O vírus da mancha das orquídeas (“Orchid fleck virus” - OFV), transmitido pelo ácaro Brevipalpus californicus, causa manchas cloróticas e necróticas em orquídeas de vários gêneros e foi relatado em diversos países. O diagnóstico de "orchid fleck", doença causada pelo OFV, tem sido feito através da análise dos sintomas, sorologia, observação de cortes ultrafinos de tecido infectado em microscópio eletrônico de transmissão ou RT-PCR. No entanto, apesar de testes moleculares serem freqüentemente mais eficientes e específicos que outros métodos, os "primers" disponíveis na literatura nem sempre detectam o vírus em baixas concentrações no tecido vegetal, ou amplificam regiões da planta sadia. Com base nas seqüências nucleotídicas da capa protéica viral depositadas no GenBank foram desenhados novos “primers”, que amplificam um fragmento de 326 pb. Esses “primers” foram utilizados para a detecção do OFV por RT-PCR e para a marcação com digoxigenina de sondas para hibridização. A variabilidade de um fragmento do gene da capa protéica deste vírus foi estudada por polimorfismo conformacional de fita simples ("Single strand conformational polymorphism" – SSCP) e seqüenciamento de nucleotídeos. Quarenta e oito amostras de 18 gêneros de orquídeas foram coletadas no Brasil, Costa Rica e Austrália. As análises dos padrões de SSCP resultaram em seis haplótipos diferentes e em agrupamentos baseados na origem geográfica das amostras. Amostras representando cada um desses padrões foram seqüenciadas e comparadas com aquelas disponíveis no GenBank. A análise de SSCP provou ser eficiente para fornecer informações preliminares sobre a variabilidade do OFV. No entanto, apenas através do seqüenciamento de nucleotídeos das amostras foi possível determinar a real variabilidade das mesmas. / Orchid fleck virus (OFV), transmitted by the mite Brevipalpus californicus, causes chlorotic and necrotic ringspots in many orchid genera and was reported in several countries. The diagnosis of the Orchid fleck disease has been performed by symptomatology, transmission electon microscopy, serology or RT-PCR. Even though the molecular tests are usually more efficient and specific than other methods, the available primers did not always detect the OFV in low concentrations or sometimes amplified healthy plant samples. Based on the nucleotide sequences of the coat protein gene (cp) available in the GenBank, new primers were designed. These primers amplified a 326 pb specific OFV fragment and were used for RT-PCR and as hybridization probes. The variability of a fragment of the cp of this virus was investigated by “single strad conformational polymorphism (SSCP)” and nucleotide sequencing. Forty eight samples of 18 genera of orchids were collected from Brazil, Costa Rica and Australia. The SSCP analysis resulted in six different haplotypes and demonstrated a clustering in samples based on geographical origin. Samples representing the different SSCP patterns were sequenced and compared with those available in the GenBank. The SSCP analysis proved to be efficient to provide preliminary information about OFV variability. However, only through nucleotide sequencing it was possible to determine the actual variability amongst the samples.

Um dos principais fatores limitantes da produção do melão é a ocorrência de doenças. Entre os patógenos mais importantes estão as bactérias, que causam perdas significativas na produção. Causada pela bactéria Acidovorax avenae subsp. citrulli (Aac), a mancha-aquosa-do-melão, também conhecida como mancha-bacteriana-dofruto, é uma doença grave, que tem preocupado produtores do nordeste, sendo que todos os tipos de melão apresentam suscetibilidade ao patógeno. A principal fonte de inóculo para esta bactéria é a semente infectada. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um meio semi-seletivo para detecção e identificação de Acidovorax avenae subsp. citrulli em sementes de melão, para testes de rotina em laboratórios de patologia de sementes. Por meio de testes de fungitoxicidade, antibiogramas qualitativos e quantitativos e testes bioquímicos foi desenvolvido o seguinte meio semiseletivo para a detecção de Aac em sementes de melão: dextrose (5 g/L), NaCl (5 g/L), peptona (5 g/L), KH2PO4 (2 g/L), MgSO4.7H2O (0,2 g/L), vermelho de fenol (0,012 g/L), uréia (25 g/L), agar (17 g/L), benomil (100 mg/L), nistatina (200 mg/L) e amoxicilina (15 mg/L). / One of the main limiting factors of the melon production is the occurrence of diseases. The bacteria are among the most important pathogens causing significant losses in the production. Caused by the bacterium Acidovorax avenae subsp. citrulli (Aac), the bacterial-fruit-blotch is a serious disease that affects all types of melon and has worried northeast producers. The main source of inoculum for this bacterium is the infected seed. This work had as objective the development of a semi-selective medium to detect and identify Acidovorax avenae subsp. citrulli in melon seeds, for routine tests in seed pathology laboratories. By means of fungitoxicity tests, qualitative and quantitative antibiograms and biochemical tests the following semi-selective medium to detect Aac in melon seeds was developed: dextrose (5 g/L), NaCl (5 g/L), peptone (5 g/L), KH2PO4 (2 g/L), MgSO4.7H2O (0,2 g/L), phenol red (0,012 g/L), urea (25 g/L), agar (17 g/L), benomil (100 mg/L), nistatina (200 mg/L) and amoxicilin (15 mg/L).

O manejo da cultura de milho (Zea mays L.) tem incorporado os recentes avanços tecnológicos em agricultura, o que tem proporcionado aumentos significativos de rendimento. Procedimentos relativos à redução da severidade de doenças, como a causada por Phaeosphaeria maydis, tornam-se prementes. O fungo é um agente biótico que promove redução de produtividade. Tal fato está relacionado com o estresse da planta, com a severidade da doença e com as condições climáticas, principalmente umidade relativa e temperatura do ar. A ênfase da pesquisa é a de nortear mais detalhadamente as ações de manejo levando em consideração esses fatores, estabelecendo técnicas culturais racionais quando da utilização de genótipos susceptíveis. Por outro lado, mesmo utilizando genótipos tolerantes, um manejo nutricional inadequado da cultura sob condições climáticas favoráveis à doença, pode ser constatada a incidência de P. maydis com maior severidade. Sendo assim, com o objetivo de avaliar cinco diferentes genótipos de milho, sendo quatro tolerantes a P. maydis e um susceptível, foram conduzidos ensaios em quatro épocas de semeadura, as duas primeiras no campus "Luiz de Queiroz" (Local 1) e as duas últimas na Estação Experimental de Anhembi (Local 2), ambos no município de Piracicaba, sob a influência de cinco doses de nitrogênio (0; 60; 120; 180 e 240 kg/ha). De acordo com os resultados obtidos, concluiu-se que: (i) o desempenho do genótipo é dependente da época de Semeadura, e a adubação nitrogenada propicia aumento no rendimento de grãos apenas quando a condição ambiental não é limitante; e (ii) a severidade de P. maydis é dependente da época de semeadura, da dose de nitrogênio e do material genético. O estresse da planta provocado por elevadas temperaturas predispõe a cultura à incidência da doença com maior severidade. / Maize (Zea mays L.) crop management is incorporating the ultimate technological advances in Agriculture, resulting in higher yield. Procedures to reduce diseases severity, as those caused by Phaeosphaeria maydis, are becoming more important. The fungus is a biotic agent that reduces productivity due to plant stress. This is related to disease severity and climatic conditions, mainly air temperature and relative humidity. The research had the emphasis of getting better orientation for management actions, using rational agricultural techniques when susceptible genotypes are used. Under favorable climatic condition for P. maydis, the inadequate crop nutritional management results in higher severity even using tolerant genotypes. Therefore, with the purpose of evaluating five different maize genotypes (four tolerant and one susceptible to P. maydis), the field experiments were carried out in four sowing dates, the first two at "Luiz de Queiroz" campus (Location 1) and the last two at Anhembi Experimental Station (Location 2), both in Piracicaba county, São Paulo State, Brazil, making four environments, all under the influence of five nitrogen doses (0; 60; 120; 180 e 240 kg/ha). According to the results, we concluded: (i) the genotype performance depends on the sowing date, and the nitrogen fertilization increases grain yield only without environmental limitation to plant growth; and (ii) the P. maydis severity depends on the sowing date, nitrogen fertilization dose and genotype susceptibility. The stress caused by high air temperature results in higher severity incidence of P. maydis.

O tomateiro é a segunda hortaliça em importância econômica no mundo, sendo uma das culturas mais exigentes em cuidados fitossanitários, devido ao grande número de doenças que a acometem e pela elevada capacidade destrutiva e difícil controle dos patógenos. A mancha-bacteriana, causada por espécies do gênero Xanthomonas (X. euvesicatoria, X. gardneri, X. vesicatoria e X. perforans), é uma das mais importantes doenças do tomateiro estaqueado ou rasteiro, que afeta a planta em qualquer estádio de desenvolvimento, podendo ocorrer em toda parte aérea, provocando redução em quantidade e qualidade da produção. Para diminuir a disseminação do patógeno e determinar medidas de controle nas áreas de cultivo, é importante que haja a detecção eficiente do patógeno em plantas e sementes. Assim, existe a necessidade de análises que possibilitem detectar bactérias em sementes, especialmente quando o nível de infecção ou incidência é muito baixo. O objetivo deste trabalho foi desenvolver métodos de detecção e diferenciação de Xanthomonas spp. em sementes de tomate. Desenvolveu-se um meio semi-seletivo, constituído por dextrose (5,0 g/L), NaCl (5,0 g/L), KH2PO4 (1,4 g/L), K2HPO4 (3,6 g/L), extrato de carne (1,0 g/L), peptona (5,0 g/L), extrato de levedura (2,0 g/L), cefaclor (40,0 mg/L), nistatina (50,0 mg/L), benomil (10,0 mg/L) e ágar (14,0 g/L), que mostrou baixa repressividade a Xanthomonas spp. e supressividade moderada aos microrganismos não-alvos associados a sementes de tomate e elevada sensibilidade, além de baixo custo. Por PCR-RFLP de um fragmento do gene rpoB, foi possível diferenciar as diferentes espécies causadoras da mancha-bacteriana em tomateiro. / The tomato is the second economical important horticultural crop in the world, being one of the most exigent cultures in phytosanitary cares, due to the large number of diseases that attack the culture and for the high destructive capacity and difficult control of the pathogens. The bacterial-spot, caused by species of the genus Xanthomonas (X. euvesicatoria, X. gardneri, X. vesicatoria and X. perforans), is one of the most important tomato diseases, affecting plant in any development stage, being able to occur in all aerial part, provoking reduction in quantity and quality of the production. To reduce the pathogen dissemination and to determine control measures in the cultivation areas, it is important that the pathogen detection in plants and seeds has been efficient. So, it is necessary to carry out analysis to detect bacteria in seeds, especially when the infection level or incidence is very low. The objective of this work was to develop detection and differentiation methods of Xanthomonas spp. in tomato seeds. A semi-selective medium was developed, constituted by dextrose (5,0 g/L), NaCl (5,0 g/L), KH2PO4 (1,4 g/L), K2HPO4 (3,6 g/L), meat extract (1,0 g/L), peptone (5,0 g/L), yeast extract (2,0 g/L), cefaclor (40,0 mg/L), nistatine (50,0 mg/L), benomyl (10,0 mg/L) and agar (14,0 g/L), wich showed low repressivity to the Xanthomonas spp. and moderate supressivity to the non-target microorganisms associated to tomato seeds and high sensibility, besides low cost. By PCR-RFLP of a rpoB gene fragment, it was possible to differentiate the species of the tomato bacterial-spot.

A mancha preta dos citros (MPC) é uma doença que limita a exportação de laranja brasileira para o Japão e países da Europa. Exceto para Citrus aurantium e seus híbridos, todas as outras variedades são susceptíveis ao patógeno. O fungo Guignardia citricarpa, descoberto por Kiely em 1948 em New South Wales na Austrália, é o estádio sexual do agente causal da MPC e a sua fase imperfeita é Phyllosticta citricarpa. Uma importante característica da MPC é seu longo período de latência. A infecção pode ser efetuada por ascósporos e picnidiósporos. A lesão nos frutos fica restrita ao flavedo (epicarpo), sendo que o fungo não infecta o albedo (mesocarpo). O albedo é rico em celulose, carboidratos solúveis, pectinas, compostos fenólicos (flavonóides), aminoácidos e vitaminas. Os compostos fenólicos presentes nas plantas são produtos do metabolismo secundário, e podem ser resultantes da interação planta-ambiente e podem sintetizados como resposta ao ataque de fitopatógenos. Os fenólicos presentes nos citros incluem flavonóides, antocianinas, coumarinas e psorolenos entre outros. Estes compostos podem exibir ação antimicrobiana e antiviral e podem contribuir controle da MPC. A aplicação de fungicidas é o método de controle da MPC. Uma outra possibilidade de controle seria a ativação de fatores de resistência através do uso de indutores bióticos (Saccharomyces cerevisiae) e abióticos (Bion e ácido salicílico). Deste modo, este trabalho teve como objetivos estudar os efeitos do uso de extratos aquosos, metanólicos e etanólicos de albedo de laranja na germinação formação de apressório e crescimento micelial de P. citricarpa in vitro, bem como avaliar o uso da indução de resistência para o controle da MPC através dos indutores S. cerevisiae, Bion e ácido salicílico em pós e pré-colheita em frutos de laranja ‘Pêra-Rio’ e folhas de limão ‘Siciliano’. Os resultados experimentais mostraram que os extratos de albedo, nas concentrações de 10 e 100 mg / mL de água, foram capazes de inibir em 100% a germinação, formação de apressório e o crescimento micelial de P. citricarpa. Foi observado que os extratos, dependendo da concentração, podem ter ação fungicida ou fungistática. No tocante a utilização de S. cerevisiae, Bion e ácido salicílico, aplicados em pós-colheita, foi observado que estes agentes não foram capazes de impedir o desenvolvimento de novas lesões em frutos de laranja ‘Pêra-Rio’. Também foi constatado que S. cerevisiae e Bion, aplicados em pré-colheita, não foram capazes de induzir resistência contra P. citricarpa em folhas de limão ‘Siciliano’ inoculadas previamente a campo com G. citricarpa. Nesse sentido, sugere-se que outros estudos sejam conduzidos, principalmente no que se refere ao uso potencial de extratos do albedo de laranja como medida alternativa de controle da MPC. / Black spot of citrus (CBS) has been a limiting factor in the export of brazilian oranges to Japan and European countries and Japan. Except for Citrus aurantium and its hybrids, all commercially growing Citrus spp. are susceptible to the pathogen. The fungus Guignardia citricarpa, discovered by Kiely in 1948 in New South Wales, is the sexual stage of the causal agent of CBS and Phyllosticta citricarpa is the imperfect stage. An important characteristic of CBS is the long latent period after infection. The infection is carried out by ascospores and pycnidiospores. The fungicidal application is the most important method of control of CBS. The CBS lesion in citrus fruits is limited to the flavedo, since P. citricarpa does not infect the albedo. The albedo is rich in cellulose, soluble carbohydrates, pectin, phenolic compounds, amino acids and vitamins. The phenolics present in the plants are secondary metabolic products and are believed to be produced as a result of the plant interaction with the enviromment and synthesized as a response to attempted phytopathogen attacks. The phenolics that occur in Citrus include flavonoids, anthocyanins, coumarins and psorolens. These compounds may exhibit antiviral and antimicrobial activities, and may contribute to the control of CBS disease. An another possibility to the CBS control is the activation of factors resistance by the use of abiotics (Bion and salicylic acid) and biotics (Saccharomyces cerevisiae) “plant defence activator” (inducers). Therefore, the objectives of this paper were to study the in vitro effects of aqueous, ethanolic and methanolic albedo orange extracts on the germination, appressorium formation and mycelial growth of P. citricarpa as well as to evaluate the use of the S. cerevisiae, Bion and salicylic acid as “plant defence activator” at post and preharvest conditions in fruit of “Pêra-Rio” and leaves of ’Siciliano’ lemon. The results showed that the use of albedo extracts, 10 and 100 mg per mL of water, inhibited 100 % the germination, appressorium formation and mycelial growth of P. citricarpa. It was also observed that the extracts of albedo, depending upon the concentration, exhibited fungicidal or fungistatic activity. The use of S. cerevisiae, Bion and salicylic acid at postharvest conditions did not affect the development of new lesions of CBS in ‘Pêra-Rio’ orange fruit. It was also observed that the use of S. cerevisiae and Bion at preharvest conditions, did not induce resistance against P. citricarpa in leaves of ‘Siciliano’ lemon naturally infected with G. citricarpa under field conditions. Thus, it is suggested that other studies be carried out, mainly regarding the potential of orange albedo’s extracts as a alternative method for CBS control.

A citricultura é uma atividade rural extremamente importante no contexto sócio-econômico brasileiro. A laranja representa 49% de toda a produção brasileira de frutas. Entretanto, anualmente milhares de toneladas de frutos são perdidas devido à ação de fitopatógenos. A Mancha Preta dos Citros (MPC) tem sido responsável por grandes prejuízos em várias regiões produtoras de citros no mundo, sendo designada como barreira fitossanitária, principalmente no mercado Europeu. Para o consumo in natura, a aparência dos frutos é fator essencial, onde a MPC compromete a comercialização de frutas frescas. O controle químico de patógenos de plantas é geralmente o mais utilizado para minimizar os danos causados pela MPC, apesar do uso de tais produtos implicar em altos custos, tanto para os agricultores com para o meio ambiente, causando contaminação do solo e da água e aumentando a pressão de seleção sobre a população do patógeno. Dessa forma, o controle biológico torna-se uma alternativa atrativa, como uma estratégia que permite um menor impacto ambiental aliado à proteção da planta contra o patógeno. No entanto, para sua aplicação, são necessários estudos relacionados à utilização de técnicas de biocontrole, como por exemplo, a utilização de microrganismos produtores de enzimas hidrolíticas. Tais enzimas, como as quitinases, endoglicanases e β- glicosidases têm a capacidade de digerir a parede celular de fungos e bactérias. Neste trabalho, 24 isolados de G. citricarpa foram avaliados quanto à sensibilidade aos fungicidas usados em campo para controle da doença: piraclostrobina e carbendazim, nas dosagens de 0,5; 1 e 2 mg i.a./mL, a fim de verificar o efeito da pressão de seleção causada pelo uso contínuo destes compostos. Dois dos isolados apresentaram resistência ao carbendazim em todas as dosagens testadas, indicando que o uso desse agroquímico pode selecionar mutantes resistentes, resultando na não eficiência deste produto no controle da MPC. Uma alternativa para minimizar este tipo de efeito seria a utilização deste composto em combinação com outros princípios ativos. As atividades celulolíticas e quitinolíticas de 96 isolados de fungos filogeneticamente distintos foram avaliadas para a seleção de potenciais agentes de controle biológico. Os quatro isolados que apresentaram maior atividade de cada uma destas enzimas, além de duas linhagens de Trichoderma, foram testados como potencial de biocontrole de G. citricarpa em um experimento com folhas laranja ‘Valência’, comparando a ação destes com a de fungicidas comerciais. Apesar de o melhor controle do patógeno ter sido observado em folhas tratadas com piraclostrobina, dois isolados fúngicos mostraram eficiência similar ao fungicida, inibindo o desenvolvimento de G. citricarpa, o que sugere a possibilidade de futura utilização de métodos de controle biológico para a Mancha Preta dos Citros. / Citriculture is an extreme important rural activity in social and economical national context in Brazil. Orange is 49% of total brazilian fruit production. However, thousands of tons are lost due to the action of phytopathogens annually. The Black Spot of Citrus (BSC) is responsible for great lost in various citrus producers regions all around the world, being already designed as a phytosanitary barrier, mainly in European market. For in natura fruit consuming, the fruit esthetic is a limiting factor, where BSC compromises the market of fresh affected fruits. Chemical control of plant pathogens is the most commonly way used to minimize damages in citriculture by BSC, although the application of such products implies in high costs, not only for farmers but also for environment, causing soil and water contamination and increasing the selection pressure on pathogen population. On this way, the biocontrol became an attractive way, as a strategy that permits a minor environmental impact besides the plant protection against phytopathogens. For this application, are necessary researches based on utilization of biocontrol techniques, as for example, the using of microorganism producers of hydrolytic enzymes. Such enzymes, like quitinases, endoglicanases and β-glicosydases are able to digest the fungal and bacterial cell wall. In this work, 24 strains of G. citricarpa were evaluated about the sensibility to fungicides used in field for BSC control: piraclostrobin and carbendazin, in dosages of 0,5, 1,0 and 2,0 mg a.i./mL, aiming to verify the effect of selection pressure caused by continuous use of this compounds. Two of these strains presented resistance to carbendazim in all evaluated dosages, showing that the use of this agrochemical may select resistant individuals, resulting a non-efficiency of this compound for BSC control. An alternative to minimize this kind of effect must be the application of this compound in combination to others active principles. The celullolitic and chitinollitic activities of 96 fungi strains widely spread phylogenetically were evaluated for selection of potential biological control agents. Four strains that presented major activity of each enzyme, besides two Trichoderma lineages, were tested as potential biological control of G. citricarpa in an experiment with ‘Valência’ orange leaves, comparing the action of these biocontrolers with commercial fungicides. Although a better pathogen control was achieved in leaves treated with piraclostrobin, two fungi strains revealed to have the similar efficiency to fungicide, inhibiting the development of G. citricarpa, suggesting the possible future utilization of biocontrol methods to Black Spot of Citrus.

O Brasil é líder absoluto no comércio internacional de suco de laranja concentrado congelado participando com 82% do volume comercializado no mundo. Guignardia citricarpa é um fungo Ascomiceto agente causal da Mancha Preta dos Citros (MPC), uma doença importante no contexto da Citricultura, causando lesões negras em frutos tornando-os impróprios para a exportação, já que não são aceitos na União Européia pois o patógeno é classificado como quarentenário. O presente trabalho teve como objetivo principal estabeler a metodologia de transformação genética de G. citricarpa para futuramente auxiliar no entendimento dos mecanismos de patogenicidade desta espécie, visando diminuir perdas na citricultura brasileira devido à MPC. Além disso, foi realizada uma análise do gene da enzima endopoligalacturonase, a qual está associada à capacidade de patógenos em colonizar plantas. Para elucidar esse fenômeno, foi realizada a busca de genes relacionados à patogenicidade em outros fungos fitopatogênicos previamente descritos e confirmados participarem no processo de doenças em diversas plantas. Considerando que esses genes possuem uma região conservada para esse fim, após o alinhamento dessas sequências foram construídos primers e o gene de endopoligalacturonase foi identificado no gênero Guignardia sp. Outra espécie pertencente a esse gênero é G. mangiferae, conhecida como endófito de citros, ou seja, coloniza os tecidos internos da planta hospedeira sem causar dano. Em análises enzimáticas foi observado que a quantidade de endopoligalacturonase produzida pela espécie patogênica é superior à da espécie endofítica, mostrando que essa enzima pode participar do processo de patogenicidade de G. citricarpa. Estudos para comprovar a participação de genes nos mecanismos de patogenicidade em diversas espécies utilizando reconhecimento de genes e genômica funcional, expressão e knockout de genes estão sendo realizados, permitindo uma visão geral da organização genômica do sistema patogênico. Pensando nisso, esse trabalho descreve pela primeira vez a metodologia de transformação genética de G. citricarpa via micélio e a obtenção de transformantes expressando a proteína verde fluorescente (GFP). Micélios do fungo foram transformados pelo sistema via Agrobacterium tumefaciens com o plasmídeo pFAT-gfp, contendo os genes de resistência à higromicina B (hgr) e da GFP. A otimização do protocolo de agrotransformação foi realizada a partir do teste de diferentes condições como: tipo de membrana, concentração de agente indutor e tempo de cocultivo. A melhor condição incluiu a utilização de membrana de éster de celulose; 200 PM de AS e 96 horas de co-cultivo. Os transformantes apresentaram alta estabilidade mitótica (82%) e tiveram a inserção do gene hgr confirmada por PCR e do gfp observada em microscopia óptica de epifluorescência. Além disso, foi acompanhado o desenvolvimento do fungo inoculado em frutos, mostrando a interação planta-patógeno. O estabelecimento do sistema de transformação por Agrobacterium para G. citricarpa possibilita o uso dessa ferramenta para estudos de mutagênese insercional e interrupção gênica visando a identificação de genes importantes, como os envolvidos com os mecanismos de patogenicidade utilizados por esse fungo. / Brazil is the world leader in the international trade of frozen orange juice concentrate, taking part with around 82% of the traded volume. Guignardia citricarpa (anamorph Phyllosticta citricarpa) is a fungal pathogen of citrus plants, being described as the causal agent of citrus black spot (CBS), one of the most important fungal diseases of citrus worldwide. Its symptoms are black lesions on fruit, making them unsuitable for the international fresh market, since they are included in the quarantine list of the European Plant Protection Organization (EPPO). Moreover, when the disease is severe it may cause extensive premature fruit drop that reduces yields of fruit for processing. Taking this into consideration, the current work aimed to improve the understanding on the pathogenic mechanisms of this fungus. Firstly, in an attempt to elucidate this phenomenon, it was performed a search for pathogenicity genes previously reported to some pathogenic fungi and confirmed to participate in the process of infection in many plants , especially endopolygalacturonase. Primers were designed using the conserved regions of the genes and allowed the identification of the Guignardia spp. endopolygalacturonase gene for the first time. This enzyme has been described as playing important role in the process of fungal diseases in plants. In the present work, enzymatic analysis showed that the pathogen G. citricarpa produced significantly greater amounts of endopolygalacturonase when compared to G. mangiferae, a closely related fungus described as a citrus endophyte. This result suggests that this enzyme may participate in the process of pathogenicity, characteristic of the pathogenic species. Genetic transformation methods have been used to prove the involvement of genes in pathogenic mechanisms, however, a suitable methodology for G. citricarpa has not been described yet. In this way, this study describes for the first time a methodology for genetic transformation of G. citricarpa via mycelia and the successful generation of transformants expressing the green fluorescent protein (GFP) and resistant to the hygromycin B antibiotic. Mycelia of the fungus were genetically transformed via Agrobacterium tumefaciens hosting the plasmid pFAT-gfp, which carries the genes for resistance to hygromycin B (hph) and for GFP (gfp). The protocol was optimized through different test conditions (type of membrane, concentration of the inducing agent acetosyringone and duration of the co-cultivation period). The higher transformation efficiencies were observed using cellulose ester membrane, 200 PM of acetosyringone and 96 hours of cocultivation. The transformants showed high mitotic stability (82%) and the insertion of the T-DNA was confirmed by PCR and GFP expression through epifluorescence microscopy observation. Moreover, it was observed the development of the fungus in inoculated oranges, showing the plant-pathogen interaction observed by epifluorescense microscopy. The establishment of the Agrobacterium-mediated transformation system for G. citricarpa represents an important step on the search for unveiling important genes of this fungus, such as those involved in the pathogenic mechanisms.

A ocorrência de doenças em soja tem aumentado nos últimos anos, provocando grandes perdas em plantios comerciais e exigindo respostas rápidas da pesquisa para desenvolvimento e aplicação de técnicas de controle. Mais de 40 doenças afetam a cultura da soja em todo o mundo e dentre elas estão a ferrugem asiática (Phakopsora pachyrhizi Sydow) e a septoriose ou mancha parda (Septoria glycines Hemmi). Estas doenças estão disseminadas em praticamente todas as regiões produtoras de soja do Brasil. Os objetivos desse trabalho foram mapear o gene que confere resistência a P. pachyrhizi presente na cultivar de soja FT-2 e QTLs envolvidos na resistência a S. glycines, utilizando uma população de plantas F2 derivada do cruzamento entre as cultivares FT-2 (resistente) e Davis (suscetível). Marcadores microssatélites foram testados nos genitores, sendo os polimórficos utilizados para genotipar as plantas da geração F2. Progênies F3:2 e F4:2 foram obtidas e avaliadas para reação às doenças. Para a ferrugem da soja foram detectados cinco marcadores associados ao caráter, sendo que dois deles (Satt079 e Satt307) flanqueiam o gene dominante de resistência, que foi mapeado no grupo de ligação C2 da soja. Uma eficiência de seleção de 100% foi obtida com o uso simultâneo destes dois últimos marcadores, indicando que os mesmos podem ser ferramentas úteis para a seleção assistida de genótipos homozigóticos resistentes. Para a mancha parda, análises de regressão e de variância foram realizadas para identificar associações significativas entre marcadores e QTLs devido a efeitos aditivos e não aditivos do caráter. Foi realizado, também, o mapeamento por intervalo dos QTLs. As análises de regressão detectaram maior número de marcadores ligados a QTLs do que o mapeamento por intervalo; houve concordância entre os resultados dos dois métodos em apenas um caso, no qual o marcador Satt277, pertencente ao grupo de ligação C2, foi relacionado significativamente ao caráter. / The occurrence of soybean diseases that causes large yield losses in commercial fields has increased in recent years forcing research to face the challenge of providing quick responses to develop control techniques. More than 40 diseases affect soybeans worldwide, among them the Asian rust (Phakopsora pachyrhizi Sydow) and brown spot (Septoria glycines Hemmi). These diseases are spread in practically all Brazilian soybean cropping areas. The objectives of this work was to map the resistance gene to P. pachyrhizi and the QTLs involved in the resistance to S. glycines in the soybean cultivar FT-2, using an F2 plant population derived from the cross between FT-2 (resistant) and Davis (susceptible). SSR markers were tested in the parents and those showing polymorphism were used to screen plants of the F2 generation. F3:2 and F4:2 progenies were evaluated for disease reaction. Five markers associated to soybean rust resistance were detected and two (Satt079 and Satt307) are flanking a dominant resistance gene that was mapped in the C2 soybean linkage group. An efficiency of 100% was obtained with the simultaneous use of those markers for selection, which indicated that they could be useful in marker-assisted selection of resistant homozygous genotypes. For brown spot resistance, regression analyses and ANOVAs were performed to identify significant associations between markers and resistance QTL’s showing additive and non-additive effects. The interval mapping of the QTL’s was also performed. The regression analyses detected more markers linked to QTL’s than the interval analyses. Only the Satt277 marker (soybean linkage group C2) was significantly associated to the trait by both detection methods.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The culture of pecan [Carya illinoinensis (Wangenh.) K. Koch] has presented greater economic importance in southern Brazil in recent decades, thus increasing the planted area, mainly in the states of Rio Grande do Sul (RS), Santa Catarina (SC) and Paraná (PR). However, despite the increasing growth of planted area, little research related to diseases in culture and breeding aimed at obtaining cultivars resistant to diseases, have been held in the country. The occurrence of leaf spot symptoms caused by Cladosporium spp. was observed in field in three southern states of Brazil. Given this observation, the general objective of this study was to evaluate the morphological and molecular variability of Cladosporium spp. isolates associated with leaf spot in pecan, checking its distribution in southern Brazil, as well as selecting resistant cultivars as a way to control the disease. The specific objectives were established as follows: a) To identify the species of Cladosporium spp. causing leaf spot in pecan orchards coming from producing areas of the three southern states of Brazil; b) To verify the diversity and morphological and genetic variability, by sequencing elongation factor (TEF - 1α) region, isolates of Cladosporium spp. from pecan plants with symptoms of leaf spot; c) To select efficient morphological characters for separation of isolated groups according to the species to which they belong; d) To confirm the pathogenicity of Cladosporium spp., as well as quantify the incidence and severity of leaf spot in Shawnee‟ and Barton‟ cultivars. For this, leaf samples were taken in 16 symptomatic pecan orchards to the isolation of the pathogen in the states of Paraná, Santa Catarina and Rio Grande do Sul. The isolates were characterized morphologically using mycelial growth, sporulation, colonies pigmentation, conidia and ramoconidia dimensions. These variables were used in the UPGMA analysis in which the isolates were grouped in a dendrogram according to genetic similarity and established characters that contributed most to the divergence. The analysis of 40 isolates by means of morphological and genetic analysis, sequencing of genes from the elongation factor TEF-1α confirmed that the species C. cladosporioides (21 isolates), C. pseudocladosporioides (18 isolates) and C. subuliforme (only one isolate) associated with leaf spot. The region of the elongation factor (TEF-1α) is efficient to identify and group the species associated with pecan included in the C. cladosporioides complex and sporulation is an important morphological characteristic to differentiate the species of Cladosporium spp. All 40 isolates were pathogenic to cultivars Barton‟ and Shawnee‟. The two cultivars were considered susceptible to leaf spot for the three species of Cladosporium spp. tested and there is susceptibility difference for C. pseudocladosporioides, where 'Shawnee' showed greater severity of disease in relation to 'Barton'. / A cultura da nogueira-pecã [Carya illinoinensis (Wangenh.) K. Koch] tem apresentado maior importância econômica no sul do Brasil nas últimas décadas, aumentando assim a área plantada, principalmente nos estados do Rio Grande do Sul (RS), Santa Catarina (SC) e Paraná (PR). No entanto, apesar do aumento crescente das áreas plantadas, poucas pesquisas relacionadas a doenças na cultura e ao melhoramento genético visando a obtenção de cultivares resistentes a doenças, têm sido realizadas no país. A ocorrência de sintomas de mancha foliar causada por Cladosporium spp. foi observada a campo nos três estados do sul do Brasil. Diante dessa observação, o objetivo geral do presente trabalho foi verificar a variabilidade morfológica e molecular de isolados de Cladosporium spp. associados à mancha foliar em nogueira-pecã, verificando sua distribuição na região sul do Brasil, bem como selecionar cultivares resistentes como forma de controle para a doença. Como objetivos específicos foram estabelecidos os seguintes: a) identificar as espécies de Cladosporium causadoras de mancha foliar em pomares de nogueira-pecã procedentes de regiões produtoras dos três estados do sul do Brasil; b) verificar a diversidade e a variabilidade morfológica e genética, através do sequenciamento da região do fator de elongação (TEF 1α), de isolados de Cladosporium spp. provenientes de plantas de nogueira-pecã com sintomas de mancha foliar; c) selecionar caracteres morfológicos eficientes para a separação dos isolados em grupos, de acordo com a espécie a que pertencem; d) confirmar a patogenicidade de isolados de Cladosporium spp., bem como quantificar a incidência e severidade da mancha foliar nas cultivares Barton‟ e Shawnee‟. Para isso, foram realizadas coletas de folhas sintomáticas em 16 pomares de nogueira-pecã para o isolamento do patógeno, nos estados do PR, SC e RS. Os isolados foram caracterizados morfologicamente através do crescimento micelial, esporulação, pigmentação das colônias, dimensões de conídios e ramoconídios. Essas variáveis foram utilizadas na análise UPGMA em que os isolados foram agrupados em um dendrograma de acordo com a similaridade genética e, estabelecidos os caracteres que mais contribuíram para a divergência. A análise dos 40 isolados através das características morfológicas e da análise genética, a partir do sequenciamento dos genes do fator de elongação TEF-1α, confirmaram as espécies C. cladosporioides (21 isolados), C. pseudocladosporioides (18 isolados) e C. subuliforme (apenas um isolado) associadas à mancha foliar. A região do fator de elongação (TEF-1α) é eficiente para identificar e agrupar as espécies associadas à nogueira-pecã incluídas no complexo C. cladosporioides e a esporulação é uma importante característica morfológica para diferenciar as espécies de Cladosporium spp. Todos os 40 isolados foram patogênicos às cultivares Barton‟ e Shawnee‟. As duas cultivares foram consideradas suscetíveis à mancha foliar para as três espécies de Cladosporium spp. testadas e existe diferença de suscetibilidade para C. pseudocladosporioides, onde a Shawnee‟ apresentou maior severidade da doença em relação a Barton‟.

This study explores the intersection of the philosophy of Martin Heidegger and Spanish literature. The study examines the Heideggerian authenticity and inauthenticity of two characters in the literature: Melibea in La Celestina by Fernando de Rojas and Grisóstomo in Don Quijote de la Mancha by Miguel de Cervantes. Heidegger’s concept of authenticity is the ability of the individual to live in the world according to her own desires, outside of the influence of others. Both die by suicide, but Melibea is an authentic character in Heideggerian terms and Grisóstomo is inauthentic. At the end of her life, Melibea has resolved all anxiety into resoluteness and is determined to live life in her own terms. Grisóstomo, however, dies inauthentically, full of anxiety and subject to the will of Others. He never leaves the influence of others to live a life of his own determination.