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This work investigates the encapsulation of organic light-emitting diodes (OLEDs) and organic solar cells (OSCs) in order to extend their lifetimes. Despite their unquestioned benefits, such as low material consumption and flexibility, their short lifetime span in ambient atmosphere is a clear disadvantage. For protection purposes, the devices are required to be encapsulated with permeation barriers. An appropriate barrier must have a water vapor transmission rate (WVTR) below 10^(-4) g(H2O) m^(-2) d^(-1) – below a monolayer of water permating through the barrier per day. Thus to design such barriers, a highly sensitive method for their evaluation is the primary requirement. Much fundamental research and setup development is thus performed in this work in order to improve the electrical calcium test to a sufficient level of sensitivity, reliability, and measurement capacity. The electrical calcium test uses a thin film of ignoble calcium and determines the amount of incoming water based on the decrease in its electrical conductance. In order to obtain highly precise results, this work identifies the reaction product (calcium hydroxide) and electrical resistivity of evaporated calcium films ((6.2 +- 0.1) 10^(-6-) Ohm cm). In contrast to a common assumption for the evaluation of calcium tests, calcium is found to corrode laterally inhomogeneous. However, it is shown theoretically and experimentally that this inhomogeneity does not distort the WVTR-measurement. Besides these fundamental investigations, calcium test design problems – as well as their solutions – are shown such as the damaging of an inorganic barrier film by an adjacent calcium sensor. As a result, a powerful and reliable measurement setup has been created. Subsequently, an investigation of a variety of barriers is presented, based on calcium tests, but also on device encapsulation and electroplating into defects: Permeation through evaporated aluminum thin films is found to occur mainly through macroscopic defects (radii > 0.4 μm) characterizable by optical inspection. Barriers made via atomic layer deposition (ALD) show improved performance with increasing layer thickness. Using ALD on foils provides excellent but, thus far, unreliable barriers. Permeation through bare polymer foils as well as sputtered zinc tin oxide (ZTO) increases roughly linear with increasing humidity and the measured WVTRs are highly comparable to reference values. The POLO barrier with a WVTR in the lower 10^(-4) g(H2O) m^(-2) d^(-1)-regime reaches the sensitivity limit of the current calcium test layout. In summary, in-depth investigations on permeation through different barriers are conducted here which reveal basic WVTR-dependencies from process- and climate parameters. Finally, water is identified as the predominant cause for device degradation, reducing the active area. For one type of both OLEDs and OSCs, the amount of water causing a 50% loss in active area (T50- water-uptake) is quantified via a comparative aging experiment involving calcium tests. Further for the case of the OSC, this T50-water-uptake of (20 +- 7) mg(H2O) m^(-2) is shown to be independent of climate conditions. As a result, the previously unspecific request for an aimed device lifetime can now be translated into a specific requirement for the permeation barrier: a water vapor transmission rate. Regarding the field of encapsulation, this work improves an essential measurement technique, characterizes a variety of permeation barriers, and investigates degradation of devices by ambient gases. The encapsulation field still poses several open questions. This work, however, strengthens the belief that organic devices will outlive them. / Diese Arbeit untersucht die Verkapselung organischer Leuchtdioden (OLEDs) und organischer Solarzellen (OSCs), um ihre Lebensdauer zu verlängern. Trotz unbestrittener Vorteile wie geringer Materialaufwand und mechanische Flexibilität stellt die kurze Lebensdauer dieser Bauteile an Luft einen deutlichen Nachteil dar. Um sie zu schützen, müssen sie mit Permeationsbarrieren verkapselt werden. Eine geeignete Barriere zeichnet sich durch eine Wasserpermeationsrate (WVTR) unterhalb von 10^(-4) g(H2O) m^(-2) d^(-1) aus – weniger als eine Monolage Wasser pro Tag. Folglich wird zur Entwicklung einer solchen Barriere primär eine äußerst empflindliche Methode zu ihrer Vermessung benötigt. Um für den elektrischen Calcium-Test ein hinreichendes Maß an Messgenauigkeit, Zuverlässigkeit und Probendurchsatz zu erzielen, werden in dieser Arbeit Grundlagenuntersuchungen sowie die Entwicklung des Messaufbaus umfassend behandelt. Der elektrische Calcium-Test bestimmt die Menge eindringenden Wassers anhand der Leitfähigkeitsabnahme einer dünnen Schicht Calcium – eines unedlen Metalls. Um eine hohe Genauigkeit zu erlangen, werden das Reaktionsprodukt (Calciumhydroxid) und der spezifische Widerstand ((6,2 +- 0,1) 10^(-6) Ohm cm) aufgedampfter Calcium-Filme bestimmt. Entgegen einer für die Auswertung von Calcium-Tests üblichen Annahme wird für Calcium ein lateral inhomogenes Korrosionsverhalten festgestellt. Allerdings kann theoretisch und experimentell nachgewiesen werden, dass hierdurch die WVTR-Messung nicht verfälscht wird. Neben diesen Grundlagenuntersuchungen werden Design-Probleme des Calcium-Tests und deren Lösung vorgestellt, z. B. die Schädigung der anorganischen Barriere durch direkten Kontakt mit dem Calcium-Sensor. Im Ergebnis ist damit ein ebenso leistungsstarker wie zuverlässiger Messaufbau entwickelt worden. Im nächsten Schritt wird die Untersuchung einer Vielzahl von Barrieren mithilfe von Calcium-Tests, aber auch Bauteil-Verkapselung und galvanischer Abscheidung in Defekten, vorgestellt: Die Permeation durch aufgedampfte Aluminium-Dünnfilme geschieht demnach im Wesentlichen durch Makro-Defekte (Radien > 0,4 μm), die einer optischen Charakterisierung zugänglich sind. Barrieren, die durch Atomlagenabscheidung (ALD) hergestellt werden, verbessern sich mit steigender Schichtdicke, wobei solche Schichten auf Folien ausgezeichnete – aber bisher unzuverlässige – Permeationsbarrieren darstellen. Sowohl für einfache Polymerfolien als auch für gesputterte Zink-Zinn-Oxid-Barrieren (ZTO) werden zum einen gute Übereinstimmungen der gemessenen WVTR mit Vergleichswerten erzielt, zum anderen wächst in beiden Fällen die WVTR grob linear mit der anliegenden Luftfeuchte. Die POLO-Barriere mit einer WVTR im unteren 10^(-4) g(H2O) m^(-2) d^(-1)-Bereich erreicht die Messgrenze des aktuellen Messaufbaus. Kurzgesagt, es werden tiefgehende Untersuchungen zur Permeation durch verschiedene Barrieren durchgeführt, die grundlegende Zusammenhänge zwischen WVTR und Prozess-/Klimabedingungen beleuchten. Schließlich wird Wasser, das die aktive Fläche reduziert, als die vorrangige Degradationsursache identifiziert. Für je eine Sorte OLEDs und OSCs wird mittels eines vergleichenden (gegenüber Calcium-Tests) Alterungsexperiments dieWassermenge bestimmt, die die aktive Fläche um 50% verringert (T50-Wasser-Aufnahme). Für die OSC wird zudem gezeigt, dass die T50-Wasser-Aufnahme von (20 +- 7) mg(H2O) m^(-2) unabhängig von den Klimabedingungen ist. Folglich kann die zuvor unspezifische Forderung nach einer angestrebten Lebensdauer nun in eine konkrete Anforderung an die Barriere übersetzt werden: eine Wasserpermeationsrate. Mit Blick auf das Feld der Verkapselung verbessert diese Arbeit eine wichtige Messmethode, charakterisiert eine Vielzahl an Permeationsbarrieren und untersucht die Bauteilalterung durch Lufteinwirkung. Auch wenn das das Forschungsfeld der Verkapselungen nach wie vor eine Reihe offener Fragen aufweist, so bestärkt diese Arbeit doch in der Hoffnung, dass die organischen Bauteile selbige überdauern werden.

This thesis deals with a newly-developed model for the spatiotemporal calcium dynamics within presynaptic terminals. The model is based on single-protein kinetics and has been used to successfully describe different neuron types such as pyramidal neurons in the rat neocortex and the Calyx of Held of neurons from the rat brainstem. A limited number of parameters had to be adjusted to fluorescence measurements of the calcium concentration. These values can be interpreted as a prediction of the model, and in particular the protein densities can be compared to independent experiments. The contribution of single proteins to the total calcium dynamics has been analysed in detail for voltage-dependent calcium channel, plasma-membrane calcium ATPase, sodium-calcium exchanger, and endogenous as well as exogenous buffer proteins. The model can be used to reconstruct the unperturbed calcium dynamics from measurements using fluorescence indicators. The calcium response to different stimuli has been investigated in view of its relevance for synaptic plasticity. This work provides a first step towards a description of the complete synaptic transmission using single-protein data.

Ziel der Arbeit war eine Steigerung der Wasseraufnahme und Harndilution durch Supplementierung von Natriumchlorid (NaCl) oder pH-Wert-Senkung durch Zugabe von Ammoniumchlorid (NH4Cl) zur Reduktion des Harnsteinbildungspotenzials. Durch die NaCl-Zulage wurde die Harnmenge signifikant gesteigert und das spezifische Gewicht des Harns gesenkt. Eine NaCl-Gabe stellt somit einen möglichen ergänzenden therapeutischen Ansatz für eine vermehrte Ausscheidung von Kristallen dar. Eine Ansäuerung des Harns durch Zulage von NH4Cl ließ sich nicht erreichen.

This work investigates the encapsulation of organic light-emitting diodes (OLEDs) and organic solar cells (OSCs) in order to extend their lifetimes. Despite their unquestioned benefits, such as low material consumption and flexibility, their short lifetime span in ambient atmosphere is a clear disadvantage. For protection purposes, the devices are required to be encapsulated with permeation barriers. An appropriate barrier must have a water vapor transmission rate (WVTR) below 10^(-4) g(H2O) m^(-2) d^(-1) – below a monolayer of water permating through the barrier per day. Thus to design such barriers, a highly sensitive method for their evaluation is the primary requirement. Much fundamental research and setup development is thus performed in this work in order to improve the electrical calcium test to a sufficient level of sensitivity, reliability, and measurement capacity. The electrical calcium test uses a thin film of ignoble calcium and determines the amount of incoming water based on the decrease in its electrical conductance. In order to obtain highly precise results, this work identifies the reaction product (calcium hydroxide) and electrical resistivity of evaporated calcium films ((6.2 +- 0.1) 10^(-6-) Ohm cm). In contrast to a common assumption for the evaluation of calcium tests, calcium is found to corrode laterally inhomogeneous. However, it is shown theoretically and experimentally that this inhomogeneity does not distort the WVTR-measurement. Besides these fundamental investigations, calcium test design problems – as well as their solutions – are shown such as the damaging of an inorganic barrier film by an adjacent calcium sensor. As a result, a powerful and reliable measurement setup has been created. Subsequently, an investigation of a variety of barriers is presented, based on calcium tests, but also on device encapsulation and electroplating into defects: Permeation through evaporated aluminum thin films is found to occur mainly through macroscopic defects (radii > 0.4 μm) characterizable by optical inspection. Barriers made via atomic layer deposition (ALD) show improved performance with increasing layer thickness. Using ALD on foils provides excellent but, thus far, unreliable barriers. Permeation through bare polymer foils as well as sputtered zinc tin oxide (ZTO) increases roughly linear with increasing humidity and the measured WVTRs are highly comparable to reference values. The POLO barrier with a WVTR in the lower 10^(-4) g(H2O) m^(-2) d^(-1)-regime reaches the sensitivity limit of the current calcium test layout. In summary, in-depth investigations on permeation through different barriers are conducted here which reveal basic WVTR-dependencies from process- and climate parameters. Finally, water is identified as the predominant cause for device degradation, reducing the active area. For one type of both OLEDs and OSCs, the amount of water causing a 50% loss in active area (T50- water-uptake) is quantified via a comparative aging experiment involving calcium tests. Further for the case of the OSC, this T50-water-uptake of (20 +- 7) mg(H2O) m^(-2) is shown to be independent of climate conditions. As a result, the previously unspecific request for an aimed device lifetime can now be translated into a specific requirement for the permeation barrier: a water vapor transmission rate. Regarding the field of encapsulation, this work improves an essential measurement technique, characterizes a variety of permeation barriers, and investigates degradation of devices by ambient gases. The encapsulation field still poses several open questions. This work, however, strengthens the belief that organic devices will outlive them.:1 Introduction 2 Fundamentals 2.1 Organic Semiconductors 2.2 Organic Solar Cells 2.3 Organic Light-Emitting Diodes 2.4 Humidity, Evaporation, and Condensation 2.5 Principles of Permeation 3 State of the Art in Barrier Production and Evaluation 3.1 Barrier Technologies 3.2 Permeation Measurement Techniques 4 Experimental 4.1 Description of the As-Delivered Substrates 4.2 Treatment of Substrates 4.3 Deposition of Calcium Tests and Devices by Thermal Evaporation 4.4 Permeation Barriers by Atomic Layer Deposition 4.5 Defect Evaluation by Electrodeposition 5 Calcium for Permeation Tests Properties and Corrosion Behavior 5.1 Electrical Conductance and Optical Transmission 5.2 Corrosion Product 5.3 Laterally Inhomogeneous Calcium Corrosion 5.4 Implications for Optical and Electrical Calcium Corrosion Tests 6 Electrical Calcium Test 6.1 Measurement Setup 6.2 Calcium Test Layout 6.3 Comparability with Other Methods – OE-A Round Robin 6.4 Limitations and Future Prospects of the Electrical Calcium Test 6.5 Setup and Layout – Conclusions 7 Barrier Investigation 7.1 Thermally Evaporated Aluminum as Thin Film Encapsulation 7.2 ZnSnO (Magnetron Sputtered) on Polymer Foil 7.3 Al2O3 (ALD) on Polymer Substrate and as Thin Film Encapsulation 7.4 Summary and Conclusions for the Investigated Barriers 8 Encapsulation and Lifetime of Devices 8.1 Phenomenology of Device Degradation in Ambient Atmosphere 8.2 OLED Degradation Investigated by Calcium Tests 8.3 OSC Degradation Investigated by Calcium Tests 8.4 Discussion 8.5 Conclusions 9 Conclusions and Future Prospects Bibliography Acknowledgements Statement of Authorship / Diese Arbeit untersucht die Verkapselung organischer Leuchtdioden (OLEDs) und organischer Solarzellen (OSCs), um ihre Lebensdauer zu verlängern. Trotz unbestrittener Vorteile wie geringer Materialaufwand und mechanische Flexibilität stellt die kurze Lebensdauer dieser Bauteile an Luft einen deutlichen Nachteil dar. Um sie zu schützen, müssen sie mit Permeationsbarrieren verkapselt werden. Eine geeignete Barriere zeichnet sich durch eine Wasserpermeationsrate (WVTR) unterhalb von 10^(-4) g(H2O) m^(-2) d^(-1) aus – weniger als eine Monolage Wasser pro Tag. Folglich wird zur Entwicklung einer solchen Barriere primär eine äußerst empflindliche Methode zu ihrer Vermessung benötigt. Um für den elektrischen Calcium-Test ein hinreichendes Maß an Messgenauigkeit, Zuverlässigkeit und Probendurchsatz zu erzielen, werden in dieser Arbeit Grundlagenuntersuchungen sowie die Entwicklung des Messaufbaus umfassend behandelt. Der elektrische Calcium-Test bestimmt die Menge eindringenden Wassers anhand der Leitfähigkeitsabnahme einer dünnen Schicht Calcium – eines unedlen Metalls. Um eine hohe Genauigkeit zu erlangen, werden das Reaktionsprodukt (Calciumhydroxid) und der spezifische Widerstand ((6,2 +- 0,1) 10^(-6) Ohm cm) aufgedampfter Calcium-Filme bestimmt. Entgegen einer für die Auswertung von Calcium-Tests üblichen Annahme wird für Calcium ein lateral inhomogenes Korrosionsverhalten festgestellt. Allerdings kann theoretisch und experimentell nachgewiesen werden, dass hierdurch die WVTR-Messung nicht verfälscht wird. Neben diesen Grundlagenuntersuchungen werden Design-Probleme des Calcium-Tests und deren Lösung vorgestellt, z. B. die Schädigung der anorganischen Barriere durch direkten Kontakt mit dem Calcium-Sensor. Im Ergebnis ist damit ein ebenso leistungsstarker wie zuverlässiger Messaufbau entwickelt worden. Im nächsten Schritt wird die Untersuchung einer Vielzahl von Barrieren mithilfe von Calcium-Tests, aber auch Bauteil-Verkapselung und galvanischer Abscheidung in Defekten, vorgestellt: Die Permeation durch aufgedampfte Aluminium-Dünnfilme geschieht demnach im Wesentlichen durch Makro-Defekte (Radien > 0,4 μm), die einer optischen Charakterisierung zugänglich sind. Barrieren, die durch Atomlagenabscheidung (ALD) hergestellt werden, verbessern sich mit steigender Schichtdicke, wobei solche Schichten auf Folien ausgezeichnete – aber bisher unzuverlässige – Permeationsbarrieren darstellen. Sowohl für einfache Polymerfolien als auch für gesputterte Zink-Zinn-Oxid-Barrieren (ZTO) werden zum einen gute Übereinstimmungen der gemessenen WVTR mit Vergleichswerten erzielt, zum anderen wächst in beiden Fällen die WVTR grob linear mit der anliegenden Luftfeuchte. Die POLO-Barriere mit einer WVTR im unteren 10^(-4) g(H2O) m^(-2) d^(-1)-Bereich erreicht die Messgrenze des aktuellen Messaufbaus. Kurzgesagt, es werden tiefgehende Untersuchungen zur Permeation durch verschiedene Barrieren durchgeführt, die grundlegende Zusammenhänge zwischen WVTR und Prozess-/Klimabedingungen beleuchten. Schließlich wird Wasser, das die aktive Fläche reduziert, als die vorrangige Degradationsursache identifiziert. Für je eine Sorte OLEDs und OSCs wird mittels eines vergleichenden (gegenüber Calcium-Tests) Alterungsexperiments dieWassermenge bestimmt, die die aktive Fläche um 50% verringert (T50-Wasser-Aufnahme). Für die OSC wird zudem gezeigt, dass die T50-Wasser-Aufnahme von (20 +- 7) mg(H2O) m^(-2) unabhängig von den Klimabedingungen ist. Folglich kann die zuvor unspezifische Forderung nach einer angestrebten Lebensdauer nun in eine konkrete Anforderung an die Barriere übersetzt werden: eine Wasserpermeationsrate. Mit Blick auf das Feld der Verkapselung verbessert diese Arbeit eine wichtige Messmethode, charakterisiert eine Vielzahl an Permeationsbarrieren und untersucht die Bauteilalterung durch Lufteinwirkung. Auch wenn das das Forschungsfeld der Verkapselungen nach wie vor eine Reihe offener Fragen aufweist, so bestärkt diese Arbeit doch in der Hoffnung, dass die organischen Bauteile selbige überdauern werden.:1 Introduction 2 Fundamentals 2.1 Organic Semiconductors 2.2 Organic Solar Cells 2.3 Organic Light-Emitting Diodes 2.4 Humidity, Evaporation, and Condensation 2.5 Principles of Permeation 3 State of the Art in Barrier Production and Evaluation 3.1 Barrier Technologies 3.2 Permeation Measurement Techniques 4 Experimental 4.1 Description of the As-Delivered Substrates 4.2 Treatment of Substrates 4.3 Deposition of Calcium Tests and Devices by Thermal Evaporation 4.4 Permeation Barriers by Atomic Layer Deposition 4.5 Defect Evaluation by Electrodeposition 5 Calcium for Permeation Tests Properties and Corrosion Behavior 5.1 Electrical Conductance and Optical Transmission 5.2 Corrosion Product 5.3 Laterally Inhomogeneous Calcium Corrosion 5.4 Implications for Optical and Electrical Calcium Corrosion Tests 6 Electrical Calcium Test 6.1 Measurement Setup 6.2 Calcium Test Layout 6.3 Comparability with Other Methods – OE-A Round Robin 6.4 Limitations and Future Prospects of the Electrical Calcium Test 6.5 Setup and Layout – Conclusions 7 Barrier Investigation 7.1 Thermally Evaporated Aluminum as Thin Film Encapsulation 7.2 ZnSnO (Magnetron Sputtered) on Polymer Foil 7.3 Al2O3 (ALD) on Polymer Substrate and as Thin Film Encapsulation 7.4 Summary and Conclusions for the Investigated Barriers 8 Encapsulation and Lifetime of Devices 8.1 Phenomenology of Device Degradation in Ambient Atmosphere 8.2 OLED Degradation Investigated by Calcium Tests 8.3 OSC Degradation Investigated by Calcium Tests 8.4 Discussion 8.5 Conclusions 9 Conclusions and Future Prospects Bibliography Acknowledgements Statement of Authorship

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Die Informationsverarbeitung im Nervensystem basiert auf der Signalübertragung an chemischen Synapsen. Um diese bei hochfrequenter Aktivität aufrecht erhalten zu können, ist das Nachfüllen von Neurotransmitter-gefüllten Vesikeln an die präsynaptische Membran von zentraler Bedeutung. Die glutamatergen Parallelfaser-Purkinjezelle-Synapsen (PF-PC-Synapsen) des Zerebellums weisen eine ausgeprägte und anhaltende Kurzzeitbahnung für bis zu 30 Aktionspotentiale (APs) bei hochfrequenter Aktivität auf, obwohl anfänglich nur eine vergleichsweise geringe Anzahl synaptischer Vesikel (~ 3) an der aktiven Zone gedockt ist. Dies wird durch ultra-schnelles Nachfüllen (Recruitment) im Millisekundenbereich ermöglicht, welches sogar zu einer Vergrößerung des Pools gedockter und freisetzungsbereiter Vesikel (Readily releasable pool, RRP) führt (Overfilling, Überfüllen). Es gibt Evidenz dafür, dass dieser Prozess mindestens teilweise Kalzium(Ca2+)-abhängig ist. Durch welche Kanäle das hierfür bereitgestellte Ca2+ in die Präsynapse gelangt, war bislang unklar. An PF-PC-Synapsen sind drei Subtypen spannungsabhängiger Ca2+-Kanäle (Cavs) vorhanden: Cav2.1 (P/Q Typ), Cav2.2 (N Typ) und Cav2.3 (R Typ). Diese stellen in jungen Mäusen (P8-10) gemeinsam das Ca2+ für die Freisetzung der Transmitter-Vesikel zur Verfügung. Während der Entwicklung verringert sich die Kopplungsdistanz zwischen Cav2.1-Kanälen und Ca2+-Sensor, sodass bei reiferen Tieren (P21–24) allein der Ca2+-Einstrom durch eng gekoppelte Cav2.1 zur Vesikelfreisetzung führt. Cav2.2 und Cav2.3 sind jedoch weiterhin an der Präsynapse vorhanden und tragen zum Aktionspotential(AP)-vermittelten Ca2+-Einstrom bei. Die Funktion dieser Kanäle in reiferen Tieren blieb bisher weitgehend ungeklärt. Vorliegend wurden folgende Hypothesen überprüft: 1. Ca2+-Einstrom durch Cav2.2 oder Cav2.3 ist für spontane, nicht AP-vermittelte Vesikelfreisetzung verantwortlich. 2. Ca2+-Einstrom durch Cav2.2 oder Cav2.3 stellt Ca2+ für ultra-schnelles Nachfüllen mit Überfüllen bereit. Um diese Hypothesen zu prüfen, wurden Whole-Cell Patch-Clamp Messungen an Purkinjezellen in akuten Hirnschnitten reifer (P21–24) C57BL/6 Mäuse durchgeführt und die Parallelfasern (PFs) extrazellulär in der Molekularschicht stimuliert. Zunächst wurde die Hypothese geprüft, ob Cav2.2 und Cav2.3 an der Ca2+-Bereitstellung für spontane Vesikelfreisetzung beteiligt sind. Dazu wurden sogenannte miniature excitatory postsynaptic currents (Miniatur-EPSCs, mEPSCs) der Purkinjezellen aufgezeichnet. Bei Erhöhung der extrazellulären Ca2+-Konzentration von 2 mM auf 5 mM zeigte sich eine deutliche Steigerung der mEPSC-Frequenz, was die Annahme stützt, dass die spontane Vesikelfreisetzung eine Ca2+-abhängige Komponente hat. Um Rückschlüsse auf die Beteiligung der Cav-Subtypen ziehen zu können, wurden Cav2 Subtyp-spezifische Toxinblocker eingesetzt. Ω-Agatoxin-IVA wurde zur Blockierung von Cav2.1 eingesetzt. Cav2.2 wurde mit Ω-Conotoxin GVIA und Cav2.3 mit SNX-482 blockiert. Unter dem Einfluss dieser Toxine konnte weder einzeln noch in Kombination ein Effekt auf die Frequenz der mEPSCs beobachtet werden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Funktion dieser Cav2s nicht die Ca2+-Bereitstellung für spontane Vesikelfreisetzung ist. Anschließend wurde der Einfluss der Blockade der Cav2 Subtypen auf das Vesikel-Nachfüllen untersucht. Dazu wurden Parallelfasern zunächst fünf Mal bei einer Frequenz von 20 Hz extrazellulär stimuliert und die hervorgerufenen EPSCs aufgezeichnet. Hieraus wurde das Verhältnis aus den Amplituden des zweiten bis fünften EPSCs zur Amplitude des ersten EPSCs berechnet (Ai/A1). Diese Paarpulsverhältnisse sollten sich bei einem durch Cav2-Blocker beeinträchtigtem Vesikel-Nachfüllen verkleinern. Ein solcher Effekt war jedoch bei dieser kurzen Aktivierung mit 5 Stimuli nicht zu beobachten. Da die in-vivo-Aktivität an der PF-PC-Synapse aus längeren, hochfrequenten Trains besteht und sie in der Lage ist, auch bei länger anhaltender Stimulation zu bahnen, wurde ein weiteres Experiment mit Trains aus 50 Stimuli durchgeführt. Hierbei sollte während oder zumindest gegen Ende des Trains ein Gleichgewicht aus Freisetzung und Nachfüllen (Steady State) erreicht werden. Dazu war es erforderlich, die extrazelluläre Ca2+-Konzentration auf 6 mM zu erhöhen. Die aufgezeichneten EPSC-Amplituden wurden in einem kumulativen Plot aufgetragen und mit einer Methode nach Schneggenburger et al. ausgewertet. Dabei wird der Gleichgewichtsbereich mit einer linearen Funktion gefittet, deren Anstieg ein Maß für die Nachladerate und deren y-Achsenabschnitt ein Maß für das Dekrement des RRP ist. Durch spezifische Blockade einzelner Cav-Subtypen kann man Aussagen über deren Einfluss auf Vesikel-Nachfüllen und RRP treffen. Unter Hinzugabe von Ω Agatoxin IVA konnte, wie erwartet, eine starke Reduktion bereits bei der ersten EPSC-Amplitude beobachtet werden, da der Ca2+-Einstrom durch Cav2.1 entscheidend für die Freisetzungswahrscheinlichkeit der Vesikel (pv) ist. Hierdurch erklärt sich die beobachtete Abnahme des RRP-Dekrements. Der Anstieg der Geraden im Gleichgewichtszustand zeigte sich durch Ω-Agatoxin-IVA nicht signifikant verändert. Allerdings könnte ein möglicher Effekt durch die starke Reduktion der pv maskiert sein. Daher wurde in einem weiteren Versuch eine reduzierte Dosis (100 nM statt 250 nM) Ω Agatoxin-IVA eingesetzt. Hier zeigte sich neben dem Effekt auf das RRP-Dekrement außerdem ein vermindertes Nachfüllen der Vesikel. Dieser Effekt wurde bei voller Dosis vermutlich maskiert und weist darauf hin, dass Ca2+-Einstrom durch Cav2.1 zur Aufrechterhaltung des Vesikel-Nachfüllens beiträgt. Bei Blockade von Cav2.3 mit SNX-482 konnte kein signifikanter Einfluss auf Vesikel-Nachfüllen oder RRP festgestellt werden. Unter dem Einfluss des Cav2.2-Blockers Ω-Conotoxin GVIA zeigte sich ein interessanter Effekt: Die Nachladerate wurde durch die Toxinapplikation selektiv reduziert. Hieraus lässt sich schlussfolgern, dass die Bereitstellung von Ca2+ für das Vesikel-Nachfüllen eine Funktion des Cav2.2 an dieser Synapse darstellt. Das RRP-Dekrement blieb davon unbeeinflusst, was zu dem beschriebenen Befund passt, nach dem Cav2.2s in diesem Alter nicht an der Vesikelfreisetzung beteiligt sind. Unter Cav2.1-Block dagegen, blieben die EPSC-Amplituden am Ende verhältnismäßig unbeeinflusst, während die ersten stark reduziert waren. Dieser Befund passt zu der Annahme, dass Ω-Agatoxin-IVA pv stark verringert, während das Nachfüllen über den erhaltenen Ca2+-Einstrom durch Cav2.2 weiterläuft. Anhand unserer Daten ist allerdings nicht auszuschließen, dass ein Unterschied zwischen früh und spät im Train rekrutierten Vesikeln hinsichtlich deren Kopplung an Cav2.1 oder Cav2.2 besteht. Im Anschluss an die Trains mit 50 Stimuli wurde eine Erholungsphase aufgezeichnet. Hierbei wurde mit konsekutiv steigenden Interstimulus-Intervallen die Regeneration der EPSC-Amplituden bis etwa auf das Ausgangsniveau aufgezeichnet. Der Zeitverlauf der Erholung wurde mittels biexponentieller Funktionen gefittet. Bei der Applikation von Ω Agatoxin-IVA zeigte sich der Gleichgewichtszustand ohne Depression, während er unter Ω Conotoxin GVIA und SNX-482 eine deutliche Depression aufwies. Ω-Agatoxin-IVA führte zu einer signifikant beschleunigten Erholung. Dieser Effekt resultiert aber am ehesten aus der starken Reduktion von pv und der fehlenden Depression. Sowohl der Zeitverlauf der Erholung als auch die EPSC-Amplituden während der kurzen Aktivierung mit 5 Stimuli waren unbeeinflusst von Cav2.2- und Cav2.3-Block. Gemeinsam spricht dies für das Vorhandensein eines basalen Nachfüllens, welches zusätzlich zum Ca2+-abhängigen Nachfüllen mit Einstrom durch Cav2.1 und Cav2.2 stattfindet. Das Ziel der Studie bestand darin, die Funktion der Cav2.2- und Cav2.3-Kanäle im präsynaptischen Bouton der reifen Parallelfaser zu erforschen. Obwohl spontane Vesikelfreisetzung zumindest teilweise Ca2+-abhängig zu sein scheint, war keiner der untersuchten Cav2-Kanäle bedeutsam beteiligt. Bei Cav2.3 konnte des Weiteren keine Relevanz für das Nachfüllen festgestellt werden. Für Cav2.2-Kanäle konnte jedoch die Funktion als Ca2+-Bereitsteller für das Nachfüllen bei anhaltender synaptischer Transmission identifiziert werden. Zusammenfassend bestätigen unsere Daten den maßgeblichen Einfluss von Cav2.1 auf pv und zeigen eine wichtige Funktion von Cav2.2: die Erhaltung der synaptischen Effektivität unter anhaltender, hochfrequenter Aktivität an der Parallelfaser. Es bleibt die Frage offen, inwiefern diese Befunde auch für andere kleine glutamaterge Synapsen, beispielsweise im Neocortex, zutreffen. Auch dort konnte der entwicklungsbedingte Wechsel von gemeinsamer Steuerung der Vesikelfreisetzung durch Cav2.1 und Cav2.2 zu alleiniger Steuerung durch Cav2.1 beobachtet werden. Gleichzeitig bleibt auch hier die Ca2+-Signalgebung durch Cav2.2 erhalten.:Einleitung 1 Aufbau und Funktion chemischer Synapsen 1 Kurzzeitbahnung und Vesikel-Nachfüllen 2 Parallelfaser-Purkinjezelle-Synapse als Modellsystem 4 Experimenteller Aufbau und Auswertungsmethoden 7 Publikation 9 Zusammenfassung 24 Literaturverzeichnis 28 Darstellung des eigenen Beitrags 31 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 32 Lebenslauf 33 Danksagung 34

Die Basis für den therapeutischen Einsatz elektrischer Felder bei der Behandlung von Knochenbrüchen liegt in der Existenz von belastungsabhängigen elektrischen Potentialen im Knochen. Die zellulären Wirkungsmechanismen sind jedoch unverstanden. Um zu untersuchen, ob und wie elektrische Felder Wachstum und Differenzierung von Knochenzellen beeinflussen, wurden humane Osteosarcomazellen (HOS TE85) und aus Minischweinen isolierte primäre Osteoblasten mit elektrischen Feldern im Frequenzbereich von 0.1 Hz bis 100 kHz befeldet und verschiedene zelluläre Parameter zeitabhängig gemessen. Das elektrische Feld wurde mittels platinierten Platinelektroden appliziert, um ausreichend hohe Feldstärken bei gleichzeitig guter Kontrolle über die im Gewebe erzeugte Wellenform zu gewährleisten. Beim Einsatz von Elektroden müssen jedoch elektrochemische Reaktionen an der Elektrodenoberfläche berücksichtigt werden. Daher wurden verschiedene Elektroden für die in vivo- und in vitro-Stimulation mit elektrischen und numerischen Methoden untersucht und verglichen. Das führte einerseits zur Erarbeitung verschiedener Kriterien zur Auswahl geeigneter Elektrodenmaterialien und -geometrien. Andererseits konnten detaillierte Angaben zur effektiven Feldstärke und Feldverlauf in der Zellebene sowie zu elektrochemisch bedingten Nebenwirkungen gemacht werden. Es konnte gezeigt werden, dass elektrische Felder das Signalsystem und den Stoffwechsel von Knochenzellen im gesamten untersuchten Frequenzbereich beeinflussen. Die Richtung des Nettoeffekts war jedoch im oberen und im unteren Frequenzbereich unterschiedlich. Im Frequenzbereich über 1 kHz fanden wir immer eine Erhöhung des Wachstums und der Konzentration der "second messenger" und eine Herabsetzung der Konzentration der reaktiven Sauerstoffverbindungen (ROS). Bei Frequenzen unter 1 kHz wurde dagegen eine Erhöhung der Aktivität der alkalischen Phosphatase und des oxidativen Stress beobachtet. Signifikante Effekte traten jedoch nur bei Feldstärken oberhalb 100 V/m auf. Hinweise auf bevorzugte Frequenzen oder Wellenformen, die für "Fenstereffekte" sprechen würden, konnten nicht gefunden werden. Da alle zellulären Parameter an einem einheitlichen System gemessen wurden, ließen sich die Ergebnisse in ein Modell der feldinduzierten Signaltransduktion integrieren. Prinzipiell muss man von einem gemeinsamen Effekt mehrerer Signalwege ausgehen. Dabei kann die Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration als ein genereller Mechanismus der Feldwirkung angesehen werden. Dafür sind sowohl der Influx als auch die Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern verantwortlich. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass auch cGMP und Prostaglandin E2, jedoch nicht cAMP an der Vermittlung der Feldwirkung beteiligt ist. Außerdem wurde die Translokation der mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) beeinflusst. Trotzdem sind die beobachteten Effekte relativ schwach im Vergleich zu publizierten klinischen Erfolgen. Es muss daher in vivo Verstärkungsmechanismen geben, die durch Untersuchungen an Zellkulturen nicht erfasst werden können. / The therapeutic use of electric fields in the treatment bone fracture healing is based on the existence of different load dependent electric potentials in bone. However, the cellular mechanisms of field action are still not understood. We investigated the effect of electric fields on proliferation and differentiation of human osteosarcoma cells (HOS TE85) and primary osteoblasts isolated from mini pigs. The cells were exposed to electric fields (0.1 Hz - 100 kHz) and various cellular parameters were measured. The field was applied using platinized platinum electrodes ensuring sufficiently strong electric fields and a well controlled wave form in the tissue. Nevertheless, in this case electrochemical reactions which occur at the electrode surface have to be taken into account. That’s why various electrodes for in vivo and in vitro stimulation are characterized by electrical and numerical methods leading not only to criteria for choosing electrode materials and geometries, but also providing detailed knowledge about the electric field induced in the tissue and electrochemically induced side effects. We found that cellular signaling as well as proliferation and differentiation of bone cells are influenced by electric fields in the whole investigated frequency range. Proliferation and the second messenger concentrations are increased at frequencies above 1 kHz, whereas below 1 kHz the alkaline phosphatase activity is increased. Significant effects were found only for electric fields above 100 V/m, but we could not find any hints on preferred frequencies or wave forms ruling out "window effects". Because all cellular parameters were measured within one experimental system, the results can be summarized in a signal transduction model for the action of electric fields. Generally, a common action of multiple signaling pathways has to be assumed. The increase of the intracellular calcium concentration can be considered as a general mechanism of field action. This increase is caused by calcium release from intracellular calcium stores as well as influx of extracellular calcium. Additionally, the concentration of cGMP and prostaglandin E2, but not that of cAMP is increased by the electric field. Furthermore, the translocation of the mitogen activated protein kinase (MAPK) is influenced. Nevertheless, the field effects found are weak compared to those published in clinical studies. We suppose that there are amplifying mechanisms in vivo which could not be seen during in vitro investigations.

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