Adult T-cell leukemia (ATL) is an aggressive lymphoproliferative disorder associated with human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) infection. Reactivation of telomerase, a critical event in tumor progression observed in late phases of ATL development, has been shown to be caused by HBZ (HTLV-1 bZIP factor), a regulatory protein encoded by the negative strand of the HTLV-1 genome. The HBZ-mediated up-regulation of the telomerase catalytic subunit is dependent on JunD, which in the cellular context occurs in the complex with menin, the product of the MEN-1 tumor suppressor gene. Interaction with menin represses JunD-dependent transcription and converts JunD into a growth suppressor, whereas it acts as a growth promoter in the absence of menin. My results demonstrate that the viral protein HBZ abrogates tumor suppressor function of menin, resulting in the activation of JunD transcriptional activity and finally in the up-regulation of its target gene, the human telomerase reverse transcriptase (hTERT). I showed that HBZ, JunD and menin can coexist in the same protein complex and that HBZ and menin exert opposite effects on JunD transcriptional activity. Moreover menin inhibits the JunD-mediated activation of the hTERT proximal promoter and HBZ is able to counteract this effect. Finally, I proposed that HBZ, by recruiting p300 histone acetyltransferase, reverses the histone deacetylation conducted by menin-recruited HDACs and therefore up-regulates the expression of the hTERT gene. Altogether, my work led to the identification of the molecular mechanism leading to the functional impairment of the menin tumor suppressor, which results in the deregulation of AP-1 signaling in HTLV-1 infected cells. Finally this work gave new insights into the mechanism of the transcriptional up-regulation of the hTERT gene upon HTLV-1 infection, being a key event during the development of Adult T-cell leukemia and a necessary step towards the progression into more aggressive courses.

HTLV-1, un rétrovirus endémique des Antilles-Guyane qui infecte plus de 10 millions de personnes dans le monde, est l’agent étiologique de l’ATL, une leucémie agressive des lymphocytes T CD4+ résistante aux traitements conventionnels actuels. Le rôle émergent des miARN dans la leucémogénèse et la résistance aux chimiothérapies a soulevé des interrogations quant à leurs rôles dans le développement de l’ATL. Les miARN sont de petits ARN non codant qui régulent l’expression génique. Récemment leur altération durant le cycle de vie du HTLV-1 a été mise en lumière. Une des caractéristiques de l’émergence de l’ATL est la perte d’expression des protéines virales codées par le promoteur en amont du génome proviral (LTR5’), à l’exception d’hbz dont l’expression est initiée dans le promoteur en aval du génome proviral (LTR3’). Dans une première étude, nous démontrons, dans un modèle mimant la cellule ATL, qu’HBZ module sa propre transcription à travers une boucle de rétrocontrôle qui implique une coopération avec le facteur de transcription de la famille AP-1 JunD. Nous montrons que l’expression d’HBZ induit des caractéristiques phénotypiques de fibroblastes transformés. Nous avons, ensuite, analysé l’effet d’HBZ sur les miARN dans les cellules ATL et montré qu’il induit une diminution des miARN cellulaires via l’inhibition d’un acteur clé de la maturation, Dicer. En accord avec notre première étude, nous montrons que l’induction d’HBZ dans les CD4+ de patients ATL corrèle avec une augmentation de la charge provirale (CPV) et donc l’évolution de l’ATL. Le traitement de ces cellules au VPA inhibe l’expression d’hbz, restaure celle de dicer et inverse la CPV et donc la prolifération des cellules malignes ex vivo. / HTLV-1, a retrovirus endemic of Antilles-Guyana that infects more than 10 million people worldwide, is the etiological agent of ATL, an aggressive leukemia of CD4+ T lymphocytes resistant in currents treatments. The emerging role of miRNA in leukemogenesis and chemoresistance has risen questioning about their role in ATL development. MiRNAs are a class of non-coding RNAs that regulate gene expression. Involvement of their alteration in the HTLV-1 life cycle has recently come to light. One of the hallmarks of progression toward ATL is the emergence of LTR5’-deficient provirus and thereby eliminating the expression of all viral proteins on the sense strands in these cells, with the exception of the hbz gene regulated by an independent promoter in the 3’LTR. In a first study, using a provirus with the 5’LTR deleted, we found that HBZ modulates its own expression through a positive-feedback loop that involves cooperation with AP-1 transcription factor JunD. We also found that hbz-expressing fibroblasts displayed of a transformed phenotype. Then, we analyzed the effect of HBZ on miRNA expression in ATL patients and report that hbz reduce significantly expression of cellular miRNAs via inhibition of an enzyme essential for maturation, Dicer1. In agreement with our previous study, we show that hbz expression in ATL samples correlates with HTLV-1–provirus load (CPV) and consequently progression of the pathology. VPA treatment of these cells inhibits hbz expression, restores Dicer expression, and inverts the proviral charge thereby reducing cellular proliferation of malignant cells.

La Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) est une maladie clonale caractérisée par la présence du chromosome Philadelphie codant pour Bcr-Abl, une tyrosine kinase constitutivement active responsable de la leucémogenèse. Bien que très efficaces, les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITKs) restent cependant inactifs sur les cellules souches leucémiques. Ce travail de thèse montre que la signalisation calcique, connue pour réguler de nombreux processus dans les cellules saines et cancéreuses, est importante dans la signalisation cellulaire au décours de la LMC. Le rôle des entrées calciques dépendantes des stocks (SOCEs) médiées par STIM1 (STromal Interaction Molecule 1) et les canaux Orai1 et TRPC1 ainsi que des entrées calciques induites par la thrombine a été étudié dans la leucémogenèse. Nous avons observé une diminution de ces entrées dans les cellules exprimant Bcr-Abl pouvant être expliquée par le changement de stœchiométrie Orai1/STIM1. Ceci entraîne la diminution de l'activation de NFAT (Nuclear Factor of Activated T-cells) ainsi que des conséquences sur la prolifération et la migration cellulaire mais pas sur l'apoptose. De plus, les SOCEs sont restaurées dans les cellules cancéreuses après traitement à l'Imatinib, le principal ITK. Nous proposons alors que l'expression de Bcr-Abl joue un rôle sur l'homéostasie calcique en entraînant une dérégulation générale des fonctions cellulaires dans les cellules leucémiques notamment via la voie PKC (Protein Kinase C). Ainsi, ces résultats montrent une dérégulation des entrées calciques dans les cellules exprimant Bcr-Abl, suggérant que la signalisation calcique puisse être une cible thérapeutique en parallèle avec les ITKs. / Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a clonal disease characterized by the presence of the Philadelphia chromosome encoding for Bcr-Abl, a constitutively active tyrosine kinase responsible for leukemogenesis. Although Bcr-Abl tyrosine kinase inhibitors (TKIs) have revolutionized the therapy of Ph+ leukemia, the complete eradication of CML is limited by the emergence of resistance in hematopoietic stem cells. This thesis proposes that calcium (Ca2+) signaling pathways, known to govern a large number of functions in normal and cancer cells, may be important in CML cell signaling. Therefore, we studied the role of Store Operated-Calcium entry (SOCE) (i.e. STromal Interaction Molecule 1 (STIM1), Orai1 and TRPC1 channels) and thrombin induced Ca2+ entry in leukemogenesis. We found a decrease in both calcium entries in Bcr-Abl-expressing cells compared to normal cells. The reduced SOCE seems related to a change in stoichiometry of Orai1/STIM1. This leads to a reduction of the Nuclear Factor of Activated T-cells (NFAT) translocation and functional consequences on cell proliferation and migration but not on apoptosis. Moreover, we showed that SOCE is restored in malignant cells after treatment with Imatinib, the main TKI. We proposed that Bcr-Abl expression could impact on Ca2+ homeostasis enhancing a general disorganization of cell functions in leukemia cells notably via Protein Kinase C (PKC) pathway. Altogether this work shows a deregulation of Ca2+ entry in Bcr-Abl-expressing cells, suggesting that the Ca2+ signaling pathway could be a therapeutic target in parallel with TKIs.

Les leucémies chroniques à éosinophiles sans autre spécification (CEL,NOS) sont des néoplasmes myéloprolifératifs rares caractérisés par une hyperéosinophilie (HE) clonale. Avec 12 cas décrits, la translocation t(5;12)(q31;p13), différente de la translocation t(5;12)(q32;p13) ETV6-PDGFRB classique, semble être récurrente de cette entité. Peu étudiée, sa leucémogenèse reste non élucidée.L’objectif de ce travail était la caractérisation génomique et transcriptomique de ce remaniement afin d’en comprendre la physiopathologie.L’étude FISH sur cellules triées réalisée confirmait l’HE clonale, et indiquait un avantage sélectif semblant limité aux polynucléaires éosinophiles (PNE), puisque d’autres cellules, également porteuses de la translocation, ne proliféraient pas.Un transcrit de fusion ETV6-FNIP1, jamais décrit, différent des transcrits ETV6-ACSL6 habituellement observés, a été retrouvé dans le cas d’étude. La non récurrence d’un transcrit fonctionnel commun entre les cas était en défaveur de leur implication dans la leucémogenèse par l’apport d’une nouvelle fonction.ETV6 et ACSL6 étaient constamment impactés par le réarrangement, soit par formation d’un transcrit, soit par délétion comme dans le cas d’étude. Leur diminution d’expression, en l’absence de second événement, témoignait de l’haploinsuffisance de ces gènes suppresseurs de tumeurs.Par l’étude d’une cohorte de 39 patients avec HE, nous avons montré une dérégulation spécifique d’IL-3 dans la translocation t(5;12)(q31;p13), sans atteinte d’IL-5 ni de CSF2 (GM-CSF), cytokines impliquées dans l’éosinopoïèse. Des séquences conservées situées dans l’intron 2 d’ETV6 et en aval de l’exon 11 d’ACSL6 pourraient être responsables de cette dérégulation.Sans autre anomalie spécifique retrouvée, la translocation t(5;12)(q31;p13) constitue l’évènement oncogénique principal de ces cas. Parmi les mécanismes étudiés, plusieurs, sinon tous, pourraient être nécessaires au développement de la maladie. / Chronic eosinophilic leukemias not otherwise specified (CEL, NOS) is a rare myeloproliferative neoplasm characterized by clonal eosinopoiesis. In this setting, we studied a patient with a t(5;12)(q31;p13) which differs from the usual t(5;12)(q32;p13) ETV6-PDGFRB translocation. In this rare translocation (11 similar examples so far described in the litterature), mechanisms driving leukemogenesis still need to be investigated.The aim of this study was the genomic and transcriptomic characterization of this translocation in order to understand its pathophysiology.Triaged FISH study confirmed clonal HE, and suggested a specific advantage limited to eosinophils, since other nonproliferative cells also carried the translocation.A novel ETV6-FNIP1 fusion transcript hitherto never described was found. This transcript was different from the usual out-of-frame ETV6-ACSL6 transcripts, and no common functional transcript was observed among the published cases. The implication of these transcripts seems unlikely.ETV6 and ACSL6 are constantly impacted by rearrangement, either by a fusion transcript or by deletion as in the case study. Their underexpression, in the absence of a second hit, support the haploinsufficiency of these tumor suppressor genes.By studying a cohort of 39 patients with HE, we show a deregulation of IL-3 in the t(5;12)(q31;p13) translocation, without deregulation of IL-5 or CSF2 (GM-CSF), cytokines involved in eosinopoiesis. Conserved sequences in ETV6 intron 2 and downstream of ACSL6 exon 11 may be responsible for this deregulation.The t(5;12)(q31;p13) constitues the main oncogenic driver. From the mechanisms studied, many, if not all, may be associated for the development of the disease.

Les leucémies aiguës lymphoblastiques de la lignée B (LAL-B) sont les cancers pédiatriques les plus fréquents. Dans ce type de leucémie, l'une des anomalies génétiques les plus fréquentes est la translocation t(12 ;21) aboutissant à la protéine de fusion ETV6-RUNX1. Cette pathologie est décrite comme un modèle à deux « hits ». Le premier, se produit in utero et génère la protéine de fusion. Le second, correspond à l’acquisition d’anomalies génétiques après la naissance. Ces réarrangements génomiques aberrants ont été décrits comme provenant d’une activité anormale de la recombinasse RAG. Notre travail a consisté dans un premier temps à compléter le modèle de leucémogénèse à plusieurs « hits ». En continuant notre étude des LAL B à translocation ETV6-RUNX1, nous nous sommes concentrés sur le rôle de RUNX1, gène dérégulé dans ce type de leucémie.L’ensemble de nos résultats confirme le rôle prépondérant de RUNX1 dans l’hématopoïèse et la leucémogenèse grâce à sa capacité à s’associer à des protéines aux fonctions différentes et grâce à son implication dans la transcription de gènes clé en hématologie. Nos résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives dans la compréhension du contrôle de l’activité transcriptionnelle de RUNX1 et dans son rôle dans les hémopathies malignes. / B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) is the most common pediatric cancer. In this type of leukemia, one of the most common genetic abnormalities is the ETV6-RUNX1 rearrangement. This malignancy is described as a two "hits" model. The first event occurs mainly in utero and generates the fusion gene ETV6-RUNX1. The second event consists in the acquisition of additional genetic abnormalities after birth. These aberrant genomic modifications have been described as resulting from abnormal activity of the RAG recombinase. Our work consisted initially in completing the leukemogenesis model. In continuing our study of ETV6-RUNX1 B-ALL, we focused on the role of RUNX1, an upregulated gene in this type of leukemia. All results confirm the predominant role of RUNX1 in hematopoiesis and leukemogenesis thanks to its ability to associate with proteins with different functions and its involvement in the transcription of key genes in hematology. Our results therefore open new perspectives in understanding the control of transcriptional activity of RUNX1 and its role in malignant hematology.

La leucémie T de l’adulte (ATL) est une pathologie lympho-proliférative aiguë associée à l’infection par le virus HTLV-1 (human T-cell leukemia virus type 1). La réactivation de la télomérase observée lors de la phase tardive du développement de l’ATL est un évènement crucial dans la progression tumorale. Elle est induite au niveau transcriptionnel par la protéine HBZ (HTLV-1 bZIP factor) et est dépendante du facteur de transcription JunD. Ce dernier est normalement associé en complexe avec le produit du gène suppresseur de tumeur MEN-1, la ménine, dont l’interaction avec JunD réprime la transcription JunD-dépendante et convertit JunD en inhibiteur de croissance.Mes résultats démontrent que la protéine virale HBZ inhibe la fonction suppresseur de tumeur de la ménine, induisant l’activité transcriptionnelle de JunD et donc l’activation de la transcription de son gène cible : la transcriptase inverse télomérase humaine (hTERT). J’ai démontré que HBZ, JunD et la ménine peuvent coexister dans un même complexe protéique et que HBZ et la ménine ont des effets opposés sur l’activité transcriptionnelle de JunD. En effet la ménine inhibe l’activation du promoteur proximal d’hTERT par JunD, alors que HBZ est capable de contre balancer cet effet. Finalement, je propose qu’en recrutant l’histone acétyltransférase p300, HBZ réverse la déacétylation des histones induite par le recrutement des HDACs par la ménine et par conséquent active le promoteur d’hTERT. L’ensemble de ces résultats a permis d’identifier les mécanismes moléculaires aboutissant à l’inhibition fonctionnelle de la protéine suppresseur de tumeur ménine, résultant en la dérégulation de la voie AP-1 dans les cellules infectées par HTLV-1. Finalement, ce travail apporte de nouvelles précisions sur le mécanisme de la surexpression transcriptionnelle de la télomérase lors de l’infection par HTLV-1, une étape importante de la mise en place et du développement de la leucémie T de l’adulte vers des stades plus agressifs. / Adult T-cell leukemia (ATL) is an aggressive lymphoproliferative disorder associated with human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) infection. Reactivation of telomerase, a critical event in tumor progression observed in late phases of ATL development, has been shown to be caused by HBZ (HTLV-1 bZIP factor), a regulatory protein encoded by the negative strand of the HTLV-1 genome. The HBZ-mediated up-regulation of the telomerase catalytic subunit is dependent on JunD, which in the cellular context occurs in the complex with menin, the product of the MEN-1 tumor suppressor gene. Interaction with menin represses JunD-dependent transcription and converts JunD into a growth suppressor, whereas it acts as a growth promoter in the absence of menin. My results demonstrate that the viral protein HBZ abrogates tumor suppressor function of menin, resulting in the activation of JunD transcriptional activity and finally in the up-regulation of its target gene, the human telomerase reverse transcriptase (hTERT). I showed that HBZ, JunD and menin can coexist in the same protein complex and that HBZ and menin exert opposite effects on JunD transcriptional activity. Moreover menin inhibits the JunD-mediated activation of the hTERT proximal promoter and HBZ is able to counteract this effect. Finally, I proposed that HBZ, by recruiting p300 histone acetyltransferase, reverses the histone deacetylation conducted by menin-recruited HDACs and therefore up-regulates the expression of the hTERT gene. Altogether, my work led to the identification of the molecular mechanism leading to the functional impairment of the menin tumor suppressor, which results in the deregulation of AP-1 signaling in HTLV-1 infected cells. Finally this work gave new insights into the mechanism of the transcriptional up-regulation of the hTERT gene upon HTLV-1 infection, being a key event during the development of Adult T-cell leukemia and a necessary step towards the progression into more aggressive courses.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une hémopathie maligne causée par l‘apparition du chromosome Philadelphie dans la cellule souche hématopoïétique (CSH), conduisant à l‘expression de la protéine de fusion BCR-ABL1. L‘activité tyrosine kinase dérégulée de cette oncoprotéine provoque l‘activation de plusieurs voies de signalisation critiques dans la leucémogenèse. Si les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) ciblant BCR-ABL1 représentent des traitements dans l'ensemble très efficaces, plusieurs études montrent que les cellules leucémiques les plus immatures de la moelle osseuse y sont insensibles. Cette thèse propose de compléter les connaissances relatives aux effets de BCR-ABL1 dans la cellule, et plus généralement aux propriétés des CSH de LMC. Notre intérêt s‘est focalisé sur le rôle potentiel des microARN. Dans un premier travail, nous nous sommes intéressés à l‘effet de l‘activité BCR-ABL1 sur le protéome et sur l‘expression des microARN dans la lignée cellulaire K562. Les résultats montrent que BCR-ABL1 régule l'expression d'un microARN fréquemment surexprimé dans les cancers, miR-21. Cet effet dépend du facteur de transcription STAT5, cible bien connue de l'activité kinase de BCR-ABL1. Dans une seconde partie, nous avons montré que dans la moelle osseuse des patients LMC, la fraction cellulaire enrichie en cellules souches (les cellules CD34+CD38low) exprime quatre microARN particuliers: mir-10a, mir-150, miR-155 et miR-146a. Deux de ces microARN (miR-150 et miR-155) sont trouvés spécifiquement dans les cellules des patients, et pas dans celles des individus sains. / In chronic myeloid leukemia (CML), the activity of the constitutively active tyrosine kinase BCR-ABL1 drives the activation of the PI3K/AKT, JAK/STAT, and RAS/RAF/MEK/ERK pathways. Among other consequences, activated or inhibited transcription factors induce important modifications of the CML cells gene expression pattern that could impact cell cycle control, apoptosis and genetic instability, leading to the expansion of the oncogene-transformed cells and to the acquisition of potentially harmful de novo mutations. However, indirect BCR-ABL1-dependant regulations might also occur, for instance through the action of microRNAs (miRNAs). Among the ~2000 miRNAs reported in humans, numerous species are up- or down-regulated in various cancer models. In the context of CML however, there is no clear consensus regarding the role of specific miRNAs, despite several studies. The first aim of this thesis was to study the effects of a clinically relevant concentration of imatinib, a tyrosine-kinase inhibitor (TKI) that blocks BCR-ABL1, on the CML cell line K562: both the microRNA expression profile and the cells proteome were analyzed. Using microarray hybridization, RT-qPCR experiments and a functional assay, we identified miR-21 as one of the most significantly down-regulated microRNA in cells that were treated with imatinib. In parallel, a semi-quantitative proteomic approach identified the tumor suppressor programmed cell death protein 4 (PDCD4) as the most over-expressed protein in imatinib-treated cells. We showed that miR-21 can bind to PDCD4 3'UTR and decrease its expression. The STAT5 - miR-21 - PDCD4 pathway was conserved in CML primary CD34+ cells, and to some extent in acute myeloid leukemia (AML) models as well; the known functions of miR-21 and PDCD4 suggest that their regulation by BCR-ABL1 could participate in the antileukemic response triggered by tyrosine kinase inhibitors. In the second part of this manuscript, we was interested in the immature stem cells population that cannot be eliminated by TKI. The underlying mechanisms of this resistance are not fully understood. The TKI-resistant CML stem cells reside in the CD34+/CD38low subpopulation, that can be sorted from the mononuclear cells fraction using FACS. In this project, we propose to describe the microRNA repertoire of the CML CD34+/CD38low cells to highlight the potential role of microRNA in the resistance mechanisms by identifying some of their targets, using bioinformatic and experimental approaches. This combination of miRNome and functional analysis would allow to increase the knowledge of the biology of the TKI-resistant CML stem cells. Our results have shown that the cellular fraction enriched in stem cells (CD34+CD38low) expressed specifically four microRNA: miR-10a, miR-146, miR-150 and miR-155. It is also interested to notice that only two of them, miR-150 and miR-155, are highly expressed in CML-patient CD34+CD38low cells compared to normal cells.

La leucémie T de l’adulte (ATL), caractérisée par une prolifération dérégulée de lymphocytesT CD4+ activés, se développe chez des individus infectés par le virus T-lymphotropehumain (HTLV-1). Une période asymptomatique de plusieurs décennies sépare l’infection del’apparition des symptômes cliniques de l’ATL, rendant complexe la compréhension des étapesinitiales de la leucémogenèse. Le modèle de la souris humanisée dans laquelle est reconstituéun système hémato-lymphoïde humain est pertinent pour étudier ces étapes, depuis l’infectionpar HTLV-1 jusqu’à l’apparition de la lymphoprolifération. Grâce à ce modèle, mes travaux dethèse ont aidé à mieux comprendre deux mécanismes importants. D’abord, le rôle du chimiotactisme dans le contact cellule infectée-cellule non infectée in vivo. En inhibant la sécrétion de leukotriène B4, un chimioattractant, dans des souris humanisées et infectées, la charge proviraleest plus faible que celle des souris témoins et la prolifération des CD4+ activés est égalementréduite, soulignant le rôle du leukotriène B4 dans la primo-infection. Ensuite, j’ai étudié l’implicationdes protéines PDZ dans le processus leucémogène in vivo. En effet, certaines de cesprotéines, dont Scribble, interagissent avec le PBM (PDZ-domain Binding Motif) de la protéinevirale Tax. Des souris humanisées ont été infectées avec un provirus soit sauvage soit muté auniveau du PBM et j’ai montré, dès 5 semaines après infection, que l’interaction de ce domaineavec des protéines PDZ augmente la prolifération des CD4+ activés et perturbe l’expression degènes impliqués dans la prolifération, l’organisation du cytosquelette et des voies de l’apoptose.Ces résultats attestent du rôle du PBM de Tax dans le soutien de la lymphoprolifération in vivo. / Human T-Cell Leukemia Virus 1 (HTLV-1) is the causative agent of Adult T-cell Leukemia(ATL) characterized by a deregulated proliferation of activated CD4+ T cells. An asymptomaticperiod of several decades separates the infection and the onset of the leukemia, complicating thestudy of the initial leukemogenic steps. Humanized mouse models are relevant to study thosesteps as these mice harbor human hemato-lymphoid cells that can be infected by HTLV-1.I used this animal model to better characterized two biological mecanisms during my thesis.First, the role of chemotaxis in infected-non infected cell contact in vivo. Inhibiting the secretionof leukotriene B4, a potent chemoattractant, in HTLV-1-infected humanized mice reduces theproviral load and the proliferation of activated CD4+ T cells. Those results establish the importanceof leukotriene B4 in HTLV-1 primo-infection. Next, I focused on the importance of thePDZ proteins in the leukemogenic process in vivo. The PDZ-domain Binding Motif (PBM) ofthe Tax viral protein interacts with several cellular PDZ proteins including Scribble. I infectedhumanized mice either with a wild-type or a PBM-mutated provirus of HTLV-1. I showed thatinteraction of the Tax PBM with PDZ proteins enhances activated CD4+ T cells proliferationfrom 5 weeks after infection and disrupts expression of genes implicated in cell proliferation,apoptotic processes and cytoskeleton organization. This study indicated that the PBM of Taxis important for sustaining the lymphoproliferation in vivo.

STAT5A et B sont des facteurs de transcription qui constituent le point de convergence de nombreux signaux extracellulaires. Parmi leurs fonctions biologiques, ils sont connus pour leur rôle dans le développement et la différentiation des cellules hématopoïétiques. Cependant, un taux d’activation et/ou d’expression élevé de ces protéines aboutit à une prolifération incontrôlée des cellules aboutissant ainsi à une leucémogenèse. Ce présent travail vise à caractériser des aptamères ADN (Apta1 et Apta2) sélectionnés préalablement au sein de notre laboratoire contre STAT5B afin de réguler son activité dans le contexte leucémique. Les aptamères ADN sont des oligonucléotides simple brin qui adoptent une structure 3D et interagissent de manière spécifique avec leurs cibles. Contrairement aux anticorps, ils sont peu immunogènes ; ils possèdent alors un potentiel thérapeutique intéressant. La première partie de ce projet se focalise sur l’étude de la capacité d’Apta1 et Apta2 à interagir avec la forme cellulaire et recombinante de STAT5B par pull down et calorimétrie à titrage isotherme. La seconde partie concerne l’évaluation de l’activité d’Apta2 par l’étude de son effet sur la viabilité d’un modèle de leucémie myéloïde chronique et sur sa capacité à perturber la voie de signalisation impliquant STAT5. / STAT5A and B are common transcription factors that constitute a convergent point for many cellular pathways. Among their multiple biological functions, they are well known in promoting immune cell development and differentiation. When some oncogenic mutations occur, STAT5A and B are highly activated leading to uncontrolled proliferation and then to leukemia. Thus, they constitute a prime target to therapeutic intervention. In this work, we characterize new DNA aptamers (Apta1 and Apta2) selected previously by our laboratory against STAT5B. DNA aptamers are single stranded DNA molecules that can adopt 3D structures and recognize specific targets. Unlike antibodies, they fail to induce the immune response: they emerge as potentiel therapeutic molecules. In the first part of this work, the selected aptamers were assessed on their ability to interact with the cellular and recombinant form of STAT5B by using pull down assay and Isothermal Titration Calorimetry. In the second part, we focused on evaluating the effect of Apta2 on chronic myeloid leukemia cell line. For this purpose, cell viability, apoptosis process and JAK-STAT5 signaling pathway were depicted when cells are treated with Apta2.

Die myeloische Entwicklung wird durch die Familie der Transkriptionsfaktoren CCAAT/Enhancer-Binding-Protein (C/EBP) reguliert. Eine aberrante Expression oder Funktion von C/EBPs stört die normale myeloische Differenzierung und wird bei vielen Arten hämatopoetischer Malignome beobachtet. Mutationen von CEBPA führen zu einem veränderten Expressionsanteil der verkürzten Isoform C/EBPa p30 und werden bei etwa 15% der AML-Patienten (akute myeloische Leukämie) nachgewiesen. Obwohl die verkürzte Isoform C/EBPα p30 als Onkogen identifiziert wurde da sie die Proliferation myeloischer Vorläufer fördert, behält sie dennoch eine Differenzierungsfunktion. Unser Interesse gilt der Frage, wie diese beiden Funktionen von C/EBPα p30 reguliert werden. Die C/EBP-Familie gehört der Gruppe intrinsisch ungeordneter Proteine an, die zudem viele posttranslationale Modifikationen (PTMs) aufweisen. PTMs auf C/EBPα verändern seine biologische Funktionsweise stark. Frühere Forschungsarbeiten haben drei Argininreste am N-Terminus von C/EBPα p30 identifiziert, die aufgrund des Methylierungsstatus differentiell mit anderen Proteinen interagieren. In dieser Arbeit untersuchen wir den Einfluss der C/EBPα p30 Arginin-Methylierung auf seine pro-leukämische Aktivität sowie dessen Fähigkeit zur Neuausrichtung der hämatopoietischen Differenzierungslinie. Mit Hilfe von Aminosäuresubstitutionen fanden wir heraus, dass C/EBPα p30 Mutanten der Methylierungsmimesis oder Ladungsabschaffung die myeloische Differenzierung verstärkt, während Ladungserhalt-Mutanten die Erneuerung und Proliferation hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen unterstützt. Transkriptionelles Profiling von Zellen, die mutierte C/EBPα -p30-Varianten exprimieren, deutet auf potenzielle Ziele der methyliertem bzw. unmethyliertem C/EBPα p30 hin. Die Ergebnisse legen nahe, dass der Arginin-Methylierungsstatus das Leukämie- und Differenzierungs-Potenzial von C/EBPα p30 verändert und somit ein neues Ziel der Leukämietherapie darstellen könnten. / Myeloid development is regulated by the family of transcription factors CCAAT/enhancer-binding-protein (C/EBP). Aberrant expression or functioning of C/EBPs disturbs normal myeloid differentiation and is found in many types of hematopoietic malignancies. Mutations of CEBPA lead to imbalanced expression of the truncated isoform C/EBPα p30 and are found in approximately 15% of AML (acute myeloid leukemia) patients. Yet, how C/EBPα participates in leukemic progression remains to be discovered. More specifically, the truncated isoform C/EBPα p30, although being identified as an oncogenic isoform that promotes proliferation of myeloid progenitors, still retains differentiation function. The question of how both functions of C/EBPα p30 are regulated, is of our interest. C/EBP family also represents a group of intrinsically disordered proteins, which contain many post-translational modifications (PTMs). PTMs on C/EBPα greatly alter its functioning. Previous works have identified three arginine residues at the N-terminus of C/EBPα p30 that interact differently with others protein dependent on their methylation status. We hypothesize, that methylation of these arginine residues plays important roles in the biology of C/EBPα p30. In this study, we used a lymphoid-to-myeloid transdifferentiation (LMT) system to investigate the influence of arginine-methylation on C/EBPα-induced lineage switch and its pro-leukemic activity. Using amino acid substitution, we found that C/EBPα p30 mutants that resemble arginine-methylated p30 enhanced myeloid differentiation, while the charge-retention mutant, resembling arginine-unmethylated p30, supported renewability and proliferation of hematopoietic progenitors. Transcriptional profiling of cells expressing C/EBPα p30 variants suggested potential targets of either methylated or unmethylated p30. The results implied that arginine methylations alter C/EBPα p30’s leukemic potential and might comprise novel targets of leukemia therapy.