Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-24T14:12:03Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marilisa Pedroso Nogueira Gaeti - 2011.pdf: 1666080 bytes, checksum: 19b32c55290366843f42da074251d027 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-24T14:50:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marilisa Pedroso Nogueira Gaeti - 2011.pdf: 1666080 bytes, checksum: 19b32c55290366843f42da074251d027 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-24T14:50:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marilisa Pedroso Nogueira Gaeti - 2011.pdf: 1666080 bytes, checksum: 19b32c55290366843f42da074251d027 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2011-11-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Liposomes containing 4-nerolidylcatechol (4-NC), the main metabolite isolated from Pothomorphe umbellata, were obtained and characterized. The influence of liposomal encapsulation on the chemical stability of 4-NC and on the cytotoxicity profile of this drug was evaluated. Liposomal dispersion was prepared by lipid film hydration followed by extrusion through polycarbonate membranes. Entrapment efficiency for 4-NC was approximately 92%. Liposome mean diameter was 100 nm with a polydispersity index below 0.13. 4-NC encapsulated in liposomes (L4-NC) and in methanolic solution (F4-NC) were submitted to forced degradation tests (photostability and acid/base hydrolysis), monitored by HPLC. Photodegradation assay was performed according to ICH Guidelines, using a photostability chamber equipped with both UV and white light sources. Results demonstrated that liposomal encapsulation was able to markedly reduce 4-NC degradation rates for all the forced degradation conditions tested. L4-NC showed a half-live approximately 15% higher than F4-NC under light exposure. After 72 hours, acid and base hydrolysis of F4-NC lead to 13 and 16% of degradation, respectively. However, no degradation was observed in L4-NC. EPR spectra of the liposomal membrane showed that greatest changes in membrane properties were obtained when 5-doxyl stearic acid was used as the spin label, showing a marked decrease in the fluidity of the bilayer and indicating that 4-NC was located near the polar head groups of the phospholipid bilayer. F4-NC induces hemolysis under isotonic conditions whereas liposomal encapsulation protects erythrocytes from lysis. Following incubation with K562 cells, 4-NC showed a concentration-dependent cytotoxicity profile, while L4-NC exhibited a time and concentration-dependent profile, characterizing the liposomal formulation as a controlled release system. / Lipossomas contendo 4-nerolidilcatecol (4-NC), principal metabólito isolado da Pothomorphe umbellata, foram preparados e caracterizados. A influência da encapsulação em lipossomas na estabilidade do 4-NC foi avaliada. A dispersão lipossomal foi preparada através do método de hidratação do filme lipídico seguido por extrusão em membrana de policarbonato. A eficiência de encapsulação foi de aproximadamente 92%. O diâmetro médio dos lipossomas obtidos foi de 100 nm, com índice de polidispersão em torno de 0,13. Amostras do 4-NC encapsulado em lipossomas (L4-NC) e em solução metanólica (F4-NC) foram submetidas a testes de degradação forçada (fotoestabilidade e hidrólise ácida/básica) e monitoradas por CLAE. Os resultados demonstraram que a encapsulação do 4-NC em lipossomas foi capaz de reduzir as taxas de degradação para todas as condições testas. O teste de fotoestabilidade foi realizado seguindo recomendações do ICH, em câmara de fotoestabilidade equipada com lâmpadas de UV e visível. L4-NC apresentou tempo de meia vida aproximadamente 15% maior quando comparado com a F4-NC. Após 72 horas, a hidrólise ácida e básica do F4-NC promove degradação de 13 e 16 % respectivamente. No entanto, não foi observada degradação em L4-NC para as mesmas condições de hidrólise testadas. Espectros de EPR dos lipossomas contendo 4-NC apresentaram mudanças nas propriedades da membrana quando marcados com o 5-doxil ácido esteárico (5-DSA), apresentando acentuada diminuição na fluidez da bicamada e indicando que o 4-NC está localizado próximo ao grupamento polar da bicamada lipídica. O 4-NC livre induz hemólise em condições isotônicas enquanto que a encapsulação em lipossomas protege os eritrócitos da lise. Após ensaio de citotoxicidade utilizando células K562, F4-NC apresentou perfil concentração dependente, enquanto que o L4-NC exibiu perfil concentração e tempo dependente, indicando que a formulação liposomal constitui um sistema de liberação controlada.

A pele possui um grande número de mecanismos de defesa antioxidante. No entanto, a exposição prolongada à radiação ultravioleta (RUV), é capaz de aumentar a concentração de espécies reativas de oxigênio (EROs) provocando um desequilíbrio antioxidante/oxidante. A geração de EROs pode levar ao fotoenvelhecimento e doenças, como o câncer. A administração tópica de antioxidantes é uma maneira eficiente de enriquecer o sistema protetor cutâneo endógeno e, assim, uma estratégia para reduzir os danos oxidativos causados pela RUV à pele. Entretanto, para fornecer a proteção adequada à pele, estas substâncias devem ultrapassar a barreira imposta pelo estrato córneo. O extrato de Lychnophora salicifolia Mart. possui compostos com atividades antioxidante, anti-inflamatória e analgésica, como o ácido clorogênico e a vicenina-2, sendo, portanto, um possível candidato à agente protetor dos danos induzidos pela radiação na pele. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial fotoquimiopreventivo deste extrato e do ácido clorogênico, bem como de formulações contendo o extrato e a substância isolada encapsulados em lipossomas. Para atingir tal objetivo, foram realizados experimentos in vitro e in vivo de atividade antioxidante e eficácia fotoquimiopreventiva para comprovação do potencial antioxidante e anti-inflamatório, estudos de liberação e estudos de penetração cutânea das formulações utilizando pele humana e pele de orelha de porco. Os resultados obtidos demonstraram que o extrato possui atividade antioxidante in vitro e baixa citotoxicidade. A incorporação do extrato e da substância isolada em lipossomas foi bem sucedida, uma vez que estes demonstraram uma boa estabilidade físico-química e aumentaram a penetração dos compostos na pele de camundongos sem pelos. As formulações contendo lipossomas permitiram que os compostos do extrato e o ácido clorogênico isolado atravessassem o estrato córneo chegando até epiderme e derme na pele humana ex vivo. O acúmulo de partículas nos folículos pilosos parece não exercer influencia neste processo. Os extrato foi capaz de sequestrar EROs intracelulares e evitar a depleção do antioxidante endógeno GSH tanto em cultura de células como nos experimentos in vivo. Também foi observada a inibição in vivo da metaloproteinase de matriz-9 (MMP-9), enzima ativada pela RUV e que tem a capacidade de degradar os componentes da matriz extracelular da pele. Além disso, o extrato apresentou atividade anti-inflamatória superior à do ácido clorogênico, verificada pela diminuição dos níveis de citocinas pró-inflamatórias (IL-1?, IL-6 e TNF-?) e da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) in vivo. Portanto, o extrato parece ser um agente fotoquimiopreventivo promissor para uso tópico e, as formulações desenvolvidas, um sistema viável para liberação destas substâncias na pele. / The skin has several defense mechanisms to avoid oxidant damages. However, a prolonged exposition under ultraviolet radiation (UVR) may increase reactive oxygen species (ROS) concentration causing antioxidant/oxidant imbalance. ROS generation can induce photoaging and skin cancer. Topical administration of antioxidants is an efficient way to fortify the endogenous protection system and to reduce the oxidative damage caused by UVR. Nevertheless, to be effective, these compounds need to pass through the skin barrier imposed by stratum corneum. Lychnophora salicifolia Mart. extract has antioxidant, antiinflammatory and analgesic compounds, such as chlorogenic acid and vicenin-2, and it may be a skin protector agent against UVR damage. Therefore, the aim of this study was to evaluate the photochemopreventive potential of this extract and chlorogenic acid, as well as their formulation containing liposomes. In vitro and in vivo tests were performed to prove antioxidant and antiinflammatory activity. Formulation release and skin penetration studies were also carried out in human and porcine ear skin. The results showed that the extract has antioxidant activity in vitro and low cytotoxicity. The extract and the isolated compound were successfully entrapped in liposomes, demonstrating a good physic and chemical stability and increasing the skin penetration in hairless mice. The formulations containing liposomes allowed that the extract compounds and chlorogenic acid passed through the stratum corneum and reached epidermis and dermis in human skin ex vivo. The hair follicle uptake of the particles do not influenced the penetration process. The extract was able to scavenge intracellular ROS and avoid the depletion of the endogenous GSH both in cell culture and in vivo, even as it inhibited matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), enzyme activated by UVR that degrades skin matrix extracellular components. The extract also presented larger antiinflammatory properties than chlorogenic acid, decreasing the cytokines (IL-1?, IL-6 and TNF-?) levels and the mieloperoxidase activity in vivo. Therefore, the results suggest the potential applicability of the extract as a photochemopreventive agent to topical use and the developed formulations seem to be a viable system to release these compounds to the skin.

Um dos principais limitantes do desenvolvimento de protocolos eficientes de terapia gênica e vacinação com DNA provém da baixa eficiência de transferência gênica por parte dos vetores não-virais. Isso surge, principalmente, pela dificuldade de transporte de DNA estrangeiro do exterior para o núcleo das células alvo, devido à presença de inúmeras barreiras. O principal objetivo do trabalho realizado foi o desenvolvimento e caracterização de novos vetores não virais multifuncionais, capazes de realizar eficientemente a entrega de material genético (DNA plasmidial, pDNA) ao núcleo de células de mamífero (HeLa). Para esse fim, complexos binários (CBs) foram formados combinando-se pDNA à protamina ou proteínas recombinantes (TRP3) anteriormente desenvolvidas por nosso grupo. Foi também estudado o encapsulamento destes CBs em lipossomas catiônicos, formados pelos lipídios EPC:DOPE:DOTAP, gerando então complexos pseudo-ternários (CPTs). Os estudos com a protamina revelaram que os CPTs formados apresentavam tamanhos relativamente pequenos (< 123 nm) e com valores de potencial zeta, variando de +22,8 mV a +36,3 mV, nas várias relações mássicas (pDNA:protamina) estudadas (1:0,5; 1:0,7, 1:0,9 e 1:1). Os ensaios de transfecção mostraram que o CPT na relação 1:0,5 (CB) obteve o melhor nível de transfecção das células (17,1%) com um nível de viabilidade celular de 73,2%. Os ensaios utilizando a TRP3 mostraram que os CPTs formados adquiriram tamanhos pequenos (< 134 nm) e valores de potencial zeta entre +36,8 mV e +11,9 mV dependendo da relação mássica do CB (1:1, 1:30 e 1:60). Os ensaios de transfecção mostram que os CPTs formados com a TRP3 aumentaram o nível de transfecção em todas as relações de pDNA-TRP3 usadas (1:1; 1:30 e 1:60). Vale ressaltar que nas relações mássicas 1:30 e 1:60 houve um aumento significativo na transfecção (25,2% e 24,5%, respectivamente). Os ensaios de citotoxicidade mostram que os CBs não afetaram a viabilidade célular, entretanto quando combinada ao lipossoma foi observado aumento da citotoxicidade. Finalmente, os resultados indicam que a TRP3 associada ao lipossoma (CPTs) aumenta a eficiência de entrega de pDNA sugerindo um efeito sinérgico entre essas duas moléculas na superação das várias barreiras físicas, químicas e difusionais encontradas na célula. / One of the major challenges on the development of efficient protocols for gene therapy and DNA vaccination is the low efficiency of gene transfer by non viral vectors. This is mainly attributed to the fact that, during the traffic to target cells nuclei, plasmid vectors must overcome a series of physical, enzymatic and diffusional barriers. The objective of this work was the development and characterization of new multifunctional non-viral vectors, based on lipids and proteins, able to delivery efficiently the foreign pDNA (plasmid DNA) to the nucleus of mammalian cells. A model pDNA containing the reporter gene GFP was complexed to protamine or the recombinant protein (TRP3), forming binary complexes (BC). In addition, we studied the ability of the cationic liposomes (EPC:DOPE:DOTAP) to encapsulate this binary complexes to form pseudo-ternary complexes (PTCs). The studies of size (DLS) and zeta potential revealed that both proteins were able to condense pDNA to form small complexes (BCS and PTCs) (~100 nm) and positively charged (+11,9 mV a +36,8 mV), both interesting characteristics for transfections. However, the CPTs formed by TRP3 was that showed the highest transfections level (25,3%). The cytotoxicity assays indicated the BCs had a low effect on the cell viability. On the other hand, the biggest effect on cell death was found when PTCs were used. The results indicated the TRP3 associated to liposomes (PTCs) increased the delivery efficiency due to differences in the intracellular trafficking, suggesting a synergic effect between these different molecules in the vector in order to overcome the barriers found inside the cell.

Esta tese apresenta resultados da caracterização estrutural de três sistemas de classes diferentes por meio, principalmente, da modelagem de dados de espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS). No sistema surfactante-surfactante as micelas mistas são formadas por dodecil sulfato de sódio (SDS) e um dos surfactantes da série Tween (Tween 20, 40, 60 e 80). A modelagem adotada impôs vínculos moleculares uma vez que os dados de SAXS estavam em escala absoluta. Isso reduziu a ambiguidade nos valores dos parâmetros ajustáveis e permitiu verificar que os dados de SAXS são satisfatoriamente descritos considerando-se que as micelas são elipsoides de revolução core-shell, podendo ser prolatas ou oblatas dependendo do tipo de Tween empregado. Para o sistema proteína-surfactante, a metodologia experimental utilizada permitiu um estudo estrutural e termodinâmico dos complexos formados por meio do acompanhamento do processo de ligação de SDS às proteínas lisozima e alfa-lactalbumina. A técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) forneceu um panorama geral sobre a desnaturação proteica e norteou os experimentos seguintes de SAXS e dicroísmo circular (CD). Por meio da análise dos dados de CD concluiu-se que as proteínas perdem quase totalmente sua estrutura terciária, mas não a secundária (esse estado é conhecido como molten globule). Já a modelagem de SAXS em escala absoluta com imposição de vínculos permitiu concluir que os complexos proteína-surfactante podem ser entendidos micelas decoradas, isto é, a proteína está distribuída sobre a superfície de uma micela de SDS. Esse modelo, aliado à abordagem experimental empregada, permitiu a caracterização sistemática dos complexos durante a desnaturação proteica. Em relação ao sistema lipossomas-(bio)ativos, a análise dos dados de SAXS por meio do Método da Deconvolução Gaussiana usando bicamadas simétricas, para os sistemas Phospholipon 90H curcumina/vitamina D3 e dipalmitoilfosfatidilcolina de soja (DPPC) ácido láurico (LA), e assimétricas, para o caso fosfatidilcolina de ovo (EPC) sumatriptano (SMT), permitiu acompanhar mudanças na estrutura das mesmas ocasionadas pela presença dos (bio)ativos. Verificou-se em todos os casos que a espessura da bicamada se mantém praticamente constante. A flexibilidade membranar aumenta, seja em função da temperatura, para o sistema Phospholipon 90H curcumina/ vitamina D3, seja em função da concentração de (bio)ativos, como nos outros dois casos. Para estes, concluiu-se pela análise dos perfis de contraste de densidade eletrônica que os (bio)ativos interagem preferencialmente com as cabeças polares dos fosfolipídeos que constituem os lipossomas, possivelmente causando defeitos topológicos nessa região e ocasionando o aumento da flexibilidade membranar mencionada antes. LA, diferentemente de SMT, induz uma transição de lipossomas multilamelares para unilamelares, e esse fenômeno é grandemente influenciado pelo pH do meio. / This thesis presents a structural characterization of three systems of different classes through, mainly, the small angle X-ray scattering (SAXS) technique. In the surfactant-surfactant system the mixed micelles are composed by sodium dodecyl sulfate (SDS) and one of the Tween surfactants (Tween 20, 40, 60 and 80). The adopted modeling imposed molecular constraints since the SAXS data was in absolute scale. This procedure reduced the ambiguity in the values of the adjustable parameters and allowed to verify that SAXS data is satisfactorily described considering that the micelles are core-shell revolution ellipsoids which can be prolate or oblate depending on the type of Tween used in the micelle. For the protein-surfactant system, the applied experimental methodology allowed a structural and thermodynamic study of the complexes formed through monitoring the binding of SDS to the proteins lysozyme and alpha-lactalbumin. Isothermal titration calorimetry (ITC) technique provided an overview of proteic denaturation and guided the following experiments of SAXS and circular dichroism (CD). From CD data analysis it was concluded that the proteins lose almost totally their tertiary structure, but not the secondary one (this state is known as \"molten globule\"). On the other hand, SAXS data modeling in absolute scale with molecular constraints leaded to the conclusion that protein-surfactant complexes can be considered decorated micelles in which the protein is distributed over a SDS micelle surface. This model, combined to the adopted experimental procedure, allowed the systematic characterization of the complexes along the protein denaturation. In the liposome-(bio)actives system, the SAXS data analysis using the Gaussian Deconvolution Method assuming symmetric bilayers, for the systems Phospholipon 90H curcumin /vitamin D3 and soybean dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC) lauric acid (LA), and asymmetric bilayers, in the case of egg phosphatidylcholine (EPC) sumatriptan (SMT) system, allowed to follow changes in the lipid bilayer structure induced by the presence of the (bio)actives. It has been found, in all cases, that the bilayer thickness remains approximately. Membrane flexibility increases, depending on the temperature, for the Phospholipon 90H curcumin /vitamin D3 system, or as a function of the (bio)actives concentrations, as in the other two cases. For those, it was concluded, by the analysis of electron density contrast profiles, that the (bio)actives preferentially interact with the polar heads of the phospholipids forming the liposomes, possibly causing topological defects in that region and leading the membrane flexibility increase. LA, unlike SMT, induces a transition from multilamellar to unilamellar liposomes, and this phenomenon is greatly influenced by the pH of the medium.

O remifentanil é um opióide potente comparável ao fentanil, mas, possui rápida eliminação plasmática e por isso necessariamente deve ser adiministrado por infusão contínua. A administração transdérmica pode liberar fármacos de forma prolongada, contínua e controlada. Características que facilitariam a administração do remifentanil, contornariam sua limitação farmacocinética e ampliariam os casos em que este fármacos seria útil. Lipossomas deformáveis são formados por fosfolipídios e por tensoativo que normalmente é um surfactante de cadeia simples que aumenta a flexibilidade da bicamada lipídica da membrana e torna os lipossomas deformáveis. Os lipossomas deformáveis são capazes de disponibilizar, de forma expressiva, várias substâncias transdermicamente incluindo macromoléculas e podem ser um eficiente sistema de liberação controlada de remifentanil. O presente estudo desenvolve diferentes dispersões de lipossomas deformáveis de remifentanil e caracteriza essas dispersões quanto a tamanho de diâmetro dos lipossomas, eficiência de encapsulação dos lipossomas, elasticidade da membrana, permeação e retenção cutânea in vitro. As dispersões de lipossomas deformáveis preparadas foram compostas por remifentanil, fosfatidilcolina de soja, tensoativo tween 80 ou tween 20 e etanol a 10% ou a 20% e foram preparadas por dois métodos: sonicação e hidratação de filme e sonicação. O tamanho e a distribuição de tamanho foram obtidos por espalhamento dinâmico de luz, a eficiência de encapsulação por diálise, a elasticidade por filtração, seguido de determinação do tamanho. Células de difusão de Franz e pele de orelha de porco foram usadas para estudar a permeação e a retenção cutânea in vitro. Os lipossomas deformáveis preparados apresentaram pequeno diâmetro (40 a 71 nm) quando comparado a outros na literatura e seus tamanhos foram dependentes da formulação. Todos os lipossomas deformáveis preparados apresentaram boa elasticidade e permeação dependente da eficiência de encapsulação e do tamanho de diâmetro. A solução hidroetanólica com remifentanil e a mistura física dos excipientes com remifentanil não apresentaram permeação e retenção. A eficiência de encapsulação dos lipossomas deformáveis é coerente com outros resultados na literatura e foi dependente da formulação e do método de preparação. A avaliação da permeação de dispersões de lipossomas deformáveis com remifentanil não encapsulado foi feita para se obter informações sobre os mecanismos de ação pelos quais estes lipossomas agem. Verificou-se que o transporte de substâncias encapsuladas nos lipossomas foi o mecanismo de maior importância / Remifentanil is a potent opioid comparable to fentanyl. Remifentanil has rapid systemic elimination and, therefore, it necessarily has to be administered by continuous parenteral infusion. Transdermal delivery can provide extended, continuous and controlled delivery of drug. Characteristics that could make the remifentanil administration easier, could resolve its phamacocinetcs limitation and could enlarge the cases that this drug would be useful. Deformable liposomes consist of phospholipid and surfactant that is often a single chain surfactant that increases the membrane lipid bilayer flexibility and makes the liposome deformable. Deformable liposomes are able to expressively improve skin delivery of many drugs, including macromolecules and could be an efficient controlled delivery system of remifentanil. The aim of this study has been to develop different deformable liposomes dispersions of remifentanil and to characterize those dispersions by liposome diameter size, liposome entrapment efficiency, membrane elasticity and in vitro skin permeation and deposition. The deformable liposomes consisted of remifentanil, soybean phosphatidylcholine, surfactant tween 80 or tween 20, and ethanol at 10% or 20%. They have been prepared by two methods: sonication or conventional mechanical dispersion and sonication. The size was determined by light scattering, the entrapment efficiency by dialysis, the membrane elasticity by filtration and size determination. Franz diffusion cells and ear porcine skin wore used to evaluate the in vitro skin permeation and the skin deposition. The deformable liposomes showed small size (40 a 71 nm) compared with others from literature and their sizes wore dependent of the formulation. All deformable liposomes showed good membrane elasticity and showed permeation that was dependent of the formulation and diameter size. The remifentanil hidroetanolic solution and the excipients physical mixture with remifentanil did not have any permeation and retention. The deformable liposomes entrapment efficiency has been coherent with others literature results and also was dependent of the formulation and preparation method. The permeation of deformable liposomes dispersions wore evaluated to get information about the deformable liposome action mechanisms. The transport of encapsulated substances on liposome was the action mechanism of major importance.

Esta tese apresenta resultados da caracterização estrutural de três sistemas de classes diferentes por meio, principalmente, da modelagem de dados de espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS). No sistema surfactante-surfactante as micelas mistas são formadas por dodecil sulfato de sódio (SDS) e um dos surfactantes da série Tween (Tween 20, 40, 60 e 80). A modelagem adotada impôs vínculos moleculares uma vez que os dados de SAXS estavam em escala absoluta. Isso reduziu a ambiguidade nos valores dos parâmetros ajustáveis e permitiu verificar que os dados de SAXS são satisfatoriamente descritos considerando-se que as micelas são elipsoides de revolução core-shell, podendo ser prolatas ou oblatas dependendo do tipo de Tween empregado. Para o sistema proteína-surfactante, a metodologia experimental utilizada permitiu um estudo estrutural e termodinâmico dos complexos formados por meio do acompanhamento do processo de ligação de SDS às proteínas lisozima e alfa-lactalbumina. A técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) forneceu um panorama geral sobre a desnaturação proteica e norteou os experimentos seguintes de SAXS e dicroísmo circular (CD). Por meio da análise dos dados de CD concluiu-se que as proteínas perdem quase totalmente sua estrutura terciária, mas não a secundária (esse estado é conhecido como molten globule). Já a modelagem de SAXS em escala absoluta com imposição de vínculos permitiu concluir que os complexos proteína-surfactante podem ser entendidos micelas decoradas, isto é, a proteína está distribuída sobre a superfície de uma micela de SDS. Esse modelo, aliado à abordagem experimental empregada, permitiu a caracterização sistemática dos complexos durante a desnaturação proteica. Em relação ao sistema lipossomas-(bio)ativos, a análise dos dados de SAXS por meio do Método da Deconvolução Gaussiana usando bicamadas simétricas, para os sistemas Phospholipon 90H curcumina/vitamina D3 e dipalmitoilfosfatidilcolina de soja (DPPC) ácido láurico (LA), e assimétricas, para o caso fosfatidilcolina de ovo (EPC) sumatriptano (SMT), permitiu acompanhar mudanças na estrutura das mesmas ocasionadas pela presença dos (bio)ativos. Verificou-se em todos os casos que a espessura da bicamada se mantém praticamente constante. A flexibilidade membranar aumenta, seja em função da temperatura, para o sistema Phospholipon 90H curcumina/ vitamina D3, seja em função da concentração de (bio)ativos, como nos outros dois casos. Para estes, concluiu-se pela análise dos perfis de contraste de densidade eletrônica que os (bio)ativos interagem preferencialmente com as cabeças polares dos fosfolipídeos que constituem os lipossomas, possivelmente causando defeitos topológicos nessa região e ocasionando o aumento da flexibilidade membranar mencionada antes. LA, diferentemente de SMT, induz uma transição de lipossomas multilamelares para unilamelares, e esse fenômeno é grandemente influenciado pelo pH do meio. / This thesis presents a structural characterization of three systems of different classes through, mainly, the small angle X-ray scattering (SAXS) technique. In the surfactant-surfactant system the mixed micelles are composed by sodium dodecyl sulfate (SDS) and one of the Tween surfactants (Tween 20, 40, 60 and 80). The adopted modeling imposed molecular constraints since the SAXS data was in absolute scale. This procedure reduced the ambiguity in the values of the adjustable parameters and allowed to verify that SAXS data is satisfactorily described considering that the micelles are core-shell revolution ellipsoids which can be prolate or oblate depending on the type of Tween used in the micelle. For the protein-surfactant system, the applied experimental methodology allowed a structural and thermodynamic study of the complexes formed through monitoring the binding of SDS to the proteins lysozyme and alpha-lactalbumin. Isothermal titration calorimetry (ITC) technique provided an overview of proteic denaturation and guided the following experiments of SAXS and circular dichroism (CD). From CD data analysis it was concluded that the proteins lose almost totally their tertiary structure, but not the secondary one (this state is known as \"molten globule\"). On the other hand, SAXS data modeling in absolute scale with molecular constraints leaded to the conclusion that protein-surfactant complexes can be considered decorated micelles in which the protein is distributed over a SDS micelle surface. This model, combined to the adopted experimental procedure, allowed the systematic characterization of the complexes along the protein denaturation. In the liposome-(bio)actives system, the SAXS data analysis using the Gaussian Deconvolution Method assuming symmetric bilayers, for the systems Phospholipon 90H curcumin /vitamin D3 and soybean dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC) lauric acid (LA), and asymmetric bilayers, in the case of egg phosphatidylcholine (EPC) sumatriptan (SMT) system, allowed to follow changes in the lipid bilayer structure induced by the presence of the (bio)actives. It has been found, in all cases, that the bilayer thickness remains approximately. Membrane flexibility increases, depending on the temperature, for the Phospholipon 90H curcumin /vitamin D3 system, or as a function of the (bio)actives concentrations, as in the other two cases. For those, it was concluded, by the analysis of electron density contrast profiles, that the (bio)actives preferentially interact with the polar heads of the phospholipids forming the liposomes, possibly causing topological defects in that region and leading the membrane flexibility increase. LA, unlike SMT, induces a transition from multilamellar to unilamellar liposomes, and this phenomenon is greatly influenced by the pH of the medium.

Infecções associadas a cepas da Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC), podem causar manifestações clínicas sendo a Síndrome Hemolítica Urêmica (SHU), a complicação mais severa. SHU está relacionada a presença da toxina de Shiga do tipo 2 (Stx2) e até o momento não se dispõe de uma vacina ou tratamentos efetivos para uso em humanos. Assim, este trabalho teve por objetivo desenvolver uma vacina baseada no derivado atóxico contendo a subunidade B e a porção A2 da subunidade A denominado Stx2&#916;AB. Após expressão em linhagens de E.coli e tentativas iniciais de purificação, resultaram na formação de agregados proteicos. Ajustes nas condições de cultivo e purificação permitiram obter a proteína na forma de monômero da subunidade B, mas sem a presença da porção A2. O antígeno foi incorporado a lipossomas multilamelares (MLVs), combinados ao lipídio A e administrados por via subcutânea a camundongos. Animais imunizados desenvolveram anticorpos sistêmicos específicos contra Stx2 capazes de neutralizar a toxina in vitro e conferir proteção parcial a animais desafiados com dose letal da toxina. Em conclusão, o trabalho confirmou o potencial vacinal do antígeno e validou a estratégia baseada na incorporação do antígeno às MLVs como estratégia de imunização. / Infections associated with strains of enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC), can cause clinical manifestations are the hemolytic uremic syndrome (HUS), the most severe complication. HUS is related to the presence of Shiga toxin type 2 (Stx2) and yet do not have a vaccine or effective treatments for use in humans. This work aimed to develop a vaccine based on non-toxic derivative containing the B subunit and the A2 portion of the subunit called Stx2&#916;AB. After expression in E. coli strains and initial purification attempts resulted in the formation of protein aggregates. Adjustments in the cultivation and purification conditions have enabled the protein as the monomer subunit B but without the presence of the A2 portion. The antigen was incorporated into multilamellar liposomes (MLVs), the combined lipid A and administered subcutaneously to mice. immunized animals develop systemic antibodies specific against Stx2 able to neutralize toxin in vitro and to confer partial protection when challenged with a lethal dose of toxin. In conclusion, the study confirmed the potential vaccine antigen and validated strategy based on antigen incorporation into MLVs as immunization strategy.

Orientador: Marlus Chorilli / Resumo: O diabetes mellitus (DM) é uma síndrome metabólica caracterizada por deficiência na produção/secreção pancreática de insulina e/ou resistência à ação do hormônio nos tecidos alvo, resultando em hiperglicemia. Diversas pesquisas têm desencadeado o desenvolvimento de novos sistemas de administração de insulina que possibilitem a utilização de vias alternativas à parenteral, com destaque à administração de insulina por via nasal. Esta via tem-se mostrado promissora, pois pode promover uma rápida absorção do fármaco e aumentar a sua biodisponibilidade. Entretanto, existem mecanismos de depuração mucociliar que limitam a administração de fármacos, além da baixa permeabilidade do epitélio nasal, o qual dificulta a absorção de fármacos com alto massa molar. Uma estratégia para vencer tais barreiras é a utilização de sistemas nanoestruturados (lipossomas), pois são amplamente utilizados para o aperfeiçoamento da potencialização da ação terapêutica de fármacos. Além disso estes lipossomas foram funcionalizados com peptídeos de transdução de membrana (CPPs), tais como os peptídeos TAT e Penetratin (PNT), que atuam como promotores da penetração e absorção do fármaco, com posterior dispersão em hidrogel de hidroxietilcelulose. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar lipossomas contendo solução de insulina, funcionalizados com CPPs (TAT e PNT) e dispersos em hidrogel, avaliar o potencial pela via nasal, in vivo, para a melhora dos níveis séricos e efeito hipoglicemiante d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

[pt] Norfloxacina (NFX) é um antibiótico fluorescente de amplo espectro bacteriológico, membro da família das fluorquinolonas (FQs). A interação das FQs com íons metálicos pode incrementar a ação bactericida e agir contra a resistência das bactérias frente aos antibióticos. Diversos exemplos de complexos mistos de norfloxacina e Cu(II) podem ser encontrados na literatura. A compreensão dos mecanismos moleculares de interação desses antibióticos com os diferentes componentes das células e com nanopartículas de ouro, como transportadores do fármaco, é extremamente importante. Para entender essas interações, neste trabalho utilizamos diferentes técnicas espectroscópicas, como espectroscopia de fluorescência estacionária e resolvida no tempo, absorção de luz UV-Visível e ressonância paramagnética eletrônica (RPE). A interação de NFX e do complexo ternário Cu(II):L:NFX, onde o ligante L é a 1,10-fenantrolina (Phen) ou 2,2-bipiridina (Bipy), com micelas e lipossomas unilamelares pequenos de fosfatidilcolina de ovo (PC) foi estudada usando espectroscopia de fluorescência em estado estacionário e resolvida no tempo. Foi estudada a estabilidade dos complexos ternários formados em micelas. Foram obtidas constantes de estabilidade no interior de micelas de SDS, as quais mostraram valores muito maiores do que em tampão. Já os espectros de RPE deram maiores detalhes sobre a estrutura dos complexos e confirmaram a formação do complexo ternário dentro das micelas. Foram estudadas as interações de FQs e seus complexos de cobre com lipossomas de PC preparados com diferentes densidades superficiais de carga elétrica negativa. No estudo da interação de FQs com nanopartículas de ouro sintetizadas por ablação a laser (nanocompósitos, AuNCs), NFX mostrou maiores mudanças, tanto na absorbância como na fluorescência, do que as FQs ciprofloxacina (CFX) e levofloxacina (LFX). Os resultados sugerem mudanças no índice de refração na superfície dos AuNCs, por associação com o fármaco e/ou formação de aglomerados como resultado da interação. Observou-se também uma supressão lenta, porém significativa, na fluorescência da NFX, sem mudança na posição do pico, indicando que NFX mantém o seu estado inicial de protonação ligando-se à superfície dos AuNCs. Também foi observada a liberação de FQs ligadas à superfície de AuNPs mediante substituição por tióis, que ocasiona recuperação parcial da fluorescência da fluorquinolona. Por último, como o surfactante aniônico SDS se mostrou promissor na interação com NFX, em comparação com surfactantes catiônicos e neutros, e como os AuNCs são estáveis em SDS, estudamos a interação de NFX com AuNCs sintetizados em presença de SDS e, para comparação, com AuNCs colocados em solução de SDS após a síntese. / [en] Norfloxacin (NFX) is a fluorescent antibiotic of broad bacteriological spectrum, member of the fluoroquinolone (FQ) family. The interaction of FQs with metal ions can increase the bactericidal action and act against antibiotics bacterial resistance. Several examples of mixed-ligand norfloxacin Cu (II) complexes can be found in the literature. Understanding the molecular mechanisms of interaction of these antibiotics with different cell components and with gold nanoparticles as drug transporters is extremely important. To clarify these interactions, we used different spectroscopic techniques, such as steady-state and time-resolved fluorescence spectroscopy, UV-Visible light absorption, and electron paramagnetic resonance (EPR). The interaction of NFX and the ternary complex Cu(II):L:NFX, where the L is the ligand 1,10-phenanthroline (Phen) or 2,2-bipyridine (Bipy), with micelles and small unilamellar liposomes of egg phosphatidylcholine (PC) was studied using steady-state and time-resolved fluorescence spectroscopy. The stability of the ternary complexes formed in micelles was studied, and stability constants were obtained inside SDS micelles, which showed values much larger than in buffer. The EPR spectra gave further details on the structure of the complexes, and confirmed the formation of the ternary complex inside the micelles. The interactions of FQs and their copper complexes with PC liposomes prepared with different surface densities of negative electrical charge were studied. In the study of the interaction of FQs with gold nanoparticles synthesized by laser ablation (nanocomposites, AuNCs), NFX showed greater changes than FQs ciprofloxacin (CFX) and levofloxacin (LFX) in both absorbance and fluorescence. The results suggest changes in the surface refractive index of the AuNCs and/or cluster formation, as result of the interaction with the drug. A slow but significant quenching of NFX fluorescence was also observed, with no change in peak position, indicating that NFX maintains its initial state of protonation by binding to the surface of the AuNCs. Release of FQs attached to the surface of AuNCs by thiols has also been observed, which causes partial recovery of FQ fluorescence. Finally, as the anionic surfactant SDS showed to be promising in the interaction with NFX, compared to cationic and neutral surfactants, and because the AuNCs are stable in SDS, we studied the interaction of NFX with AuNCs synthesized in the presence of SDS and, for comparison, with AuNCs placed in SDS solution after synthesis.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:05:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LourenaMF_TESE_Capa_ate_pag79.pdf: 4572586 bytes, checksum: 2630047160ff526cc964f166fb86ab33 (MD5) Previous issue date: 2011-03-14 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Gene therapy is one of the major challenges of the post-genomic research and it is based on the transfer of genetic material into a cell, tissue or organ in order to cure or improve the patient s clinical status. In general, gene therapy consists in the insertion of functional genes aiming substitute, complement or inhibit defective genes. The achievement of a foreigner DNA expression into a population of cells requires its transfer to the target. Therefore, a key issue is to create systems, vectors, able to transfer and protect the DNA until it reaches the target. The disadvantages related to the use of viral vectors have encouraged efforts to develop emulsions as non-viral vectors. In fact, they are easy to produce, present suitable stability and enable transfection. The aim of this work was to evaluate two different non-viral vectors, cationic liposomes and nanoemulsions, and the possibility of their use in gene therapy. For the two systems, cationic lipids and helper lipids were used. Nanoemulsions were prepared using sonication method and were composed of Captex? 355; Tween? 80; Spam? 80; cationic lipid, Stearylamine (SA) or 1,2-dioleoyl-3-trimethylammoniumpropane (DOTAP) and water (Milli-Q?). These systems were characterized by average droplet size, Polidispersion Index (PI) and Zeta Potential. The stability of the systems; as well as the DNA compaction capacity; their cytotoxicity and the cytotoxicity of the isolated components; and their transfection capacity; were also evaluated. Liposomes were made by hydration film method and were composed of DOTAP; 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), containing or not Rhodaminephosphatidylethanolamine (PE- Rhodamine) and the conjugate Hyaluronic Acid DOPE (HA-DOPE). These systems were also characterized as nanoemulsions. Stability of the systems and the influence of time, size of plasmid and presence or absence of endotoxin in the formation of lipoplexes were also analyzed. Besides, the ophthalmic biodistribution of PE-Rhodamine containing liposomes was studied after intravitreal injection. The obtained results show that these systems are promising non-viral vector for further utilization in gene therapy and that this field seems to be very important in the clinical practice in this century. However, from the possibility to the practice, there is still a long way / A terapia g?nica ? um dos maiores desafios propostos pela pesquisa p?s-gen?mica e se baseia na transfer?ncia de material gen?tico a uma c?lula, tecido ou ?rg?o com o intuito de curar ou melhorar o estado cl?nico do paciente. Em sua forma mais simples, a terapia g?nica consiste na inser??o de genes funcionais em c?lulas com genes defeituosos objetivando substituir, complementar ou inibir esses genes causadores de doen?as. Para que o DNA ex?geno seja expresso em uma popula??o celular faz-se necess?ria a sua transfer?ncia at? o local de a??o. Assim, ? necess?rio criar ve?culos, que transportem e protejam o DNA at? que este chegue a uma popula??o celular alvo. Os obst?culos encontrados com a utiliza??o de vetores virais t?m proporcionado o interesse no desenvolvimento de vetores n?o-virais, por serem f?ceis de produzir, apresentarem estabilidade control?vel e facilitarem a transfec??o g?nica. O objetivo deste trabalho foi avaliar dois diferentes vetores n?o virais, lipossomas e nanoemuls?es cati?nicos, e sua poss?vel utiliza??o na terapia g?nica. Para isso, foram utilizados lip?deos cati?nicos e co-tensoativos na produ??o dos dois sistemas. As nanoemuls?es foram produzidas pelo m?todo de sonica??o e compostas por Captex? 355; Tween? 80; Spam? 80; lip?deo cati?nico, Estearilamina (EA) ou N-[1-(2,3-Dioleoiloxi)propil]-N,N,Ntrimetilamonio metilsulfato (DOTAP); e ?gua ultra-pura (Milli-Q?). Estes sistemas foram caracterizados quanto ao tamanho m?dio de got?cula, ?ndice de polidispers?o (PI) e potencial zeta. Avaliou-se ainda a estabilidade dos sistemas e suas capacidades de compacta??o do material gen?tico. Os lipossomas foram preparados a partir do m?todo de hidrata??o do filme e compostos por DOTAP, Dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), na presen?a ou aus?ncia de Rodaminafosfatidiletanolamina (PE-Rodamina) e do conjugado ?cido Hialur?nico DOPE (HA-DOPE). Estes sistemas foram caracterizados da mesma forma que as nanoemuls?es e tamb?m foram avaliados estabilidade, influ?ncia do tempo, tamanho de material gen?tico e presen?a ou aus?ncia de endotoxinas na forma??o dos lipoplexos. Os resultados obtidos permitem afirmar que os sistemas s?o promissores para posterior utiliza??o na terapia g?nica e que esta ?rea promete ser uma ?rea f?rtil de pesquisa cient?fica e cl?nica por muitos anos, e provavelmente se tornar? uma pr?tica cl?nica importante neste s?culo. No entanto, da possibilidade ? pr?tica existe um longo caminho a percorrer