A irradiação do sangue humano é usada para evitar a TA-DECH (\"transfusão associada a doença do enxerto contra hospedeiro\"), um raro mas devastador efeito adverso dos leucócitos presentes em componentes de sangue de doadores. Normalmente esta prática de irradiação é executada para a eliminação física de leucócitos. A implementação de procedimentos permitirá que a dose apropriada, dentro de uma faixa de 25 Gy a 50 Gy, seja absorvida pelas bolsas de sangue coletadas em um banco de sangue. Os estudos para estabelecer os procedimentos de BPF (Boas Práticas de Fabricação) foram desenvolvidos baseados na norma ISO 11137 Esterilização de produtos médicos Requisitos para validação e controle de rotina Esterilização por radiação. Dois sistemas dosimétricos foram usados para o mapeamento de dose durante os estudos da qualificação do irradiador, carregamento de produto, validação de processo de irradiação e auditoria. O dosímetro CaSO4:Dy apresentou dificuldades em relação à incerteza na medição da dose, estabilidade, rastreabilidade e calibração. Os dosímetros PMMA e Gafchromic mostraram uma melhor performance e foram adotados para estudos de qualificação de irradiadores necessários para a implantação de BPF. Os testes de irradiação foram realizados em um irradiador Gammacell 220. Os procedimentos desenvolvidos podem ser adaptados para diferentes tipos de irradiadores gama, permitindo a implantação de um programa de garantia da qualidade e BPF para irradiação de sangue. / The irradiation of human blood is used to avoid the TA-GVHD (transfusion-associated graft-versus-host-disease), a rare but devastating adverse effect of leukocytes present in blood components for a immunocompetent transfusion recipients. Usually this irradiation practice is performed to a physical elimination of leukocytes. The implementation of the procedures will assure that the properly dose in a range of 25 Gy to 50 Gy will be delivered to the blood in the bag collected in a blood tissue bank. The studies of the procedures in order to establish a GMP (Good Manufacturing Practices) were developed under the guidelines of the standard ISO 11137 Sterilization of health care products Requirements for validation and routine control Radiation sterilization. In this work, two dosimetric systems were used for dose mapping during the studies of irradiator qualification, loading pattern, irradiation process validation and auditing. The CaSO4:Dy dosimeter presented difficulties concerning to uncertainty on dose measurement, stability, traceability and calibration. The PMMA and Gafchromic dosimetric systems have shown a better performance and were adopted on studies of irradiators qualification that are necessary to implementation of GMP. The irradiation tests have been done in a Gammacell 220 irradiator. The developed procedures can be adapted for different kinds of gamma irradiators, allowing implanting a quality assurance program and a GMP for blood irradiation.

Hidroquinona (HQ) é um dos metabólitos do benzeno responsáveis pelos efeitos tóxicos da exposição ao solvente, além de ser componente da dieta, medicamentos, cigarro e poluente do meio ambiente. Considerando a imunotoxicidade desta substância, o grupo de pesquisa do laboratório investiga o papel da exposição à HQ por período prolongado de tempo sobre respostas inflamatórias agudas (RIA). Neste contexto, o presente trabalho avaliou os efeitos desta exposição sobre os mecanismos vasculares e celulares da RIA de diferentes doses diárias de HQ (5, 10 ou 50 mg/kg) em ratos Wistar machos, via i.p., por 17 ou 22 dias, uma vez ao dia, com intervalos de 2 dias a cada 5 doses. Animais controles receberam o veículo (salina com 5% etanol). A resposta inflamatória aguda inata foi induzida pela administração de glicogênio de ostra (1% em PBS, 5 mL) na bolsa subcutânea dorsal ou pela instilação de lipopolissacarídeo de Salmonella abortus (LPS; 100 µL de solução 100 µg/mL); A resposta inflamatória aguda adquirida foi provocada pela inalação de ovalbumina (10 mL de solução de OA 1% PBS, 15 min) em animais previamente sensibilizados (10 µ/100mg AI(OH)3 no décimo dia de exposição). Os resultados obtidos mostraram que: 1) o aumento do número de leucócitos na bolsa dorsal de animais expostos a 50 mg/kg de HQ é dependente, pelo menos em parte, da maior interação de leucócitos circulantes à parede vascular da microcirculação, mas não é decorrente de alterações na reatividade microvascular; o aumento de expressão de moléculas de adesão (β2 integrina), que pode ser a responsável pelo aumento de interaçãoleucócito-endotélio e migração celular; 2) a redução da migração de leucócitos para o pulmão inflamado pelo LPS em animais expostos a HQ, nas menores doses, não foi decorrente de modificações na interação leucócito-endotélio, nem da expressão de moléculas de adesão nos leucócitos circulantes ou na célula endotelial do tecido pulmonar; 3) a redução da migração celular para o pulmão durante a RIA alérgica em animais expostos a 5, 10 ou 50 mglkg de HQ é dependente, pelo menos em parte, da menor concentração de anticorpos anafiláticos circulantes e conseqüentemente da desgranulação reduzida de mastócitos teciduais, visualizados no leito mesentérico após desafio in situ pela OA. A menor produção de anticorpos anafiláticos pode ser decorrente da ação da HQ em diferentes tipos celulares, uma vez que foi observada expressão reduzida de moléculas co-estimulatórias em linfócitos do baço (CD45R e CD6), menor atividade microbicida de macrófagos peritoniais frente a Candida albicans e menor secreção de interferon-γ por células do peritônio. Em conjunto, os resultados apresentados mostram os mecanismos da HQ sobre a resposta do organismo ao trauma de diferentes origens, interferindo com tipos celulares distintos envolvidos nas reações. / Hydroquinone (HQ) is one of the metabolites of benzene responsible for the toxic effects of exposure to solvent, as well as being part of the diet, medicines, tobacco and polluting the environment. Considering the immunotoxicity of this substance, our laboratory has investigated the role of exposure to HQ by prolonged period of time on acute inflammatory responses (AIR). In this context, this study evaluated the effects of this exposure on the vascular and cellular mechanisms of AIR of different daily doses of HQ (5, 10 or 50 mg/kg) in male rats, via ip, for 17 or 22 days, a once a day, with intervals of 2 days every 5 doses. Control animais received the vehicle (saline with 5% ethanol). Innate AIR was induced by the administration of oysters glycogen (1% in PBS, 5 mL) into subcutaneous back pouch or by instillation of lipopolysaccharide of Salmonella aborius (LPS, 100 µL of solução100 µg/mL); Allergic AIR gained was caused by inhalation of ovalbumin (10 mL solution of 1% OA in PBS, 15 min) in previously sensitized animal (10 µ/100mg AI (OH)3 on the tenth day of exposure). Results showed that: 1) the increased number of white blood cells back into the pouch of animais exposed to 50 mg/kg of HQ is dependent, at least in part, of higher interaction of circulating leukocytes to the vascular wall of the microcirculation, but is not due to changes in microvascular reactivity; an increase of expression of molecules of accession (β2 integrin), which may be responsible for the enhanced interaction of leukocyteendothelial and cell migration 2) the reduced migration of leukocytes into the lung inflamed by LPS in animals exposed to 5 or 10 mg/kg was not due to changes in the interactions of leukocyte to endothelium, either the expression of adhesion molecules in circulating white blood cells or in cell endothelial lung tissue, 3) the reduced cell migration to the lungs during the AIR allergic to animais exposed to HQ, in lower doses, is dependent on lower concentration of· circulating anaphylactics antibodies which may be responsible for the mast cell desgranulation. The lower amount of anaphylatic antibodies in the circulation may be due to action of HQ in different cells, as reduced expression of co-stimulatory molecules by Iymphocytes (CD45R and CD6), lower microbicide activity of macrophages and reduced secretion of interferon-γ by peritoneal cells were detected. Together, the results show the toxicity of HQ on the body\'s response to trauma from different sources, interfering with different cell types involved in the reactions.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-12T20:54:45Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Marcio Tavares Costa.pdf: 1603225 bytes, checksum: 56077ca53540d1e03d5e586689091d43 (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-12T20:56:36Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Marcio Tavares Costa.pdf: 1603225 bytes, checksum: 56077ca53540d1e03d5e586689091d43 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-12T20:56:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Marcio Tavares Costa.pdf: 1603225 bytes, checksum: 56077ca53540d1e03d5e586689091d43 (MD5) Previous issue date: 2016-07-15 / Philodryas patagoniensis é uma serpente opistóglifa comum no Rio Grande do Sul. Sua peçonha, produzida na glândula Duvernoy, constitui-se basicamente por metaloproteinases. Compostos biologicamente ativos que, assim como outros extratos naturais, são alvos de pesquisas na busca por agentes farmacológicos. No entanto, em conjunto, os mesmos devem passar por testes para caracterizar seus efeitos toxicológicos. Estes exames permitem definir se o composto analisado é capaz de causar danos à saúde humana, diagnosticar seus possíveis locais de ação, além de apontar tratamentos em casos de intoxicações e envenenamentos. Assim, a presente dissertação visa avaliar os potenciais toxicológicos da peçonha de P. patagoniensis: citotoxicologia e genotoxicologia. Para tanto, espécimes de P. patagoniensis foram capturados para a extração da zootoxina, a qual teve sua concentração proteica determinada por método colorimétrico de Bradford. A determinação da toxicidade aguda foi realizada em Artemia salina. Para avaliar a citotoxicidade e a genotoxicidade utilizou-se o teste de exclusão de azul de Tripan e ensaio Cometa em leucócitos mononucleares humanos, respectivamente. Ao final, testou-se a presença de atividade DNase na peçonha via difusão radial em agarose, e sua capacidade de gerar estresse oxidativo em náuplios de A. salina. Os resultados indicaram uma concentração proteica média de 115,7 mg/mL nos pools de veneno extraídos, os quais apresentaram uma DL50 de 461 μg/mL em A. salina, dose que o caracteriza como tóxico para este modelo experimental. Ao testar a toxina nas concentrações de 55, 110, 220, 575 e 1150 μg/mL, sua capacidade citotoxicológica e genotoxicológica foi significativa nas duas maiores concentrações. A atividade DNase foi ausente, no entanto, o estresse oxidativo foi detectado pela presença de biomarcadores. Foi possível estabelecer uma relação direta entre a toxicidade aguda em A. salina, a citotoxicidade e a genotoxicidade apurada, pois as doses letais para as artêmias causaram danos significativos, enquanto que as subletais não obtiveram diferença expressiva. Entre as possíveis razões para esta toxicidade, o estresse oxidativo desencadeado pela zootoxina demonstra estar relacionado aos danos encontrados. / Philodryas patagoniensis is a common opisthoglyphous serpent in Rio Grande do Sul State. Its venom produced in Duvernoy’s gland consists mainly of metalloproteinases. Compounds biologically active which, like other natural extracts, are research targets in pursuit of pharmacological agents. However, together, should go through tests to characterize their toxicological effects. These tests allow you to define whether the analysed compound is able to cause damage to human health, diagnose its possible sites of action, in addition to point treatments in cases of intoxications and poisonings. Thus, the dissertation aims to evaluate the potential toxicity of P. patagoniensis venom: cytotoxicology and genotoxicology. Therefore, P. patagoniensis specimens were captured for the extraction of the zootoxin, which had its protein concentration determined by Bradford colorimetric method. Determination of acute toxicity was conducted in Artemia salina. To assess the cytotoxicity and genotoxicity used the exclusion of Trypan blue test and Comet assay in human mononuclear leukocytes, respectively. Finally, tested the presence of DNase activity in the venom via radial diffusion in agarose, and venom’s ability to generate oxidative stress in nauplii of A. salina. The results indicated a mean protein concentration of 115.7 mg/mL in pools of venom extracted, which showed an LD50 of 461 μg/mL in A. salina, dose that characterizes as toxic to this experimental model. When the toxin was tested at concentrations of 55, 110, 220, 575 and 1150 μg/ml, its cytotoxicology and genotoxicology capacity were significant in two largest concentrations. The DNase activity was absent, however, oxidative stress was detected by the presence of biomarkers. It was possible to establish a direct relationship between the acute toxicity in A. salina, cytotoxicity and genotoxicity found, because the lethal doses for brine shrimp caused significant damage, while sublethal did not obtain significant difference. Among the possible reasons for this toxicity, oxidative stress triggered by zootoxin shown to be related to the damage found.

O quelônio Phrynops geoffroanus aparece freqüentemente associado a cursos d\'água poluídos, sem que, no entanto, sejam conhecidos aspectos que descrevam sua atividade imune celular frente situações adversas (efeitos antrópicos). A citometria de fluxo permite mensurar características estruturais e imunológicas de células em suspensão submetidas a um fluxo contínuo, sendo capaz de analisar inúmeros tipos celulares. Neste trabalho foi desenvolvida metodologia para estudar e avaliar a função celular de leucócitos sangüíneos do Phrynops geoffroanus através da fagocitose e burst oxidativo espontâneo e induzido utilizando a citometria de fluxo. Para definir a metodologia foram utilizadas 86 amostras sangüíneas de Phrynops geoffroanus encontrados em ambientes antrópicos do rio Piracicaba, ribeirão Piracicamirim e Fundação Parque Zoológico de São Paulo como grupo de comparação. Estes resultados foram complementados pelo perfil hematológico. O processamento incluiu transporte e conservação das amostras em RPMI 1640 Gibco® para posterior utilização de Ficoll-PaqueTM PLUS como agente separador entre leucócitos e hemácias, utilizando-se centrifugações refrigeradas (18°C) com acelerações e desacelerações graduais. Amostras com porcentagens de viabilidade inferiores a 90 % não foram utilizadas na realização dos estímulos: Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) Bio Particles®, Alexa Fluor® 594 conjugate para induzir fagocitose e miristato acetato de phorbol (PMA) e Saccharomyces cerevisiae (Zymosan) na indução do burst oxidativo. Condições ambientais, espécie específica e da metodologia da citometria de fluxo determinaram uma melhor resposta para realização da fagocitose em comparação com o burst oxidativo dos leucócitos aqui avaliados. / The freshwater turtle Phrynops geoffroanus is frequently associated with polluted waters; however, the aspects that describe the cellular immune activity against adverse situations (anthropogenic effects) are still unknown. Flow cytometry allows us to measure and analyze the characteristics of the suspended cells when submitted to a continuous flow; it is capable of analyzing a number of different types of cells. In this study, it designed a methodology in order to study and evaluate the cellular function of blood leucocytes, through phagocytosis and spontaneous or induced oxidative bursts, using flow cytometry. This methodology, was designed with 86 blood samples, collected from Phrynops geoffroanus in anthropogenic environments of the river Piracicaba and its tributary Piracicamirim and the Sao Paulo Zoological Park Foundation, as a comparison group, all in Sao Paulo State, Brazil. These results were complemented with the blood profile. The samples were stored in RPMI 1640 Gibco®, medium for transportation. Initially, it was used Ficoll-PaqueTM PLUS, as a separator of leucocytes and red blood cells. Later the samples were centrifuged at 18°C, with gradual break and speed. Samples with viability percentage under 90% were not used. The agents used for stimulation were Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) Bio Particles®, Alexa Fluor® 594 conjugate to induce phagocytosis and phorbol miristate-acetate (PMA) and Saccharomyces cerevisiae (Zymosan) to induce oxidative burst. Environmental, species-specific and cytometric methodology conditions determined a better response for the occurrence of phagocytosis in comparison with oxidative burst of the leucocytes analyzed.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-02-02T11:50:38Z No. of bitstreams: 1 arquivo total.pdf: 1446130 bytes, checksum: b1ef9c5052fd39babcc817cb3607f741 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-02T11:50:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivo total.pdf: 1446130 bytes, checksum: b1ef9c5052fd39babcc817cb3607f741 (MD5) Previous issue date: 2016-02-18 / Systemic low-grade inflammation has a significant impact on human health and longevity, and nutrients appear to be able to modulate this inflammatory state. In this context, the present study aimed to assess the relationship between inflammatory markers and habitual consumption of iron and fats in general in an elderly population. A cross-sectional epidemiological design was adopted, using a stratified sample of the elderly population of the city of João Pessoa / Paraíba / Brazil. The study included 171 older adults aged over 60 years from different socio-economic conditions, with or without chronic degenerative diseases and in use or not of drugs. Socio-economic, demographic, epidemiological and food consumption data were collected and nutritional assessment and biochemical analyses were performed. The average intake of total, saturated, monounsaturated and polyunsaturated fat was 32.56 ± 26.31 (g / day) 8.69 ± 5.69 (g / day), 7.39 ± 4.98 (g / day) 6.63 ± 1.51 (g / day), respectively. The average iron consumption was 7.9 ± 2.97 (mg / day) and the amount of calories was 1260.85 ± 304.42 (kcal / day). Through multiple linear regression, a relationship between CRP concentrations and habitual consumption of saturated fat (p = 0.009) and usual iron intake (p = 0.045) was observed, demonstrating that as the saturated fat intake increases by 1g, CRP concentrations increase by 1.43 mg / dL and when iron consumption increases by 1mg, CRP values increase by 0.1493 mg / dL, compared to the consumption of monounsaturated fat, and when this consumption increases by 1g, CRP concentrations decrease by 0.23 mg / dL (p = 0.008) and when BMI increases by 1kg / m², CRP concentrations increase by 0.11 mg / dL (p = 0.001). The same regression model was applied to white blood cells and hemoglobin, and no relationship between these study variables was found. Based on correlations between CRP levels and usual food intake, adequate intake of fats and iron would be even more justified, considering their importance in the adjustment of CRP values and, consequently, in the prevention of chronic diseases. / RESUMO A inflamação sistêmica de baixo grau tem um impacto significativo na saúde humana e longevidade, sendo que os nutrientes parecem ser capazes de modular esse estado inflamatório. Neste contexto, a presente pesquisa teve como objetivo principal avaliar a relação entre marcadores inflamatórios e o consumo habitual de ferro e gorduras em geral em uma população de idosos. Adotou-se delineamento epidemiológico transversal, utilizando-se uma amostragem estratificada da população de idosos do município de João Pessoa/Paraíba/Brasil. Participaram do estudo 171 idosos com idade acima de 60 anos, de diferentes condições socioeconômicas, portadores ou não de doenças crônico-degenerativas e em uso ou não de medicamentos. Foram coletados dados socioeconômicos, demográficos, epidemiológicos e de consumo alimentar e realizaram-se a avaliação nutricional e análises bioquímicas. O consumo médio de gordura total, saturada, monoinsaturada e poli-insaturada foram de 32.56 ± 26.31 (g/dia), 8.69 ± 5.69 (g/dia), 7.39 ± 4.98 (g/dia) e 6.63 ± 1.51 (g/dia), respectivamente. O consumo médio do ferro foi 7.09 ± 2.97 (mg/dia) e a quantidade de calorias, 1260.85 ± 304.42 (kcal/dia). Através da regressão linear múltipla, observou-se relação entre as concentrações de PCR e o consumo habitual de gordura saturada (p=0,009) e consumo habitual de ferro (p=0,045), demonstrando que à medida que o consumo de gordura saturada aumenta em 1g as concentrações de PCR aumentam em 1.43 mg/dL e quando o consumo de ferro aumenta em 1mg os valores de PCR aumentam em 0.1493 mg/dL. Em relação ao consumo de gordura monoinsaturada, quando esse consumo aumenta em 1g as concentrações de PCR diminuem 0,23 mg/dL (p= 0,008) e quando o IMC aumenta em 1kg/m² as concentrações de PCR aumentam em 0.11 mg/dL (p= 0,001). O mesmo modelo de regressão foi aplicado aos leucócitos e hemoglobina, e não se encontraram relações entre essas variáveis do estudo. Com base nas correlações encontradas entre os valores de PCR e o consumo alimentar habitual mencionado, a ingestão adequada de gorduras e ferro seria ainda mais justificada, considerando também a sua importância na adequação dos valores de PCR e, consequentemente, na prevenção das doenças crônicas não transmissíveis.

Made available in DSpace on 2015-04-17T15:03:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 820384 bytes, checksum: 3a4f59492492f300381b1848655d3407 (MD5) Previous issue date: 2014-03-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The intake of vitamins with antioxidant effect may contribute to the betterment of the elderly s health, well-being, and longevity. In this context, the present research had as it main objective to assess the relation among high sensitivity C-Reactive Protein (hs-CRP), leukocytes and lymphocytes and the habitual eating intake of vitamins with antioxidant effect, while taking into consideration the lack of study on it. The cross-sectional epidemiological design was the one adopted using a stratified representative sample of the elderly population from the city of João Pessoa/Paraíba/Brazil. The study included 174 elderly people aged between 60 and 90 years old, from different socioeconomic conditions, with or without chronic-degenerative diseases, taking some medicine or not. Questionnaires were applied to obtain socioeconomic, demographic, epidemiological and food consumption information and there were nutritional assessment and biochemical analyzes. Regarding the habitual intake of vitamins with antioxidant effect, the average consumption of vitamin A, β-carotene, vitamin E and vitamin C were 1994,39±1421,24 (μg RAE/day), 5959,29±4739,66 (μg/day), 6,01±4,44 (mg/day) e 162,10±118,12 (mg/day), respectively. To verify the correlation among the variables of the study, Spearman correlation coefficient was used. There was a negative correlation between the values of leukocytes and vitamin E (r = -0.29, p = 0.0316), β - carotene (r = -0.32, p = 0.0189) and vitamin A (r = - 0.36, p = 0.0062). No significant correlation was found between the values of leukocyte and vitamin C, as well as between PCR-us and the habitual eating intake of these vitamins. No relation was found among study variables when the multiple linear regression was applied. Based on the correlations found, for the first time in elderly, among the values of leukocytes with vitamin B, β-carotene, and vitamin E, the intake of these vitamins would be even more taking into consideration also its importance in the adequacy of the leukocyte values. / O consumo de vitaminas de ação antioxidante pode contribuir para a promoção da saúde, do bem-estar e longevidade em idosos. Neste contexto, a presente pesquisa teve como objetivo principal avaliar a relação entre os valores de proteína c-reativa ultra sensível (PCR-us), leucócitos e linfócitos e o consumo alimentar habitual de vitaminas com ação antioxidante, considerando a inexistência de estudo. Adotou-se delineamento epidemiológico transversal, utilizando-se uma amostragem estratificada da população de idosos do município de João Pessoa/Paraíba/Brasil. Participaram do estudo 174 idosos com idade entre 60 e 90 anos, de diferentes condições socioeconômicas, portadores ou não de doenças crônico-degenerativas e em uso ou não de medicamentos. Aplicaram-se questionários para obtenção de informações socioeconômicas, demográficas, epidemiológicas e de consumo alimentar e realizaram-se a avaliação nutricional e análises bioquímicas. Quanto ao consumo alimentar habitual das vitaminas com ação antioxidante, o consumo médio de vitamina A, β-caroteno, vitamina E e vitamina C foram de 1994,39±1421,24 (μg RAE/dia), 5959,29±4739,66 (μg/dia), 6,01±4,44 (mg/dia) e 162,10±118,12 (mg/dia), respectivamente. Para verificar a correlação entre as variáveis do estudo utilizou-se o coeficiente de correlação de Spearman. Houve correlação negativa entre os valores de leucócito e vitamina E (r = -0,29, p = 0,0316), β-caroteno (r = - 0,32, p = 0,0189) e vitamina A (r = -0,36, p = 0,0062). Não foi encontrada correlação significativa entre os valores de leucócito e vitamina C, como também entre PCR-us e o consumo alimentar habitual dessas vitaminas. Não encontrou-se relação entre as variáveis do estudo ao aplicar-se a regressão línea múltipla. Com base nas correlações encontradas entre os valores de leucócitos e as vitaminas mencionadas, a ingestão dessas vitaminas, seria ainda mais justificada, considerando-se também, a sua importância na adequação dos valores de leucócitos.

Diferentes populações de leucócitos desempenham papeis fundamentais na eliminação de agentes invasores através da sua fagocitose e destruição, utilizando-se de mecanismos dependentes (metabolismo oxidativo) e independentes de oxigênio. Baseando-se na hipótese de que o vírus da Leucose Enzoótica Bovina, uma enfermidade crônica, que afeta, particularmente, os órgãos ricos em tecido linfóide destes animais, altera quantitativa e qualitativamente as subpopulações de leucócitos circulantes dos bovinos, influenciando na qualidade da resposta imunológica inata destes animais, o presente estudo avaliou a produção intracelular de peróxido de hidrogênio (H2O2) por leucócitos circulantes, frente estímulo in vitro com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), lipopolissacarídeos de Escherichia coil (LPS) e após fagocitose de Staphylococcus aureus conjugados com iodeto de propídio (Sa-PI). Para tal, células foram obtidas de cinco vacas negativas no diagnóstico para LEB, de cinco vacas naturalmente infectadas pelo vírus da leucose bovina (VLB), alinfocitóticas, e de cinco vacas infectadas, manifestando linfocitose persistente (LP), e analisadas por citometria de fluxo. Foi averiguada a normalidade da distribuição dos resultados, utilizando-se do teste de Anderson-Darling, e sua homoscedasticidade, utilizando-se do teste F ou do teste de Lavene. Para a análise das freqüências observadas, foi utilizado o teste Qui-quadrado. Para a avaliação das diferenças entre as médias dos resultados obtidos, foram feitos os testes de análise de variância (One-way ANOVA), de Tukey-Kramer, teste t de Student, de Mann-Whitney ou de Kruskal-Wallis. A porcentagem média total de células produzindo H2O2, caracterizada pela intensidade de fluorescência da 2,7-diclorofluoresceína, no ensaio sem estímulo in vitro, de 30,60%, foi menor (p=0,005) que aquela observada no ensaio com adição in vitro de LPS, de 52,00%, e que aquela obtida no ensaio com adição in vitro de PMA, de 63,13%. A porcentagem média total de células produzindo H2O2 no ensaio com estímulo por fagocitose in vitro de SaPI, de 47,47%, não diferiu da observada no ensaio sem estímulo. As porcentagens médias totais de células produzindo H2O2 não diferiram entre os ensaios em que houve prévio estímulo in vitro. Não houve diferença na porcentagem de leucócitos que estavam produzindo H2O2, entre os grupos experimentais, todavia, a produção intracelular média de H2O2, sem estímulo in vitro (p=0,007), após adição in vitro de PMA (p<0,001), de LPS (p=0,001) ou após fagocitose (p=0,002), de leucócitos obtidos de animais apresentando LP, foi menor que aquela verificada em células provenientes de animais soronegativos e de animais soropositivos alinfocitóticos. A porcentagem de leucócitos realizando fagocitose, caracterizada pela intensidade de fluorescência do iodeto de propídio, entre as células obtidas de animais com LP, de 7,20%, foi menor que aquela verificada nas amostras coletadas de animais soronegativos, de 12,90%, e soropositivos alinfocitóticos, de 14,70% (p=0,047). Além disso, as células provenientes de animais com LP apresentaram uma menor intensidade de fagocitose que aquela observada em leucócitos de animais soronegativos e soropositivos alinfocitóticos (p<0,001). Assim, os resultados obtidos demonstram uma vulnerabilidade funcional em leucócitos sangüíneos obtidos de animais infectados pelo VLB, manifestando LP. / Different leukocyte populations play key roles on the elimination of foreign antigens through phagocytosis and killing by oxygen-independent and -dependent (respiratory burst) mechanisms. Assuming that Enzootic Bovine Leukosis virus (BLV), that causes a chronic disease, and affects, mainly, lymphoid tissues, alters bovine circulating leukocyte subpopulations quantitatively and qualitatively, and influences the innate immune response, this study evaluated the intracellular production of hydrogen peroxide (H2O2) of circulating leukocytes after in vitro stimuli with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), Escherichia coli lipopolysaccharides (LPS), or phagocytosis of propidium iodide-labeled Staphylococcus aureus (PI-Sa). Cells were obtained from five BLV-negative cows, five naturally BLV-infected, non-lymphocytotic cows, and five BLV-positive cows with persistent lymphocytosis (PL), and analyzed by flow cytometry. Normality was tested using the Anderson-Darling test, followed by an F test or a Lavene\'s test to analyze the equality of variances. Differences among frequencies were tested using the Qui-square test. Differences among means were verified by a one way analysis of variance (ANOVA), followed by a Turkey-Kramer test, or a Student t-test, a Mann-Whitney U-test, or a Kruskal-Wallis test. Mean total percentage of H2O2-producing cells, characterized by the intensity of 2,7-dichlorofluorescein fluorescence, in the assay without in vitro stimulus (30.60%) was smaller (p=0.005) than that verified in the assay after in vitro addition of LPS (52.00%), and after addition of PMA (63.13%). Mean total percentage of H2O2-producing cells in the assay with stimulus by in vitro phagocytosis of PI-Sa (47.47%) was not different from that verified in the assay without in vitro stimulus. Mean total percentages of H2O2-producing leukocytes did not differ among assays with previous in vitro stimuli. There was no difference in the percentages of H2O2-producing leukocytes, among cells obtained from cows that belonged to different groups. However, mean intracellular H2O2-production of leukocytes obtained from BLV-infected cows, presenting PL, without in vitro stimulus (p=0.007), after in vitro addition of PMA (p<0.001), or LPS (p=0.001), or after phagocytosis (p=0.002) was smaller than that verified in leukocytes obtained from non-infected and from BLV-infected, non-lymphocytotic, cows. The percentage of leukocytes that were carrying out phagocytosis, characterized by the intensity of propidium iodide fluorescence, among cells obtained from BLV-infected cows, presenting PL (7.20%), was smaller (p=0.047) than that verified among cells obtained from non-infected and from BLV-infected (12.90%), non-lymphocytotic (14.70%), cows. Furthermore, leukocytes obtained from BLV-infected cows, presenting PL, showed smaller phagocytosis intensity (p<0.001) than leukocytes obtained from non-infected and from BLV-infected, non-lymphocytotic, cows. Therefore, results show a functional vulnerability of circulating leukocytes obtained from BLV-infected, lymphocytotic cows.

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The first trial had four diets (0% SPC, 3% SPC, 6% SPC and 9% SPC), which evaluated different levels of SPC inclusion in diets, and the second trial, which evaluated the replacement of spray dried blood plasma (SDP) by SPC, had three diets (0.0%-SPC + 5.0-SDP, 2.5%-SPC + 2.5%-SDP and 5.0%-SPC + 0.0%-SDP). In both trials, diets and water were offered ad libitum in pre-starter l (21-32 days old) and pre-starter ll (33-42 days old) phases, but during the starter phase (43-66 days old) all piglets received a single diet. At 32 days of age, blood was collected from one animal per experimental unit and then these animals were euthanized to collect samples of the small intestine. Linear effect was observed In the first trial, over feed conversion (FC) as the level of CPS in diet was increased in the period between 21 and 32 days of age. Linear effect was also observed on the FC in the period of 33-42 days old, however in a reverse form from the previous period, wherein the increase of the SPC level in diets resulted in the increase of FC. In the total period of this trial (21-66 days old), it was found a quadratic effect of SPC on piglets FC. In the second trial, the replacement of SDP by CPS caused effect on performance variables, except for feed conversion (FC) during 21-32 days of piglets age. The average daily feed intake (ADFI) was higher for pigs fed 2.5%-SPC + 2.5%-SDP and the average daily gain (ADG) and the final body weight (FBW) of the piglets in this period was higher for 2.5%-SPC + 2.5%-SDP compared to 5.0%-SPC + 0.0%-SDP. In the period of 21-42 days old, it was observed best results of ADFI and FBW for piglets fed diet containing 2.5%-SPC + 2.5%-SDP compared to piglets fed 5.0%-SPC + 0.0%-SDP. The ADG showed better results for diets containing 0.0%-SPC + 5,0-SDP and 2.5%-SPC + 2.5%-SDP and FC was higher for the diet with 0.0%-SPC + 5.0%-SDP compared to the diet with 5.0%-SPC + 0.0%-SDP. During total period of the experiment (21-66 days old) ADG and ADFI was influenced by substitution of SDP for SPC, wherein the best results was presented by piglets fed 2.5%-SPC + 2.5%-SDP compared to those fed 5.0%-SPC + 0.0%-SDP. In both trials, no effect was observed upon histomorphometric variables (villus height, crypt depth and villus: crypt). Regarding the blood variables (leukocytes, eosinophils and lymphocytes), no effect of SPC at 32 days of age the piglets was observed in the first trial. But in the second trial, total leukocyte count was higher in animals fed 5.0%-SPC + 0.0%-SDP compared to ones fed 0.0%-SPC + 5.0%-SDP and lymphocyte count was lower in piglets receiving 0.0%-SPC + 5.0%-SDP. In the first trial, the use of SPC in diets of post-weaning piglets during pre-starter period (21-42 days old) did not influence performance from 21 to 66 days of life, or intestinal morphology and leukocyte, lymphocytes and eosinophils count in these animals. In the second, the combined use of SPC and SDP in the diets of pigs between 21 and 42 days of age reduces the activation of the immune system and improves productive performance. / Foram conduzidos dois experimentos com objetivo de avaliar o efeito da utilização de Concentrado proteico de soja (CPS) em dietas pré-inicias de leitões sobre o desempenho, histomofometria intestinal e alguns parâmetros sanguíneos. Foram utilizados 72 leitões machos castrados desmamados aos 21 dias de idade no primeiro experimento e 54 no segundo. Ambos foram delineados em blocos ao acaso com seis repetições e três leitões por unidade experimental, tendo o primeiro quatro tratamentos (0% CPS, 3% CPS, 6% CPS e 9% CPS), o qual avaliou diferentes níveis de inclusão de CPS nas dietas, e o segundo, para avaliar a substituição de plasma sanguíneo (SDP) por CPS, três (0,0%-CPS + 5,0-SDP, 2,5%-CPS + 2,5%-SDP e 5,0%-CPS + 0,0%-SDP). Em ambos as rações experimentais e água foram fornecidas à vontade nas fases pré-inicial l (21 a 32 dias de idade) e pré-inicial ll (33 a 42 dias de idade), sendo que na fase inicial (43 a 66 dias de idade) todos os leitões receberam uma única dieta. Aos 32 dias de idade foi coletado sangue de um animal por unidade experimental e em seguida estes animais foram eutanasiados para coleta de amostras de intestino delgado. No primeiro experimento, foi observado efeito linear decrescente sobre a conversão alimentar (CA) à medida que aumentou o nível de CPS na dieta no período entre 21 e 32 dias de idade. Efeito linear também foi observado sobre a CA no período entre 33 e 42 dias de idade dos leitões, entretanto de forma inversa ao período anterior, ou seja, à medida que se aumentou o nível de CPS na dieta a CA aumentou. Foi observado no período total (21 a 66 dias de idade) do primeiro experimento efeito quadrático do CPS sobre a CA dos leitões. No segundo experimento a substituição de SDP por CPS causou efeito sobre as variáveis de desempenho no período entre 21 e 32 dias de idade, exceto sobre a CA. O CDR foi superior para os leitões alimentados com 2,5%-CPS + 2,5%-SDP e o GDP e o peso final (PF) dos animais neste período foi superior com 2,5%-CPS + 2,5%-SDP comparado a 5,0%-CPS + 0,0%-SDP. No período entre 21 e 42 dias de idade foi observado melhores resultados de CDR e PF para a dieta com 2,5%-CPS + 2,5%-SDP comparado a 5,0%-CPS + 0,0%-SDP. O GDP apresentou melhores resultados para as dietas com 0,0%-CPS + 5,0-SDP e 2,5%-CPS + 2,5%-SDP e a CA foi superior para a dieta com 0,0%-CPS + 5,0%-SDP diante da dieta com 5,0%-CPS + 0,0%-SDP. No período total do experimento (21 a 66 dias de idade) foi observado efeito da substituição dos SDP por CPS sobre o GDP e o CDR, sendo que os animais alimentados com 2,5%-CPS + 2,5%-SDP apresentaram resultados superiores aos alimentados com 5,0%-CPS + 0,0%-SDP. Emambos os experimentos nenhum efeito foi observado sobre as variáveis histomorfométricas (altura de vilosidade, profundidade de cripta e relação vilo:cripta). Em relação às variáveis sanguíneas (leucócitos, linfócitos e eosinófilos) do primeiro experimento, não foi observado nenhum efeito do CPS aos 32 dias de idade dos leitões. No segundo experimento, a contagem total de leucócitos foi superior para os animais alimentados com 5,0%-CPS + 0,0%-SDP sobre os alimentados com 0,0%-CPS + 5,0%-SDP e a contagem de linfócitos foi menor nos leitões que receberam 0,0%-CPS + 5,0%-SDP. No primeiro experimento, a utilização de CPS em dieta de leitões pós-desmame no período préinicial (21 a 42 dias de idade) não influenciou o desempenho produtivo dos leitões no período entre 21 e 66 dias de vida, nem a histomorfometria intestinal e a contagem de leucócitos, linfócitos e eosinófilos desses animais. No segundo, a utilização conjunta de CPS e SDP nas rações reduz a ativação do sistema imune e melhora o desempenho produtivo.

LOPAP (Lonomia obliqua prothrombin activator protease) é uma serino protease isolada das cerdas da Lagarta Lonomia obliqua que induz efeitos sobre a coagulação sanguínea, semelhantes ao extrato de cerdas bruto. Recentemente, foi obtido um peptídeo do LOPAP, P4, que parece possuir efeitos similares à proteína. No sentido de complementar os dados sobre estas toxinas, este estudo investigou os efeitos do LOPAP ou do P4 sobre interações leucócito-endotélio in vivo; expressão de moléculas de adesão, síntese de mediadores inflamatórios, apoptose e necrose de leucócitos e célula endotelial, além de suas possíveis ações sobre a formação de novos vasos. Aplicação tópica de 30&#181;g/mL ou 300&#181;g/mL (10&#181;L) de LOPAP ou de P4 na rede microvascular do mesentério de ratos Wistar machos não alterou o diâmetro de vênulas pós-capilares, as interações dos leucócitos ao endotélio, nem a reatividade microvascular frente à acetilcolina ou noradrenalina. Somente a concentração de 1000&#181;g/mL aumentou o número de leucócitos aderidos à parede vascular, simultaneamente a estases intermitentes nos vasos da microcirculação. Ensaios de citometria de fluxo mostraram que a incubação de LOPAP ou P4 (300&#181;g/mL) não modificou a expressão de L-selectina e &#946;2-integrina em neutrófilos circulantes obtidos de ratos Wistar. Por outro lado, incubações do LOPAP ou do P4 com célula endotelial (cultura primária obtida do músculo cremaster de ratos Wistar; 300&#181;g/mL) induziram a expressão da molécula ICAM-1 , e somente o P4 promoveu a expressão de VCAM-1. Diferentemente, nenhuma das toxinas alterou a expressão de PECAM-1. Ensaios imuinoenzimáticos realizados em sobrenadantes de neutrófilos e de célula endotelial incubadas com LOPAP ou P4 (300&#181;g/mL) mostraram que as toxinas não alteraram a secreção de interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10), fator de necrose tumoral-&#945; (TNF-&#945;) por neutrófilos; as toxinas não induziram a secreção de TNF-&#945; pela célula endotelial, mas aumentaram a secreção de IL-6 e IL-10. A concentração de óxido nítrico (NO), quantificado pela reação de Griess, estava aumentada nos sobrenadantes dos dois tipos celulares incubados com LOPAP ou P4. A incubação de LOPAP ou P4 com neutrófilos ou célula endotelial não alterou a viabilidade celular, mas preveniu a apoptose da célula endotelial ou neutrófilo provocada pela carência de soro bovino fetal. A incubação simultânea com L-NAME (1 mM) reduziu a proteção conferida pelo LOPAP ou pelo P4. A investigação dos efeitos das toxinas sobre a formação da rede microcirculatória foi realizada em camundongos Swiss, machos, utilizando o modelo da câmara dorsal por microscopia intravital. A aplicação tópica do LOPAP ou P4 (30&#181;g/mL, 300&#181;g/mL; 10&#181;L; 3 doses a cada 96 horas) no leito microvascular dorsal reduziu significantemente o número de vasos na rede microcirculatória em condições basais. Adicionalmente, o tratamento com P4 inibiu a formação de novos vasos provocada pela aplicação tópica de suplemento de fatores de crescimento vascular. O tratamento de célula endotelial de microcirculação de camundongos imortalizadas (tENd) com LOPAP ou P4 (300&#181;g/mL) reduziu a capacidade de migração destas células. Em conjunto, os dados obtidos até o momento mostram que o LOPAP e o P4 não induziram as interações leucócito-endotélio in vivo e que a secreção de mediadores por neutrófilos e célula endotelial, como o NO, podem estar envolvidos com suas atividades anti-apoptótica. Ademais, o LOPAP e o P4 inibem o crescimento de novos vasos, e um dos possíveis mecanismos pode ser a interferência nos mecanismos de migração da célula endotelial. / LOPAP (Lonomia obliqua prothrombin activator protease) is a serine protease isolated from the crude extract of Lonomia obliqua caterpillar, which induces effects on blood coagulation comparable to the extract. Recently it was obtained a peptide fragment from LOPAP, P4, with similar activities with the protein. This study aimed to complete data about these toxins, LOPAP and P4, on in vivo leukocyte-endothelial interactions; adhesion molecule expressions, synthesis of inflammatory mediators, necrosis and apoptosis of neutrophils and endothelial cells, besides possible actions on angiogenesis. Topical applications of 30&#956;g/mL or 300&#181;g/mL (10&#181;L) of LOPAP or P4 on microvascular network of mesentery of Male Wistar rats did not affect the diameter of postcapillary venules, leukocyte-endothelial interactions, either vascular reactivity to acetylcholine or norepinephrine. Only topical application of 1000&#181;g/mL (10 &#181;L) promoted increment on the number of leukocytes adhered to vessel wall, simultaneously to intermittent blood stasis in the microvascular network. Flow cytometry assays showed that incubations with LOPAP or P4 (300&#181;g/mL) did not modify the expression of L-selectin or &#946;2-integrin in neutrophils from Male Wistar rats. On the other hand, incubations of LOPAP or P4 with primary cultured endothelial cells evoked expressions of ICAM-1, and only incubation with P4 promoted expression of VCAM-1. Differently, the treatments did not affect PECAM-1 expression in endothelial cells. Immunoenzimatic assays carried out in supernatants of neutrophils and endothelial cells incubated with LOPAP or P4 (300&#181;g/mL) showed that both toxins did not alter the basal secretion of interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;) by neutrophils; both toxins did not promote secretion of TNF-&#945; by endothelial cells, however they enhanced the secretion of IL-6 and IL-10. Concentrations of nitric oxide (NO), quantified by Griess reaction, were enhanced in the supernatant of neutrophils or endothelial cells incubated with LOPAP or P4. LOPAP or P4 treatments did not alter the viability of neutrophils or endothelial cells, but prevented the apoptosis of both type cell caused by fetal bovine serum deprivation. Simultaneous incubation with L-NAME (1 mM) and LOPAP or P4 reduced the protection on apoptosis exerted by the toxins. The action of toxins on formation of microcirculatory network was investigated in Male Swiss mice. Topical application of LOPAP or P4 (30&#181;g/mL, 300&#181;g/mL; 10&#181;L; 3 times each 96 hours) in the microvascular network significantly reduced the number of vessels in basal conditions. Additionally, treatment with P4 inhibited the new vessel formation provoked by topical application of vascular growth factor supplement. Immortalized endothelial cells of mice (tEnd) incubated with toxins presented lower migration than cells incubated with saline. Together, data herein obtained showed that LOPAP and P4 did not evoke in vivo leukocyte-endothelial interactions and secretions of chemical mediators by neutrophils and endothelial cells, as NO, seem to be related to anti-apoptotic activities. Additionally LOPAP or P4 inhibit the microcirculatory network formation, by interfering, at least in part, by altering the migration of endothelial cells.

Este estudo teve por objetivos: a) caracterizar o influxo de leucócitos (LC) induzido pelo veneno de Bothrops moojeni (VBm); b) avaliar o papel dos mastócitos (MC) e da histamina neste evento; c) analisar a liberação de TXA2, PGD2, LTB4, MCP-1 e KC e d) avaliar a capacidade do VBm desgranular MC in vivo e in vitro. A injeção intraperitoneal de VBm, em camundongos, causou o recrutamento de LC e neutrofilia. O tratamento dos animais com cromoglicato aboliu o influxo de LC enquanto a difenidramina, ranitidina e a tioperamida, antagonistas da histamina, reduziram o influxo de neutrófilos. Ainda, o veneno induziu a liberação de PGD2, TXA2, LTB4, MCP-1 e de KC e causou a desgranulação de MC in vivo e a liberação de -hexosaminidase de MC in vitro. Em conclusão, o VBm induz influxo de LC para o local de sua injeção. Este efeito depende da histamina, via receptores H1, H2 e H4 e da desgranulação de MC, que decorre de ação direta do veneno nestas células. A neutrofilia e o TXA2, LTB4, MCP-1 e KC devem contribuir para o influxo de leucócitos causado pelo VBm. / In this study the effects of Bothrops moojeni venom (BmV) on the cellular component of inflammatory responses and the mechanisms involved in this effect were investigated. The effects of venom on peritoneal and circulating leukocyte numbers and on the release of inflammatory mediators, such as LTB4, TXA2, PGD2, MIP-1 and KC, were assessed. The role of both mast cells and histamine receptors in leukocyte recruitment induced by BmV was assessed by selected pharmacological treatments. BmV caused a marked infiltration of leukocytes (3-24 h) when injected into the peritoneal cavity of mice. Neutrophils (PMN) were the predominant cell type in the early stages of response whereas macrophages (MN) were accumulated from 3 up to 24 h. Moreover, BmV increased blood neutrophil numbers at 3 h after injection. The BmV-induced leukocyte influx was abrogated by cromoglicate and significantly reduced either by difenidramine or ranitidine or tioperamide, histamine H1, H2 and H4 receptor antagonists, respectively, at 6 h after injection. Significant increments in peritoneal levels of LTB4, TXA2, PGD2, MIP-1 and KC were detected at distinct periods of time after venom injection. In addition, BmV induced mast cell degranulation both in vivo and in vitro. In conclusion, obtained data demonstrated the ability of BmV induce leukocyte recruitment into the site of its injection. This effect is dependent on mast cell activation and degranulation, which may be due to a direct effect of venom on these cells, and is mediated at least in part by histamine via H1, H2 and H4 receptors. Moreover, the ability of venom to mobilize leukocytes from bone marrow reserve compartments and to release the chemotactic mediators TXA2, LTB4, MCP-1 and KC may be relevant for leukocyte infiltration.