Maspina é uma proteína supressora de tumor e metástase e sua localização subcelular está relacionada ao prognóstico do câncer de mama. Nosso grupo mostrou em MCF-10A que quando fosforilada maspina se acumula no citoplasma. Porém, esta correlação ainda não foi relatada in vivo. Aqui investigamos a expressão, fosforilação e localização subcelular de maspina ao longo do desenvolvimento da glândula mamária murina. Maspina foi detectada no estágio mais tardio da gestação, na lactação e na involução. Os níveis de fosforilação de maspina são maiores no período de lactação do que na involução. Interessantemente, a porcentagem de células que apresenta maspina no núcleo é maior na fase de involução do que na fase de lactação Estes dados mostram que a correlação entre níveis de fosforilação de maspina e localização subcelular também é observada in vivo e que esses processos são reguladas ao longo do desenvolvimento na glândula mamária murina. / Maspin is a protein with tumor and metastasis suppressing activity and its subcellular localization is related to breast cancer prognosis. Using MCF-10A cells as a model system, our group demonstrated a correlation between maspin phosphorylation and cytoplasmic accumulation. Here we investigated maspin expression, phosphorylation levels and subcellular localization in vivo during the murine mammary gland development. Maspin was detected in late pregnancy, during lactation and involution. Maspin phosphorylation levels is higher during lactation than during involution. Interestingly, the percentage of cells which present nuclear maspin is higher in the involution than in lactation. These data show that the correlation between maspin phosphorylation and subcellular localization is also observed in vivo and these processes are regulated during murine mammary gland development.

Orientador: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Resumo: A glândula mamária é o segundo sítio mais comum de desenvolvimento tumoral em cadelas. Uma das formas de estadiamento destes tumores é avaliar a presença ou ausência de metástase à distância, inclusive na medula óssea. Este achado, na Medicina, associa-se a baixa sobrevida de mulheres com tumores mamários, porém na Medicina Veterinária esse estadiamento clínico é mais utilizado para pacientes com linfomas e mastocitomas. Estudos que utilizem a biópsia de medula óssea como método de pesquisa de estadiamento em tumores mamários são escassos. Desta forma o presente estudo teve como objetivo avaliar lesões mamárias e a medula óssea de 36 cadelas, buscando-se células tumorais disseminadas ou focos metastáticos. Para isso realizou-se a análise histopatológica dos tumores de mama, linfonodos e medula óssea dessas cadelas, corados com Hematoxilina e Eosina. Na medula óssea também foram utilizadas a coloração com Tricrômio de Masson, para avaliação de fibrose medular, e a imunohistoquímica, para a pesquisa de micrometástase. O carcinoma em tumor misto grau I fora o mais observado (18,08%), não havendo diferença estatística com relação ao tamanho tumoral e a presença de metástase em linfonodos. Na medula óssea de uma cadela com carcinossarcoma (4,35%) houve marcação citoplasmática de uma provável célula tumoral disseminada, de origem epitelial, com o anticorpo citoqueratina-19 pela imunohistoquímica. Nenhuma das cadelas que apresentou diminuição da celularidade ou fibrose medular (Tric... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Orientador: Humberto Tonhati / Resumo: A mastite é a enfermidade que mais causa prejuízos de ordem quantitativa e qualitativa nos sistemas de produção de leite no mundo. A prevenção e controle da doença precisam envolver atividades práticas e eficientes que auxiliem a tomada de decisões rápidas na fazenda. Os métodos de triagem para o diagnóstico da mastite aplicados às búfalas leiteiras são aqueles desenvolvidos especificamente para as vacas. Assim, o objetivo geral da tese foi estudar a mastite subclínica em búfalas e avaliar os métodos de triagem que auxiliam o diagnóstico da doença na fazenda. O trabalho se divide em quatro capítulos que tratam de: revisar a literatura sobre as temáticas (I); caracterizar o leite de quartos mamários com e sem infecção intramamária, e avaliar a associação entre a presença de infecção intramamária e as características microbiológicas do leite de quartos mamários de búfalas, posição dos tetos e os resultados dos métodos de triagem (II); e avaliar os testes rápidos California Mastitis Test , Somaticell e condutividade elétrica como métodos de triagem para auxiliar o diagnóstico da mastite subclínica em búfalas diretamente na fazenda (III). O estudo foi realizado em um rebanho de búfalas no estado do Rio Grande do Norte. Foram colhidas 533 amostras de leite de quartos mamários que foram submetidas à contagem eletrônica de células somáticas (CCS), aos testes de triagem (California Mastitis Test – CMT, teste Somaticell - SO e condutividade elétrica – CEL) e ao exame microbiológico pa... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mastitis is the disease that causes the most quantitative and qualitative losses in milk production systems in the world. Disease prevention and control need to involve practical and efficient actions that may help on decision-making on farm. Screening methods applied for mastitis diagnosis in dairy buffaloes are those developed specifically for cows. Thus, the objective of the thesis was to study subclinical mastitis in buffaloes and to evaluate the screening methods that help the disease diagnosis in farm. The work is divided into four chapters that deal with: reviewing the literature on the themes (I); to characterize breast milk with and without intramammary infection and to evaluate the association between the presence of intramammary infection and microbiological characteristics of buffalo milk, teat position, and the results of screening methods (II); and evaluate the California Mastitis Test (CMT), Somaticell (SO) and electrical conductivity (EC) rapid tests as a screening method to assist the diagnosis of subclinical mastitis in buffaloes on farm (III). The work was developed in a buffaloes commercial herd in the Rio Grande do Norte state. A total of 533 randomly selected milk samples were obtained and submitted to electronic somatic cell count (SCC), screening tests (CMT, SO and EC) and microbiological examination for diagnosis of subclinical mastitis (IMM: positive/negative), infection classification (negative, contagious, environmental, mixed and opportunistic) an... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Guilherme de Paula Nogueira / Resumo: O objetivo desse estudo foi comparar as concentrações séricas de cálcio, progesterona e fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-I) e a ocorrência de crescimento microbiano no leite e de retenção de placenta antes da secagem e após o parto de vacas de alta produção tratadas ou não com cabergolina. Foram utilizadas 48 vacas multíparas, das raças holandesas, girolandas ou jersolandas no final da lactação (aproximadamente 60 dias antes do parto), com produção acima de 14 L/dia. Os animais foram divididos em grupo controle e grupo tratado, recebendo 5,6 mg de cabergolina via I.M. As coletas de sangue para mensuração das concentrações de progesterona, IGF-I e de cálcio sérico foram realizadas no dia da secagem (antes da aplicação da cabergolina), um dia após a secagem, sete dias após a secagem, de quinze a sete dias antes do parto e sete dias após o parto; no dia do parto e um dia após o parto foi feita apenas a dosagem de cálcio. Para análise microbiológica foi coletado leite sete dias antes da secagem, no dia da secagem e no dia do parto e foi observada a ocorência de retenção de placenta. Não foi observada diferença significativa entre os grupos (p > 0,05) na ocorrência de infecção da glândula mamária, nas concentrações séricas de cálcio e hormônios, exceto nas amostras coletadas uma semana após o parto, quando a concentração de cálcio foi superior no grupo tratado quando comparado ao controle (11,10 ± 1,751 vs. 9,610 ± 2,212 mg/dL, p = 0,03). A ocorrência de rete... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this study was to compare the serum concentrations of calcium, progesterone, insulin-like growth factor-1 (IGF-I), occurrence of milk microbiological growth and of retained placenta before drying off and after parturition in high production dairy cows treated or not with cabergoline. A total of 48 multiparous Holstein, Gyr x Holstein and Jersey x Holstein cows at the end of lactation period (approximately 60 days before partum) were used, with production above 14L/day and sorted into control and treated group receiving 5.6 mg of cabergoline via I.M. Blood samples for serum concentrations of progesterone, IGF-I and calcium were drawn on the day of drying off (before cabergoline injection), one day after drying off, seven days after drying off, between fifteen and seven days before partum and seven days postpartum; on the day of parturition and one day postpartum only calcium was measured. For microbiological analysis, milk samples were collected seven days before drying off, on the day of drying off and on the day of partum. In addition, occurrence of retained placenta were recorded. No significant difference was observed between the groups (p > 0.05) in the occurrence of mammary gland infection, calcium and hormones serum concentrations, except in the samples collected one week after calving, when the calcium concentration was higher in the treated group compared to the control group (11.10 ± 1.751 vs. 9.610 ± 2.212 mg/dL, p = 0.03). The occurrence of placent... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Com o objetivo de avaliar a relação entre o exame físico da glândula mamária de ovelhas com o leite, 292 ovelhas da raça Santa Inês foram examinadas. As amostras de leite foram submetidas ao exame bacteriológico, ao CMT e a CCS (automática e microscópica). Variações especificamente identificadas por inspeção da mama apresentaram alterações de celularidade observadas pelo CMT (p<0,002), na CCS automática (p<0,006), e na CCS microscópica diferencial para células mononucleares (p<0,03). Mamas pendulosas puderam ser associadas a maior isolamento bacteriológico (p<0,0006) e maior celularidade nas CCS automática (p<0,01) e microscópica (p<0,05). Na inspeção do teto foram encontradas diferenças no exame da CCS automática (p<0,002), no CMT (p<0,004) e na CCS microscópica diferencial para células mononucleares (p<0,005). Nos tetos com soluções de continuidade, foram observadas diferenças apenas no exame bacteriológico (p<0,03). Quanto à palpação da mama, foram observadas diferenças no exame bacteriológico (p<0,001), no CMT (p<0,01) e na CCS microscópica total (p<0,02) e diferencial para células polimorfonuleares (p<0,02) e para células mononucleares (p<0,0002). Quanto à palpação do teto, foram encontradas diferenças no CMT (p<0,01) e na CCS microscópica total (p<0,002) e diferencial para células polimorfonucleares (p<0,002) e para células mononucleares (p<0,002). Associando-se a inspeção à palpação das metades mamárias, observou-se diferenças na CCS automática (p<0,0002) e na CCS microscópica total (p<0,04) e diferencial para células mononucleares (p<0,01). No exame do fundo escuro, foram observadas diferenças no CMT (p<0,0001), na CCS automática (p<0,0001), e na CCS microscópica total (p<0,0001) e diferencial para células polimorfonucleares (p<0,0001) e mononucleares (p<0,0001). Quando associadas duas categorias do exame físico da glândula mamária, a inspeção e a palpação, e o exame do fundo escuro, foram observadas diferenças no CMT (p<0,0001), na CCS automática (p<0,0001) e na CCS microscópica total (p<0,0001) e diferencial para células mononucleares (p<0,0001). Nas ovelhas acompanhadas durante a lactação foram observadas diferenças na inspeção da mama (p<0,0001) e do teto (p<0,0001), na palpação da mama (p<0,005) e do teto (p<0,003), na inspeção e palpação das metades mamárias (p<0,04), na inspeção, palpação e fundo escuro das metades mamárias (p<0,03), na CCS automática (p<0,0001) e na CCS microscópica total (p<0,02) e diferencial para células polimorfonucleares (p<0,02) e para células mononucleares (p<0,02). Foi possível concluir que há relação entre o exame físico e o perfil celular e bacteriológico, mas que a inflamação da mama foi melhor identificada pelo CMT, através da inspeção da mama e do teto, da palpação da mama e do teto, do exame do fundo escuro e da avaliação da inspeção, palpação e fundo escuro das metades mamárias. A inflamação também foi identificada pela avaliação da CCS automática e/ou da CCS microscópica total e/ou diferencial através da inspeção da mama e do teto, pendulosidade da mama, palpação da mama e do teto, inspeção e palpação das metades mamárias, exame do fundo escuro e a inspeção, palpação e fundo escuro das metades mamárias. O processo infeccioso mamário pôde ser identificado através da pendulosidade mamária, presença de soluções de continuidade no teto e pela palpação da mama. A maior celularidade ocorreu no início da lactação. No final da lactação, houve maiores proporções de alterações na inspeção da mama e do teto e na palpação do teto. Nas fases intermediárias da lactação, as alterações na inspeção e palpação associadas e na inspeção, palpação e fundo escuro associados foram menores. / The aim of this work is to evaluate the relationship between the mammary gland physical examination of ewes and their milk. 292 ewes of Santa Inês breed were evaluated, and the milk samples were submitted to bacteriological examination, to CMT (California Mastitis Test), to automatic SCC (somatic cell count) and microscopic SCC. Specifically identified variations during the mama inspection had cellular alterations, observed in CMT (p<0,002), in automatic SCC (p<0,006) and in differential microscopic count for mononuclear cells (p<0,03). Pendulous mamas could be associated to the largest bacteriological isolation (p<0,0006) and the largest cellular in automatic SCC (p<0,01) and microscopic SCC (p<0,05). In the teat inspection, differences were found in the automatic SCC (p<0,002) in the CMT (p<0,004) and in differential microscopic count for mononuclear cells (p<0,005). In the teat with lesion, differences were observed only in bacteriological examination (p<0,03). In mamma palpation, there were observed differences in bacteriological examination (p<0,001), in CMT (p<0,01), in total microscopic count (p<0,02), differences to polymorphonuclear cells (p<0,02) and to mononuclear cells (p<0,0002). In teat palpation, differences were found in CMT (p<0,01), in total microscopic count (p<0,002) and differences to polymorphonuclear cells (p<0,002) and to mononuclear cells (p<0,002). Associating the inspection and palpation of mammary gland, differences were observed in automatic SCC (p<0,0002) and in total microscopic count (p<0,04) and differences to mononuclear cells (p<0,01). In tamis exam, differences were observed in the CMT (p<0,0001), in automatic SCC (p<0,0001), and in total microscopic count (p<0,0001) and differences to polymorphonuclear cells (p<0,0001) and mononuclear cells (p<0,0001). When the two categories of mammary gland physical exam, the inspection, the palpation, and the tamis exam were associated, there were observed differences in the CMT (p<0,0001), in the automatic SCC (p<0,0001) and in the total microscopic count (p<0,0001), and differences in the microscopic SCC to mononuclear cells (p<0,0001). In the ewes followed during the lactation there were differences in mamma inspection (p<0,0001), in teat (p<0,0001), in mamma palpation (p<0,005) and in teat (p<0,003), in the inspection and palpation of mammary gland (p<0,04), in inspection, palpation and tamis exam of mammary gland (p<0,03), in automatic SCC (p<0,0001) and in total microscopic count (p<0,02), and differences for polymorphonuclear cells (p<0,02) and to mononuclear cells (p<0,02). It can be concluded that there is a relationship among the physical exam and the cellular and bacteriological profile, but the mamma inflammation was better identified by the CMT, through inspection of mamma and teat, and mamma and teat palpation, and tamis exam and the evaluation by inspection, palpation and macroscopic assessment of the milk by mammary glands. The inflammation was also identified by the evaluation of automatic SCC and/or total microscopic count through inspection of mamma and teat, pendulous mamma, palpation of mamma and teat, inspection and palpation of mammary gland, tamis exam and the inspection, palpation and tamis exam of mammary gland and milk. The infection in mammary gland can be identified by pendulous mamma, lesion in teat and by palpation of mamma. The biggest cellular was found in early lactation. And in late lactation, there were found more alterations in mamma and teat inspection and palpation of teat. In the intermediate phases of lactation, the alterations in inspection and palpation associated and the inspection, palpation and the tamis exam associated were smaller.

Para produção de biofármacos protéicos, como a eritropoietina recombinante humana (EPOrh), são necessárias alterações pós-traducionais adequadas que garantam a sua especificidade e atividade biológica. Essas características são obtidas apenas em biorretores baseados em células eucarióticas, como as da glândula mamária. Sistemas baseados nesse tipo celular, tanto in vivo quanto in vitro, já são utilizados para produção estratégica e viável de proteínas recombinantes biologicamente ativas. Assim, tanto o estabelecimento de novas linhagens de células mamárias que apresentem boa expressão protéica quanto o desenvolvimento de sistemas in vivo que utilizem a estrutura da glândula mamária para essa produção de proteínas recombinantes são de grande valia. O presente trabalho teve como objetivo comparar dois métodos de estabelecimento de uma cultura de células de glândula mamárias ovinas, enzimático e não enzimático, e verificar sua capacidade de expressão das proteínas do leite &beta;-lactoglobulina, &alpha;-caseína, &beta;-caseína e &kappa;-caseína mediante o tratamento com SFB (soro fetal bovino) ou SOL (soro de ovelha lactante), na presença ou não de Matrigel. Para isso, foi realizado um experimento in vitro, no qual foi estabelecido o cultivo celular até a passagem 12 (P12) de duas linhagens celulares: digerida (LD) e não digerida (LND). Para a LD na P12 foi observado apenas um tipo celular, o qual era positivo para a marcação com vimentina. Essa linhagem apresentou expressão gênica de &beta;-caseína e &beta;-lactoglobulina apenas quando tratada com meio de cultivo acrescido de SFB, sendo a expressão inferior (P=0,001) ao grupo da LND submetido ao mesmo tratamento. Já a LND, quando tratada com meio adicionado com SFB expressou &kappa;-caseína além da &beta;-caseína e &beta;-lactoglobulina. A troca do SFB do meio de cultivo por SOL aumentou a expressão gênica de &beta;-lactoglobulina (P=0,001) para ambas linhagens. Foi realizada a curva de crescimento para LD e LND na P12 com o meio de cultivo acrescido com SFB ou SOL. Para a LND observou-se o efeito do meio na velocidade de crescimento celular, sendo que foi maior para o grupo tratado com SFB (P&lt;0,05). Para a LD, não ocorreu o efeito do meio na velocidade de crescimento celular (P&gt;0,05), não sendo observada diferença com a LND tratada com SOL (P&gt;0,05). A LND apresentou marcação positiva para a presença de vimentina e citoqueratina. Este trabalho visou, ainda, estabelecer um sistema de produção da EPOrh no leite de ovelhas não transgênicas pela técnica de infusão intra-mamária in vivo de dois plasmídeos diferentes e verificar a secreção qualitativa desta proteína por Western-blotting. Assim, foi feito um experimento in vivo no qual glândulas mamárias de ovelhas foram transfectadas com dois plasmídeos diferentes: ALAC (n=2), BGL (n=2) e controle negativo (n=2). Após a infusão dos plasmídeos, foi realizada a eletroporação de cada teto (3 choques de 500 volts com a duração de 15ms cada, sendo realizada a inversão da polaridade). Os animais foram ordenhados durante 20 dias após a transfecção, porém não foi possível detectar a presença de EPOrh nas amostras de leite analisadas. O limiar de detecção do teste utilizado foi de 67,5pg de EPOrh (Eritromax&reg;) em leite controle negativo de ovelha. Concluindo, foi possível estabelecer o cultivo in vitro das LD e LND com capacidade de expressar proteínas do leite, sendo a expressão da &beta;-lactoglobulina aumentada pelo tratamento com SOL. Ambas as linhagens apresentaram marcação positiva para vimentina, mas apenas LND para citoqueratina. Ainda, para o experimento in vivo, não foi possível detectar a expressão de EPOrh no leite das ovelhas transfectadas com os plasmídeos ALAC e BGL. / Some post-translational modifications are necessary for the production of biopharmaceutical proteins, such as recombinant human erythropoietin (rhEPO), with a good specific action and a high biological activity. These modifications are obtained only by bioreactors based on eukaryotic cell as mammary cells. Bioreactors, in vivo or in vitro, with this kind of cell have been used for a viable and strategic production of biologically active recombinant proteins. For this reason, the establishment of a new line of mammary cells with high milk protein expression and the development of systems for production of recombinant proteins by the mammary gland in vivo are essential studies. One of the main objectives of this study was to compare two methods, enzymatic and non-enzymatic, to establish ovine mammary cells culture and verify their gene expression of milk proteins such as &beta;-lactoglobulin, &alpha;-casein, &beta;-casein and &kappa;-casein with different treatments: LOS (lactating ovine serum) or FBS (fetal bovine serum) added to the culture medium, in the presence or absence of Matrigel&reg;. In this manner, an in vitro study was performed and the culture of two lines were established, digested (DL) and non-digested (NDL), of ovine mammary cell until the passage 12 (P12). In DL was observed just one cellular type that was positive for staining with vimentin. This cell line expressed &beta;-lactoglobulin and &beta;-casein genes with the FBS treatment and without Matrigel. The gene expression was lower (P=0,001) when compared to the NDL under the same conditions of culture. Then, the NDL expressed &beta;-lactoglobulin, &beta;-casein and &kappa;-casein genes when treated with FBS without Matrigel. The treatment with LOS in the culture medium increased the gene expression of &beta;-lactoglobulin for both cell lines. The growth curve was determined with both cell lines in P12 with FBS or LOS treatment. For the NDL, the type of medium had effect on the cell growth speed and was highest with the FBS treatment (P&lt;0,05). However, the medium did not have effect on growth speed of LD (P&gt;0,05) and no difference was observed at the NDL treated with LOS (P&gt;0,05). The NDL was positive for staining with vimentin and cytokeratin. The second main objective of this study was to establish an in vivo system for the production of rhEPO in milk of non-transgenic ewes by the intra-mammary infusion of two different plasmids and verify the qualitative milk secretion of this protein by western-blotting. In this way, in the in vivo experiment ovine mammary glands were transfected with two different plasmids: ALAC (n=2), BGL (n=2) and negative control (n=2). Each half udder was filled with plasmid solution and three 3 electric pulses of 500 volts were applied for 15ms each, followed by another three pulses with reversed polarity. The three animals were milked for 20 days after transfection, nevertheless it was not possible to identify rhEPO in any milk sample. The test threshold to identify rhEPO (Eritromax&reg;) in milk from a negative control animal was 67,5pg. In conclusion, the in vitro culture of NDL and DL was established up to the P12 with expression of milk protein and the LOS treatment increased the expression of &beta;-lactoglobulin. The two cell lines culture were positive for staining of vimentina but only NDL was positive for cytokeratin. In the in vivo experiment, rhEPO secretion was not detected in the milk from ewes transfected with ALAC and BGL plasmids.

O vírus da leucose enzoótica bovina (VLEB) pode interferir na proporção e na funcionalidade dos linfócitos B e das demais células sanguíneas. Acreditando-se que essas alterações pudessem interferir nos mecanismos de defesa da glândula mamária, o presente estudo avaliou funcionalmente os fagócitos sanguíneos e lácteos de vacas naturalmente infectadas pelo VLEB, por meio da expressão de diferentes receptores de superfície celular de fagócitos e linfócitos; da morte celular dos fagócitos e do linfócito B; pelo potencial de fagocitose e produção intracelular de peróxido de hidrogênio pelas células CD14+ e CH138+. Foram selecionadas nove vacas negativas para a LEB (grupo negativo), dez positivas sem linfocitose (grupo AL) e seis positivas com linfocitose persistente (grupo LP). Independente do perfil hematológico das vacas positivas para a LEB, nas amostras de sangue foram observadas menor expressão de células mononucleares CD14+, de linfócitos T (CD3+) e de linfócitos B CD21+ CD11b+ e maior expressão de linfócitos B (CD21+). As vacas do grupo LP apresentaram menores quantidades de linfócitos T auxiliares (CD3+ CD4+) e de linfócitos B CD21+ CD5- CD11b- e maiores quantidades de linfócitos B CD21+ CD5+ CD11b+. Menores quantidades de linfócitos B CD21+ CD5+ foram observados nas vacas do grupo AL do que nas vacas do grupo negativo. As vacas do grupo LP apresentaram menores índices de fagocitose por Escherichia coli pelas células mononucleares CD14+, menor produção de peróxido de hidrogênio e menores índices de fagocitose por Staphylococcus aureus pelas células polimorfonucleares CH138+. As vacas do grupo LP apresentaram menores índices de necrose, de apoptose e/ou necrose e maior viabilidade das células mononucleares CD14+, das células polimorfonucleares CH138+ e dos linfócitos B (CD21+). Apenas os linfócitos B (CD21+) das vacas do grupo LP apresentaram menores índices de morte por apoptose, e as células mononucleares CD14+ das vacas do grupo AL manifestaram maiores índices de apoptose e/ou necrose do que as vacas negativas. Independente do perfil hematológico das vacas, nas amostras de leite foram observadas maiores quantidades de macrófagos e maiores expressões de linfócitos T (CD3+) e de linfócitos B (CD21+). As vacas do grupo AL apresentaram maior quantidade de linfócitos B (CD21+) do que as vacas negativas. As vacas do grupo LP apresentaram menores quantidades de linfócitos T citotóxicos (CD3+ CD8+), de linfócitos B CD21+ CD11b+ e de linfócitos B CD21+ CD5+ CD11b+ e maior quantidade de linfócitos B CD21+ CD5- CD11b-. As vacas do grupo AL apresentaram menores índices de fagocitose por Escherichia coli pelos macrófagos CD14+ e pelos leucócitos CH138+ e as vacas do grupo LP apresentaram maior produção de peróxido de hidrogênio intracelular. As vacas positivas para LEB apresentaram maiores índices de morte por necrose dos macrófagos CD14+ e dos linfócitos B (CD21+) e menores índices de morte por apoptose dos macrófagos CD14+, dos leucócitos CH138+ e dos linfócitos B (CD21+). Estas vacas também apresentaram maior viabilidade dos macrófagos CD14+ e dos leucócitos CH138+. As vacas do grupo LP apresentaram maiores índices de apoptose e/ou necrose dos macrófagos CD14+, de necrose de leucócitos CH138+ e de viabilidade de linfócitos B (CD21+). Resultados permitem concluir que a o VLEB altera a resposta imune da glândula mamária. / The enzootic bovine leukemia virus (BLV) can influence the amount of lymphocytes B and other blood cells and their functions. Believing that these changes could interfere in the defense mechanisms of the mammary gland, this study evaluated blood and milk phagocytes functions from cows naturally infected VLEB through the expression of different cell surface receptors of phagocytes and lymphocytes; from death cell of phagocytes and B lymphocytes; the phagocytosis and intracellular production of hydrogen peroxide by CD14+ and CH138+ cells. We chose nine cows negative for the LEB (negative group), ten positive without lymphocytosis (LA group) and six positive with persistent lymphocytosis (LP group). In blood samples of positive cows for BLV, it was observed smaller expression of CD14+ mononuclear, T lymphocytes (CD3+) and CD21+ CD11b+ B lymphocytes, along with increased expression of B lymphocytes (CD21+). Cows of the LP group had lower amounts of T helper lymphocytes (CD3+ CD4+) and CD21+ CD5- CD11b- B lymphocytes and higher amounts of CD21+ CD5+ CD11b+ B lymphocytes. In cows of AL group it was observed lower amounts of CD21+ CD5+ B lymphocytes than in cows of negative group. Cows of LP group had lower rates of Escherichia coli phagocytosis by CD14+ mononuclear cells, lower intracellular production of hydrogen peroxide and lower rates of phagocytosis of Staphylococcus aureus by CH138+ polymorphonuclear cells. Cows of LP group showed less necrosis, apoptosis and/or necrosis and increased viability of CD14+ mononuclear cells, CH138+ polymorphonuclear cells and B lymphocytes (CD21+). Only the B-lymphocytes (CD21+) of the cows in the LP group showed less apoptosis, and CD14 + mononuclear cells from cows in the AL group showed higher rates of apoptosis and/or necrosis than the ones from negative cows. In the milk sample, the positive cows showed higher amounts of macrophages and increased expression of T lymphocytes (CD3+) and B lymphocytes (CD21+). Cows of AL group showed a higher amount of B lymphocytes (CD21+) than negative cows. Cows of LP group had lower amounts of T cytotoxic lymphocytes (CD3+, CD8+), CD21+ CD11b+ B lymphocytes and CD21+, CD5+, CD11b+, B lymphocytes and increased amount of CD21 + CD5- CD11b- B lymphocytes. Cows of the AL group had lower rates of Escherichia coli phagocytosis by CD14+ macrophages and CH138+ leukocytes and cows of group LP had higher production of intracellular hydrogen peroxide. The positive cows for LEB had higher rates of death by necrosis of CD14+ macrophages and B lymphocytes (CD21+) and lower rates of apoptosis of CD14+ macrophages, CH138+ leukocytes and B lymphocytes (CD21+). These cows also had higher viability of CD14+ macrophages and CH138+ leukocytes. Cows on the LP group had higher rates of apoptosis and/or necrosis of CD14+ macrophages, necrosis of CH138+ leukocytes and viability of B lymphocytes (CD21+). Results suggested that the VLEB influence the immune response of the mammary gland.

Objetivou-se identificar parâmetros bioquímicos, hematológicos e imunológicos, sistêmicos e locais, associados a modelo de risco de mastite bovina, da secagem ao final do período de transição da lactação subsequente, de vacas submetidas a antimicrobiano e selante na secagem. Foram utilizadas 34 vacas da raça Holandesa, divididas em três grupos: grupo controle (GC; n = 13); grupo antimicrobiano (GA; n = 10) composto animais que receberam antimicrobiano intramamário; grupo selante (GS; n = 11), composto por animais que receberam selante intramamário. Foram coletadas amostras de leite e sangue onde avaliou-se hemograma, metabolismo oxidativo de neutrófilos (NBT), imunoglobulinas, bioquímica, e CMT, contagem de células somáticas, isolamento microbológico do colostro e leite e imunoglobulinas do leite nos 60 dias que antecederam o parto (M1), no dia do parto (M2), três, sete, 15, 21, 30 dias pós-parto (M3, M4, M5, M6 e M7). Os dados foram analisados pelo software Stata utilizando um modelo de regressão logística. As variáveis foram analisadas primeiro individualmente para verificar o significado e em seguida, em combinação, para avaliar o efeito das variáveis individuais. Na primeira fase da análise, empregou-se modelo logístico para cada variável relacionada com os achados clínicos, com valores de P inferiores a 0,20 foram considerados como uma variável selecionada e passada para a próxima fase da análise. Dentro o modelo final, foram usadas variáveis selecionadas na primeira fase para desenvolver um modelo logístico multivariado em que as variáveis com P&le;0.05 foram retidas no modelo final. Foi possível identificar que alterações nos parâmetros, proteína, albumina e fibrinogênio, servem de biomarcadores associados à mastite bovina. Alterações metabólicas específicas e características do período de transição, nos parâmetros sanguíneos, sobrepõem o efeito dos protocolos de secagem empregados e, sugere-se que o perfil sistêmico da vaca o periparto está associado à mastite / Objective identify biochemical, hematological and immunological systemic and local, associated with Bovine Mastitis risk model, drying at the end of the transitional period of the subsequent lactation cows treated with antimicrobial and sealant to dry. 34 cows were used the Dutch race, divided into three groups: control group (GC; n = 13); antimicrobial Group (GA; n = 10) animals receiving antimicrobial intramamário; sealant Group (GS; n = 11), composed of animals that received intramamário sealant. Milk samples were collected and evaluated blood where blood count, neutrophil oxidative metabolism (NBT), immunoglobulins, biochemistry, and CMT, somatic cell count, microbológico isolation of colostrum and milk and milk immunoglobulins in the 60 days preceding childbirth (M1) on the day of delivery (M2), three, seven, 15, 21, 30 days postpartum (M3, M4, M5, M6 and M7). Data were analyzed by the software Stata using a logistic regression model. The variables were analyzed individually to check the meaning and then, in combination, to evaluate the effect of individual variables. In the first phase of the analysis, logistic model was used for each variable related to the clinical findings, with P values less than 0.20 were considered as a variable selected and passed to the next stage of analysis. In the final model, selected variables were used in the first phase to develop a multivariate logistic model in which the variables with P &le; 0.05 were retained in the final model. It was possible to identify changes in the parameters, protein, albumin and Fibrinogen, serve as biomarkers associated with Bovine Mastitis. Specific metabolic changes and characteristics of the transitional period, blood parameters, overlapping the effect of drying employees and protocols, it is suggested that the systemic profile the periparto cow is associated with mastitis

A presente dissertação foi elaborada em dois experimentos. No primeiro experimento objetivou-se determinar o dia do parto através de alterações físicas e circulatórias locais, e avaliar o pH da secreção da glândula mamária comparando dois métodos em éguas no pré-parto. Foram utilizadas 30 éguas gestantes sem raça definida (SRD), durante duas estações de monta (2015 e 2016), com idade de 10&#177;4 anos, e peso corporal de 560&#177;57 kg. Foram observadas possíveis alterações na área pélvica, abdominal, edema vulvar e a coloração da mucosa vaginal até o dia do parto através de fotográfias sequênciais, e as fotos foram analisadas individualmente e classificadas usando um sistema de escore. Para mensuração do pH, foi utilizado o peagâmetro portátil (Quimis&reg;) e o teste de pH em fita (Fusion&reg;). As colheitas iniciaram a partir de 310 dias de gestação. Para às mensurações do pH, foi utilizado um modelo misto sendo a égua o efeito aleatório e o tempo como efeito fixo. As associações entre as diferentes mensurações de pH foram avaliadas por meio de correlação de Momento-produto de Pearson. Para avaliar o escores físicos e circulatórios locais os dados foram analisados pelo teste de razão de Probabilidade Qui-Quadrado e por regressão, para observar a frequência dos escores 1, 2 ou 3 até o dia do parto. O nível de significância utilizado foi de 5%. O pH da secreção mamária pode ser utilizada para determinar o dia do parto, independente do método utilizado. A coloração de mucosa vaginal e edema vulvar podem auxiliar na predição do dia do parto, porém não devem ser utilizados como único método. No segundo experimento, o objetivo foi estudar o relacionamento entre a égua e e sua cria no primeiro dia pós-parto, e relacionar o fator progênitor sobre o comportamento do potro. Foram utilizadas 22 éguas multíparas e seus respectivos potros em duas temporadas de parto (2015 e 2016). Os progenitores eram formados por jumento e equinos. O etograma foi delineado considerando-se os comportamentos característicos apresentados por éguas e potros, e divididos em atividades de interação entre égua e produto, atividades do produto, postura e outros comportamentos. As observações foram realizadas no primeiro dia pós-parto durante 10 horas a cada 2 minutos, através de observação direta com rota de amostragem focal da égua e sua cria. Foi realizada a análise de frequência dos comportamentos ao longo do tempo, considerando cada par (égua/potro) como uma unidade experimental. As frequências dos comportamentos de interação, postura e outros comportamentos das éguas foram analisadas pelo teste de Qui-Quadrado para proporções iguais. Para dependência do comportamento do potro sobre o tipo de progênitor foi realizado o teste de Qui-Quadrado de Pearson. O nível de significância utilizado foi 5%. Concluí-se que no primeiro dia pós-parto as éguas buscam auxiliar a mamada, enquanto os potros mamam e descansam. Potros e muares apresentam diferenças na postura. / The present dissertation was elaborated in two experiments. The first experiment aimed to determine the day of birth through local physical and circulatory changes, and to evaluate the pH of the mammary gland secretion comparing two methods of mares in preparturient. Thirty non-defined pregnant mares (SRD) were used during two mating seasons (2015 and 2016), aged 10 &#177; 4 years, and body weight of 560 &#177; 57 kg. Possible alterations in pelvic, abdominal, vulvar edema and vaginal mucosa staining until the day of delivery were observed through sequential photographies, and the photos were analyzed individually and classified using a scoring system. For pH measurement, the portable pHmeter (Quimis&reg;) and the pH strip test (Fusion&reg;) were used. Crops started at 310 days of gestation. For the pH measurements, a mixed model was used, the mare being the random effect and the time as a fixed effect. The associations between the different pH measurements were evaluated through Pearson\'s Moment-product correlation. In order to evaluate the local physical and circulatory scores, the data were analyzed by the chi-square probability and regression test to observe the frequency of scores 1, 2 or 3 until the day of delivery. The level of significance was 5%. The pH of the mammary secretion can be used to determine the day of delivery, regardless of the method used. The coloration of vaginal mucosa and vulvar edema may aid in the prediction of the day of delivery, but should not be used as the sole method. In the second experiment, the objective was to study the relationship between the mare and her offspring on the first postpartum day, and to relate the progenitor factor to the foal behavior. Twenty - two multiparous mares and their respective foals were used in two calving seasons (2015 and 2016). The parents were formed by donkeys and horses. The etogram was delineated considering the characteristic behaviors presented by mares and foals, and divided into activities of interaction between mare and product, product activities, posture and other behaviors. The observations were performed on the first day postpartum for 10 hours every 2 minutes, through direct observation with the focal sampling route of the mare and her offspring. The behavioral frequency analysis was performed over time, considering each pair (mare / foal) as an experimental unit. The frequencies of the interaction behaviors, posture and other behaviors of the mares were analyzed by the Chi-square test for equal proportions. For the dependence of the behavior of the foal on the type of progenitor was carried out the test of Chi-Square of Pearson. The level of significance was 5%. It was concluded that on the first day postpartum the mares seek to assist the feeding, while the foals suck and rest. Foals and mules show differences in posture.

Para produção de biofármacos protéicos, como a eritropoietina recombinante humana (EPOrh), são necessárias alterações pós-traducionais adequadas que garantam a sua especificidade e atividade biológica. Essas características são obtidas apenas em biorretores baseados em células eucarióticas, como as da glândula mamária. Sistemas baseados nesse tipo celular, tanto in vivo quanto in vitro, já são utilizados para produção estratégica e viável de proteínas recombinantes biologicamente ativas. Assim, tanto o estabelecimento de novas linhagens de células mamárias que apresentem boa expressão protéica quanto o desenvolvimento de sistemas in vivo que utilizem a estrutura da glândula mamária para essa produção de proteínas recombinantes são de grande valia. O presente trabalho teve como objetivo comparar dois métodos de estabelecimento de uma cultura de células de glândula mamárias ovinas, enzimático e não enzimático, e verificar sua capacidade de expressão das proteínas do leite &beta;-lactoglobulina, &alpha;-caseína, &beta;-caseína e &kappa;-caseína mediante o tratamento com SFB (soro fetal bovino) ou SOL (soro de ovelha lactante), na presença ou não de Matrigel. Para isso, foi realizado um experimento in vitro, no qual foi estabelecido o cultivo celular até a passagem 12 (P12) de duas linhagens celulares: digerida (LD) e não digerida (LND). Para a LD na P12 foi observado apenas um tipo celular, o qual era positivo para a marcação com vimentina. Essa linhagem apresentou expressão gênica de &beta;-caseína e &beta;-lactoglobulina apenas quando tratada com meio de cultivo acrescido de SFB, sendo a expressão inferior (P=0,001) ao grupo da LND submetido ao mesmo tratamento. Já a LND, quando tratada com meio adicionado com SFB expressou &kappa;-caseína além da &beta;-caseína e &beta;-lactoglobulina. A troca do SFB do meio de cultivo por SOL aumentou a expressão gênica de &beta;-lactoglobulina (P=0,001) para ambas linhagens. Foi realizada a curva de crescimento para LD e LND na P12 com o meio de cultivo acrescido com SFB ou SOL. Para a LND observou-se o efeito do meio na velocidade de crescimento celular, sendo que foi maior para o grupo tratado com SFB (P&lt;0,05). Para a LD, não ocorreu o efeito do meio na velocidade de crescimento celular (P&gt;0,05), não sendo observada diferença com a LND tratada com SOL (P&gt;0,05). A LND apresentou marcação positiva para a presença de vimentina e citoqueratina. Este trabalho visou, ainda, estabelecer um sistema de produção da EPOrh no leite de ovelhas não transgênicas pela técnica de infusão intra-mamária in vivo de dois plasmídeos diferentes e verificar a secreção qualitativa desta proteína por Western-blotting. Assim, foi feito um experimento in vivo no qual glândulas mamárias de ovelhas foram transfectadas com dois plasmídeos diferentes: ALAC (n=2), BGL (n=2) e controle negativo (n=2). Após a infusão dos plasmídeos, foi realizada a eletroporação de cada teto (3 choques de 500 volts com a duração de 15ms cada, sendo realizada a inversão da polaridade). Os animais foram ordenhados durante 20 dias após a transfecção, porém não foi possível detectar a presença de EPOrh nas amostras de leite analisadas. O limiar de detecção do teste utilizado foi de 67,5pg de EPOrh (Eritromax&reg;) em leite controle negativo de ovelha. Concluindo, foi possível estabelecer o cultivo in vitro das LD e LND com capacidade de expressar proteínas do leite, sendo a expressão da &beta;-lactoglobulina aumentada pelo tratamento com SOL. Ambas as linhagens apresentaram marcação positiva para vimentina, mas apenas LND para citoqueratina. Ainda, para o experimento in vivo, não foi possível detectar a expressão de EPOrh no leite das ovelhas transfectadas com os plasmídeos ALAC e BGL. / Some post-translational modifications are necessary for the production of biopharmaceutical proteins, such as recombinant human erythropoietin (rhEPO), with a good specific action and a high biological activity. These modifications are obtained only by bioreactors based on eukaryotic cell as mammary cells. Bioreactors, in vivo or in vitro, with this kind of cell have been used for a viable and strategic production of biologically active recombinant proteins. For this reason, the establishment of a new line of mammary cells with high milk protein expression and the development of systems for production of recombinant proteins by the mammary gland in vivo are essential studies. One of the main objectives of this study was to compare two methods, enzymatic and non-enzymatic, to establish ovine mammary cells culture and verify their gene expression of milk proteins such as &beta;-lactoglobulin, &alpha;-casein, &beta;-casein and &kappa;-casein with different treatments: LOS (lactating ovine serum) or FBS (fetal bovine serum) added to the culture medium, in the presence or absence of Matrigel&reg;. In this manner, an in vitro study was performed and the culture of two lines were established, digested (DL) and non-digested (NDL), of ovine mammary cell until the passage 12 (P12). In DL was observed just one cellular type that was positive for staining with vimentin. This cell line expressed &beta;-lactoglobulin and &beta;-casein genes with the FBS treatment and without Matrigel. The gene expression was lower (P=0,001) when compared to the NDL under the same conditions of culture. Then, the NDL expressed &beta;-lactoglobulin, &beta;-casein and &kappa;-casein genes when treated with FBS without Matrigel. The treatment with LOS in the culture medium increased the gene expression of &beta;-lactoglobulin for both cell lines. The growth curve was determined with both cell lines in P12 with FBS or LOS treatment. For the NDL, the type of medium had effect on the cell growth speed and was highest with the FBS treatment (P&lt;0,05). However, the medium did not have effect on growth speed of LD (P&gt;0,05) and no difference was observed at the NDL treated with LOS (P&gt;0,05). The NDL was positive for staining with vimentin and cytokeratin. The second main objective of this study was to establish an in vivo system for the production of rhEPO in milk of non-transgenic ewes by the intra-mammary infusion of two different plasmids and verify the qualitative milk secretion of this protein by western-blotting. In this way, in the in vivo experiment ovine mammary glands were transfected with two different plasmids: ALAC (n=2), BGL (n=2) and negative control (n=2). Each half udder was filled with plasmid solution and three 3 electric pulses of 500 volts were applied for 15ms each, followed by another three pulses with reversed polarity. The three animals were milked for 20 days after transfection, nevertheless it was not possible to identify rhEPO in any milk sample. The test threshold to identify rhEPO (Eritromax&reg;) in milk from a negative control animal was 67,5pg. In conclusion, the in vitro culture of NDL and DL was established up to the P12 with expression of milk protein and the LOS treatment increased the expression of &beta;-lactoglobulin. The two cell lines culture were positive for staining of vimentina but only NDL was positive for cytokeratin. In the in vivo experiment, rhEPO secretion was not detected in the milk from ewes transfected with ALAC and BGL plasmids.