Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement répandu chez les bactéries à Gram négatif. Il permet la sécrétion d'enzymes lytiques et de toxines. Chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, les pectinases, sécrétées par ce système appelé Out, dégradent la pectine, provoquant les symptômes de pourriture molle. La sécrétion par le T2SS se passe en 2 étapes : les protéines traversent la membrane interne par le système Sec ou le système Tat. Une fois dans le périplasme, elles sont repliées et transloquées par le T2SS à travers la membrane externe. Le système Out est composé de 14 protéines intégrées ou associées à l'une des deux membranes. Son assemblage et son fonctionnement restent obscurs. Une plateforme serait formée dans la membrane interne par OutE, -F, -L, -M et -C. Ces trois derniers composants sont des protéines bitopiques dont la stœchiométrie et le rôle sont inconnus. Pour identifier des interactions entre ses composants, nous avons utilisé le double-hybride bactérien, basé sur la reconstitution de l'activité d'adénylate cyclase. Nous avons démontré que le domaine de type ferrédoxine, situé en C-terminus d'OutL et d'OutM, est directement impliqué dans l'homo- et l'hétérodimérisation de ces protéines. Une interaction entre les régions périplasmiques d'OutC et d'OutD a été aussi détectée (Login et al., 2010). Pour mieux analyser les multiples interactions au sein du T2SS, des expériences de triple-hybride ont été réalisées en co-exprimant différentes combinaisons des régions solubles de trois composants. Nos résultats suggèrent qu'OutL empêche l'interaction entre OutC et OutD. Par ailleurs, OutL est impliquée dans l'activation de l'ATPase OutE, le moteur du système (Camberg et al., 2007). OutL serait donc impliquée dans la transmission du signal entre le périplasme et le cytoplasme et pourrait intervenir dans la dissociation du complexe OutD/OutC. Afin d'analyser le rôle des segments transmembranaires (TMS) de composants du T2SS, nous avons adapté la technique du double-hybride. Le domaine de la protéine rapporteur Cya a été fusionné au N-terminus du TMS et BlaM au C-terminus. BlaM sert à contrôler la topologie correcte des fusions dans la membrane. Plusieurs interactions bi-partenaires entre les TMS d'OutC, OutL et OutM ont été ainsi détectées. Ce travail a été complété par une étude in vitro (pull-down) et par mutagenèse dirigée. Ces interactions TMS-TMS pourraient intervenir dans la transmission du signal du périplasme vers le cytoplasme à travers la membrane interne.

L'étude des interactions non-covalentes et des relations structure-fonction est à la base de la compréhension des systèmes biologiques. La MS supramoléculaire est une technique de choix pour l'étude des interactions protéine/protéine ou protéine/ligand. Dans le cadre d'études qualitatives ou quantitatives, pour chaque système étudié, les conditions expérimentales et les paramètres instrumentaux ont été optimisés pour conserver le complexe en phase gazeuse (1). L'objectif principal de ce travail est de caractériser le site nucléotidique de hPEBP1 et de contribuer à la découverte de molécules anti-métastases. Sur le plan fonctionnel, une activité enzymatique de hPEBP1 n'a pas pu être mise en évidence. Pour ce projet, une méthode MS de détermination de KD de complexes à faible affinité, plus précise et ne nécessitant par l'utilisation d'un ligand de référence a été développée (2). Une recherche des déterminants structuraux d'un ligand optimal de hPEBP1 a été réalisée par criblage de composés issus d'une synthèse raisonnée basée sur la structure des nucléotides FMN et GTP et par la détermination de leur KD (3). Les criblages ont montré que les critères structuraux indispensables pour la liaison sont la présence d'un groupement chargé ou donneur d'électrons, d'une structure apparentée à une base azotée et d'un cycle additionnel. Une part importante de l'affinité est liée au caractère hydrophobe du ligand. Certains ligands de synthèse ont montré une activité inhibitrice de l'invasion des lignées tumorales.

Les IDPs sont des protéines dépourvues de structure 3D unique en solution et en l'absence de leur(s) partenaire(s). Ces protéines possèdent des propriétés d'interactions avec leurs partenaires uniques.L'extrêmité C-terminale de la nucléoprotéine du virus de la rougeole, NTAIL, est une IDP. NTAIL interagit avec XD, le domaine C-terminal globulaire de la phosphoprotéine virale, via la box2 qui est un a-MoRE. Cette interaction permet le recrutement de la protéine L afin de former la polymérase virale.J'ai pu montrer que la contribution des différents résidus au sein de l'a-MoRE dépend de l'orientation de leur chaîne latérale, et que la substitution d'un seul acide aminé crucial a des effets dramatiques sur la réplication virale.Les IDPs conservent un désordre résiduel non négligeable au sein du complexe. Cela se manifeste par la présence des régions « fuzzy » de part et d'autres du MoRE. Nous avons montré que la région « fuzzy » en amont de la box2 inhibe l'établissement de l'interaction entre NTAIL et ses partenaires.Lors de l'interaction avec leurs partenaires les IDPs subissent en général un gain de structure. Le repliement associé à l'interaction peut avoir lieu avant ou après interaction. Des études précédentes ont montré l'existence d'une pré-structuration partielle de l'alpha-MoRE de NTAIL. L'interaction entre NTAIL et XD a été étudiée et a permis de conclure que NTAIL se replie selon un mécanisme de repliement induit.Dans leur ensemble, ces études contribuent à éclaircir les mécanismes moléculaires qui gouvernent la reconnaissance de partenaires par les IDPs. / IDPs are proteins devoided of a unique and stable 3D structure in solution and in the absence of their partners. Those proteins possess unique properties, as well as mechanisms of interaction with their partners.The C-terminal region of the nucleoprotein of measles virus, NTAIL, is an IDP and interacts with XD, the globular C-terminal domain of the viral phosphoprotein, via the box2 region that is an (alpha-MoRE). This interaction allows to recruit the L protein in order to form the viral polymerase.The aim of my work was to characterize the molecular basis of NTAIL-XD interaction. I was able to show that the contribution of the amino acids among box2 depends on the orientation of their lateral chain, and that the substitution of one single amino acid has drastic effect upon the viral replication.IDPs keep a non-negligible amount of residual disorder among the complex. This fuzziness can have multiple forms, like the presence of fuzzy regions from either side of the MoRE. The impact fuzzy regions have within the complex is not well known. We demonstrated that the fuzzy region upstream box2 inhibits the settlement of the interaction between NTAIL and its partners.When interacting with their partners, IDPs generally undergo a folding associated with binding that can take place either before or after the interaction. The interaction between NTAIL and XD was investigated and monitored by fluorescence kinetic measurements, using variants bearing a tryptophan substitution. We concluded without any doubt that NTAIL folds under an induced folding mechanism.Those studies together contribute to enlighten the molecular mechanisms that govern partner recognition by the IDPs.

Déterminer les protéines cibles de l’uranium est un enjeu majeur dans la détermination de la toxicité de ce métal et la conception d’agents décorporants. Dans ce contexte, ce travail étudie les possibilités offertes par le couplage CE-ICP/MS dans la détection de complexes protéine-uranium. Par des conditions de séparation judicieusement choisies, il est possible d’obtenir une distribution de l’uranium dans des échantillons de complexité moyenne. Cette approche a été validée sur des protéines cibles connues (seules ou en mélange) pour lesquelles les constantes d’équilibre apparentes ont été déterminées avec une justesse comparable à celle des méthodes biophysiques. L’intérêt de ce couplage a été illustré au travers de diverses applications. Ainsi l’analyse directe de sérum a confirmé l’implication forte de la fétuine, une glycoprotéine humaine, dans le devenir de l’uranium dans le sang. De plus, l’intégration ce couplage dans une approche multi-techniques (ICP/MS, DLS, CE-ICP/MS) a permis d’étudier l’influence de l’uranium dans la formation de particules de calciprotéines et fournit la preuve du maintien de l’interaction protéine-uranium dans de tels édifices. / Identification of proteins targeted by uranium is of major concern in the determination of uranium toxicity and the development of decorporation agents. In this study, we examine the capabilities offered by hyphenated CE - ICP/MS for the detection of protein-uranium complexes. With judicious separation conditions, it is possible to obtain the uranium distribution in samples of moderate complexity. This approach was validated by using known proteins targeted by uranium (individually or in simple mixtures). Apparent equilibrium constants were determined with an accuracy similar to the ones obtained by biophysical methods. The interest of using this hyphenation was illustrated through diverse applications. The direct analysis of human serum confirmed the strong involvement of fetuin, a human glycoprotein, in the uranium blood distribution. Last but not least, the integration of this hyphenation into a multi-techniques approach (ICP/MS, DLS, CE-ICP/MS) allowed evaluating the influence of uranium on the formation of calciprotein particles and provided a proof of the preservation of protein-uranium complexes in such conditions.

RhoB est une petite GTPase rapidement activée par les facteurs de croissance et les stress cellulaires, qui régule des processus biologiques fondamentaux comme la migration, l'angiogenèse, la réparation de l'ADN, l'apoptose ainsi que la réponse à des thérapeutiques anticancéreuses. L'activité des petites GTPases est finement régulée par leur localisation subcellulaire. Cependant, l'activation de RhoB en cellules vivantes n'avait jamais été investiguée. Ce travail a permis d'adapter et de valider une méthode innovante d'analyse des interactions protéine-protéine par complémentation split-GFP tripartite, pour la détection sensible et spécifique de l'activation des petites GTPases en cellules vivantes. Nous avons ensuite développé un modèle cellulaire optimisé par la combinaison de la technologie split-GFP tripartite et d'un intracorps anti-GFP amplificateur de fluorescence, pour détecter la régulation de l'activation de RhoB avec une haute résolution spatiale. Ce biosenseur a mis en évidence la translocation de la forme active de RhoB en réponse au sérum à partir des endosomes pour s'accumuler au niveau de la membrane plasmique, révélant ainsi une nouvelle plateforme de signalisation membranaire de RhoB. Ce biosenseur permettra d'analyser le profil d'activation de RhoB et d'autres petites GTPases, sous d'autres stimulations ou dans différents contextes cellulaires, et d'identifier leurs partenaires et les modulateurs de leur activation. / RhoB is a small GTPase that is rapidly activated in response to growth factors and cellular stress. It regulates fundamental biological processes such as cell migration, angiogenesis, DNA repair, apoptosis and response to anticancer therapies. Small GTPases activity is tightly regulated by their subcellular localization. However, RhoB activation had never been investigated in living cells. In this work, we have adapted and validated an innovative method of protein-protein interactions analysis using tripartite split-GFP complementation, for the sensitive and specific detection of small GTPases activation in living cells. Then, we developed an optimized cellular model by combining the tripartite split-GFP technology with an anti-GFP intrabody fluorescence-enhancer to detect the regulation of RhoB activation with high spatial resolution. This biosensor highlighted the translocation of active RhoB from endosomes to accumulate at the plasma membrane upon serum stimulation, revealing a novel membrane signaling platform of RhoB. Future studies based on this biosensor will enable the analysis of RhoB activation profile and other small GTPases upon various stimuli or in different cellular contexts, as well as the identification of the GTPases partners and activation modulators.

La dystrophine est une grande protéine membranaire périphérique qui assure un rôle de soutien du sarcolemme permettant aux cellules musculaires de résister aux stress mécaniques engendrés lors des processus de contraction/élongation. Des mutations génétiques conduisent à sa production sous forme tronquée voire à un déficit total en protéine engendrant de sévères myopathies actuellement incurables. Concevoir des thérapies adaptées passe par une meilleure compréhension du rôle biologique de la dystrophine. Par une approche structure/fonction, notre objectif est de déterminer les bases moléculaires impliquées dans les interactions de la dystrophine avec les lipides membranaires du sarcolemme. Grâce à une approche de diffusion aux petits angles (SAXS et SANS) combinée à de la modélisation moléculaire, nous montrons dans un premier temps que les bicelles constituent un modèle expérimental particulièrement adapté aux analyses de structures de protéines qui y sont associées. Ce développement méthodologique original a été exploité dans un deuxième temps pour caractériser les modifications structurales subies par la dystrophine lorsqu’elle interagit avec les lipides. Nous montrons particulièrement que la liaison aux lipides induit l’ouverture significative de la structure en triple hélice « coiled-coil » de la répétiton 1 du domaine central, et proposons en conclusion un modèle tout atome de la protéine en présence de bicelles. Ces travaux de thèse (i) constituent un apport méthodologique significatif pour l’étude de protéines membranaires, (ii) contribuent à une meilleure compréhension du rôle biologique de la dystrophine en vue de thérapies dédiées aux patients atteints de myopathies. / Dystrophin is a large peripheral membrane protein that provides a supporting role for sarcolemma allowing muscle cells to withstand the mechanical stresses generated during contraction / elongation processes. Genetic mutations lead to dystrophin production in truncated form or even to a total deficit in the protein leading to severe myopathies currently incurable. Designing adapted therapies requires a huge knowledge of the biological role of dystrophin. Using a structure / function approach, our aim is to determine the molecular bases involved in the interactions of dystrophin with the membrane lipids of the sarcolemma. Using a small-angle scattering approach (SAXS and SANS) combined with molecular modeling, we show that bicelles constitute a versatile membrane mimic that is particularly adapted to analyze the structure of membrane proteins. This original methodological development was exploited to characterize the structural changes undergone by dystrophin upon lipid binding. We highlight in particular that the lipid binding induces a significant opening of the coiled-coil structure of the repeat 1 of the central domain and, in conclusion, we propose an all-atom model of the protein bound to a bicelle. These thesis works (i) constitute a significant methodological contribution for the study of membrane proteins, (ii) contribute to a better understanding of the biological role of dystrophin for therapies dedicated to patients with myopathies.

Les interactions protéine-protéine (IPP) jouent un rôle essentiel dans le vivant. Mon travail de thèse s’est concentré sur développement de méthodes bio-informatiques pour la prédiction et la modélisation structurale des IPP. Mon objectif était d'améliorer le pouvoir prédictif des méthodes permettant de prédire les structures d’assemblages macromoléculaires (docking) et d'aborder les problèmes rencontrés par les biologistes sur des cas réels d’interactions.Pour obtenir des modèles de protéines isolées de meilleure qualité, j’ai tout d’abord développé le serveur HHalign-Kbest basé sur des algorithmes d’alignements sous-optimaux. Ensuite, dans le domaine du « docking », j’ai élaboré le serveur InterEvDock qui prend en compte les informations de coévolution entre protéines. Les validations en aveugle montrent que ce serveur atteint de meilleures performances que d’autres serveurs de référence lorsque l’information évolutive est disponible.Afin de tester plus à fond nos méthodes, nous avons participé au concours CAPRI - un concours international pour la prédiction des interactions protéiques. Sur les sessions couvrant la période 2013-2016, notre groupe s’est classé 1er. Enfin, j'ai développé un jeu de données d’apprentissage et de test, PPI4DOCK. Il contient un très grand nombre de cibles de complexes (plus de 1000) et permettra d'améliorer les méthodes de docking à partir des structures expérimentales ou de modèles.En termes d'applications, je me investis dans différents projets collaboratifs, qui touchent des domaines aussi variés que, la recherche de partenaires pour le chaperon d’histone Asf1; la prédiction des modes d’interaction entre CENP-F et Nup133 dans le contexte de la mitose et de Exo70 et Abi dans celui de la régulation de la mobilité cellulaire; la simulation des modes de liaison entre le complexe Ku et ses partenaires peptidiques, dans les voies de réparation de l'ADN. / Protein-protein interactions (PPIs) play essential roles in life. My PhD work aimed at developing advanced bioinformatics methods in the field of PPI prediction at the structural scale. My goal was to improve the predictive power of methods which model the structures of macromolecular assemblies (docking) and to tackle real-life problems faced by biologists.First, I developed HHalign-Kbest server using algorithms for the search of suboptimal solutions to gain better-quality models. Second, in the field of protein docking, I built InterEvDock server which can take co-evolutionary information into account. It yields better performance than other state-of-the-art servers. In order to further test our methods, we participated in CAPRI – an international challenge for prediction of protein interactions. Over years 2013-2016, our group ranked 1st at the 6th CAPRI evaluation meeting. At last, I developed a realistic benchmark dataset PPI4DOCK, largest dataset so far, in order to improve docking methods for the scientific community.In terms of applications, I was involved in a variety of collaborative projects with different labs. As representative examples, I searched for binding partners of the histone chaperone Asf1; I studied the CENP-F/Nup133 interaction in the context of mitosis and the Exo70/Abi interaction related to cell mobility regulation; I also simulated the binding modes of multiple peptides, partners of Ku complex involved in DNA repair pathway.

L’Adénylate cyclase (CyaA), produite par B. pertussis, agent responsable de la coqueluche, est un des principaux facteurs de virulence de la bactérie. La toxine est une grande protéine multi-domaine qui est synthétisée comme un précurseur inactif, proCyaA. Ce précurseur est converti dans la forme active après une acylation spécifique. Après la sécrétion, la toxine envahir les cellules eucaryotes par un mécanisme unique qui implique la translocation de son domaine catalytique dans le cytosol des cellules eucaryotiques. Cette mécanisme est toujours pas clair et nombreuses questions restent ouvertes. Dans la présente étude, nous avons étudié les propriétés structurales et fonctionnelles des différentes espèces de (pro)CyaA en solution et inséré dans la membrane. Nous avons observé que le repliement de (pro)CyaA dans la forme monomérique dépend de la présence de calcium et de l'acylation post-traductionnelle. En outre, nous avons observé que la présence du calcium améliore fortement la stabilité de la protéine. De plus, nous avons identifié un segment hydrophobe dans CyaA, mais pas dans proCyaA, qui intervient dans les premières étapes du repliement de la protéine. L'analyse macroscopique a révélé que CyaA est plus stable et compacte par rapport à proCyaA. Nous avons aussi observé que les deux toxines sont capables de perméabiliser les membranes in vitro, mais que seulement la toxine monomérique et acyle est capable d'exercer des activités de membranes efficaces dans la cellule (hémolyse, translocation de AC et production de cAMP). Nous proposons que la toxine monomérique est la seul espèce compétent et fonctionnel. / Adenylate cyclase is one of the major virulence factors produced by Bordetella pertussis, the causative agent of whopping cough. The toxin is a huge multi-domain protein synthesized as an inactive precursor, proCyaA, which is converted into the active form upon a specific acylation. Once secreted across the bacterial cell envelope, the toxin invades eukaryotic cells through a unique mechanism that involves the direct translocation of its catalytic domain inside the cytosol of the target cells. This mechanism is still not clear and many questions remain open. In the present study we investigated the structural and functional properties of various (pro)CyaA species in solution and upon membrane-insertion. We found that the (re)folding of CyaA into a monomeric form critically depend upon the presence of calcium and the post-translational acylation. We observed that calcium binding strongly improves the stability of the protein. Moreover we identified a hydrophobic segment in CyaA, but not in proCyaA, which is involved in the early stages of the refolding process. Macroscopic analysis showed that CyaA is more stable and compact as compared to proCyaA. We also observed that both toxins are able to permeabilize membranes in vitro, although only the monomeric and acylated toxin is able to exert efficient membrane activities in cellula (i.e., hemolysis, AC translocation and cAMP production). We propose that the monomeric species is the functional competent and active state and that the acyl chains play not only a structural role but are also essential for the functional activities of the toxin.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

L'étude des interactions non-covalentes et des relations structure-fonction est à la base de la compréhension des systèmes biologiques. La MS supramoléculaire est une technique de choix pour l’étude des interactions protéine/protéine ou protéine/ligand. Dans le cadre d'études qualitatives ou quantitatives, pour chaque système étudié, les conditions expérimentales et les paramètres instrumentaux ont été optimisés pour conserver le complexe en phase gazeuse (1). L'objectif principal de ce travail est de caractériser le site nucléotidique de hPEBP1 et de contribuer à la découverte de molécules anti-métastases. Sur le plan fonctionnel, une activité enzymatique de hPEBP1 n'a pas pu être mise en évidence. Pour ce projet, une méthode MS de détermination de KD de complexes à faible affinité, plus précise et ne nécessitant par l'utilisation d'un ligand de référence a été développée (2). Une recherche des déterminants structuraux d'un ligand optimal de hPEBP1 a été réalisée par criblage de composés issus d’une synthèse raisonnée basée sur la structure des nucléotides FMN et GTP et par la détermination de leur KD (3). Les criblages ont montré que les critères structuraux indispensables pour la liaison sont la présence d’un groupement chargé ou donneur d’électrons, d’une structure apparentée à une base azotée et d’un cycle additionnel. Une part importante de l’affinité est liée au caractère hydrophobe du ligand. Certains ligands de synthèse ont montré une activité inhibitrice de l’invasion des lignées tumorales. / The study of noncovalent interactions and structure-function relationships provides the basis for the understanding of biological systems. Supramolecular MS is a favored technique to dissect protein/protein or protein/ligand interactions. In the context of qualitative or quantitative studies, experimental conditions and instrumental parameters have been optimized for each system to preserve the noncovalent complex in the gas-phase (1). The main objective of this work is to characterize the nucleotide site of hPEBP1 and to contribute to the discovery of antimetastatic molecules. Functionally, a catalytic activity for hPEBP1 could not be detected. For this project, an original MS method to more accurately determine KD for low-affinity complexes without a reference ligand was developed (2). Structural features of an optimal hPEBP1 ligand were determined by screening compounds based on FMN and GTP nucleotides in the context of a rational design approach, using KD determination to rank affinities (3). Screening highlighted that the essential structural requirements for binding hPEBP1 consist in a charged group or an electron donor, a structure related to a cyclic nitrogenous base and an additional cycle. A significant part of the affinity depends on the hydrophobic nature of the ligand. Some of the synthesized nucleotide analogs are active as inhibitors of invasion in tumor cell lines.