CAR (Constitutive Androstane Receptor, NR1I3) et PXR (Pregnane X Receptor, NR1I2) sont deux récepteurs nucléaires dédiés à la reconna issance et à l'élimination de molécules lipophiles potentiellement toxiques pour l'organisme. Ces facteurs de transcription peuvent être activés par des ligands d'origines et de structures diverses (médicaments, polluants environnementaux, produits de l'alimentation et de phytothérapies). L'activation de ces récepteurs entraîne l'expression des gènes majeurs de la fonction de détoxication entéro-hépatique (CYP450, transférases, transporteurs) permettant l'élimination de ces toxiques. Dans ce travail, nous avons dans un premier temps 1) montré que CAR contrôle l'expression de Spot14, une protéine pro-lipogénique, et 2) nous avons identifié une nouvelle isoforme de PXR (PXR-small) codant uniquement pour le domaine de liaison des ligands de PXR. Nous avons pu déterminer les origines de transcription par 5'-RACE PCR et montrer que PXR-small représente environ 10% de l'ensemble des transcrits de PXR dans le tissu hépatique sain par une approche de PCR qua ntitative. Nous avons pu détecter sa présence par western-blot sur des extraits de protéines nucléaires issus de tissus hépatiques et de lignées cellulaires hépatiques. Par des expériences de gel retard, nous avons observé que cette nouvelle isoforme tronquée, qui ne code que pour le LBD de PXR, ne peut pas se lier à l'ADN. Des expériences de gènes rapporteurs suggèrent que cette isoforme se comporte comme un dominant négatif de PXR. Enfin, la présence d'un ilot CpG situé juste en amont de PXR-small suggère que cette nouvelle isoforme pourrait être régulée épigénétiquement par méthylation, notamment dans les cellules tumorales. / CAR (Constitutive Androstane Receptor, NR1I3) and PXR (Pregnane X Receptor, NR1I2) are two nuclear receptors devoted to the recognition and elimination of lipohilic molecules potentially toxic to the body.These transcription factors can be activated by ligands of different origins and structures (drugs, environmental pollutants, food products and herbal medicine...). The activation of these receptors leads to the expression of major genes of the detoxification process (CYP450, transferases, transporters) leading to the elimination of these toxics. In this work, we 1) showed that Spot14, a pro-lipogenic protein, is a target gene of CAR, then 2) we identified a novel isoform of PXR (PXR-small), coding only the ligand binding domain of PXR. By using 5'-RACE PXR, we established the origins of transcription of PXR-small and by quantitative PCR we observed that PXR-small represents about 10% of all PXR transcripts in human liver. By using western blo t, we detect its presence on nuclear protein extracts from liver tissues and hepatic cell lines. In Electromobility shift essays experiments, we observed that PXR-small cannot bind to DNA, while reporter essay experiments suggest that this isoform acts as a dominant negative of PXR. Finally, the presence of a CpG island just upstream of PXR-small suggests that this novel isoform might be regulated epigenetically by methylation, more particularly in tumor cells.

De nombreuses études indiquent que la prématurité, qui représente 8 % des naissances, estassociée à des indices précoces de dysfonction vasculaire, d’élévation de la pression sanguineet de survenue de diabète de type 2. Les enfants nés prématurément sont plus sujets auxblessures oxydatives de par l’immaturité de leurs défenses antioxydantes et de leur expositionà des situations pro-oxydantes (exposition à l’air ambiant, à un supplément d’oxygène, ou àune exposition aux infections). Cependant, les conséquences à long terme des blessuresoxydatives induites par une exposition à l’oxygène en période périnatale restent méconnues.Le but de ce doctorat a été de mettre en évidence certains mécanismes pouvant relier lesdommages de la prématurité induits par l’oxygène, et le risque à long terme de développer desmaladies cardiovasculaires et métaboliques dans le concept global d’une programmationdéveloppementale de l’hypertension et des pathologies reliées au syndrome métabolique. Des ratons Sprague-Dawley (SD) ont été exposés à 80 % O2 (O2) vs air ambiant (AA) du 3èmeau 10ème jour de vie. Concernant les paramètres cardiovasculaires, nous avons mesuré aucours de la croissance, la pression sanguine à la queue (de la 4ème semaine à la 15ème semaine)et à l’âge adulte : la réactivité vasculaire à l’angiotensine II (AngII) et au carbachol (ex vivo,carotides) avec ou sans le tempol; la production d’oxyde nitrique (NO) en présence ou non Larginineet de L-sépiaptérine (aorte, immunohistochimie) ainsi que l’expression de la nitricoxyde synthase endothéliale (eNOS) (aorte, immunohistochimie et western blot); le stressoxydant vasculaire (aorte, chemiluminescence) par la mesure de la production d’anionssuperoxide en présence ou non des inhibiteurs de la nicotinamide-adenine-dinucleotide-phosphate (NADPH oxydase) et de la nitric oxyde synthase endotheliale (eNOS), l’apocynine,et N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) respectivement, ainsi que le stress oxydantcirculant par la mesure des niveaux plasmatiques de malondialdéhyde (MDA, HPLC); ladensité microvasculaire a été évaluée au niveau du muscle tibial antérieur,immunohistochimie); la vitesse d’onde pulsée (VOP) (entre la valve aortique et juste avant labifurcation ilio-fémorale) a été mesurée par ultrason; le nombre de néphrons a été compté pardigestion acide. L’ontogenèse de la plupart de ces mécanismes a été regardée à l’âge de 4semaines.Concernant les paramètres métaboliques, le poids a été mesuré au cours de la croissance. Àl’âge adulte, la composition corporelle et la tolérance au glucose ont été évaluées. À l’âge de 4 semaines, aucune différence n’a été observée dans la pression sanguine, laréactivité vasculaire et le stress oxydant, mais chez les rats O2 vs AA, la densitémicrovasculaire est moindre, et des changements histologiques suggèrent la présence d’unerigidité artérielle augmentée.À l’âge adulte chez les rats O2 vs AA (n = 6-8 /groupe) : i) les pressions sanguines systoliqueset diastoliques sont augmentées; ii) la réactivité vasculaire à l’AngII est augmentée et celle aucarbachol est diminuée, le tempol prévient ces dysfonctions; iii) la production de NO est plusfaible au niveau basal et après stimulation par le carbachol, mais est restaurée après la préincubationavec L-arginine et L-sépiaptérine; iv) l’expression d’eNOS est diminuée parimmunohistochimie et augmentée par western blot; v) les niveaux d’anions superoxide, auniveau basal et en réponse à l’AngII, sont augmentés et sont induits par la NADPH oxydase etle non-couplage d’eNOS; vi) les niveaux plasmatiques de MDA sont augmentés; vii) Ladensité microvasculaire est moindre; viii) la VOP est augmentée; ix) le nombre de néphrons par rein est réduit; x) le poids est plus faible au cours de la croissance et un catch up estobservé à l’âge adulte; la composition corporelle n’est pas différente entre les groupes; xi) latolérance au glucose est diminuée. Ces résultats supportent l’hypothèse d’une programmation développementale des maladiescardiovasculaires et métaboliques à l’âge adulte à la suite d’un stress hyperoxique néonatal. / Many studies showed that prematurity, which represents 8 % of birth, is associated with earlyindices of vascular dysfunction, increased blood pressure and Type 2 diabetes. Prematuritybabies are more susceptible to oxidative injury, consequence of the immaturity of theirantioxidant defences, and exposure to pro-oxidant situations (oxygen supplementation,infection). However, the long-term consequences of oxidative injury induced by oxygenexposure in the neonatal period are unknown.The aim of these PhD studies was to unravel some mechanisms that might underlie thedamage induced by oxygen and the long-term risk of developing vascular and metabolicdiseases in the overall concept of developmental programming of hypertension and metabolicsyndrome-related diseases. Sprague-Dawley pups were kept with their mother in 80 % O2 (O2) or room air (RA) from day3 to 10 of life. Cardiovascular parameters, tail blood pressure was measured between 4 and15 weeks of life. In adulthood : vascular reactivity (ex vivo carotid rings) to angiotensine II(AngII) and carbachol with and without tempol was studied; studies of nitric oxide (NO)production with and without L-arginine and L-sépiaptérine (aorta, immunohistochemistry)and endothelial nitric oxide synthase expression (eNOS; aorta, immunohistochemistry,western blot) were performed; vascular oxidative stress (aorta, using chemiluminescence) bymeasuring superoxide anion production with and without inhibitors of nicotinamide-adeninedinucleotide-phosphate (NADPH oxydase) and nitric oxyde synthase endotheliale (eNOS),apocynin and N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) respectively, and circulating oxidative stress by measuring the plasma levels of malondialdéhyde (MDA, HPLC) wereevaluated; microvascular density was assessed on tibialis anterior muscle sections; pulse wavevelocity (PWV) was measured by ultrasound, between aortic valve and ilio-femoralbifurcation; nephrons were counted after hydrochloric acid digestion. The main observationswere also evaluated at 4 weeks of age. Metabolic parameters: body weight has beenmeasured during the growth. In adulthood, body composition, glucose tolerance wereevaluated. A 4 weeks of age, no difference was observed regarding blood pressure, vascular reactivity,and oxidative stress indices, but in rats O2 vs. RA (n = 6-8 /group), microvascular rarefactionand histological changes suggesting enhanced vascular stiffness were present.To adulthood, rats O2 vs. RA (n = 6-8/group) : i) systolic and diastolic blood pressures areincreased; ii) vascular reactivity to Ang II is increased and to carbachol is decreased, thesedysfunction were totally abolished by co-incubation of the vessel rings with tempol; iii) NOproductionis decreased in basal condition and after carbachol stimulation, but is restored afterpre-incubation of aorta sections with L- arginine and L-sépiaptérine; iv) eNOS expression isdecreased by immunohistochemistry but increased by western blot; v) vascular superoxideanion levels are increased in basal condition, after AngII stimulation and this is mediated byNADPH oxydase and eNOS uncoupling; vi) the plasma levels of MDA are increased; vii)microvascular density is decreased; viii) PWV is increased; ix) nephron count per kidney isdecreased; x) body weight is less during growth, but a catch up is observed in adulthood,body composition is similar; xi) the glucose tolerance is decreased in adults. These results support the hypothesis of developmental programming of vascular andmetabolic diseases in adulthood, after exposure to hyperoxic stress in the neonatal period.

La maladie de Wilson est une maladie héréditaire due à un déficit du transporteur du cuivre, l’ATP7B. Cette maladie se présente sous forme d’insuffisance hépatique aiguë ou chronique, pour lesquels le traitement médical actuel consiste en l’administration d’agents chélateurs, ce qui ne résulte cependant pas en une guérison complète de la maladie. La transplantation orthotopique du foie est le seul traitement définitif actuellement, avec tous les désavantages qu’elle comporte. Un traitement alternatif à cette option est donc souhaitable. Cette étude porte sur la faisabilité de la transplantation d’hépatocytes chez le modèle animal de la maladie de Wilson, le rat Long Evans Cinnamon (LEC), avec pour buts d’en déterminer la sécurité et l’efficacité tant sur le plan clinique (amélioration de la survie, prévention de l’hépatite) que pathologique. Douze rats LEC ont reçu une injection intrasplénique de 2,6 x 105 – 3,6 x 107 hépatocytes prélevés chez des rats donneurs de souche LE. Ils ont été suivis durant 6 mois puis sacrifiés. Ils ont ensuite été comparés à un groupe contrôle de douze autres rats LEC. Aucune différence significative n’a été notée au niveau du poids, du bilan hépatique et des concentrations de cuivre biliaire et hépatique. Cependant, une amélioration de l’activité oxydase de la céruloplasmine post-transplantation a été démontrée chez le groupe de rats transplantés (49,6 ± 31,5 versus 8,9 ± 11,7). Les rats transplantés ont aussi eu une amélioration sur tous les critères histologiques étudiés. Enfin, l’ARNm de l’atp7b a été retrouvé chez 58% des rats transplantés avec un taux d’expression de 11,9% ± 13,6 par rapport à un rat LE normal. L’immunohistochimie a quant à elle démontré la présence de l’atp7b chez tous les rats transplantés. Les résultats obtenus sont considérés favorables à ce traitement alternatif, et indiquent que la transplantation d’hépatocytes est une technique sécuritaire qui peut contribuer à renverser le processus pathologique en cours dans la maladie de Wilson. / Wilson’s disease (WD) is a hereditary metabolic disease caused by a deficiency of copper-transporting ATP7B, resulting in copper accumulating to toxic levels in the liver. Its manifestations range from acute or chronic hepatic insufficiency to fulminant liver failure. The mainstay of therapy is the use of chelating agents. However selected patients may also require orthotopic liver transplantation (OTL), an invasive and complex procedure with life-long implications. Hepatocyte transplantation is an appealing alternative to OLT. Its safety and efficacy were evaluated in the animal model of WD, the Long Evans Cinnamon (LEC) rat. Twelve LEC rats received an intrasplenic injection of 2,6 x 105 – 3,6 x 107 hepatocytes obtained from LE donor rats. They were followed for 6 months before sacrifice. They were then compared to a control group of twelve rats. No difference was found when comparing their weights, biochemical parameters such as liver function tests and bilirubin, as well as their biliary and hepatic copper concentrations. However, the ceruloplasmin oxydase activity was improved in the transplanted rats (49,6 ± 31,5 versus 8,9 ± 11,7). After sacrifice, histologic evaluation and demonstration of atp7b mRNA in the recipient liver were performed. There was evidence of histological improvement and atp7b mRNA was found in 58% of transplanted rats with an expression of 11,9% ± 13,6 when compared to a normal LE rat. Evidence of successful engraftment of the transplanted cells was found in every transplanted rat using the technique of immunohistochemistry. These encouraging results are in accordance with previous studies on hepatocyte transplantation in the LEC rat. Its application to the human clinical setting is the next step, as it has already been tried in other metabolic liver diseases.

Le récepteur X des farnésoïdes (FXR) fait partie de la superfamille des récepteurs nucléaires et agit comme un facteur de transcription suite à la liaison d’un ligand spécifique. Le récepteur FXR, activé par les acides biliaires, joue un rôle essentiel dans le métabolisme des lipides et du glucose en plus de réguler l’homéostasie des acides biliaires. Notre laboratoire a récemment mis en évidence une nouvelle voie de régulation du récepteur PPARγ en réponse au récepteur de la ghréline. En effet, la ghréline induit l’activation transcriptionnelle de PPARγ via une cascade de signalisation impliquant les kinases Erk1/2 et Akt, supportant un rôle périphérique de la ghréline dans les pathologies associées au syndrome métabolique. Il est de plus en plus reconnu que la cascade métabolique impliquant PPARγ fait également intervenir un autre récepteur nucléaire, FXR. Dans ce travail, nous montrons que la ghréline induit l’activation transcriptionnelle de FXR de manière dose-dépendante et induit également la phosphorylation du récepteur sur ses résidus sérine. En utilisant des constructions tronquées ABC et CDEF de FXR, nous avons démontré que la ghréline régule l’activité de FXR via les domaines d’activation AF-1 et AF-2. L’effet de la ghréline et du ligand sélectif GW4064 sur l’induction de FXR est additif. De plus, nous avons démontré que FXR est la cible d’une autre modification post-traductionnelle, soit la sumoylation. En effet, FXR est un substrat cellulaire des protéines SUMO-1 et SUMO-3 et la sumoylation du récepteur est ligand-indépendante. SUMO-1 et SUMO-3 induisent l’activation transcriptionnelle de FXR de façon dose-dépendante. Nos résultats indiquent que la lysine 122 est le site prédominant de sumoylation par SUMO-1, quoiqu’un mécanisme de coopération semble exister entre les différents sites de sumoylation de FXR. Avec son rôle émergeant dans plusieurs voies du métabolisme lipidique, l’identification de modulateurs de FXR s’avère être une approche fort prometteuse pour faire face à plusieurs pathologies associées au syndrome métabolique et au diabète de type 2. / The farnesoid X receptor (FXR) is a ligand-activated transcription factor within the nuclear receptor superfamily. FXR is activated by bile acids and plays a crucial role in the regulation of glucose and lipid metabolism and in bile acid homeostasis. Our group has recently identified the contribution of the ghrelin receptor in the regulation of the nuclear receptor PPARγ. Indeed, ghrelin triggers transcriptional activation of PPARγ through a concerted signaling cascade involving Erk1/2 and Akt kinases. These results support the peripheral actions of ghrelin in diseases associated with the metabolic syndrome. It is recognized that there is interplay between PPARγ metabolic cascade and FXR. Here, we demonstrate that ghrelin promotes FXR transcriptional activity in a dose-dependent manner and also promotes its phosphorylation on serine residues. By using truncated ABC and CDEF constructs of FXR, we found that ghrelin induces FXR activity through the AF-1 and AF-2 activation domains. The ghrelin-induced FXR activity is additive to the induction by the selective agonist GW4064. Also, we demonstrate that FXR is the target of sumoylation, another post-translational modification. In particular, FXR is modified by SUMO-1 and SUMO-3 in a ligand-independent manner. SUMO-1 and SUMO-3 promote dose-dependent transcriptional activity of FXR. Our results show that lysine 122 is the prevalent site of sumoylation by SUMO-1, though a compensation mechanism seems to exist between the various sumoylation sites of FXR. With its emerging role in several metabolic cascades, identification of FXR modulators represents a promising approach for the treatment of the metabolic syndrome and type 2 diabetes.

Résumé Objectifs : Le syndrome métabolique (MetS) est un ensemble de composantes (obésité, résistance à l'insuline, intolérance au glucose, dyslipidémie, hypertension) qui sont associées à une augmentation du risque de diabète de type 2 et de maladies cardiovasculaires. Aux États-Unis, la fréquence du MetS atteint des proportions épidémiques avec une prévalence de 25% de la population. Les études nutritionnelles traditionnelles se sont concentrées sur l’effet d’un nutriment alors que les études plus récentes ont déterminé l’effet global de la qualité alimentaire sur les facteurs de risque. Cependant, peu d'études ont examiné la relation entre la qualité alimentaire et le MetS. Objectif: Déterminer l'association entre la qualité alimentaire et le MetS et ses composantes. Méthodes: La présence du MetS a été déterminée chez 88 femmes post-ménopausées en surpoids ou obèses, selon la définition du National Cholesterol Education Program Adult treatment Panel III alors que la qualité alimentaire a été évaluée selon le Healthy Eating Index (HEI). La sensibilité à l’insuline, la composition corporelle et le métabolisme énergétique ont été mesurés. Résultats: Le HEI corrélait négativement avec la plupart des mesures de masse grasse et du poids mais pas avec la sensibilité à l'insuline, l’hypertension et la plupart des marqueurs lipidiques. Cependant, l’HEI corrélait positivement avec LDL-C/ApoB et négativement avec le métabolisme énergétique. Conclusion: Les résultats démontrent que l’HEI est associé avec les mesures de gras corporel et la grosseur des LDL. Mots clés: Obésité, qualité alimentaire, métabolisme lipidique, syndrome métabolique. / Abstract Background: The metabolic syndrome (MetS) is a constellation of different metabolic components including central obesity, insulin resistance, abnormal glucose homeostasis, dyslipidemia and high blood pressure which identify individuals at high risk of type 2 diabetes and cardiovascular events. In the US, the prevalence of MetS has reached epidemic proportion and up to 25% of the population is affected. Traditional nutritional studies have focused on a single nutrient. Recently, measures of overall diet quality have been proposed as an alternative to assess diet-related diseases. However, few studies have addressed the relationship between diet quality and the MetS. Objective: To investigate the association of diet quality with the MetS and its components. Methods: The presence of the MetS was determined in 88 postmenopausal overweight or obese women using the National Cholesterol Education Program Adult treatment Panel III definition while diet quality was assessed with the Healthy Eating Index (HEI). We also measured insulin sensitivity, body composition and energy metabolism. Results: The HEI correlated negatively with most measures of body fat and body weight but not with insulin sensitivity, blood pressure and most markers of lipid metabolism. However, HEI correlated positively with LDL-C/ApoB and negatively with energy metabolism. Conclusion: Our results demonstrated that HEI is associated with fat distribution and LDL size. Key words: Obesity, diet quality, lipid metabolism, metabolic syndrome.

L’obésité est définie comme un surplus de masse adipeuse. Cette condition représente un problème de santé publique devenu pandémique dans les pays industrialisés. Elle prédispose à des maladies potentiellement mortelles comme le diabète de type 2, les maladies cardiovasculaires et la stéatose hépatique non-alcoolique. L’accumulation du tissu adipeux intra-abdominal, formé d’adipocytes, est corrélée avec la résistance à l’insuline. L’augmentation de la masse adipeuse se fait par l’hyperplasie des préadipocytes, la différenciation des préadipocytes en adipocytes et l’hypertrophie des adipocytes. La différenciation des préadipocytes se fait selon l’adipogenèse qui est régulée par une multitude de facteurs, mais qui est inhibée pas les stimuli inflammatoires qui sont aussi responsables de la résistance à l’insuline et de l’apparition des problèmes de santé liés à l’obésité. Nous avons identifié un nouveau système de régulation autocrine/paracrine de l’adipogenèse dans les cellules du tissu adipeux. Le pyroglutamylated RF-amide peptide (QRFP), qui était connu pour son rôle dans la régulation de l’appétit, est un activateur de l’adipogenèse par l’activation de son récepteur, le G protein-coupled receptor 103 (GPR103). Le QRFP est exprimé dans les macrophages et les adipocytes alors que le GPR103 de sous-type b est exprimé dans les adipocytes seulement. Un traitement des adipocytes avec le QRFP augmente le captage des acides gras, l’accumulation de lipides ainsi que l’expression et l’activité de l’enzyme LPL. Le QRFP augmente aussi l’expression des gènes des transporteurs d’acides gras CD36 et FATP1, de l’enzyme activatrice d’acides gras ACSL1 et des facteurs de transcription PPAR-γ et C/EBP-α, qui sont tous impliqués dans l’adipogenèse. En plus de ses effets sur l’adipogenèse, le QRFP possède aussi un effet inhibiteur sur l’activité lipolytique induite par les catécholamines. Nous avons montré que l’expression du QRFP est diminuée dans le tissu adipeux des souris obèses. Selon nos résultats, cette diminution pourrait être expliquée par une augmentation des endotoxines circulantes chez les obèses, appelée endotoxémie métabolique, qui agirait, entre autres, par l’induction des interférons dans les macrophages. Les voies de signalisation de ces effets ont aussi été identifiées. Nous avons montré un autre exemple de stimulus inflammatoire qui régule les signaux adipogènes à la baisse. / Obesity is defined as an excess of fat tissue mass. Obesity is a public health problem which became pandemic in developed countries. The condition of obesity predisposes to potentially fatal diseases like type 2 diabetes, cardiovascular diseases and non-alcoholic steatohepatitis. The increase in intra-abdominal adipose tissue mass is intimately associated with the development of insulin resistance. An increase in fat tissue mass occurs by preadipocytes hyperplasia, preadipocytes differentiation into adipocytes and adipocyte hypertrophy. The differentiation of preadipocytes occurs during adipogenesis and is regulated by multiple factors but inhibited by inflammatory stimuli that are responsible for insulin resistance and the emergence of obesity-related dysfunctions. We identified a new autocrine/paracrine system of regulation of adipogenesis in adipose tissue cells. The pyroglutamylated RF-amide peptide (QRFP), previously known for its role in the regulation of appetite, is an activator of adipogenesis by activating its receptor, G protein-coupled receptor 103 (GPR103). QRFP is expressed in adipocytes and macrophages whereas the GPR103 subtype b is expressed in adipocytes only. Treatment of adipocytes with QRFP increases fatty acids uptake, lipid accumulation, LPL enzyme expression and activity. QRFP upregulates gene expressions of fatty acids transporters CD36 and FATP1, of the fatty acid activating enzyme ACSL1 and of transcription factors PPAR-γ and C/EBP-α, which are all involved in adipogenesis. In addition to its effects on adipogenesis, QRFP shows an inhibitory effect on lipolytic activity induced by catecholamines. We have shown that QRFP expression is decreased in adipose tissues of obese mice. According to our results, this decrease could be explained by an increase of circulating endotoxins in obesity, called metabolic endotoxemia, which mediate its effect, in part, by the induction of interferons in macrophages. Signaling pathways of these effects have been identified. We demonstrated another example of inflammatory stimulus downregulating adipogenic signals.

Les défis conjoints du changement climatique d'origine anthropique et la diminution des réserves de combustibles fossiles sont le moteur de recherche intense pour des sources d'énergie alternatives. Une avenue attrayante est d'utiliser un processus biologique pour produire un biocarburant. Parmi les différentes options en matière de biocarburants, le bio-hydrogène gazeux est un futur vecteur énergétique attrayant en raison de son efficacité potentiellement plus élevé de conversion de puissance utilisable, il est faible en génération inexistante de polluants et de haute densité d'énergie. Cependant, les faibles rendements et taux de production ont été les principaux obstacles à l'application pratique des technologies de bio-hydrogène. Des recherches intensives sur bio-hydrogène sont en cours, et dans les dernières années, plusieurs nouvelles approches ont été proposées et étudiées pour dépasser ces inconvénients. À cette fin, l'objectif principal de cette thèse était d'améliorer le rendement en hydrogène moléculaire avec un accent particulier sur l'ingénierie métabolique et l’utilisation de bioprocédés à variables indépendantes. Une de nos hypothèses était que la production d’hydrogène pourrait être améliorée et rendue plus économiquement viable par ingénierie métabolique de souches d’Escherichia coli producteurs d’hydrogène en utilisant le glucose ainsi que diverses autres sources de carbone, y compris les pentoses. Les effets du pH, de la température et de sources de carbone ont été étudiés. La production maximale d'hydrogène a été obtenue à partir de glucose, à un pH initial de 6.5 et une température de 35°C. Les études de cinétiques de croissance ont montré que la μmax était 0.0495 h-1 avec un Ks de 0.0274 g L-1 lorsque le glucose est la seule source de carbone en milieu minimal M9. .Parmi les nombreux sucres et les dérivés de sucres testés, les rendements les plus élevés d'hydrogène sont avec du fructose, sorbitol et D-glucose; 1.27, 1.46 et 1.51 mol H2 mol-1 de substrat, respectivement. En outre, pour obtenir les interactions entre les variables importantes et pour atteindre une production maximale d'hydrogène, un design 3K factoriel complet Box-Behnken et la méthodologie de réponse de surface (RSM) ont été employées pour la conception expérimentale et l'analyse de la souche d'Escherichia coli DJT135. Le rendement en hydrogène molaire maximale de 1.69 mol H2 mol-1 de glucose a été obtenu dans les conditions optimales de 75 mM de glucose, à 35°C et un pH de 6.5. Ainsi, la RSM avec un design Box-Behken était un outil statistique utile pour atteindre des rendements plus élevés d'hydrogène molaires par des organismes modifiés génétiquement. Ensuite, l'expression hétérologue de l’hydrogénases soluble [Ni-Fe] de Ralstonia eutropha H16 (l'hydrogénase SH) a tenté de démontrer que la mise en place d'une voie capable de dériver l'hydrogène à partir de NADH pourrait surpasser le rendement stoechiométrique en hydrogène.. L’expression a été démontrée par des tests in vitro de l'activité enzymatique. Par ailleurs, l'expression de SH a restaurée la croissance en anaérobie de souches mutantes pour adhE, normalement inhibées en raison de l'incapacité de réoxyder le NADH. La mesure de la production d'hydrogène in vivo a montré que plusieurs souches modifiées métaboliquement sont capables d'utiliser l'hydrogénase SH pour dériver deux moles d’hydrogène par mole de glucose consommé, proche du maximum théorique. Une autre stratégie a montré que le glycérol brut pourrait être converti en hydrogène par photofermentation utilisant Rhodopseudomonas palustris par photofermentation. Les effets de la source d'azote et de différentes concentrations de glycérol brut sur ce processus ont été évalués. À 20 mM de glycérol, 4 mM glutamate, 6.1 mol hydrogène / mole de glycérol brut ont été obtenus dans des conditions optimales, un rendement de 87% de la théorie, et significativement plus élevés que ce qui a été réalisé auparavant. En prolongement de cette étude, l'optimisation des paramètres a également été utilisée. Dans des conditions optimales, une intensité lumineuse de 175 W/m2, 30 mM glycérol et 4.5 mM de glutamate, 6.69 mol hydrogène / mole de glycérol brut ont été obtenus, soit un rendement de 96% de la valeur théorique. La détermination de l'activité de la nitrogénase et ses niveaux d'expression ont montré qu'il y avait relativement peu de variation de la quantité de nitrogénase avec le changement des variables alors que l'activité de la nitrogénase variait considérablement, avec une activité maximale (228 nmol de C2H4/ml/min) au point central optimal. Dans la dernière section, la production d'hydrogène à partir du glucose via la photofermentation en une seule étape a été examinée avec la bactérie photosynthétique Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-). La méthodologie de surface de réponse avec Box-Behnken a été utilisée pour optimiser les variables expérimentales de façon indépendante, soit la concentration de glucose, la concentration du glutamate et l'intensité lumineuse, ainsi que d'examiner leurs effets interactifs pour la maximisation du rendement en hydrogène moléculaire. Dans des conditions optimales, avec une intensité lumineuse de 175 W/m2, 35 mM de glucose, et 4.5 mM de glutamate,, un rendement maximal d'hydrogène de 5.5 (± 0.15) mol hydrogène /mol glucose, et un maximum d'activité de la nitrogénase de 246 (± 3.5) nmol C2H4/ml/min ont été obtenus. L'analyse densitométrique de l'expression de la protéine-Fe nitrogenase dans les différentes conditions a montré une variation significative de l'expression protéique avec un maximum au point central optimisé. Même dans des conditions optimales pour la production d'hydrogène, une fraction significative de la protéine Fe a été trouvée dans l'état ADP-ribosylée, suggérant que d'autres améliorations des rendements pourraient être possibles. À cette fin, un mutant amtB dérivé de Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-) a été créé en utilisant le vecteur de suicide pSUP202. Les résultats expérimentaux préliminaires montrent que la souche nouvellement conçue métaboliquement, R. capsulatus DG9, produit 8.2 (± 0.06) mol hydrogène / mole de glucose dans des conditions optimales de cultures discontinues (intensité lumineuse, 175 W/m2, 35 mM de glucose et 4.5 mM glutamate). Le statut d'ADP-ribosylation de la nitrogénase-protéine Fe a été obtenu par Western Blot pour la souche R. capsulatus DG9. En bref, la production d'hydrogène est limitée par une barrière métabolique. La principale barrière métabolique est due au manque d'outils moléculaires possibles pour atteindre ou dépasser le rendement stochiométrique en bio-hydrogène depuis les dernières décennies en utilisant les microbes. À cette fin, une nouvelle approche d’ingénierie métabolique semble très prometteuse pour surmonter cette contrainte vers l'industrialisation et s'assurer de la faisabilité de la technologie de la production d'hydrogène. Dans la présente étude, il a été démontré que l’ingénierie métabolique de bactéries anaérobiques facultatives (Escherichia coli) et de bactéries anaérobiques photosynthétiques (Rhodobacter capsulatus et Rhodopseudomonas palustris) peuvent produire de l'hydrogène en tant que produit majeur à travers le mode de fermentation par redirection métabolique vers la production d'énergie potentielle. D'autre part, la méthodologie de surface de réponse utilisée dans cette étude représente un outil potentiel pour optimiser la production d'hydrogène en générant des informations appropriées concernant la corrélation entre les variables et des producteurs de bio-de hydrogène modifiés par ingénierie métabolique. Ainsi, un outil d'optimisation des paramètres représente une nouvelle avenue pour faire un pont entre le laboratoire et la production d'hydrogène à l'échelle industrielle en fournissant un modèle mathématique potentiel pour intensifier la production de bio-hydrogène. Par conséquent, il a été clairement mis en évidence dans ce projet que l'effort combiné de l'ingénierie métabolique et la méthodologie de surface de réponse peut rendre la technologie de production de bio-hydrogène potentiellement possible vers sa commercialisation dans un avenir rapproché. / The joint challenges of anthropogenic climate change and dwindling fossil fuel reserves are driving intense research into alternative energy sources. One attractive avenue is to use a biological process to produce a biofuel. Among the various biofuel options, biohydrogen gas is an attractive future energy carrier due to its potentially higher efficiency of conversion to usable power, low to non-existent generation of pollutants and high energy density. However, low yields and production rates have been major barriers to the practical application of biohydrogen technologies. Intensive research on biohydrogen is underway, and in the last few years several novel approaches have been proposed and studied to surpass these drawbacks. To this end the main aim of this thesis was to improve the molar hydrogen yield with special emphasis of metabolic engineering using the interactive effect with bioprocess independent variable. One investigated hypothesis was that H2 production could be improved and made more economically viable by metabolic engineering on the facultative hydrogen producer Escherichia coli from glucose as well as various other carbon sources, including pentoses. The effects of pH, temperature and carbon source were investigated in batch experiments. Maximal hydrogen production from glucose was obtained at an initial pH of 6.5 and temperature of 35°C. Kinetic growth studies showed that the μmax was 0.0495 h−1 with a Ks of 0.0274 g L−1 when glucose was the sole carbon source in M9 (1X) minimal medium. Among the many sugar and sugar derivatives tested, hydrogen yields were highest with fructose, sorbitol and d-glucose; 1.27, 1.46 and 1.51 mol H2 mol−1 substrate respectively. In addition, to obtain the interactions between the variables important for achieving maximum hydrogen production, a 3K full factorial Box–Behnken design and response surface methodology (RSM) were employed for experimental design and analysis on a metabolically engineered Escherichia coli strain, DJT135. A maximum molar hydrogen yield of 1.69 mol H2 mol−1 glucose was obtained under the optimal conditions of 75 mM glucose, 35°C and pH 6.5. Thus, RSM with Box–Behnken design was a useful statistical tool for achieving higher molar hydrogen yields by metabolically engineered organisms. Furthermore, the heterologous expression of the soluble [Ni-Fe] hydrogenase from Ralstonia eutropha H16 (the SH hydrogenase) was attempted to demonstrate the introduction of a pathway capable of deriving hydrogen from NADH to surpass the stoichiometric molar hydrogen yield. Successful expression was demonstrated by in vitro assay of enzyme activity. Moreover, expression of SH restored anaerobic growth on glucose to adhE strains, normally blocked for growth due to the inability to re-oxidize NADH. Measurement of in vivo hydrogen production showed that several metabolically engineered strains were capable of using the SH hydrogenase to derive 2 mol H2 per mol of glucose consumed, close to the theoretical maximum. Using another strategy, it was shown that crude glycerol could be converted to hydrogen, a possible future clean energy carrier, by photofermentation using Rhodopseudomonas palustris through photofermentation. Here, the effects of nitrogen source and different concentrations of crude glycerol on this process were assessed. At 20 mM glycerol, 4 mM glutamate, 6.1 mol hydrogen/mole of crude glycerol were obtained under optimal conditions, a yield of 87% of the theoretical, and significantly higher than what was achieved previously. As a continuation of this study, multiprocess parameter optimization was also involved. Under optimal conditions, a light intensity of 175 W/m2, 30 mM glycerol, and 4.5 mM glutamate, 6.69 mol hydrogen/mole of crude glycerol were obtained, a yield 96% of theoretical. Determination of nitrogenase activity and expression levels showed that there was relatively little variation in levels of nitrogenase protein with changes in process variables whereas nitrogenase activity varied considerably, with maximal nitrogenase activity (228 nmol of C2H4/ml/min) at the optimal central point. In the final section, hydrogen production from glucose via single-stage photofermentation was examined with the photosynthetic bacterium Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-). Response surface methodology with Box–Behnken design was used to optimize the independent experimental variables of glucose concentration, glutamate concentration and light intensity, as well as examining their interactive effects for maximization of molar hydrogen yield. Under optimal condition with a light intensity of 175 W/m2, 35 mM glucose, and 4.5 mM glutamate, a maximum hydrogen yield of 5.5 (±0.15) mol H2/mol glucose, and a maximum nitrogenase activity of 246 (±3.5) nmol C2H4/ml/min were obtained. Densitometric analysis of nitrogenase Fe-protein expression under different conditions showed significant variation in Fe-protein expression with a maximum at the optimized central point. Even under optimum conditions for hydrogen production, a significant fraction of the Fe-protein was found in the ADP-ribosylated state, suggesting that further improvement in yields might be possible. To this end an AmtB- derivative of Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-) was created by conjugating in amtB::Km using the suicide vector pSUP202. Preliminary experimental results showed that the newly metabolically engineered strain, R. capsulatus DG9, produced 8.2 (±0.06) mol hydrogen/mole of glucose under optimal conditions in batch cultures (light intensity, 175 W/m2; 35 mM glucose, and 4.5 mM glutamate). Western blot analyses of the ADP-ribosylation status of the nitrogenase Fe-protein were investigated on metabolically engineered strain R. capsulatus DG9. In brief, the progress on hydrogen production technology has been limited due to the metabolic barrier. The major metabolic barrier is due to lacking of potential consistent molecular tools to reach or surpass the stochiometric biohydrogen yield since last decades using microbes. To this end a novel approach “metabolic engineering” seems very promising to overcome this constraint towards industrialization to ensure the feasibility of hydrogen production technology. In this present study it has been shown that metabolically engineered facultative (Escherichia coli) anaerobe and photosynthetic bacteria (Rhodobacter capsulatus and Rhodopseudomonas palustris) can produce hydrogen as a major product through fermentative mode by metabolic redirection toward potential energy generation. On the other hand, response surface methodology has depicted in this study as another potential tool to statistically optimize the hydrogen production by generating suitable information concerning interactive correlation between process variables and metabolically engineered biohydrogen producers. Thus, multi process parameter optimization tool has been creating a novel avenue to make a crosslink between lab scale and pilot scale hydrogen production by providing potential mathematical model for scaling up biohydrogen production using metabolically engineered biohydrogen producers. Therefore, it has been clearly revealed in this project that combined effort of metabolic engineering and response surface methodology can make biohydrogen production technology potentially feasible towards its commercialization in near future.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'élucidation des propriétés du réseau métabolique est fondamentale pour la compréhension du fonctionnement cellulaire et pour l'élaboration de stratégies d'ingénierie métabolique. L'objectif de cette thèse était de mieux comprendre la régulation du métabolisme du NADPH, un métabolite "hub" qui joue un rôle central dans de nombreux processus cellulaires, chez Saccharomyces cerevisiae en fermentation. Nous avons utilisé une démarche systématique couplant modélisation et approches multi-“omics” pour étudier de façon quantitative la réponse à une perturbation de la demande en NADPH. Un système expérimental original, basé sur l'expression d'une butanediol déshydrogénase modifiée NADPH-dépendante a été utilisé pour augmenter de façon contrôlée la demande en NADPH. L'utilisation de ce dispositif, le développement et l'utilisation d'un modèle stœchiométrique de la levure dédié à la fermentation ont permis de prédire la répartition des flux pour différents niveaux de perturbation. Ces analyses ont montré, en premier lieu, la très grande capacité de la levure à faire face à des demandes très importantes de NADPH représentant jusqu'à 40 fois la demande anabolique. Pour des demandes modérées (allant jusqu'à 20 fois la demande anabolique), la perturbation est principalement compensée par une augmentation du flux à travers la voie des pentoses phosphate (VPP) et à moindre titre à travers la voie acétate (Ald6p). Pour une forte demande en NADPH, correspondant à 40 fois la demande anabolique, le modèle prédit la saturation de la VPP ainsi que la mise en place du cycle glycérol-DHA, qui permet l'échange du NADH en NADPH. Des analyses fluxomique (13C), métabolomique et transcriptomique, ont permis de valider ces hypothèses et de les compléter. Nous avons mis en évidence différents niveaux de régulation selon l'intensité de la perturbation : pour les demandes modérées, les flux sont réajustés par un contrôle au niveau enzymatique ; pour de fortes demandes, un contrôle transcriptionnel de plusieurs gènes de la VPP ainsi que de certains gènes des voies de biosynthèse des acides aminés est observé, cet effet résultant probablement de la moindre disponibilité en NADPH. Dans l'ensemble, ce travail a apporté un nouvel éclairage sur les mécanismes impliqués dans l'homéostasie du NADPH et plus généralement dans l'équilibre redox intracellulaire. / The elucidation of the properties of metabolic network is essential to increase our understanding of cellular function and to design metabolic engineering strategies. The objective of this thesis was to better understand the regulation of the metabolism of NADPH, a “hub” metabolite which plays a central role in many cellular processes in Saccharomyces cerevisiae during fermentation. We used a systematic approach combining modeling and multi-“omics” analyses to study quantitatively the response to a perturbation of the NADPH demand. An original experimental system, based on the expression of a modified NADPH-dependent butanediol dehydrogenase was used to increase the demand for NADPH in a controlled manner. Through the use of this device and the development and use of a stoichiometric model of yeast dedicated to the fermentation, we predicted the flux distribution for different levels of perturbation. These experiments showed, first, the overwhelming ability of yeast to cope with very high NADPH demand, up to 40 times the anabolic demand. For a moderate level (up to 20 times the anabolic demand), the perturbation is mainly compensated by increased flux through the pentose phosphate pathway (PPP) and to a lesser extent through the acetate pathway (Ald6p). For a high NADPH demand, corresponding to 40 times the anabolic demand, the model predicts the saturation of the PPP as well as the operation of the glycerol-DHA cycle, which allows the exchange of NADH to NADPH. Fluxomics (13C), metabolomics and transcriptomics data were used to validate and to complement these hypotheses. We showed different levels of control depending on the intensity of the perturbation: for moderate demands, flux remodeling is mainly achieved by enzymatic control; for a high demand, a transcriptional control is observed for several genes of the PPP as well as some genes of the amino acids biosynthetic pathways, this latter effect being likely due to the low NADPH availability. Overall, this work has shed new light on the mechanisms governing NADPH homeostasis and more generally the intracellular redox balance.