No description available.

In breast cancer, the genetic profiling of circulating cell-free DNA (cfDNA) from blood plasma was shown to have good potential for clinical use. In contrast, only a few studies were performed investigating urinary cfDNA. In this pilot study, we analyzed plasma-derived and matching urinary cfDNA samples obtained from 15 presurgical triple-negative breast cancer patients. We used a targeted next-generation sequencing approach to identify and compare genetic alterations in both body fluids. The cfDNA concentration was higher in urine compared to plasma, but there was no significant correlation between matched samples. Bioinformatical analysis revealed a total of 3339 somatic breast-cancer-related variants (VAF ≥ 3%), whereof 1222 vs. 2117 variants were found in plasma-derived vs. urinary cfDNA, respectively. Further, 431 shared variants were found in both body fluids. Throughout the cohort, the recovery rate of plasma-derived mutations in matching urinary cfDNA was 47% and even 63% for pathogenic variants only. The most frequently occurring pathogenic and likely pathogenic mutated genes were NF1, CHEK2, KMT2C and PTEN in both body fluids. Notably, a pathogenic CHEK2 (T519M) variant was found in all 30 samples. Taken together, our results indicated that body fluids appear to be valuable sources bearing complementary information regarding the genetic tumor profile.

[ES] A pesar de los nuevos avances en el tratamiento del cáncer de pulmón, su tasa de incidencia y mortalidad siguen en cabeza en todo mundo. Concretamente, el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa casi el 85% de todos los cánceres de pulmón, siendo su supervivencia a 5 años muy reducida. En base a dicho escenario, el objetivo principal de este trabajo es el de caracterizar de manera exhaustiva los exosomas secretados por las células del CPNM. Se sabe que estas microvesículas están involucradas en números procesos celulares, por lo que pueden contener gran cantidad de información acerca de las características moleculares del tumor. Para ello se han empleado cultivos primarios y líneas comerciales crecidas en diferentes condiciones, así como muestras de sangre periférica obtenida de los pacientes con CPNM. Un primer screening llevado a cabo en los exosomas secretados in vitro, ha permitido obtener un gran número de mRNAs y miRNAs relacionados con diferentes procesos biológicos y vías de señalización. Además, algunos genes como FDFT1 y SNAI1 han destacado por su sobreexpresión en exosomas procedentes de las células crecidas en formación de tumoresferas (modelos 3D), las cuales están enriquecidas en población de células madre tumorales. A su vez, otros marcadores presentes en el interior de estas microvesículas, se han mostrado relacionados con dos de los subtipos histológicos más frecuentes: adenocarcinoma (LUAD) y carcinoma escamoso (LUSC). Posteriormente, para validar los hallazgos obtenidos en exosomas, los marcadores más significativos fueron analizados in silico en una cohorte de muestras de tejido, compuesta por 661 pacientes con CPNM (TCGA database). Estos resultados han revelado una asociación entre la expresión del gen SNAI1 y la supervivencia de estos pacientes (OS y RFS p<0.05). Además, los genes XAGE1B, SEPP1 y TTF-1 (previamente determinados en exosomas), mantienen una relación significativa con el grupo de pacientes LUAD; mientras que CABYR, RIOK3 y CAPRIN1 se mantienen sobrexpresados en LUSC (Mann-Whitney test p<0.05). Estos marcadores también se han analizado en una cohorte de 186 pacientes con CPNM procedentes del Hospital General Universitario de Valencia, donde se corroboró la asociación de SNAI1 con la supervivencia de los pacientes en estadios tempranos (RFS en pacientes LUAD, p<0.05), así como la sobreexpresión de CABYR y RIOK3 en pacientes LUSC, y de XAGE1B y TTF-1 en LUAD. Por otra parte, el aislamiento de los exosomas presentes en la sangre periférica de pacientes en estadios avanzados, ha permitido identificar otros marcadores asociados a caracterísiticas clínico-patológicas relevantes. A su vez, el contenido de estas microvesículas ha sido empleado para la detección de mutaciones génicas ligadas al manejo clínico del CPNM. En resumen, los resultados obtenidos en este trabajo ponen de manifiesto el potencial de los exosomas como fuente de biomarcadores para el estudio de las diferentes etapas de desarrollo del CPNM. Estas microvesículas ofrecen una visión completa y en tiempo real, de las características de la enfermedad, pudiendo ser aisladas de forma repetida y mediante técnicas mínimamente invasivas. / [CA] A pesar dels avanços recents en el tractament del càncer de pulmó, les seues taxes d'incidència i mortalitat continuen sent altes a nivell mundial. Concretament, el càncer de pulmó de cèl·lules no petites (CPNM) representa gairebé el 85% de tots els càncers de pulmó, amb una taxa de supervivència a 5 anys molt limitada. Donat aquest escenari, l'objectiu principal d'aquest estudi és caracteritzar de manera exhaustiva els exosomes secretats per les cèl·lules de CPNM. Aquestes microvesícules estan involucrades en nombrosos processos tumorals i poden contenir una gran quantitat d'informació sobre les característiques moleculars de la malaltia. Per aconseguir-ho, es van utilitzar cultius primaris i línies cel·lulars (cultiu en diferents condicions), juntament amb mostres de sang perifèrica obtingudes de pacients amb CPNM. Un cribratge inicial en exosomes secrets in vitro va permetre identificar una quantitat significativa de mARNs i miARNs relacionats amb diversos processos biològics i vies de senyalització. A més, alguns gens com FDFT1 i SNAI1 van destacar per la seua sobreexpressió en exosomes derivats de cèl·lules crescuts en formació de tumorsferes (models 3D), que estan enriquides en poblacions de cèl·lules mare tumorals. A més, s'han trobat marcadors en aquestes microvesícules associats amb dos dels subtipus histològics més comuns: adenocarcinoma (LUAD) i carcinoma escamós (LUSC). Posteriorment, per validar els resultats obtinguts en exosomes, es van analitzar in silico els marcadors més significatius en una cohort de teixit de CPNM de la base de dades TCGA. Aquests resultats van revelar una associació entre l'expressió del gen SNAI1 i la supervivència dels pacients (OS i RFS, p <0,05). A més, l'expressió dels gens XAGE1B, SEPP1 i TTF-1 (prèviament identificats en exosomes) va mantenir una relació significativa amb el grup LUAD, mentre que CABYR, RIOK3 i CAPRIN1 van continuar sobreexpressats en els pacients de LUSC (prova de Mann-Whitney, p <0,05). Aquests marcadors també es van analitzar en una cohort de 186 pacients amb CPNM de l'Hospital General Universitari de València, on es va confirmar l'associació de l'expressió de SNAI1 i la supervivència dels pacients en estadi precoç (RFS en pacients de LUAD, p <0,05), així com la sobreexpressió de CABYR i RIOK3 en pacients de LUSC, i de XAGE1B i TTF-1 en LUAD. D'altra banda, els exosomes presents en mostres de sang de la cohort d'estadis avançats van permetre la identificació d'altres biomarcadors associats a característiques clíniques rellevants dels pacients. A més, la càrrega exosomàtica també es va utilitzar per detectar mutacions genètiques relacionades amb el tractament clínic del CPNM. En resum, els resultats obtinguts en aquesta tesi destaquen el potencial dels exosomes com a font de biomarcadors per a l'estudi de les diferents etapes del desenvolupament del CPNM. Aquestes microvesícules ofereixen una visió completa i en temps real de les característiques moleculars de la malaltia i poden ser obtingudes de manera repetida i amb una mínima invasió. / [EN] Despite recent advancements in lung cancer treatment, its incidence and mortality rates remain high worldwide. Specifically, non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for nearly 85% of all lung cancers, with a 5-year survival rate of 20%. Given this scenario, the primary objective of this study is to comprehensively characterize the exosomes secreted by NSCLC cells. These microvesicles are known to be involved in numerous tumoral processes, potentially containing a wealth of information about the molecular characteristics of the disease. To achieve this, primary cultures and cell lines, along with peripheral blood samples obtained from NSCLC patients were used. An initial screening in exosomes secreted in vitro allowed the identification of a significant number of mRNAs and miRNAs, related to various biological processes and signaling pathways. Moreover, some genes such as FDFT1 and SNAI1 stood out due to their overexpression in exosomes derived from cells grown in tumorspheres formation (3D models), which are enriched in cancer stem cell population. Additionally, markers found within these microvesicles were associated with two of the most common histological subtypes: adenocarcinoma (LUAD) and squamous cell carcinoma (LUSC). Subsequently, to validate the findings seen in exosomes, the most significant markers were analyzed in silico in an NSCLC tissue cohort from the TCGA database. These results revealed an association between the expression of SNAI1 and patient survival (OS and RFS, p<0.05). Furthermore, XAGE1B, SEPP1, and TTF-1 expression (previously identified in exosomes) maintained a significant relationship with the LUAD group, while CABYR, RIOK3, and CAPRIN1 remained overexpressed in LUSC patients (Mann-Whitney test, p<0.05). These markers were also analyzed in a cohort of 186 NSCLC patients from the University General Hospital of Valencia. The association of SNAI1 expression and the survival of early-stage patients (RFS in LUAD patients, p<0.05) was confirmed, as well as the overexpression of CABYR and RIOK3 in LUSC patients, and of XAGE1B and TTF-1 in LUAD. Furthermore, exosomes present in blood samples of the advanced-stage cohort, allowed the identification of other biomarkers associated with clinically relevant characteristics of the patients. Moreover, exosomal cargo was also used to detect gene mutations related to the clinical management of NSCLC. In summary, the results obtained in this thesis highlight the potential of exosomes as a source of biomarkers for the study of the different stages of NSCLC development. These microvesicles offer a comprehensive and real-time view of the disease's molecular features and can be obtained repeatedly and in a minimally invasive way. / Duréndez Sáez, ME. (2024). Liquid Biopsy in non-small cell lung cancer: exosomes as a tool for the study of biomarkers [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/203438

Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer worldwide; it is responsible for nearly 10% of all newly diagnosed cancers and is the second most cause of cancer related death in Europe. Biomarkers for therapy guidance, targeted therapy and survival prognosis are still limited. As CRC is a heterogeneous disease, different parts of the tumor might have varying molecular characteristics which may change during therapy or disease progression. Through solid biopsies and screenings, these local or temporal differences are impossible to monitor. To facilitate detection of these possible temporal changes, a regularly and non-invasively accessible biomarker is required for disease monitoring. Circulating tumor cells (CTCs) might represent such a biomarker as they have been shown to be fluid surrogates of the solid tumor. EpCAM positive CTCs have shown to be prognostic in CRC for survival, but their full potential has not yet been evaluated further. By using the High Definition Single Cell Analysis (HD-SCA) workflow, we were able to analyze the entire spectrum of CTCs and categorize them as the regular CTCs (HD-CTC), CTCs with a smaller nuclear area (CTC-Small), CTCs with low expression of epithelial marker cytokeratin (CTC-LowCK) and CTCs undergoing apoptosis and therefore releasing cell free DNA...

Tesis por compendio / [ES] El cáncer constituye la segunda causa de muerte en España. El tromboembolismo venoso (TEV), una complicación del cáncer, conlleva gran gasto del presupuesto sanitario y representa la segunda causa de muerte en estos pacientes. Sin embargo, las herramientas actuales disponibles para la identificación de pacientes oncológicos con elevado riesgo trombótico son limitadas. Adicionalmente, no existen métodos simples, mínimamente invasivos y económicos de diagnóstico de cáncer vesical. Por este motivo, se utilizan técnicas dañinas como la tomografía computarizada la cual implica una elevada dosis de exposición a radiación y procedimientos invasivos como la cistoscopia. Además, un estado hipercoagulable parece tener una relación directa con una mayor carga tumoral y un peor pronóstico. El objetivo principal de la presente Tesis Doctoral es explorar la utilidad clínica de nuevos métodos diagnósticos y pronósticos para el cáncer y sus complicaciones trombóticas. En la primera parte de la Tesis, nos hemos centrado en el papel de miRNAs en orina como biomarcadores de cáncer vesical. Hemos identificado al miR-29c-3p como el miRNA más estable por lo que fue utilizado como normalizador. Hemos ajustado un modelo de regresión logística ordinal para el diagnóstico y estratificación de cáncer vesical utilizando la expresión de miRNAs en orina de pacientes y controles. Este modelo incluyó la expresión de 7 miRNAs: miR-221-3p, miR-93-5p, miR-362-3p, miR-191-5p, miR-200c-3p, miR-192-5p y miR-21-5p. En la segunda parte de la Tesis, nos centramos en el estudio de nuevos biomarcadores para la trombosis asociada a cáncer. Analizamos el potencial predictivo de los miRNAs y de marcadores de activación de neutrófilos en pacientes con cáncer pancreático y pacientes con glioma y meningioma. En cáncer pancreático, obtuvimos un perfil de 7 miRNAs (miR-486-5p, miR-106b-5p, let-7i-5p, let-7g-5p, miR-144-3p, miR-19a-3p y miR-103a-3p) capaz de estimar el riesgo de TEV al diagnóstico con dianas incluidas en las rutas pancreatic cancer y complement and coagulation cascades. En el estudio de los marcadores de activación de neutrófilos, obtuvimos un nuevo modelo predictivo de TEV con la calprotectina como variable predictora. Respecto al estudio de trombosis asociada a cáncer en tumores intracraneales, en pacientes con glioma, ajustamos y validamos un modelo predictivo de embolismo pulmonar (EP) postquirúrgico con 6 miRNAs: miR-363-3p, miR-93-3p, miR-22-5p, miR-451a, miR-222-3p y miR-140-3p y otro con cfDNA y mieloperoxidasa como predictores. Además, hemos combinado los dos tipos de marcadores y hemos obtenido un modelo con mayor capacidad predictiva que incluye a miR-140-3p y a la mieloperoxidasa como predictores. En pacientes con meningioma, ajustamos y validamos un modelo predictivo de EP postquirúrgico con 6 miRNAs: miR-29a-3p, miR-660-5p, miR-331-3p, miR-126-5p, miR-23a-3p y miR-23b-3p. En conclusión, proponemos diferentes perfiles de biomarcadores para el diagnóstico de cáncer de vejiga y para la identificación de pacientes oncológicos con elevado riesgo de trombosis. / [CA] El càncer constitueix la segona causa de mort a Espanya. El tromboembolisme venós (TEV), una complicació del càncer, representa la segona causa de mort en aquests pacients i comporta una gran despesa sanitària. No obstant això, les eines disponibles actualment per a la identificació de pacients oncològics amb elevat risc trombòtic són limitades. Actualment, no existeixen mètodes diagnòstics per al càncer de bufeta senzills, mínimament invasius i econòmics. Per aquest motiu, s'utilitzen tècniques nocives com la tomografia computada la qual implica una elevada dosi d'exposició a radiació i procediments invasius com la cistoscòpia. A més, un estat hipercoagulable sembla tindre una relació directa amb una major càrrega tumoral i un pitjor pronòstic. L'objectiu principal de la present Tesi Doctoral fou explorar la utilitat clínica de nous mètodes diagnòstics i pronòstics per al càncer i les seues complicacions trombòtiques. En la primera part de la Tesi, ens hem centrat en el paper dels microRNAs (miRNAs) en orina com biomarcadors de càncer de bufeta. Hem identificat al miR-29c-3p com el miRNA més estable per la qual cosa va ser utilitzat com a normalitzador. Hem ajustat un model de regressió logística ordinal per al diagnòstic i estratificació de càncer de bufeta utilitzant l'expressió de miRNAs en orina de pacients i controls. Aquest model va incloure l'expressió de 7 miRNAs: miR-221-3p, miR-93-5p, miR-362-3p, miR-191-5p, miR-200c-3p, miR-192-5p i miR-21-5p. En la segona part de la Tesi, ens centràrem en l'estudi de nous biomarcadors per a la trombosi associada a càncer. Analitzàrem el potencial predictiu dels miRNAs i de marcadors d'activació de neutròfils en pacients amb càncer pancreàtic i pacients amb glioma i meningioma. En càncer pancreàtic, vàrem obtindre un perfil de 7 miRNAs (miR-486-5p, miR-106b-5p, let-7i-5p, let-7g-5p, miR-144-3p, miR-19a-3p i miR-103a-3p) capaç d'estimar el risc de TEV al diagnostic dels pacients els quals tenen dianes incloses en les rutes biològiques pancreatic cancer y complement and coagulation cascades. En el estudi dels marcadors d¿activació de neutròfils, vàrem obtenir un altre model predictiu de TEV amb la calprotectina com a variable predictora. Respecte a l'estudi de trombosi associada a càncer en tumors intracranials, en pacients amb glioma, ajustàrem i validàrem un model predictiu d'embolisme pulmonar (EP) incidental postquirúrgic amb 6 miRNAs (miR-363-3p, miR-93-3p, miR-22-5p, miR-451a, miR-222-3p i miR-140-3p) i un altre amb cfDNA i mieloperoxidasa com a predictors. A més, vàrem combinar els dos tipus de marcadors i vàrem obtenir un model amb major capacitat predictiva que inclou al miR-140-3p i la mieloperoxidasa com a predictors. En pacients amb meningioma, ajustàrem i validàrem un model predictiu d¿EP incidental postquirúrgic amb 6 miRNAs: miR-29a-3p, miR-660-5p, miR-331-3p, miR-126-5p, miR-23a-3p i miR-23b-3p. En conclusió, proposem diferents perfils de biomarcadors per al diagnòstic de càncer de bufeta i per a la identificació de pacients oncològics amb elevat risc de trombosi. / [EN] Cancer is the second leading cause of death in Spain. Collaterally, venous thromboembolism (VTE), as a complication of cancer, consumes a great part of its healthcare budget and, more importantly, it is the second cause of death in these patients. However, limited tools are available to identify high risk patients. Additionally, a simple, minimally invasive and economical diagnostic methods for bladder cancer are also lacking. For that aim, harmful techniques are used like CT scan with high radiation exposure and invasive procedures like cystoscopy. Moreover, a hypercoagulable state seems directly related to a large tumor burden and poor prognosis. The overall aim of this Doctoral Thesis is to explore the clinical utility of novel diagnostic and prognostic methods for cancer and its thrombotic complications. In the first part of this Doctoral Thesis, we focused on the role of urine miRNAs as bladder cancer biomarkers. We identified miR-29c-3p as the most stable miRNA and was therefore used as normalizer. We adjusted an ordinal logistic regression model for the diagnosis and stratification of BC using the urine miRNA expression levels of patients and controls. This model included 7 miRNAs: miR-221-3p, miR-93-5p, miR-362-3p, miR-191-5p, miR-200c-3p, miR-192-5p and miR-21-5p. In the second part of this Doctoral Thesis, we focused on the study of novel biomarkers for cancer-associated thrombosis. We analyzed the predictive potential of miRNAs and neutrophil activation markers of thrombotic events in patients with pancreatic cancer and patients with glioma and meningioma. In pancreatic cancer, we obtained a profile of 7 miRNAs (miR-486-5p, miR-106b-5p, let-7i-5p, let-7g-5p, miR-144-3p, miR-19a-3p and miR-103a-3p) able to estimate the risk of potential VTE at diagnosis with targets involved in the pancreatic cancer and complement and coagulation cascades pathways. In the study of the neutrophil activation makers, we obtained a new predictive model of VTE with calprotectin as predictor. Regarding the study of cancer-associated thrombosis in intracranial tumors, in glioma patients, we adjusted and validated a predictive model for post-surgical pulmonary embolism (PE) with 6 miRNAs: miR-363-3p, miR-93-3p, miR-22-5p, miR-451a, miR-222-3p and miR-140-3p, and another with cfDNA and myeloperoxidase as predictors. Furthermore, we combined both types of biomarkers and obtained an improved model using myeloperoxidase and miR-140-3p as predictors. In meningioma patients we fitted and validated a predictive model with 6 miRNAs: miR-29a-3p, miR-660-5p, miR-331-3p, miR-126-5p, miR-23a-3p and miR-23b-3p. In conclusion, we propose several profiles of biomarkers for the diagnosis of bladder cancer and for the identification of oncologic patients at high risk of suffering a thrombotic event. / Oto Martínez, AJ. (2022). Novel Diagnostic and Prognostic Methods for Cancer and Cancer Associated Thrombosis [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/181510 / Compendio

Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer worldwide; it is responsible for nearly 10% of all newly diagnosed cancers and is the second most cause of cancer related death in Europe. Biomarkers for therapy guidance, targeted therapy and survival prognosis are still limited. As CRC is a heterogeneous disease, different parts of the tumor might have varying molecular characteristics which may change during therapy or disease progression. Through solid biopsies and screenings, these local or temporal differences are impossible to monitor. To facilitate detection of these possible temporal changes, a regularly and non-invasively accessible biomarker is required for disease monitoring. Circulating tumor cells (CTCs) might represent such a biomarker as they have been shown to be fluid surrogates of the solid tumor. EpCAM positive CTCs have shown to be prognostic in CRC for survival, but their full potential has not yet been evaluated further. By using the High Definition Single Cell Analysis (HD-SCA) workflow, we were able to analyze the entire spectrum of CTCs and categorize them as the regular CTCs (HD-CTC), CTCs with a smaller nuclear area (CTC-Small), CTCs with low expression of epithelial marker cytokeratin (CTC-LowCK) and CTCs undergoing apoptosis and therefore releasing cell free DNA...

The detection of plasma cell–free tumor DNA (ctDNA) is prognostic in colorectal cancer (CRC) and has potential for early prediction of disease recurrence. In clinical routine, ctDNA-based diagnostics are limited by the low concentration of ctDNA and error rates of standard next-generation sequencing (NGS) approaches. We evaluated the potential to increase the stability and yield of plasma cell–free DNA (cfDNA) for routine diagnostic purposes using different blood collection tubes and various manual or automated cfDNA extraction protocols. Sensitivity for low-level ctDNA was measured in KRAS-mutant cfDNA using an error-reduced NGS procedure. To test the applicability of rapid evaluation of ctDNA persistence in clinical routine, we prospectively analyzed postoperative samples of 67 CRC (stage II) patients. ctDNA detection was linear between 0.0045 and 45%, with high sensitivity (94%) and specificity (100%) for mutations at 0.1% VAF. The stability and yield of cfDNA were superior when using Streck BCT tubes and a protocol by Zymo Research. Sensitivity for ctDNA increased 1.5-fold by the integration of variant reads from triplicate PCRs and with PCR template concentration. In clinical samples, ctDNA persistence was found in ∼9% of samples, drawn 2 weeks after surgery. Moreover, in a retrospective analysis of 14 CRC patients with relapse during adjuvant therapy, we successfully detected ctDNA (median 0.38% VAF; range 0.18–5.04% VAF) in 92.85% of patients significantly prior (median 112 days) to imaging-based surveillance. Using optimized pre-analytical conditions, the detection of postoperative ctDNA is feasible with excellent sensitivity and allows the prediction of CRC recurrence in routine oncology testing.