A lagarta da espécie Lonomia obliqua é medicamente importante, cujo veneno, presente nas espículas, causa uma síndrome hemorrágica caracterizada por equimoses, alterações da coagulação, dentre outros sintomas. Isto sugere a presença de peptídeos bioativos com potencial farmacêutico, devido à capacidade de modular o comportamento das células endoteliais. O objetivo deste estudo é analisar os potenciais efeitos do veneno de Lonomia obliqua na angiogênese. Uma linhagem celular endotelial (HUVEC) foi exposta a diferentes concentrações do extrato de espículas da Lonomia obliqua (Lonomia obliqua Bristle extract - LOBE) 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL e 50 μg/mL. Empregando citometria de fluxo, observou-se que nenhuma das doses afetou o ciclo celular, viabilidade ou apoptose das células endoteliais após 24h de exposição. Os esferóides das células HUVEC foram plaqueados numa matriz 3D de colágeno e observou-se que LOBE (10 μg/mL, 20 μg/mL e 50 μg/mL) induz um aumento na migração celular, consistente com o processo de angiogênese. A análise da dinâmica da VE-caderina indica que a exposição imediata a LOBE (10 μg/mL) induz um desprendimento da junção célula-célula, o que corrobora com a hemorragia observada nas vítimas de envenenamento. Através de espectrometria de massa, observou-se que LOBE possui vários potenciais peptídeos bioativos. Grupos destes peptídeos foram isolados por fracionamento com metanol a partir do veneno bruto. Os peptídeos presentes, em cada uma das 10 frações, foram caracterizados por espectrometria de massa e foram analisados os efeitos de cada fração sobre a angiogênese. Os resultados sugerem que alguns dos efeitos do envenenamento por Lonomia obliqua são devidos à presença de peptídeos bioativos que modulam o comportamento das células endoteliais. / The caterpillar of the species Lonomia obliqua is medically important, whose venom present in the bristles leads to an hemorrhagic syndrome characterized by ecchymosis, coagulation disorders and others symptoms. This suggests the presence of bioactive peptides with pharmaceutical potencial due to the ability to modulate the behavior of endothelial cells. The aim of this study is to analyze the potential effects of Lonomia obliqua venom on angiogenesis. An endothelial cell line (HUVEC) was exposed to different concentrations (5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL and 50 μg/mL) of Lonomia obliqua bristle extract (LOBE). Using flow cytometry, it was observed that none of the doses affected endothelial cell cycle, cell viability or apoptosis after 24h of exposition. Spheroids of HUVEC cells were plated in a 3D-collagen matrix and it was observed that LOBE (10 μg/mL, 20 μg/mL and 50 μg/mL) induced an increase on cell migration consistent with the angiogenesis process. Analysis of VE-cadherin dynamics indicates that the immediate exposition to LOBE (10 μg/mL) induced a loosening of cell-cell junction, which corroborates with the hemorrhage observed in the victims. By mass spectroscopy, it was observed that LOBE possesses several potentially bioactive peptides. Groups of these peptides were isolated by a methanol-based fractioning of the crude venom. The peptides present in each of the 10 fractions were characterized by mass spectroscopy and it was analyzed the effects of each fraction on angiogenesis. The results suggest that some of the effects of Lonomia obliqua envenomation are due to the presence of bioactive peptides that modulate the behavior of endothelial cells.

Uma nova lectina extraída da semente de Artocarpus integrifólia, denominada KM+ foi recentemente descrita. KM+ e haptotática para neutrófilos, promove a aglutinação de hemácias dos grupos A, B, 0, estimula a proliferação de linfócitos do baço de camundongos e liga-se em &#945 D-manose, &#945 metil manosidio e &#945 D-glicose. Esta lectina é composta por quatro monômeros, com peso molecular de 13.150 daltons cada, unidos por interações não covalentes. KM+ contem 1,8% de carboidratos e apresentou quatro isoformas com pontos isoelétricos entre 4,2 e 5,2. Este trabalho teve como objetivos estudar modificações estruturais de KM+ em função de parâmetros como temperatura, força iônica, pH, agentes desnaturantes, ligação com D-manose, monitoradas por dicroísmo circular (CD) e fluorescência. CD também foi utilizado para estimar o conteúdo de estrutura secundaria de KM+, utilizando-se dois programas descritos na literatura: SSE (Secondary Structure Estimation), que utiliza o método dos mínimos quadrados para a estimativa da estrutura secundaria e obtenção dos espectros básicos, baseados nos dados cristalográficos de proteínas de .estrutura resolvida; CCA (Convex Constraint Analisys) que utiliza o algoritmo simplex e a partir dos espectros de CD das proteínas de referencia calcula os espectros das componentes básicas. Para a estimativa das frações de estrutura secundária o segundo método utiliza o programa Lincomb. Os espectros de CD foram registrados no intervalo de 185 a 260 nm. O conteúdo em estrutura secundária, estimado pelo programa SSE foi: 0% de &#945-hélice, 41% de folha &#946, 27% de volta &#946 e 32,3 de estrutura desordenada; pelo programa CCA foi: 1% de &#945-hélice, 35% de folha &#946 anti-paralela, 21% de volta &#946 e/ou folha &#946 paralela, 15% de contribuições de aromáticos e/ou ligações dissulfeto, 28% de estrutura desordenada. Os desvios médios quadráticos para os programas SSE e CCA foram 12% e 1%, respectivamente. Portanto a lectina KM+ é principalmente constituída por estruturas tipo folha &#946 e tipo desordenada. A curva calculada pelo programa CCA foi mais bem estimada, pois tem o desvio médio quadrático 12 vezes menor que o do programa SSE. Este resultado, provavelmente ocorre devido aos seguintes fatores: (i) no programa CCA, o espectro da proteína a ser analisada e alinhado com os espectros das proteínas de referência, influenciando no calculo dos espectros básicos; (ii) maior número de proteínas com estrutura &#946 no grupo de referência do programa CCA. A estabilidade de KM+ em função da temperatura tem comportamento diferente em tampão sódio fosfato (PBS) daquele observado em água. Em PBS, quando a amostra esta a 70&#176C, a forma do espectro de CD mostrou-se consistente com um espectro de proteína desnaturada. Comumente, um espectro de proteína desnaturada caracteriza-se pela perda da estrutura secundaria predominante e aumento da estrutura desordenada. Em água, também a 70&#176C, na região da estrutura &#946 (216 nm) surge uma nova banda e na região da estrutura desordenada (195 nm) aparece uma banda com valores positivos mimetizando um espectro da estrutura &#945-hélice. Esta diferença de comportamento pode ser devida à força iônica. A desorganização promovida na molécula de KM+ por cloreto de guanidina foi típica de desnaturação. o máximo da emissão de fluorescência, da KM+ em PBS pH 7,2, foi a 328 nm, característico de resíduos de triptofano protegidos do solvente. Este máximo mudou para 340 nm em pH 10,5. Este resultado indica mudanças no ambiente químico do triptofano neste pH. O deslocamento para a região do vermelho indica, que em pH. os resíduos de triptofano estio em maior contato com o solvente. O número de sitios ligantes de D-manose J)a molécula de KM+, foi estimado pela supressão da fluorescência promovida pelo D-manose. Esta estimativa foi baseada na suposição de que todos os sítios ligantes de D-manose estivessem próximos aos resíduos de triptofano. A relação encontrada foi de 2 moles de D-manose/mol de KM+ / Recently a new lectin, KM+, isolated from Artocarpus integrifolia seeds was described. KM+ induces neutrophil migration, agglutination of human red blood cells, proliferation of mouse spleen cells and binding with monosacharides D-mannose, D-glicose and &#945-metil mannoside. This glycoprotein is composed of four monomers, assembled by non covalent bonds, has 500 aminoacids residues/mol, with a Molecular Weight of 52,000 Daltons and 1.8% of carbohydrates [27]. In this work structural changes of KM+ was studied as a function of temperature, pH, chemical denaturing agents as well as the binding with D-mannose. These changes were monitored by circular dichroism (CD) and fluorimetry. Circular Dichroism (CD) spectroscopy was used for the analysis of the secondary structure of KM+ in solution due do its capacity to indicate the presence and to estimate the proportion of &#945-helix, &#946-sheet, &#946-turn and unordered conformations. This measurent can be regarded as a function of the relative orientation of the chromophores responsible for their chiroptical activity. CD spectroscopy is also one of the methods of choice for monitorization of conformational changes in proteins as a function of solvents, pH, temperature, ionic strength and specific or non specific binding. Two programs which are in use for estimation of secondary structure: SSE, using the linear least squares method and CCA, using the simplex method, were evaluated in the present work. SSE uses a set of proteins with known X-ray data as the basis for evaluation while CCA uses only pure proteins experimental CD spectra. Fluorescence spectroscopy is very useful to monitore of protein conformational changes in solution due to the presence of intrinsic fluorophores. Fluorescence Measurements were performed at 25&#176C. Samples were excited at 280 nm and the emission was monitored in the range 290-450 nm. The maximum emission as a function of pH was at pH 7.0. The wavelength for maximum emission changed from 328 nm at pH 7.0 to 340 nm at pH 10.5. CD spectra were recorded over the range of 185 up to 260 nm. The Secondary structure content estimated by SSE program was: 0% &#945-helix, 41% &#946-sheet, 26% &#946-turn and 32% random with RMS of 12% and CCA program was: 1% &#945-helix, 35% antiparallel &#946-sheet, 21% &#946-turn and/or parallel B-sheet, 28% random, 15% aromatics contributions and dissulfide linkages with RMS of 1%. The fractions of secondary structure obtained when using CCA program were more consistent than those of SSE program. The simulation by CCA program was better probably due to its desconvolution of the spectral contribution of the common secondary structures using experimental CD curves of proteins. The stability of KM+, in PBS, as a function of temperature changes above 55&#176C but only at 70&#176C the shape of the CD spectrum is consistent with the loss of the native ordered secondary structure that should accompany protein unfolding. CD spectra of KM+ in water showed conformational changes as a function of temperature was not consistent with denaturated proteins. The unfolding of KM+ by GdnCl and SDS resulted in CD spectroscopic changes: consistent with the increased random structure and disappearance of beta sheet. Using the two denaturing agents together GdnCl and temperature, the denaturation was observed at lower decreased both GdnCl concentration and at lower temperature. The estimation of the number of binding sites for D-mannose was obtained through the fluorescence intensity decrease due to a quenching effect of D-mannose and showed that the stoichiometry of binding was 2 moles of D-mannoseimol of lectin

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Lectins are ubiquitous proteins or glycoproteins with at least one non-catalytic domain binding reversibly to a specific mono- or oligosaccharide. Lectins are ubiquitously distributed in plants, animals and microorganisms. Marine algal lectins have been isolated and characterized from only a few species and at a much slower pace since the first report, more than 40 years ago, of the haemagglutinating activity in these organisms. This paucity is mainly due to difficulties in obtaining sufficient material for study. However, among characterized lectins, proteins observed with different biochemical characteristics. Lectins from genus Codium have been isolated and characterized in some detail. In general, have specificity for GalNAc and/or GlcNAc and glycoproteins mucin, fetuin and thyroglobulin, have no requirement for metal ions and were composed by low molecular subunits and may present oligomerization. The present work deals with the purification and characterization of two lectins (CiL-1 and CiL-2) from green marine alga Codium isthmocladum, compare their characteristics and evaluate the ability in agglutinate bacterial cells and toxicity against Artemia. The lectins was purified by a combination of ammonium sulphate precipitation and ion-exchange chromatography on a DEAE-Sephacel column. The main differences observed were the metal dependence, oligomerization state and thermostability. The amino acid sequence of CiL-2 showed no similarity with CiL-1 or other lectins from protein data bank. Only CiL-1 was able to agglutinate bacterial cells whereas CiL-2 showed toxicity against Artemia after 48 hours. In the evaluation of lectin interaction, the data suggest that the CiL-2 recognizes the glycoproteins present in the microcrustacean digest tract. The work has shown that the marine green alga has at least two different lectins with differences in amino acid sequences, biochemical characteristics and biological response. / Lectinas sÃo (glico) proteÃnas com pelo menos um domÃnio nÃo catalÃtico que podem se ligar especÃfica e reversivelmente a carboidratos aglutinando cÃlulas e/ou glicoconjugados. SÃo ubÃquas na natureza, presentes em todos os organismos. Comparando com lectinas de plantas terrestres, poucas lectinas de algas marinhas tÃm sido isoladas e caracterizadas, principalmente devido à dificuldade de obtenÃÃo de material suficiente para estudo. Entretanto, entre as lectinas de algas caracterizadas, observam-se proteÃnas com caracterÃsticas bioquÃmicas diferentes. VÃrias lectinas do gÃnero Codium jà foram isoladas e caracterizadas em algum detalhe. Em geral, possuem especificidade para GalNAc e/ou GlcNAc e glicoproteÃnas, mucina, fetuÃna e tiroglobulina, nÃo dependem de cÃtions divalentes para exibir sua atividade e sÃo compostas de subunidades de baixo peso molecular podendo apresentar formas oligomÃricas. Neste trabalho objetivou-se isolar e caracterizar bioquimicamente duas lectinas isoladas da alga marinha verde Codium isthmocladum (CiL-1 e CiL-2), comparar suas caracterÃsticas e avaliar a capacidade das duas lectinas de aglutinar cÃlulas bacterianas e a toxicidade contra Artemia sp. As lectinas foram purificadas atravÃs da combinaÃÃo de precipitaÃÃo com sulfato de amÃnio e cromatografia de troca iÃnica. Entre as principais diferenÃas bioquÃmicas observadas foram: dependÃncia de metais, oligomerizaÃÃo e estabilidade tÃrmica. No entanto, ambas foram inibidas por Mucina e nÃo por carboidratos simples. Quando comparada a sequÃncia de aminoÃcidos de CiL-2, nÃo houve similaridade com a sequÃncia parcial da CiL-1 ou de qualquer outra sequÃncia de lectinas de algas disponÃveis nos bancos de dados. Somente CiL-1 foi capaz de aglutinar cÃlulas bacterianas enquanto que a CiL-2 apresentou toxicidade contra Artemia sp. apÃs 48 horas de contato. Na avaliaÃÃo da interaÃÃo da lectina, os dados sugerem que a proteÃna reconhece as glicoproteÃnas presentes no trato digestÃrio do microcrustÃceo. O trabalho evidenciou que alga marinha verde C. isthmocladum Vickers possui pelo menos duas lectinas com sequÃncia de aminoÃcidos distinta, mostrando respostas biolÃgicas diferentes, onde a CiL-1 teve capacidade de aglutinar cÃlulas bacterianas e a foi CiL-2 tÃxica contra Artemia sp.

A partir de extratos aquosos da esponja marinha Axinella corrugata, coletada na costa sul do Brasil (Santa Catarina), foram purificadas duas lectinas, ACL-I e ACL-II, por cromatografia em coluna de afinidade de matriz de estroma de coelhopoliacrilamida, seguida por gel filtração em Ultrogel AcA 44. Os trabalhos se concentraram, especialmente, no estudo da lectina com maior atividade hemaglutinante, ACL-I. Dentre os eritrócitos testados, ACL-I aglutinou, fortemente, eritrócitos de coelho, além de eritrócitos caprinos e caninos. A atividade hemaglutinante foi inibida por N-acetil-D-glicosamina, N-acetil-D-galactosamina e Nacetil- D-manosamina com igual intensidade, além de N, N’, N”-triacetilquitotriose, o melhor inibidor. Por outro lado, ACL-II aglutinou, preferencialmente, eritrócitos de coelho e caninos, tendo sua atividade hemaglutinante inibida por N-acetil-Dglicosamina, N-acetil-D-manosamina, quitina, N, N’, N”-triacetilquitotriose e fetuína, além de D-galactose, mas não por N-acetil-D-galactosamina. Ambas lectinas foram fracamente inibidas por N-acetil-D-lactosamina. A atividade hemaglutinante mostrouse independente de cátions divalentes e foi estável a uma ampla faixa de temperatura e de pH para ACL-I e para ACL-II. ACL-I foi estável frente à ação de enzimas proteolíticas, mas perdeu 50 % de sua atividade na presença de agentes redutores e desnaturantes. ACL-I é uma glicoproteína e sua massa molecular relativa foi estimada em 82.300 por SDS-PAGE em condições redutoras e não redutoras, e sem desnaturação pelo calor. Ainda, mostrou ser constituída por 6 subunidades monoméricas de 13.900, apresentando pontes de dissulfeto entre as mesmas. Por FPLC, a massa molecular estimada foi de 78.500. Da mesma forma como para ACL-I, ACL-II apresentou apenas uma banda em sistema SDS-PAGE, na ausência de agente redutor e sem desnaturação pelo calor, cuja massa molecular relativa foi estimada em 80.000, enquanto que por FPLC foi estimada em 78.000. O pI de ACL-I foi de 6,3, avaliado por focalização isoelétrica, e a sua composição centesimal de aminoácidos exibiu uma prevalência de glicina, seguida de ácido aspártico/asparagina, ácido glutâmico/glutamina e alanina. Dentre as atividades biológicas testadas, a ACL-I demonstrou atividade quimiotáxica, mitogênica e citotóxica, mas não antioxidante. Os ensaios imuno-histoquímicos mostraram que ACL-I se encontra intracelularmente em grânulos celulares, provavelmente no interior de células esferulosas da esponja marinha. A lectina também mostrou ser uma ferramenta útil na marcação de células transformadas de mama, cólon, pulmão, ovário e bexiga. / Two lectins, ACL-I and ACL-II, were purified from aqueous extracts of marine sponge Axinella corrugata, collected at Atlantic coastline of southern Brazil (Santa Catarina) by rabbit stroma-polyacrylamide gel affinity column, followed by size-exclusion chromatography on Ultrogel AcA 44. The analysis were performed, especially, on the study of lectin with greater hemagglutinating activity, ACL-I. Among the erythrocytes tested, ACL-I agglutinated, strongly, native rabbit, goat and dog erythrocytes, whose hemagglutinating activity was inhibited by N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-Dmannosamine, N-acetyl-D-galactosamine and N, N’, N”- triacetylchitotriose. On the other hand, ACL-II agglutinated, preferentially, rabbit and dog erythrocytes, with its hemagglutinating activity inhibited by D-galactose, N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl- D-mannosamine, chitin, N, N’, N”- triacetylchitotriose and fetuin, but not by N-acetyl- D-galactosamine. Both lectins were weakly inhibited by N-acetyl-D-lactosamine. The hemagglutinating activity was independent of divalent cations and it was stable at large range of temperature and pH to ACL-I and ACL-II. ACL-I was resistent to enzymatic proteolysis, but lost 50 % of its activity in the presence of reducing or denaturant agents. This lectin presented a relative molecular mass of 82,300 estimated by SDS-PAGE in the presence or absence of 2-mercaptoethanol, without pre-heating, and it is constituted by six monomeric subunits of 13,900, showing disulphide bridges among them. By FPLC the relative molecular mass was 78,500. Similar to ACL-I, ACL-II showed one unique protein band by SDS-PAGE, in the absence of 2-mercaptoethanol and without pre-heating, whose relative molecular mass was estimated as 80,000 and by gel filtration as 78,000. The isoelectric focusing of ACL-I revealed the presence of one unique protein band with pI of 6.3 and the amino acid composition showed a prevalence of glycine, followed by aspartic acid/asparagine, glutamic acid/glutamine and alanine. Among the biological activities analysed, the ACL-I demonstrated chemotactic, mitogenic and cytotoxic activities, but not antioxidant. The immunohistochemical assays revealed that ACL-I is stored in vesicles, probably inside of spherulous cells of the marine sponge. The lectin showed to be a useful tool in the labelling of transformed cells of breast, colon, lung, ovary and bladder.

Submitted by Haroudo Xavier Filho (haroudo.xavierfo@ufpe.br) on 2016-04-05T15:42:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Luís final (2).pdf: 2354969 bytes, checksum: 99edddc3a89f16f62d7e6fc6517c4a93 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-05T15:42:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Luís final (2).pdf: 2354969 bytes, checksum: 99edddc3a89f16f62d7e6fc6517c4a93 (MD5) Previous issue date: 2013-09-09 / FACEPE / As lectinas são proteínas conhecidas por sua capacidade de ligar específica e reversivelmente a carboidratos resultando em uma variedade de propriedades biológicas. Este trabalho tem por objetivo avaliar os efeitos imunomodulador e citoprotetor das lectinas Cramoll 1,4 (pCramoll) e rCramoll 1 (rCramoll). Na determinação da ação imunomoduladora macrófagos peritoneais de camundongos Balb/c foram tratados com diferentes concentrações das lectinas (0,625-10 μM) e foram analisados os efeitos na produção óxido nítrico (NO), viabilidade celular, produção de ânion superóxido, alterações no potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) e na fagocitose de Staphylococcus aureus. A produção de citocinas pró-inflamatorias (IL-1β, IL-6, INF-γ e TNF-α) foi avaliada em macrófagos infectados e não infectados com S. aureus. Ambas lectinas induziram significantemente a produção de NO e de citocinas. As proteínas foram consideradas não-citotóxicas pelo ensaio com MTT, entretanto a análise por Citometria de Fluxo revelaram um aumento de células mortas. A produção de superóxido foi estimulada pelas lectinas o que foi confirmado pelas mudanças induzidas no ΔΨm. A ação fagocítica dos macrófagos foi aumentada em 27,1% e 22,47% após o tratamento destes com pCramoll e rCramoll . Por fim, as lectinas inibiram a expressão de TNF-α e IL-6 e estimularam a produção de IL-1β e INF-γ por macrófagos infectados por S. aureus. Paralelamente, o potencial protetor das lectinas contra a morte celular induzida pelo estresse oxidativo foi avaliada. Para tanto, células Vero (fibroblastos renais de macaco) foram pré-tratadas com crescentes concentrações das lectinas (0,625-10 μM) por 30 minutos e em seguida foram expostas ao H2O2 (1 mM). Após 24 horas, o efeito citoprotetor foi avaliado. Os mecanismos celulares envolvidos foram determinados por citometria de fluxo envolvendo: proteção contra morte celular, danos nos lisossomos e DNA, produção de ânion superóxido (MitoSOX), alterações no potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) e proliferação celular. pCramoll e rCramoll atenuaram a citotoxicidade induzida por H2O2 de forma dose-dependente, os efeitos máximos foram 96.85 ± 15.59% (rCramoll) e 59.48 ± 23.44% (pCramoll). A análise com Live/Dead mostrou redução da morte celular de 65.04 ± 3.29% (H2O2) para 39.77 ± 2.93% (pCramoll) e 13.90 ± 9.01% (rCramoll). Os efeitos deletérios de H2O2 na proliferação celular foram reduzidos em 10.83% (pCramoll) e 24.17% (rCramoll). As lectinas atenuaram a produção excessiva de superóxido, o collapso do ΔΨm e os danos lisossomais e ao DNA das células Vero expostas à H2O2. Em conclusão nossos estudos demonstram que pCramoll e rCramoll possuem elevado potencial imunomodulador e citoprotetor. / This study aims to evaluate the immunomodulatory effects on macrophages and cytoprotector action against oxidative stress of Cramoll 1.4 (pCramoll) and rCramoll 1 (rCramoll). In the determination of the immunomodulory action, peritoneal macrophages from Balb/c mice were treated with different concentrations of lectins (0.625 to 10 mM) and we analyzed the effect on NO production (Griess Reagent), cell viability (MTT Reagent), induction of apoptosis (Kit Live/Dead and Acridine orange), superoxide anion production (MitoSOX), changes in mitochondrial membrane potential (ΔΨm) and phagocytosis of Staphylococcus aureus. The production of proinflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, INF-γ e TNF-α) was analyzed in S. aureus infected and non-infected macrophages. Both lectins significantly enhanced Macrophages NO production and cytokines. The lectins were not cytotoxic as observed by MTT assay. However Live/Dead analysis revealed an increase of apoptosis in treated cells, the reduction of lysosomal activity was also reduced. The superoxide production was stimulated by both lectins, which was confirmed with the reduction on ΔΨm. S. aureus phagocytic activity of macrophages were enhanced in 27.1% and 22.47% by pCramoll and rCramoll, respectively. Finally, pCramoll and rCramoll downregulated the production of IL-6 and TNF-α and upregulated the expression of IL-1β, INF-γ during S. aureus infection of macrophages. In addtion, the protective effects of lectins against cell death induced by oxidative stress were evaluated. For this purpose, Vero cells (monkey kidney fibroblasts) were pretreated with increasing concentrations of lectins (0.625 to 10 μM) for 30 minutes and then were exposed to H2O2 (1mM). After 24 hours, the cytoprotective effect was evaluated and the cellular mechanisms involved were determined by flow cytometry involving: protection against cell death (Live/Dead kit), damage to lysosomes (Acridine Orange) and DNA (TUNEL), superoxide anion production (MitoSOX), changes in mitochondrial membrane potential (ΔΨm) (Rhodamine 123) and cell proliferation. pCramoll and rCramoll significantly attenuated the H2O2-induced cytotoxicity in a dose-dependent way, the maximum protective effects were 96.85 ± 15.59% (rCramoll) and 59.48 ± 23.44% (pCramoll). The Live/Dead analysis showed a reduction in apoptotic cells from 65.04 ± 3.29% to 39.77 ± 2.93% (pCramoll) and 13.90 ± 9.01% (rCramoll). The deleterious effects of H2O2 on cell proliferation were reduced 10.83% (pCramoll) and 24.17% (rCramoll). The lectins attenuated the excessive superoxide production, the collapse of ΔΨm, lysosomal and DNA damage that occurred in Vero cells exposed to H2O2. In conclusion, our results show that pCramoll and rCramoll have high immunomodulatory potential on macrophages and cytoprotective effects against H2O2.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-06-02T14:14:51Z No. of bitstreams: 1 Flavio de Oliveira Silva.pdf: 1881383 bytes, checksum: d592819e85426667e7752e0e6bcbbf0f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-02T14:14:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Flavio de Oliveira Silva.pdf: 1881383 bytes, checksum: d592819e85426667e7752e0e6bcbbf0f (MD5) Previous issue date: 2012-02-02 / Lectins are proteins that bind specifically and reversibly to carbohydrates, showing several biological effects. In this work, we carried out a literature review about biological effects of lectin extracted from seeds of Canavalia brasiliensis (ConBr), a plant present in the northeastern and southern Brazil, which is popularly known as wild bean of Ceará. In addition, we carried out a study to analyze the modulating activity of ConBr on murine splenocytes, verifying its effect on cell viability and proliferation, cytokine and nitric oxide (NO) production. We have also performed a study to evaluate ConBr effect on B16F10 murine melanoma cells by analyzing the inhibition of cell proliferation and migration as well as apoptosis induction and synthesis of cytokines and NO. The results show that ConBr induced at concentrations of 2.5, 5.0 and 10 μg/ml promoted the proliferation of splenocytes, with high cell viability. Furthermore, the concentration of 10 μg/ml induced cytokine production and nitric oxide on B16F10 murine melanoma, it was observed that ConBr inhibited tumor cell proliferation inducing apoptosis. It was also observed nitric oxide and IL-12 production by B16F10 cells under stimulus. ConBr lectin possesses a biotechnological potential use as a mitogen and anti-tumor agent. / As lectinas são proteínas que apresentam a capacidade de se ligar de maneira específica e reversível a carboidratos, exibindo distintos efeitos biológicos. Neste trabalho, realizou-se uma revisão de literatura sobre os efeitos biológicos da lectina extraída das sementes da Canavalia brasiliensis (ConBr), uma planta presente no Nordeste e Sul do Brasil, que é conhecida popularmente como feijão bravo do Ceará. Além disso, realizou-se um estudo para analisar a atividade moduladora da ConBr sobre esplenócitos murinos, verificando-se sua ação sobre a proliferação e viabilidade celular, produção de citocinas e óxido nítrico (NO). Realizou-se também, um estudo para avaliar o efeito da ConBr sobre células B16F10 de melanoma murino, analisando-se a inibição da proliferação e migração celular, bem como a indução de apoptose e síntese de citocinas e NO. Os resultados demostraram que a ConBr induziu nas concentrações de 2.5, 5.0 e 10 μg/ml promoveu a proliferação de esplenócitos, com alto índice de viabilidade celular. Além disso, a concentração de 10 μg/ml induziu a produção de citocinas e óxido nítrico. Em células B16F10 de melanoma murino, observou-se que a ConBr inibiu a proliferação das células tumorais promovendo apoptose celular. Verificou-se ainda, a produção de óxido nítrico e da citocina IL-12 pelas células submetidas ao estímulo. A lectina ConBr possue um potencial uso biotecnológico como mitógeno e agente antitumoral.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / RizÃbios sÃo bactÃrias gram-negativas que vivem de maneira simbiÃtica nas raÃzes de leguminosas induzindo a formaÃÃo de nÃdulos. Dentro dos nÃdulos, essas bactÃrias, na sua forma endossimbiÃtica, podem fixar o nitrogÃnio atmosfÃrico e fornecÃ-lo para as cÃlulas da planta hospedeira. Diversas condiÃÃes ambientais sÃo fatores limitantes para a fixaÃÃo biolÃgica de nitrogÃnio e o desenvolvimento do vegetal, como estresse hÃdrico, salinidade, pH e temperatura. Rhizobium tropici CIAT899 à uma estirpe de rizÃbio que forma efetiva simbiose com Phaseolus vulgaris, esta estirpe mostra ser tolerante a diversos estresses ambientais, incluindo altas temperaturas, ambientes Ãcidos e de alta salinidade. Lectinas sÃo (glico) proteÃnas de origem nÃo imune que se ligam especificamente e reversÃvelmente a carboidratos, ou ainda a glicoconjugados. Devido essa capacidade de reconhecer especificamente carboidratos, lectinas mostram ser uma importante ferramenta de estudo que favorece a interaÃÃo entre rizÃbio e planta hospedeira. Nesse trabalho buscamos demonstrar a atividade das lectinas isoladas de sementes de Canavalia brasiliensis (ConBr) e Canavalia ensiformis (ConA) sobre o crescimento âin vitroâ de Rhizobium tropici. Os dados mostraram que a lectina ConBr foi capaz de estimular de maneira significante o crescimento âin vitroâ de Rhizobium tropici. O efeito encontrado foi revertido na presenÃa do aÃÃcar inibidor (manose), sugerindo uma efetiva atividade lectinica. No entanto a lectina ConA nÃo demonstrou nenhuma atividade sobre o crescimento do microrganismo. A lectina ConBr associada com FITC, como jà era esperado, demonstrou interaÃÃo com a superfÃcie bacteriana, esses resultados foram muito semelhantes aos obtidos com ConA, apesar dessa lectina nÃo demonstrar qualquer atividade sobre o crescimento microbiano de Rhizobium tropici. A diferenÃa na atividade biolÃgica destas lectinas, apesar da alta similaridade, provavelmente à devido à diferenÃa estrutural nos seus domÃnios de reconhecimento de carboidrato. / Rizobia are gram-negative bacteria that lives as symbiotic cells in roots of leguminous inducing the formation of nodules. Inside of these nodules, these bacteria in their endosymbiotic life style, fixate the atmospheric nitrogen and make it available for the cells from the host plant. Different environment conditions are limiting factors for the biological nitrogen fixation and for the plant development, like drought-stressed, salinity, pH and temperature. Rhizobium tropici CIAT899 is a rizobia‟s strain that has effective symbioses with Phaseolus vulgaris, this strain shows tolerance to many different environment stress, such as high temperatures, acid environment and high salinity. Lectins are (glico) proteins from non-immune origin that binds specific and reversible to carbohydrates or to glicoconjugates. Due to their capacity of recognizing specific carbohydrates, lectins shows to be an important tool that helps the interaction between rizobia and the host plant. In this work we tried to demonstrate the activity of the lectin isolated from Canavalia brasiliensis (ConBr) and Canavalia ensiformis seeds on the in vitro growth of Rhizobium tropici. The data demonstrate that the lectin ConBr was capable of stimulating, in a significant way, the in vitro growth of Rhizobium tropici. The effect that was found was reverted in the presence of the inhibitory sugar (mannose), suggesting an effective lectin activity. However the lectin ConA didn‟t show any activity on the growth of the microorganisms. The ConBr-FITC conjugates, as been expected, showed interaction between the bacteria surface, these results were similar with those from ConA, although this lectin doesn‟t show any activity in the microbial growth of Rhizobium tropici. The difference between the biological activities of these similar lectins, probably is due to their structure differences in the carbohydrate binding domain.

No description available.

No description available.

Dynamic Combinatorial Chemistry (DCC) is a recently introduced supramolecular approach to generate dynamically interchanging libraries of compounds. These libraries are made of different building blocks that reversibly interact with one another and spontaneously assemble to encompass all possible combinations. If a target molecule, for instance a receptor is added to the system and one or more molecules show affinity to the target species, these compounds will, according to Le Châtelier´s principle, be amplified on the expense of the other non-bonding constituents. To date, only a handful of different systems and formats have been used. Hence, to further advance the technique, especially when biological systems are targeted, new reaction types and new screening methods are necessary. This thesis describes the development of reversible sulfur reactions, thiol/disulfide interchange and transthiolesterification (the latter being a new reaction type for DCC), as means of generating reversible covalent bond reactions. Two different types of target proteins are used, enzymes belonging to the hydrolase family and the plant lectin Concanavalin A. Furthermore, two new screening/analysis methods not previously used in DCC are also presented; the quartz crystal microbalance (QCM)-technique and catalytic self-screening. / QC 20101118