analyses a strong expression of IL-6 and STAT- 3 was observed from fresh normal placenta, but very weak expression in primary cultures of normal placenta and BeWo cell line. LIF expression was very weak in all groups. In regard to the gene expression of telomerase, it was strong in the BeWo line which contrasted with its complete lack of expression in fresh normal placenta and its primary culture. Conclusion: The high expression of IL-6 and STAT-3 in biopsies of choriocarcinoma indicates the role of both in tumor progression. Regarding protein expression, the presence of IL-6 in the material from fresh normal placenta, and its absence in primary culture and BeWo line may be caused by the cell-to-cell contact cultures by inhibiting cell growth and thus signaling pathways. However, the lack of expression of phosphorylated STAT-3 whether through IF or WB shows that its JAK-STAT pathway is inhibited. Lack of expression of the LIF suggests that it might be involved indirectly in choriocarcinoma cell proliferation or be inhibited by SOCS3 protein. Moreover, the increased telomerase activity of BeWo cells enhances their relation to the malignant phenotype and indicates a good marker for disease progression / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas
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