La régulation de l'homéostasie intestinale est de la plus haute importance en raison de la constante exposition de l'intestin aux antigènes alimentaires et à la flore commensale. La perturbation de la flore intestinale est souvent associée à diverses maladies telles que l'allergie, l'obésité et certaines maladies inflammatoires. La plupart des individus sont tolérant aux antigènes alimentaires et ne développe pas de réponse immunitaire sauf en cas de prédisposition génétique ou d'exposition à un environnement défavorable. La réponse allergique se caractérise par la production d'IgE stimulé par les lymphocytes Th2. Les symptômes allergiques sont très variés et affectent plusieurs parties de l'organisme. La plupart des travaux de recherche se sont focalisé jusqu'à présent sur le rôle des cellules de l'immunité adaptative dans le développement de l'allergie en sous-estimant le rôle majeur des cellules épithéliales et des cellules de l'immunité innée. L'objectif de ce projet est de comprendre comment les cellules épithéliales intestinales modulent la réponse immunitaire à distance vers la muqueuse pulmonaire ou la peau après stimulation allergique. L'ingestion de l'antigène associé à l'adjuvant de la toxine cholérique permet d'étudier la réponse allergique chez l'animal. Nous avons démontré sur ce modèle animal que l'absence de la kinase inhibitrice IKKb dans la voie de signalisation du facteur de transcription NF-kB altère la composition de la flore intestinal d'une part et transforme la réponse immunitaire inflammatoire au niveau pulmonaire et de la peau grâce à la présence d'IgA et de lymphocyte Th17 d'autre part. En adéquation avec les observations cliniques rapportées chez les patients allergiques (allergies alimentaires, asthme, dermatite atopique), nos résultats identifient IKKb dans la cellule épithéliale intestinale comme cible potentielle pour traiter les allergies alimentaires. De futurs efforts devront être faits pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques qui considèrent la muqueuse intestinale, la production d'IgA et l'importance des bactéries commensales dans le traitement des allergies. / Immune homeostasis is of paramount importance in the gastrointestinal tract, which is constantly exposed to ingested antigens and commensal microbiota. The gut microbiota can be perturbed by endogenous or exogenous factors and it is now established that microbial dysbiosis is associated with allergy, obesity, and inflammatory diseases. Ingestion of food antigens generally fails to promote brisk immune responses but rather results in a state of immune tolerance. However, aberrant immune responses can develop in individuals with a genetic predisposition. Food allergies are generally regarded as pathologic responses to food antigens mediated by excessive Th2 responses and antigen-specific IgE antibody responses. Clinical manifestations of food allergies are very broad and symptoms can affect different organs. While past research on allergy focused on the role of cells and molecules involved in adaptive immunity, epithelial cells lining the sites of antigen entry and innate immune responses have recently emerged as important players in allergy. This project was undertaken to understand the mechanisms employed by intestinal epithelial cells (IECs) to shape immune responses to allergens and influence allergic manifestations in distant mucosal sites such as the airways or the skin. Oral administration of food antigen with cholera toxin as adjuvant in experimental animals is a well-accepted model to study allergic sensitization to food antigens. Using this model, we show that a localized impairment of the canonical NF-κB pathway through deletion of IkB kinase (IKKβ) in IECs alters the gut microbiota during oral allergic sensitization and regulates the magnitude of allergic inflammatory responses at distant sites of the airway and the skin through enhancement of IgA Abs and Th17 responses. Consistent with the clinical observations linking atopic diseases (food allergy, allergic asthma, atopic dermatitis), our results identify IKKβ in IECs as a potential therapeutic target for treatment of food allergies and subsequent disease. They also suggest that future efforts for controlling allergic responses in the airways and the skin could include strategies that use the gut microbiota and promote IgA Ab responses and prevent IL-17 responses.

A hipóxia tecidual tem sido apontada como importante fator na patogênese da Doença Renal Crônica (DRC). No entanto, faltam evidências diretas de que a exposição prolongada à hipóxia tecidual inicie ou agrave a DRC. Nós testamos essa hipótese expondo cronicamente ratos normais e ratos com nefrectomia de 5/6 (Nx) à hipóxia. Além disso, investigamos se tal efeito da hipóxia envolveria a ativação da imunidade inata. Ratos Munich-Wistar machos adultos foram submetidos a Nx (n = 54) ou cirurgia simulada (Sham, n = 52). Vinte e seis ratos sham (S+nor) e 26 Nx (Nx+nor) permaneceram em normóxia, enquanto 26 ratos sham (S+hip) e 28 Nx (Nx+hip) foram mantidos em uma câmara de hipóxia normobárica (12% O2) por 8 semanas. Confirmamos a existência de hipóxia tecidual por imuno-histoquímica para Pimonidazol (Hypoxyprobe tm). A hipóxia foi confinada à área medular em S+nor e expandiu-se à área cortical em S+hip. A hipóxia não promoveu lesão renal nem elevação do conteúdo de IL-1beta ou TLR-4 em Sham. Em Nx, a hipóxia se estendeu para a área cortical, um processo que foi intensificado em Nx+hip, mas, inesperadamente, atenuou a hipertensão, a ativação da imunidade inata, a inflamação, a lesão renal e o estresse oxidativo. Em desacordo com os conceitos atuais, o presente estudo traz evidência de que a hipóxia pode exercer um efeito renoprotetor no modelo Nx, ao invés de atuar como um fator de lesão renal. Os mecanismos desse inesperado efeito benéfico não são claros, e podem envolver inibição da via do NF-kB, melhora do estresse oxidativo e limitação da produção de angiotensina II pelo tecido renal / Hypoxia is thought to influence the pathogenesis of chronic kidney disease (CKD), but direct evidence that prolonged exposure to tissue hypoxia initiates or aggravates CKD is lacking. We tested this hypothesis by chronically exposing normal rats and rats with 5/6 nephrectomy (Nx) to hypoxia. In addition, we investigated whether such effect of hypoxia would involve activation of innate immunity. Adult male Munich-Wistar rats underwent Nx (n=54) or sham surgery (sham, n=52). Twenty six sham (S+nor) and 26 Nx (Nx+nor) rats remained in normoxia, while 26 sham rats (S+hyp) and 28 Nx rats (Nx+hyp) were kept in a normobaric hypoxia chamber (12% O2) for 8 weeks. Hypoxia was confirmed by immunohistochemistry for Pimonidazole (Hypoxyprobe®). Hypoxia was confined to the medullar area in S+nor and spread to the cortical area in S+hyp. Exposure to hypoxia promoted no renal injury or elevation of the content of IL1beta or TLR-4 in Sham. In Nx, hypoxia extended to the cortical area, a process that was intensified in Nx+hyp but, unexpectedly, attenuated hypertension, inflammation, innate immunity activation, renal injury and oxidative stress. The present study, in disagreement with current concepts, shows evidence that hypoxia exerts a renoprotective effect in the Nx model, instead of acting as a factor of renal injury. The mechanisms for this unexpected beneficial effect are unclear, and may involve NF-kB inhibition, amelioration of oxidative stress and limitation of angiotensine II production by the renal tissue

NOD1 est une protéine de surveillance intracellulaire jouant un rôle crucial dans la défense immunitaire innée. Suite à la reconnaissance d'un ligand bactérien spécifique, NOD1 recrute RICK au moyen d'une interaction CARD-CARD. RICK module ensuite l'activation du facteur de transcription NF-kB et initie une cascade de signalisation pro-inflammatoire. Le but de cette thèse était de déterminer la base structurale de ce processus. Le domaine CARD de NOD1 a été cloné, exprimé et purifié à la station EMBL de Grenoble. La structure de ce domaine a été résolue par résonance magnétique nucléaire à l'IBS de Grenoble. Cette structure est généralement similaire à celle des autres domaines CARD connus, étant constituée d'un paquet compact de 6 hélices a. Cependant elle présente des caractéristiques inhabituelles concernant la conformation de certaines boucles inter-hélices ainsi que la longueur et l'orientation de la sixième hélice. Des mutations dans les domaines CARDs des protéines NOD1 et RICK entières ont été réalisées pour identifier les résidus importants pour l'interaction ou la signalisation. Des expériences de co-immunoprécipitations et d'activation de NF-kB ont été effectuées à l'Université du Michigan. Trois résidus d'un patch acide de NOD1 (E53, D54 et E56) et trois résidus d'un patch basique de RICK (R444, R483 et R488) sont indispensables à l'interaction. Celle-ci serait donc de nature électrostatique. Deux autres résidus du patch acide du CARD de NOD1, L44 et I57, ont été identifiés comme importants pour la signalisation. Ces résidus peuvent potentiellement contribuer à la formation d'une interaction CARD-CARD fonctionnelle, ou bien également interagir avec d'autres régions de RICK.

L'exoenzyme S, une toxine de type III, de Pseudomonas aeruginosa possède un domaine GAP (GTPase Activating Protein) (ExoSGAP) inhibant les Rho GTPases (Rho, Rac, Cdc42) et la phagocytose dans les cellules de Mammifères en culture. J'ai utilisé une approche de transgenèse chez Drosophila melanogaster en utilisant un système d'expression tissu-spécifique inductible (UAS-Gal4) afin d'exprimer ExoSGAP. Nous avons montré qu'ExoSGAP cible in vivo les Rho GTPases Rho, Rac1, Rac2 et Cdc42. ExoSGAP affecte la résistance des mouches aux infections en inhibant la phagocytose des bactéries par les plasmatocytes, des cellules de type macrophage, mais n'a pas d'effet sur les voies NF-kB. Une approche génétique a permis d'identifier de nouvelles cibles de la toxine, en recherchant des gènes dont la dérégulation modifie le phénotype d'œil ou d'aile induit par l'expression d'ExoSGAP. Nous avons identifié plusieurs gènes pouvant avoir un rôle dans les voies des JNK et NF-kB Ces résultats valident une stratégie d'étude des toxines de type III par transgenèse chez la drosophile.J'ai parallèlement montré la spécificité de la GTPase Rac2 dans la résistance des mouches aux infections bactériennes. Rac2 participe notamment à la phagocytose.<br />Les travaux du Dr. H. Tricoire ont permis d'identifier 180 gènes dont la dérégulation modifie la réponse des mouches à un stress oxydant. J'ai testé 105 de ces lignées pour leur résistance aux infections, afin d'étudier une corrélation possible entre la réponse aux stress oxydant et infectieux. Ce crible a permis de montrer l'implication d'une protéine à domaine lectine PSLR (Pseudomonas Sensitive Lectin Receptor) dans la réponse immunitaire de la drosophile.

<p>B-cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia in the Western world. Although treatment of this disease has advanced considerably over the past decade, CLL remains incurable with current chemotherapeutics. In addition, available drug regimens for CLL are associated with frequent cytopenia-related complications, such as infection and fatigue. Thus, the major challenge in CLL treatment today is the need for alternative therapeutics with decreased toxicity and improved efficacy for disease refractory to currently available drugs.</p><p> </p><p>CLL is characterized by slow accumulation of malignant cells, which are supported in the microenvironment by cell-cell interactions and soluble cytokines such as tumor necrosis factor (TNF). We evaluated the effect of the small molecule TNF inhibitor LMP-420 on primary CLL cells. LMP-420 exhibited cytotoxic activity against these cells in the MTS assay, with similar potency to the front-line CLL drug fludarabine. LMP-420 induced time- and dose-dependent apoptosis in CLL cells, as demonstrated by annexin V staining, caspase activation, and DNA fragmentation. These changes were associated with decreased expression of the anti-apoptotic proteins Mcl-1, Bcl-xL, Bcl-2, and XIAP. CLL cells from patients with poor prognostic indicators exhibited LMP-420 sensitivity equal to that for cells from patients with favorable characteristics. In addition, LMP-420 potentiated the cytotoxic effect of fludarabine and inhibited in vitro proliferation of CLL cells. In contrast to other CLL therapeutics, LMP-420 exhibited minimal effects on normal peripheral blood mononuclear cell viability, mitogen-stimulated B- and T-cell proliferation, and hematopoietic colony formation. Our data suggest that LMP-420 may be a useful treatment for CLL with negligible hematologic toxicities. </p><p> </p><p>The effect profile of this compound in normal immune cells and the microarray studies in CLL cells indicate that the mechanism of action of LMP-420 likely involves modulation of the NF-kB pathway. Our initial studies demonstrate moderate but significant inhibitory activity against p65, a key member of the NF-kB transcription factor family. Research is ongoing to gain a better understanding of the specific cytotoxicity of LMP-420 for CLL cells and to elucidate other components of its mechanism of action. Regardless of the ultimate mechanistic findings with LMP-420, our studies support this molecule as a promising new CLL therapeutic that warrants further preclinical evaluation.</p> / Dissertation

Les évidences scientifiques révèlent l’implication des actions proinflammatoires de l’angiotensine II (Ang II) dans le développement de l’athérosclérose. Cependant, la caractérisation des bases moléculaires de l’Ang II sur le tissu vasculaire n’est pas totalement élucidée. La majorité des actions de l’Ang II implique l’activation d’une variété de cascades de signalisation dont les voies mitogen-activated protein kinases (MAPKs) ; c-Jun N-terminal kinases (JNKs), p38 kinases et extracellular signal-regulated kinases (ERK) et l’activation du facteur de transcription NF-κB via le complexe IKK. Récemment, une nouvelle modification post-traductionnelle dans les actions de l’Ang II, soit la polyubiquitination de la sous-unité NF-κB essential modulator (NEMO) du complexe IKK, a été révélée. L’objectif de mon projet de recherche est de vérifier l’importance de la polyubiquitination en K63 tout en caractérisant les protéines impliquées dans la modification de NEMO dans des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) exposées à l’Ang II. Notre étude suggère, selon une approche siARN combinant Ubc7 et Ubc13, la diminution de la phosphorylation du complexe IKK, de Akt et des MAPKs. De plus, nos résultats illustrent l’implication de TRAF6 dans la signalisation cellulaire de l’Ang II. Finalement, notre étude révèle la présence de la polyubiquitination en K63 dans la signalisation cellulaire de l’Ang II par chromatographie d’affinité. Cette étude met en évidence l’implication de la polyubiquitination en K63 dans la signalisation de l’Ang II dans des CMLV et implique Ubc13 et Ubc7 dans le remodelage vasculaire et l’inflammation dépendante de l’Ang II dans des CMLV. / Several studies have demonstrated that the proinflammatory and growth promoting actions of Angiotensin II (Ang II) are implicated in cardiovascular disease. However, the underlying molecular mechanisms involved in Ang II actions are still not completely elucidated. Most of the known biological effects of Ang II are through the activation of several cell signaling pathways, such as the mitogen-activated protein kinase pathways (MAPKs; c-Jun N-terminal kinases (JNKs), p38 kinases and extracellular signal-regulated kinases (ERK)), and nuclear factor kappaB transcription factor (NF-κB) pathway by IKK complex activation. Recently, another post-translational modification, polyubiquitination of the IKK complex sub-unit NF-κB essential modulator (NEMO) has been demonstrated to be implicated in Ang II signaling. The objective of my research project was to illustrate the importance of K63-linked polyubiquitination, and characterizing the proteins involved in the modification of NEMO in vascular smooth muscle cells (VSMC) exposed to Ang II. Using siRNA, we show that Ubc7 and Ubc13 together are involved in MAPK, IKK and Akt phosphorylation in VSMC exposed to Ang II. Moreover, our results show that TRAF6, a ubiquitin ligase, is involved in Ang II signaling. Finally, our study reveals involvement of K63-linked polyubiquitination in Ang II signaling by chromatography affinity. Here, we report K63-linked polyubiquitination involvement in Ang II signaling and also identify Ubc7 and Ubc13 as a ubiquitin conjugating enzymes involved in MAPKs, ERK and NF-kB signalling pathway suggesting a role of these proteins in Ang II-dependent vascular remodelling and proinflammatory effects in VSMC.

La maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU) sont des maladies inflammatoires chroniques du tube digestif qu’on regroupe sous le terme maladies inflammatoires de l’intestin (MII). Les mécanismes moléculaires menant au développement des MII ne sont pas entièrement connus, mais des études génétiques et fonctionnelles ont permis de mettre en évidence des interactions entre des prédispositions génétiques et des facteurs environnementaux - notamment la flore intestinale – qui contribuent au développement d’une dérégulation de la réponse immunitaire menant à l’inflammation de la muqueuse intestinale. Des études d’association pangénomiques et ciblées ont permis d’identifier plusieurs gènes de susceptibilité aux MII mais les estimations de la contribution de ces gènes à l’héritabilité suggèrent que plusieurs gènes restent à découvrir. Certains d’entre eux peuvent se trouver dans les régions identifiées par des études de liaison génétique. L’objectif de mon projet de doctorat était d’identifier un ou des facteurs de risque génétique dans la région chromosomale 19p (identifiée comme région de liaison IBD6) et de le/les caractériser au niveau fonctionnel. Nous avons d’abord entrepris une cartographie d’association de la région 19p. À la suite du génotypage successif de deux cohortes indépendantes, nous avons identifié un SNP intronique et quatre SNP codants dont un non-synonyme, rs8108738, tous localisés dans le gène microtubule associated serine threonine kinase gene-3 (MAST3) et associés aux MII. Peu d’information fonctionnelle sur MAST3 était disponible. Par contre MAST2, une protéine encodée par un gène de la même famille, régule l’activité du facteur de transcription inflammatoire NF-kappaB. Nous avons confirmé l’implication de MAST3 dans l’activité de NF-kappaB via un knockdown de MAST3 et des essais gène-rapporteur. Pour poursuivre la caractérisation fonctionnelle de MAST3, nous avons choisi une approche non ciblée pour étudier les effets de la variation des niveaux d’expression de MAST3 sur la cellule. C’est-à-dire que nous avons créé un 1er modèle cellulaire de surexpression du gène MAST3 dans les cellules HEK293 et analysé l’expression pangénomique endogène. La validation de l’expression génique dans un 2e modèle cellulaire de knockdown et de type cellulaire différent (THP1), nous a permis d’identifier et de contrer les effets non-spécifiques dus aux niveaux non-physiologiques. Notre étude d’expression a mené à l’identification d’un groupe de gènes dont l’expression est régulée par MAST3. Ces gènes sont majoritairement impliqués dans des fonctions immunitaires (cytokines pro-inflammatoires, régulateurs de NF-kappaB, migration cellulaire, etc.) et une forte proportion est régulée par NF-kappaB. Nous avons évalué l’importance du groupe de gènes régulés par MAST3 dans la présentation clinique des MII à travers des études d’expression dans des biopsies intestinales de patients atteints de CU. Nous avons constaté que l’expression de ces gènes est significativement supérieure dans les régions enflammées par rapport aux régions saines de la muqueuse intestinale des patients atteints de CU. Globalement, les résultats de nos études suggèrent que le facteur de risque aux MII MAST3 agit via la voie du facteur de transcription NF-kappaB pour influencer l’expression d’un groupe de gènes impliqués dans l’inflammation intestinale typique des MII. Chaque étude génétique sur les MII a le potentiel d’orienter les recherches fonctionnelles vers de nouvelles voies biologiques causales. Le dévoilement des mécanismes moléculaires sous-jacents à ces voies permet d’augmenter les connaissances sur le développement de ces maladies vers une compréhension plus complète de la pathogenèse qui permettra d’optimiser le diagnostic et le traitement de ces maladies. / Inflammatory bowel diseases (IBD) refer to different chronic inflammatory diseases of the digestive tract mainly Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC). Mechanisms leading to the pathogenesis of IBD are not completely understood, but genetic and functional studies have highlighted interactions between genetic predispositions and environmental factors, such as the intestinal microbiota, as contributors to the deregulation of the immune response that leads to inflammation of the intestinal mucosa. Genome-wide and targeted association studies have identified several IBD susceptibility genes. However, estimations of the contribution of these genes to heritability of the disease suggest that more are to be discovered. Some of these genes may be in previously identified IBD linkage regions. The objective of my doctoral project was first, to identify risk factors in the 19p chromosomal region (IBD6), previously identified following a genome-wide linkage study, then to characterise them functionally. We first performed a comprehensive association mapping study of the 19p region. Our two-stage genotyping strategy led to the identification of one intronic SNP and four coding SNP –including one non-synonymous SNP, rs8108738 – all located in the microtubule associated serine threonine kinase gene 3 (MAST3) and associated to IBD. Very limited functional information on MAST3 was available at that time. However MAST2 (a gene in the same family as MAST3), is involved in the regulation of inflammation master switch, transcription factor NF-B. We confirmed the involvement of MAST3 in the modulation of NF-B via a knockdown of MAST3 and gene reporter assays. In order to further characterize the function of MAST3, we chose a non-targeted approach to study the effects of the modulation of MAST3 levels on the cell. More specifically, we created a 1st cell model of MAST3 overexpression in HEK293 cells and analysed the resulting genome-wide endogenous gene expression. Validation in a 2nd cell model consisting of a knockdown of MAST3 in THP1 cells, allowed to identify non-specific gene expression due to non-physiological MAST3 levels. Our expression study led to the identification of a group of genes whose expression is modulated by MAST3. These genes are mainly involved in immune functions (pro-inflammatory cytokines, NF-B regulation, cellular migration, etc) and a majority is regulated by transcription factor NF-B. We evaluated the importance of this MAST3-regulated gene set in the clinical manifestation of IBD through an expression study on biopsies of UC patients. We found that the expression the MAST3-regulated gene set was significantly enriched in inflamed region of the intestinal mucosa of UC patients compared to healthy region. Taken together, the results of our study suggest that IBD risk factor MAST3 acts on the NF-B pathway to influence the expression of a group of genes involved in intestinal inflammation typical of IBD. Every genetic study on IBD has the potential to lead functional research towards new causal biological pathways. The unravelling of the molecular mechanisms underlying these pathways aims to improve the comprehension of the pathogenesis of IBD and hopefully will allow for optimization of diagnostic and treatment of these diseases.

Les bactéries commensales digestives jouent un rôle primordial dans l'homéostasie épithéliale et la santé de l'hôte, avec notamment un rôle modulateur du système immunitaire. Des effets bénéfiques dans le traitement des pathologies inflammatoires intestinales ont été caractérisés chez certaines souches de bactéries commensales. La compréhension de ces effets dans le maintien de l'homéostasie intestinale repose sur la connaissance des interactions entre les bactéries, l'épithélium intestinal et le système immunitaire muqueux. Streptococcus salivarius est l'un des premiers colonisateurs de la cavité buccale et du tractus digestif de l'homme. Cette bactérie a été utilisée comme modèle pour rechercher des mécanismes impliquée dans l'homéostasie.La recherche d'interactions entre des souches de l'espèce S. salivarius et les cellules humaines a été réalisée pour caractériser leurs éventuelles propriétés immunomodulatrices. Nous avons montré que les bactéries vivantes et les surnageants de cultures des souches de cette espèce modulent la réponse inflammatoire in vitro via un effet inhibiteur sur l'activation de la voie NF-B dans les cellules épithéliales intestinales (HT-29 et Caco-2) et les monocytes (THP-1). Cette modulation de l'inflammation a été confirmée par la capacité des surnageants bactériens à inhiber la sécrétion d'IL-8 par les cellules épithéliales. Ces surnageants agissent via une étape impliquant IB-, un inhibiteur du facteur NF-B. Ils inhibent la dégradation de la protéine IB- phosphorylée et diminuent ainsi la translocation nucléaire des composants NF-B. Nous avons également identifié et caractérisé un métabolite bactérien présent dans ces surnageants exerçant cette activité anti-inflammatoire. L'utilisation de ce métabolite et son isomère miment in vitro l'effet inhibiteur des surnageants sur l'activation de la voie NF-B dans les cellules épithéliales et les monocytes. Nous avons ainsi caractérisé un métabolite secrété par la bactérie commensale S. salivarius qui est capable d'inhiber une des voies centrales de signalisation impliquée dans la réponse inflammatoire intestinale. Enfin, une capacité anti-inflammatoire de S. salivarius a également été montrée dans un modèle murin d'inflammation digestive dans lequel les bactéries métaboliquement actives ont protégé les animaux de colites induites avec du TNBS. Ces travaux ouvrent la voie pour le développement d'applications thérapeutiques dans le traitement de pathologies inflammatoires de l'intestin basées sur ce composé actif ou l'utilisation de S. salivarius comme probiotique.

FACT est une protéine clé, qui joue de multiples rôles, y compris dans la transcription et la réparation de l'ADN endommagé. Néanmoins, comment FACT participe à la réparation et à la transcription de la chromatine n'est pas élucidé. Dans ce travail nous avons tout d'abord étudié le rôle de FACT dans le processus de réparation par excision de base (BER). Nous avons utilisé des nucléosomes reconstitués avec de l'ADN à uracile incorporé au hasard. Nous avons trouvé que l'enzyme UDG est capable d'enlever les uraciles localisés du côté de la solution et pas les uraciles se trouvant en face de l'octamère d'histone. La présence simultanée de FACT et de RSC (facteur de remodelage de la chromatine, impliqué dans la réparation) permet un enlèvement efficace des uraciles localisés du côté de l'octamère d'histone par l'UDG. De plus, l'action concertée de FACT et RSC contribue à l'enlèvement de la lésion oxidative 8-oxoG, autrement inaccessible, de la matrice nucléosomale par l'enzyme OGG1. Ce résultat est obtenu grâce à une activité " co-remodelatrice " de la protéine FACT. Dans ce travail nous décrivons pour la première fois cette nouvelle propriété de FACT et nous montrons par une série d'expériences biochimiques que FACT est capable de stimuler l'activité de remodelage du RSC. Nos expériences montrent que la présence de FACT augmente l'efficacité de RSC à transformer l'énergie libérée par l'hydrolyse de l'ATP en travail " mécanique ". Les données obtenues suggèrent une nature stochastique du BER in vivo, FACT étant un facteur clé dans le processus de réparation. Nous avons également investigué l'implication de l'activité co-remodelatrice de FACT dans la fixation de NF-kB aux matrices nucléosomales. La production de nucléosomes remodelés, mais non - mobilisés (remosomes) n'est pas suffisante pour promouvoir la fixation de NF-kB. Pourtant, la mobilisation des nucléosomes par l'intermédiaire de RSC permet une interaction efficace entre NF-kB et l'ADN nucléosomal. Toutes ces données sont essentielles pour le décryptage du mécanisme moléculaire par lequel FACT agit dans le BER et dans la transcription médiée par NF-kB.

In this thesis we have attempted to study four basic aspects of DNA-protein interactions: Affinity, specificity, accessibility and kinetics. With NF-kB as our model transcription factor, we wanted to investigate how a particular dimer recognizes a specific binding sequence? How fast are these interactions? And finally, how does the NF-kB interact with it binding site in the chromatin context? Specificity of NF-kB-DNA interactions has recently come into focus after it was shown that these dimers can bind to the sequences which do not fall into the NF-kB general consensus motif. We studied seven such sequences for their specificity for four NF-kB dimers. Our results show that p50 homodimers are least discriminative and can bind specifically to all these sequences. While as, RelA homodimers were highly discriminative and did not bind to most of these nontraditional sequences. We used two different methods to measure binding affinities: traditional gel mobility shift assay (EMSA) and a novel technique called as UV laser footprinting. Our results show that UV laser footprinting is the better method to determine the binding constants.For studying the dynamics of NF-kB-DNA binding, we combined UV laser footprinting with stopped flow device. This combination, not only give us one base pair resolution but also milli-second time resolution. Using p50 homodimers as a model transcription factor, we showed that the binding of this factor follows a two-step mechanism. First step involves the fast recognition of the sequence and second step follows a slower kinetics most likely for the stabilization of the complex. Our experiments suggest that flanking sequences play a role in the recognition and stabilization process of the complex formation.Finally, we also studied the accessibility of nucleosomes to NF-kB. Our in vitro data sheds light on the in vivo requirements for the alterations in chromatin structure necessary for the productive binding of NF-kB. These include either a removal of H2A-H2B dimers from the nucleosome and/or chromatin remodeler induced relocation of the histone octamer.Our data sheds light on the in vivo requirements for the alterations in chromatin structure necessary for the productive binding of NF-kB. We hypothesize that some factors like PU.1 might be able to target the chromatin remodeling/dimer eviction machinery to particular nucleosomes and lead to productive binding of NF-kB.