Esse trabalho é sobre a agregação da droga leishmanicida miltefosina e um análogo fluorescente e sua interação com vesículas fosfolipídicas. A leishmaniose é uma doença tropical causada por diferentes espécies do gênero Leishmania que atinge boa parte do mundo e, nas duas últimas décadas, sua manifestação visceral reapareceu de forma preocupante, uma vez que sua letalidade vem aumentando de forma gradativa. Vários medicamentos estão sendo testados, incluindo o análogo lipídico sintético hexadecilfosfocolina (miltefosina), que é um agente antitumoral e antileishmania administrado oralmente que age nas membranas celulares e pode induzir apoptose. O primeiro local de interação dos análogos de fosfolipídios é a membrana celular e eles apresentam atividade citotóxica não específica em concentrações acima da sua concentração micelar crítica, sendo importante o conhecimento de suas propriedades de agregação em meio aquoso e sua forma de interação com outros agregados presentes no meio. Além disso, derivados fluorescentes da miltefosina permitem o uso de técnicas de fluorescência para a caracterização de sua atividade leishmanicida. Neste trabalho examinamos propriedades de agregação da miltefosina (MT) e de seu análogo fluorescente MT-BODIPY em meio aquoso, utilizando técnicas baseadas em medidas de tensão superficial e de espectroscopia de fluorescência, tanto estática como com resolução temporal. Os resultados de cmc da miltefosina, a 25oC utilizando diferentes métodos, foram 60M em meio aquoso puro (água Milli-Q), 50M em tampão fosfato 10mM (pH 7,4), e 35M em tampão fosfato com NaCl 150mM. Através do estudo de vários parâmetros de fluorescência, verificamos que para a MT-BODIPY, um limite superior para sua cmc é de 10M. Utilizando a sonda fluorescente amino-hexadecil-benzamida (Ahba) estudamos a interação entre a miltefosina e vesículas fosfolipídicas de DMPC e DPPC, analisando os espectros de absorção e emissão fluorescente, a anisotropia estática e os decaimentos da intensidade fluorescente e da anisotropia. O conjunto de resultados mostrou que os efeitos do acréscimo de miltefosina às vesículas, no intervalo de razões molares entre 1:100 e 5:100, não são monitorados pela sonda Ahba, uma sonda localizada na região das cabeças polares. Por outro lado, a análise da fluorescência intrínseca da MT-BODIPY mostrou que seu acréscimo, no mesmo intervalo de razões molares, promove desorganização da bicamada lipídica. Como nesse caso o grupo fluorescente localiza-se no final da cadeia alifática, concluimos que os maiores efeitos da miltefosina sobre as bicamadas ocorrem na região interna das cadeias apolares. / This work is about the aggregation of the leishmanicidal drug miltefosine and a fluorescent analogue and their interaction with phospholipid vesicles. Leishmaniasis is a complex of tropical diseases caused by different species of the genus Leishmania which reaches almost the whole world, including Brazil, and, on the last decades, its visceral form reappeared with hundreds of million people at risk of infection, and the mortality rate increases every year. Several drugs have been used to treat the disease, and miltefosine, a synthetic phospholipid analogue, has been tested and it is already used in some countries. This drug has a confirmed antitumor and orally antileishmanial action on the cell membranes, which is the first local of interaction of a phospholipid analogue. The cytotoxic activity is not specific on concentrations above its critical micelle concentration (cmc), and the knowledge of the aggregation properties of the drug in aqueous medium becomes important, as well as its interaction with other aggregates presents in the environment. Fluorescent analogues of miltefosine allow the use of fluorescent techniques to characterize the antileishmanial activity of miltefosine. In this work we have investigated the aggregation properties of the drug miltefosine (MT), and the fluorescent analogue MT-BODIPY in aqueous medium, by using techniques of surface tension measurements and both, steady-state and time-resolved fluorescence spectroscopy. The values of miltefosine cmc at 25°C from different methods were about 60M in pure aqueous medium (Milli-Q water), 50M in phosphate buffer 10mM (pH 7,4), and 35M in phosphate buffer with the addition of NaCl 150mM. The fluorescent probe amino-hexadecyl-benzamide (Ahba) was used to study the interaction of miltefosine with phospholipid vesicles of DMPC and DPPC, from absorption and fluorescent emission spectra, steady-state anisotropy and fluorescence and anisotropy decays. The results have shown that the effects of miltefosine addition in the vesicles, with molar ratios between 1:100 and 5:100, are not monittored by the probe Ahba, which is located on the polar head groups region on the bilayer. On the other hand, analysing the intrinsic fluorescence of the analogue MT-BODIPY, we concluded that when the molecule is added, in the same molar ratio intervals, there is a disorder in the lipidic bilayer. The fluorescent group BODIPY is located on the aliphatic chain of MT, therefore, the more accentuated effects of miltefosine in the bilayers occur in the region of the apolar tails.

Na última década o emprego de nanotecnologia tem crescido exponencialmente em função das suas evidentes vantagens: maior eficácia terapêutica, menor toxicidade e liberação modificada do fármaco. Tais características permitem elevar os níveis do fármaco no compartimento intracelular, além de possibilitar sua liberação modificada no sítio específico. Essas vantagens vem ao encontro da otimização do tratamento da leishmaniose devido à falta de medicamentos seguros e de adequada atividade farmacológica. O objetivo do presente projeto constituiu-se na preparação e na avaliação das características físico-químicas da nanopartícula polimérica associada ao novo fármaco hidroximetilnitrofural (NFOH), desenvolvimento e validação do método analítico para a determinação da eficiência de encapsulação, avaliação a atividade leishmanicida in vitro em promastigotas, em macrófagos infectados por amastigotas de L. amazonensis e citotoxicidade do NFOH livre e nanoestruturado. As nanopartículas poliméricas de poli (butil cianoacrilato) (PBCA) obtidas apresentaram potencial zeta de -10,1 mV, tamanho médio de 151,5 nm, polidispersividade de 0,104 e distribuição unimodal muito próximos ao encontrado na literatura. O método analítico validado apresentou especificidade, linearidade, precisão, exatidão e robustez, mostrando-se adequado para a quantificação do NFOH em nanopartículas, o resultado final da eficiência de encapsulação foi de 64,5%. Os testes realizados em promastigotas e macrófagos infectados por amastigotas de L. amazonensis revelaram a maior atividade do fármaco nanoestruturado em relação ao fármaco livre e ao placebo. Os ensaios de citotoxicidade comprovaram que o fármaco, sistema nanoestruturado contendo NFOH e placebo apresentam baixa toxicidade. Logo, as nanopartículas obtidas contendo NFOH são uma alternativa promissora para o tratamento da leishmaniose. / In the last decade the use of nanotechnology has grown exponentially as a function of its obvious advantages: high therapeutic efficacy, lower toxicity and modified release of the drug. This feature allows raising the levels of the drug in the intracellular compartment, and enables the modified release of the drug in its specific site. These advantages come to meet the optimization of the treatment of leishmaniasis due to lack of drugs that are safe and appropriate pharmacological activity. The goal of this project consisted in the preparation and evaluation of physical and chemical characteristics of polymeric nanoparticle associated with new drug hidroxymethylnitrofurazone (NFOH), development and validation of analytical method for the determination of encapsulation efficiency, evaluating the leishmanicidal activity in vitro in promastigotes and in macrophages infected with amastigotes of L. amazonensis and finally cytotoxicity of free and nanostructured NFOH. The polymeric nanoparticles of poly(butyl cyanoacrylate) (PBCA) obtained showed zeta potential of -10.1 mV, average size of 151.1 nm, polydispersity of 0.104 and unimodal distribution very similar to that found in the literature. The validated method showed specificity, linearity, precision, accuracy and robustness, making it adequate for the quantification of NFOH nanoparticles, the final outcome of the encapsulation efficiency was 64.5%. Tests conducted on promastigotes and macrophages infected with amastigotes of L. amazonensis revealed the highest activity of nanostructured drug compared to free drug and placebo. The cytotoxicity assays showed that the NFOH, nanostructured system containing NFOH and placebo had low toxicity. Thus, the obtained nanoparticles containing NFOH are a promising alternative for the treatment of leishmaniasis.

Dentre as doenças parasitárias tropicais, as causadas por protozoários se apresentam como um grande desafio para a saúde pública, sendo representadas pela leishmaniose e doença de Chagas. Afetam grandes populações marginais ao processo econômico globalizado, e desta forma, não são vistas como mercados potenciais. O presente projeto visou o isolamento de novos compostos naturais de venenos animais com atividade anti-Leishmania e anti-T. cruzi. O presente estudo fracionou por diferentes técnicas cromatográficas, os venenos dos anfíbios Siphonops annulatus, Corythomantis greeningi, Aparasphenodon brunoi e Phyllomedusa hypochondrialis, visando o isolamento de peptídeos e metabólitos secundários através de ensaios biomonitorados. Utilizando-se a espectrometria de massas e seqüenciamento por degradação química de Edman, foi possível a caracterização bioquímica de cinco peptídeos ativos da secreção de Phyllomedusa hypochondrialis, sendo estes a bradicinina, as dermaseptinas 1 e 4 e as filoseptinas 7 e 8. Os peptídeos apresentaram uma Concentração Efetiva 50% (CE50) variando entre 0,7 a 20 ?g/mL em L. (L.) infantum chagasi e T. cruzi, com baixa ou nenhuma citotoxicidade para células de mamíferos nas concentrações testadas. Além disso, a separação química da secreção do anfíbio Siphonops annulatus forneceu uma fração altamente ativa em promastigotas de L. (L.) infantum chagasi, com CE50 0,065 ?g/mL, porém com toxicidade bastante elevada para macrófagos peritoneais e nenhuma seletividade nas formas intracelulares. Estudos ultraestruturais de Leishmania demonstraram severos danos mitocondriais, além da formação de grande vacúolos citoplasmáticos, levando o parasita a morte em poucas horas. O presente estudo demonstrou o potencial de peptídeos e metabólitos secundários de venenos de anfíbios, que se adequadamente estudados, poderão contribuir como novos protótipos de fármacos para a doenças negligenciadas. / Among the tropical parasitic diseases, those caused by protozoa present a major challenge to public health, being represented by leishmaniasis and Chagas disease. Affect large populations marginal to the global economic process, and thus are not seen as potential markets. This project aimed the isolation of new natural compounds in animal venoms with anti-Leishmania activity and anti-T. cruzi. The present study fractionated by different chromatographic techniques, the poisons of the amphibians Siphonops annulatus, Corythomantis greeningi, Aparasphenodon brunoi and Phyllomedusa hypochondrialis, aiming the isolation of peptides and secondary metabolites through bioguided assays. By using mass spectrometry and sequencing by Edman degradation, it was possible to do the biochemical characterization of five active peptides from the poison of Phyllomedusa hypochondrialis, as bradykinin, dermaseptins 1 and 4 and phylloseptins 7 and 8. The peptides showed a 50% Effective Concentration (EC50) ranging from 0.7 to 20 ?g/mL in L. (L.) infantum chagasi and T. cruzi, with little or no cytotoxicity to mammalian cells at the tested concentrations. In addition, the chemical separation of the poison of the amphibian Siphonops annulatus provided a highly active fraction against promastigotes of L. (L.) infantum chagasi, with an EC50 of 0.065 ?g/mL, but highly toxicity to peritoneal macrophages and without selectivity against the intracellular forms of Leishmania. Ultrastructural studies of Leishmania showed severe mitochondrial damages and the formation of large cytoplasmic vacuoles, leading to parasite death within few hours. The present study demonstrated the potential of peptides and secondary metabolites of amphibian poisons, and if adequately studied, may contribute as prototypes of new drugs for neglected diseases.

A leishmaniose visceral constitui grave doença infecciosa causada por um protozoário parasita intracelular obrigatório. Alguns fatores podem alterar a gravidade das manifestações clínicas, sendo um deles a predisposição genética. Este estudo investigou polimorfismos dos genes TGFB1, IL8 e IL6, que são citocinas relacionadas com o desencadeamento e a gravidade da doença, visando identificar fatores de susceptibilidade. Os polimorfismos TGFB1 -509 C/T e TGFB1 +869 T/C, IL8 -251A/T e IL6 -174G/C foram analisados por PCR-RFLP, em 198 pacientes com leishmaniose visceral (LV), 98 indivíduos com infecção assintomática (teste de hipersensibilidade tardia - DTH+) e 100 indivíduos sem evidências de infecção (DTH-). O alelo T na posição -509 do gene TGFB1 conferiu risco duas vezes maior de desenvolver LV ou ser positivo para o teste DTH (p = 0,007, OR = 1,9 [1,19-3,02]), em comparação com indivíduos DTH-. Os resultados sugerem uma associação do polimorfismo TGFB1 -509C/T com a susceptibilidade à LV, podendo contribuir para o desencadeamento da doença clínica. / Visceral leishmaniasis is a serious protozoan infectious disease caused by an obligate intracellular parasite. Some factors can affect the severity of the clinical manifestations; one of which is genetic susceptibility. This study investigated polymorphisms in the TGFB1, IL8 and IL6 genes, which are cytokines related with the onset and severity of the disease, to look for genetic susceptibility factors. Polymorphisms at TGFB1 -509C/T and +869T/C, and IL8 - 251A/T and IL6 -174G/C were analyzed by a PCR-RFLP technique, in 198 patients with Visceral Leishmaniasis (VL), 98 individuals with asymptomatic infection (positive delayed-type hypersensitivity, DTH+) and 100 individuals with no evidence of infection (DTH-). The T allele of the TGFB1 polymorphism in position -509C/T conferred a two risk fold to develop LV or to be DTH+ (p=0.007; OR=1.9 [1.19 - 3.02]) when compared with DTH- individuals. We suggest the TGFB1 -509C/T polymorphism is associated with susceptibility to LV and may contribute to development of the clinical disease.

O objetivo desse trabalho foi: identificar as espécies de flebotomíneos, estimar a taxa de infecção dos flebotomíneos, identificar os agentes etiológicos envolvidos na transmissão da LTA no município de Assis Brasil, Acre. Foi realizada a PCR para a identificação de espécies de Leishmania em amostras de flebotomíneos e biópsias humanas. Um total de 6.850 exemplares foram capturados pertencentes a 66 espécies de flebotomíneos. As espécies mais abundantes foram Lu. auraensis, Lu. davisi, Lu. choti e Lu. shawi. Trinta e dois pools foram positivos para a presença de DNA de Leishmania com uma prevalência mínima de infecção de 1,85% para Lu. davisi e de 2,05% para Lu. auraensis. As espécies de Leishmania detectadas foram: Le. (Viannia) guyanensis e Le. (V.) braziliensis. Além dessas, outras duas espécies de Leishmania foram encontradas a partir das biópsias de lesões: Le. (V.) shawi e Le. (Le.) amazonenses. A doença foi mais prevalente no sexo masculino e residente na zona rural. Esse é o primeiro registro de Le. (V.) shawi e Le. (L.) amazonenses no Acre. / The objectives of this study were: to identify phlebotominae species, to estimate infection rates of phlebotomines, to identify the etiological agents involved in ATL transmission in the municipality of Assis Brasil, Acre. The PCR was used to identify Leishmania species in phlebotomine and human biopsy samples. A total of 6,850 sandflies. comprising 66 species were captured. The most abundant species were Lu. auraensis, Lu. davisi, Lu. choti e Lu. shawi. Thirty-two pools tested positive for the presence of Leishmania DNA, with a minimum infection rate of 1.85% in Lu. davisi and 2.05% in Lu. auraensis. The Leishmania species were identified as Le. (Viannia) guyanensis and Le. (V.) braziliensis. In addition to these, two other Leishmania species were identified from lesion biopsies: Le. (V.) shawi and Le. (Le.) amazonenses. The disease was most common among males (81.6%) e and persons living in rural areas (75.7%). This is the first record of Le. (V.) shawi and Le. (Le.) amazonenses in Acre.

De acordo com a Organização Mundial de Saúde, existem atualmente 17 doenças tropicais negligenciadas prevalentes em 149 países, afetando aproximadamente um bilhão de pessoas, a nível global. A leishmaniose, problema de saúde prevalente nos países em desenvolvimento, é endêmica em aproximadamente 98 países e territórios, com 350 milhões de pessoas em risco e 12 milhões de casos de infecção no mundo. A transmissão da doença ocorre pela picada de flebotomíneos fêmeas infectadas. Essa doença apresenta três formas principais: leishmaniose cutânea (LC), leishmaniose mucocutânea (LMC) e leishmaniose visceral (LV). Enquanto a leishmaniose cutânea é a forma mais comum da doença, a leishmaniose visceral é a mais grave e pode ser fatal se não for tratada. Em 2016, o Brasil reportou 3.626 e 12.690 casos de LC e LV, respectivamente. O candidato a fármaco hidroximetilnitrofural (NFOH) mostrou atividade contra o parasita da doença de chagas e da leishmaniose. Embora o NFOH seja promissor para o tratamento da leishmaniose, esse possui baixa solubilidade em água. A nanotecnologia tem sido empregada como plataforma para o desenvolvimento de formas farmacêuticas inovadoras com maior eficácia e segurança. A redução do tamanho de partículas em escala nanométrica permite aumentar a biodisponibilidade oral de fármacos pouco solúveis em água. Os nanocristais apresentam vantagens, tais como, o aumento da solubilidade de saturação e da velocidade de dissolução, decorrentes do aumento da área superficial da partícula. Além disso, esses apresentam maior adesividade às membranas biológicas, membrana celular e superfície do trato gastrointestinal. No presente trabalho utilizou-se a moagem por via úmida em escala reduzida para a obtenção dos nanocristais de NFOH. Diferentes tensoativos foram avaliados empregando o método selecionado, os tensoativos poloxamer 188 e poloxamer 407 foram os que favoreceram a redução do tamanho das partículas. Tal característica foi observada na caracterização físico-química das nanosuspensões de NFOH. A utilização desse método permitiu a obtenção de nanocristais de NFOH, com diâmetro hidrodinâmico médio (DHM) de 184,8 ± 0,5 a 325,9 ± 2,2 nm, índice de polidispersão (IP) de 0,21 ± 0,01 a 0,57 ± 0,01 e DHM de 191,3 ± 2,1 a 326,8 ± 4,6 nm e IP de 0,21 ± 0,01 a 0,50 ± 0,01, respectivamente para o poloxamer 188 e 407. O uso de ambos os tensoativos resultaram em distribuição monomodal de tamanho das partículas. As formulações foram obtidas por meio de planejamento fatorial completo e experimentos por superfície de resposta tendo como variáreis independentes as concentrações de NFOH, dos tensoativos e o tempo de moagem. A resposta, DHM, foi determinada utilizando espalhamento de luz dinâmica (DLS). Adicionalmente, as avaliações empregando calorimetria exploratória diferencial (DSC) e difração de raio X (DRX) revelaram que não houve interação entre o fármaco e os excipientes, assim como, não foi observada alteração na estrutura cristalina do NFOH. A microscopia eletrônica de varredura demonstrou a morfologia característica do estado cristalino. Além disso, a preparação liofilizada apresentou instabilidade após armazenamento por três meses a temperatura de 25 e 4 °C. / According to the World Health Organization, there are currently 17 neglected tropical diseases prevalent in 149 countries, affecting approximately one billion people globally. Leishmaniasis, a health problem prevalent in developing countries, is endemic in approximately 98 countries and territories, with 350 million people at risk and 12 million cases of infection worldwide. The transmission of the disease occurs by the bite of infected female sandflies. This disease has three main forms: cutaneous leishmaniasis (CL), mucocutaneous leishmaniasis (MCL) and visceral leishmaniasis (VL). While cutaneous leishmaniasis is the most usual form of the disease, visceral leishmaniasis is the most serious and can be fatal if left untreated. In 2016, Brazil reported 3.626 and 12.690 cases of LC and LV, respectively. The drug candidate for hydroxymethylnitrofurazone (NFOH) showed activity against the parasite of chagas disease and leishmaniasis. Although NFOH is promising for the treatment of leishmaniasis, it has low solubility in water. Nanotechnology has been used as a platform for the development of innovative pharmaceutical forms with greater effectiveness and safety. Particle size reduction on the nanoscale enables the oral bioavailability of poorly water-soluble drugs to be increased. Nanotechnology has been used as a platform for the development of innovative pharmaceutical forms, improving effectiveness and safety. Particle size reduction on the nanoscale enables the oral bioavailability of poorly water-soluble drugs to be increased. Nanocrystals have advantages such as increased saturation solubility and dissolution rate due to the increase in the surface area of the particle. In addition, this present greater adhesiveness to the biological membranes, cell membrane and surface of the gastrointestinal tract. In the present work, wet scale milling was used to obtain NFOH nanocrystals. Different surfactants were evaluated using the selected method, poloxamer 188 and poloxamer 407 surfactants favored the reduction of particle size. This characteristic was observed in the physical-chemical characterization of NFOH nanosuspensions. The use of NFOH nanocrystals with a mean hydrodynamic diameter (DHM) of 184.8 ± 0.5 to 325.9 ± 2.2 nm, polydispersity index (IP) of 0.21 ± 0, 01 to 0.57 ± 0.01 for poloxamer 188 and DHM of 191.3 ± 2.1 at 326.8 ± 4.6 nm and IP of 0.21 ± 0.01 at 0.50 ± 0.01 for poloxamer 407, both with monomodal size distribution. The formulations were obtained by means of complete factorial planning and surface response experiments having as independent variables the concentrations of NFOH, surfactants and milling time. The response, DHM, was determined using dynamic light scattering (DLS). In addition, evaluations using differential scanning calorimetry (DSC) and X-ray diffraction (DRX) revealed that there was no change in the crystal structure of NFOH and interaction between the drug and the excipients. Scanning electron microscopy demonstrated the characteristic morphology of the crystalline state. In addition, the lyophilized preparation was instable after storage for three months at 25 and 4 ° C.

As espécies do gênero Leishmania parasitam mamíferos do Novo e Velho Mundo e possuem ciclos de vida com alternância entre vertebrados e invertebrados. A maioria das espécies se desenvolve em artrópodes hematófagos, que podem pertencer a diversas ordens e famílias. A Leishmaniose visceral é uma importante zoonose e possui canídeos silvestres e domésticos como importantes reservatórios conhecidos na diversidade genética de Leishmania infantum chagasi no Brasil ainda não é conhecida. Leishmaniose é uma doença severa com ampla distribuição geográfica com uma incidência de dois milhões de casos por ano e 350 milhões de pessoas em áreas de risco de infecção. O objetivo deste projeto foi avaliar a variação intraespecífica e biogeografia de isolados brasileiros de Leishmania infatum chagasi baseados em genes nucleares e mitocondriais. Os marcadores SSUrDNA, gGAPDH, Citocromo b, Hsp 70, Quitinase e ITS1rDNA foram amplificados, sequenciados e comparados filogeneticamente pelos métodos de parcimônia e bayesiana através de análises concatenadas. As sequencias obtidas apresentaram variabilidade entre 0 e 1% e a topologia gerada não evidenciou diferenças intraespecíficas entre os isolados brasileiros de Leishmania infantum chagasi e consequentemente padrões biogeográficos. Apesar dos resultados obtidos não refletirem a variabilidade esperada, as diversas sequencias obtidas darão subsídios para a determinação e padronização de novos testes diagnósticos da Leishmaniose visceral canina. / The Leishmania species parasite mammals in the New World and have life cycles with alternating between vertebrates and invertebrates. Most species develops in blood-sucking arthropods, which may belong to different orders and families. Visceral leishmaniasis is an important zoonosis and has wild and domestic canids as important known reservoirs and genetic diversity of Leishmania infantum chagasi in Brazil is not yet known. Leishmaniasis is a severe disease with wide geographical distribution with an incidence of two million cases per year and 350 million people at risk in endemic areas. The aim of this study was to evaluate the intraspecific variation and biogeography based on nuclear and mitochondrial genes. The SSUrDNA markers, gGAPDH, cytochrome b, hsp 70, chitinase and ITS1rDNA were amplified, sequenced and compared phylogenetically by maximum parsimony and Bayesian methods in concatenated analysis. The variability of sequences was 0 to 1%, and the topology generated showed no intraspecific differences between Brazilian strains of Leishmania infantum chagasi and consequently biogeographic patterns. Although the results do not reflect the expected variability, the various sequences obtained will provide subsidies for the establishment and standardization of new diagnostic tests of canine visceral leishmaniasis.

A taxa de infecção mínima (TIM) em flebotomíneos é uma informação útil para estudos epidemiológicos em leishmaniose. Quando estes estudos de campo contem grande número de insetos, a PCR é a indicada para caracterização por Leishmania nos vetores. Este estudo avaliou a PCR na identificação da (TIM) natural por Leishmania spp. em Lutzomyia longipalpis e, ao mesmo tempo, determinou as (TIM) por Leishmania spp em uma micro-região endêmica do Estado de São Paulo. Na primeira parte deste estudo, as avaliações do desempenho das PCRs convencional (cPCR) e em tempo real (qPCR) foram realizadas em 66 amostras de conteúdo intestinal de flebotomíneos utilizados no xenodiagnóstico (30 positivas e 36 negativas). O material contido nas lâminas foi transferido para tubos com solução salina estéril e congeladas a -20° C por cerca de 12 meses. Os marcadores moleculares utilizados foram RV1/RV2 para L. (L.) infantum na cPCR; e Linj31 para sub gênero (L.) (Leishmania) na qPCR. Das 30 amostras positivas, 20 (67%) e 21 (70%) foram positivas utilizando os marcadores RV1/RV2 e Linj31, respectivamente. Das 36 amostras negativas no xenodiagnóstico, 2 (5%) foram positivas em todos os marcadores moleculares. Na segunda parte foram analisados insetos capturados durante 2 a 3 noites/mês durante 11 meses (janeiro a novembro de 2012) usando 10 armadilhas automáticas de luz do tipo CDC ao redor de um canil em uma transição entre bairro periurbano e urbano de Dracena. As áreas de captura foram agrupadas em 3 zonas para determinar a TIM. Um total de 1.690 Lu. longipalpis foram capturadas durante o período estudado. Destes, 292 (17,25%) eram fêmeas de flebotomíneos e foram agrupadas em 165 pools (1 a 5 insetos) para extração de DNA e análise por PCR. Resultados positivos para L. (L.) infantum na cPCR e qPCR foram vistos em 7,28% (12/165) e 4,85% (8/165) das amostras, respectivamente. Estes dados confirmam que espécimes capturados na área de estudo estavam infectados por L. (L.) infantum. A TIM durante os 11 meses de capturas foi de 4,10% (292 fêmeas coletadas). Os ecótopos com TIM mais altos foram canil, galinheiro e casa 2. Flebotomíneos infectados estavam presentes nos locais de captura com abundância de hospedeiros. O maior número de pools positivos (6/93) foi obtido no galinheiro, todavia a maior TIM foi obtido em um domícilio (1/6) 16,67%. / The minimum infection rate (MIR) in sandflies is a useful information for epidemiological studies on leishmaniasis. When these field studies consider large numbers of insects, PCR is indicated for identification and characterization of Leishmania in the vectors. This study evaluated a PCR in the identification of natural (MIR) by Leishmania spp. in Lutzomyia longipalpis and, at the same time, determined MIR by Leishmania spp in a micro region endemic in São Paulo State . In the first part of this study, the performance evaluation of conventional PCR (cPCR) and real-time PCR (qPCR) were carried out on 66 intestinal contents samples of non-xenodiagnostic sandflies (30 positive and 36 negative). The material contained in the slides was transferred to tubes with sterile saline solution and frozen at -20 ° C for about 12 months. The molecular markers used were RV1 / RV2 for L. (L.) infantum in cPCR; E Linj31 for sub genus (L.) Leishmania on qPCR. From the 30 positive samples, 20 (67%) and 21 (70%) were positive using the RV1 / RV2 and Linj31 markers, respectively. From the 36 negative xenodiagnostic samples, 2 (5%) were positive in all molecular markers. In the second part, we analyzed insects captured during 2 to 3 nights / month for 11 months (January to November 2012) using 10 CDC automatic light traps around a kennel in a transition between urban and suburb of Dracena. Capture areas were grouped into 3 zones to determine MIR. A total of 1,690 Lu. longipalpis were captured during the study period. From these, 292 (17.25%) were female sand flies and were grouped into 165 pools (1 to 5 insects) for DNA extraction and PCR analysis. Positive results for L. (L.) infantum in cPCR and qPCR were seen in 7.28% (12/165) and 4.85% (8/165) of the samples, respectively. These data confirm that the specimens captured in the study area were infected by L. (L.) infantum. The MIR during the 11 months of captures was 4.10% (292 females collected). The highest MIR ecotopes were kennel, chicken coop and house 2. Infected sandflies were presented at capture sites with host abundance. The highest number of positive pools (6/93) was obtained in henhouse, however the highest MIR was obtained in a domicile (1/6) 16.67%.

Foram selecionados aleatoriamente 38 cães naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi oriundos de Araçatuba, São Paulo, área endêmica para leishmaniose visceral, e os quais foram distribuídos em dois grupos: o primeiro com 24 cães sintomáticos e, o outro, composto por 14 animais assintomáticos. Correlacionou-se a caracterização clínica (assintomáticos ou sintomáticos) com os: potencial em infectar o inseto vetor, padrão inflamatório da pele, perfil de imunidade celular e parasitismo tegumentar desses cães. Quanto ao número de formas amastigotas/mm2 no tegumento, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p = 0,1584), sendo que a densidade de parasitos na pele mostrou uma correlação positiva moderada com os títulos de anticorpos anti-Leishmania (p = 0,042). Quanto à infectividade ao vetor, evidenciada pelo xenodiagnóstico, 16 (66,7%) cães sintomáticos e 13 (93%) assintomáticos foram capazes em transmitir Leishmania aos flebotomíneos, dentre estes, respectivamente, seis (37,5%) e oito (61,5%) animais não apresentavam parasitismo cutâneo, embora todos, de ambos os grupos, tenham sido positivos quando da pesquisa de parasitos no linfonodo poplíteo. Observou-se um maior percentual de transmissibilidade para o vetor a partir de cães assintomáticos (p = 0,0494). As alterações histológicas cutâneas foram similares em ambos os grupos e se caracterizaram, de modo geral, por um infiltrado inflamatório, ora focal ora difuso, na derme, constituído, principalmente, por células mononucleares (macrófagos, linfócitos e plasmócitos), variando de discreto a intenso. Quanto à caracterização da resposta imune celular no tegumento dos animais, somente a densidade (células/mm2) de células iNOS+ foi significantemente maior na derme dos cães sintomáticos quando comparado aos assintomáticos (p = 0,0368). Observou-se correlação positiva moderada entre a densidade de parasitos na pele e a densidade de macrófagos (p = 0,031), de células T CD4+ (p = 0,015) e CD8+ (p = 0,023), e, também, naquela de células iNOS+ relativamente a de células T CD3+ (p = 0,005), CD4+ (p = 0,001) e CD8+ (p = 0,0001). Verificou-se, ainda, correlação negativa moderada com o número de manifestações clínicas e/ou gravidade da enfermidade (p = 0,028), confirmando, assim, maior transmissibilidade de parasitos ao vetor, a partir de animais assintomáticos, demonstrando-se, dessa forma, que tais cães são fontes de infecção em potencial para insetos vetores em áreas endêmicas para leishmaniose visceral canina. / Thirty-eight dogs naturally infected by Leishmania (Leishmania) infantum chagasi were randomly selected from Araçatuba of São Paulo state (Brazil), an endemic area for visceral leishmaniasis. The subjects were distributed into two groups: the first comprising 24 symptomatic dogs and the second consisting of 14 asymptomatic dogs. Possible correlations of clinical characterization (in both symptomatic and asymptomatic subjects) with potential to infect the insect vector, skin inflammatory pattern, cutaneous cellular immunity profile and cutaneous parasitism were investigated. Regarding to the number of cutaneous leishmania amastigotes/mm2, there was not a significant difference between the groups (p = 0.1584); density of skin parasites showed a moderate positive correlation with anti-Leishmania antibody titers (p = 0.042). Concerning to the infectivity to the insect vector, as evidenced by xenodiagnosis, 16 (66.7%) symptomatic and 13 (93%) asymptomatic dogs were able to transmit Leishmania to phlebotomines. Among these, six (37.5%) and eight (61.5%) dogs, respectivelly, did not show cutaneous parasitism, although all participant dogs were found positive when searching for parasites in the popliteal lymph nodes. Asymptomatic dogs showed higher transmissibility to the vector than symptomatic ones (p = 0.0494). Histological features in the skin were similar in both groups and were generally characterized by an inflammatory infiltrate, either diffuse or focal, in the dermis, mainly consisted of mononuclear cells (macrophages, lymphocytes and plasma cells), varying from mild to intense. Concerning characterization of the cutaneous cellular immune response, only iNOS+ cells density (cells/mm2) was significantly higher in the dermis of the symptomatic dogs compared to the asymptomatic ones (p = 0.0368). Moderate positive correlation between the cutaneous parasites density and the macrophages density (p = 0.031), the CD4+ T cells (p = 0.015) and CD8+ T cells (p = 0.023) were observed. Furthermore, density of iNOS+ cells in relation to CD3+ T cells (p = 0.005), CD4+ T cells (p = 0.001) and CD8+ T cells (p = 0.0001) were found positively correlated at a moderate level. It was also found a moderate negative correlation between cutaneous parasites density and the number of clinical signs and/or disease severity (p = 0.028), confirming grater parasites transmission to the vector from asymptomatic animals. It was therefore demonstrated that these dogs are potential sources of infection to insect vectors in endemic areas for canine visceral leishmaniasis.

A Leishmaniose Visceral Canina é uma doença na qual o ciclo de transmissão envolve a interação de vetores, parasitas, reservatórios e hospedeiros além de componentes ambientais, sociais, e biológicos, que tornam complexa a compreensão da dinâmica desta doença nas regiões endêmicas. Este estudo epidemiológico transversal de tipo caso controle objetivou a identificação de fatores sociodemográficos, socioeconômicos, ambientais, da dinâmica populacional canina e do estilo de vida dos cães, associados à ocorrência de Leishmaniose Visceral Canina no município de Panorama, estado de São Paulo, Brasil. Para a identificação destes fatores foi realizada um inquérito epidemiológico nos domicílios com cães positivos e negativos a Leishmaniose Visceral diagnosticados por sorologia no anos 2012 e 2013. Mediante um modelo de regressão logística foram considerados como fatores de risco para a ocorrência de Leishmaniose Visceral Canina: cães não castrados, cães que dormem fora de casa, famílias com renda inferior a três salários mínimos, presença de vegetação próximo do domicilio, não ter vidro na janela, ter vasos com plantas, ter arvores no quintal e aquisição de um cão no último ano. O desenvolvimento deste trabalho auxilia no programa de prevenção e controle da Leishmaniose Visceral Canina do Município de Panorama, mediante a identificação dos principais fatores de risco determinantes para a manutenção da doença. Este estudo demonstrou a presença de fatores de risco sujeitos a modificações por parte da população e das autoridades sanitárias que poderiam contribuir para a redução do risco de transmissão da doença em Panorama, sendo elas: a ordenação do ambiente no peri-domicílio pela redução de matéria orgânica e entulho que poderiam servir como local para reprodução e abrigo da população vetora, a modificação da relação com os cães de modo a aumentar a supervisão e a promoção do uso de medidas de proteção individual (coleira, repelentes, vacina) para a proteção da população canina nesta localidade. / Canine Visceral Leishmaniasis is a disease in which the transmission cycle involves the interaction of vectors, parasites, as well as reservoir hosts and environmental, social, and biological factors, making it very complex to understand the dynamic of this disease in endemic regions. This cross-sectional case-control epidemiological study aimed to identify risk factors for the occurrence of Canine Visceral Leishmaniasis in the city of Panorama, São Paulo, Brazil. An epidemiological survey was done to identify sociodemographic, socioeconomics, environmental, canine population dynamics and dogs life style factors, in households with positive and negative dogs diagnosed by serology in the years 2012 and 2013 in the city of Panorama. A logistic regression model was developed to take into account risk factors for the occurrence of Canine Visceral Leishmaniasis: intact dogs, dogs sleeping away from home, families with lower income, vegetation near the households, windows with no glass panels, potted plants, the presence of trees in the yard and the acquisition of a dog in the last year. The development of this work helps in the prevention and control program of Canine Visceral Leishmaniasis in the city of Panorama by the management of the determinant risk factors that maintain the disease. This study demonstrated the presence of some risk factors that are subject to modifications by the population and the health authorities and that could produce a reduction in the risk of disease transmission in Panorama: environmental ordination in areas around the houses with reduction of organic matter and rubbish that could serve as a place for the reproduction and shelter of the vector population, and the modification of the relationship with dogs promoting the use of individual protective measures (collar, repellents, vaccine etc.) to contribute to the protection of the dog population in this locality.