O presente estudo foi realizado para esclarecer o surgimento de vesículas subepidérmicas em enxertos de pele comumente descritos como áreas enxertadas. Devido à discrepância existente entre a literatura, que afirma surgirem vesículas nessas áreas, e a nossa experiência clínica, onde não observamos tal fato, decidimos investigar o problema. Para isso, estudamos a transição dermoepidérmica (TDE), em 23 pacientes submetidos à enxertia de pele, para verificar se há ou não alteração dessa estrutura que pudesse justificar a formação de vesículas. Nos 23 pacientes estudados foram feitas duas biópsias: a primeira, imediatamente antes da excisão do enxerto, na área doadora - pele sã, considerada como amostra padrão normal da TDE - Amostra Padrão AD. Após 10 dias, realizou-se uma segunda biópsia, com o mesmo vazador, próxima à área da primeira biópsia - Amostra Teste - ENX. Cada amostra foi dividida em 2 partes iguais (46 amostras) e estudadas por microscopia de luz e por imunofluorescência direta (imunomapeamento), pesquisando-se a possível alteração da zona da membrana basal (ZMB) na TDE através dos antígenos penfigóide bolhoso, laminina, colágeno IV e colágeno VII. Na microscopia de luz estudou-se, em cada biópsia, a relação entre a medida linear do relevo da trasição dermoepidérmica e a medida linear do relevo da superfície da camada granulosa, logo abaixo da camada córnea, equivalente a medida linear da superfície da pele. Nas 46 amostras as análises por microscopia de luz e de imunomapeamento para os quatro antígenos evidenciou-se a manutenção do mesmo padrão morfológico. Não houve diferença no imunomapeamento. Observou-se relações lineares das medidas com médias de 1,17 para a amostra AD e 1,44 para a amostra ENX, diferença que foi estatisticamente significativa, porém conservando a manutenção do padrão da TDE em relação à pele normal. Foi observada a manutenção do padrão do relevo da TDE no enxerto, em relação à pele sã, doadora. / SUMMARY: The present study has been done to elucidate the onset of subepidermal blisters in skin grafts, usually mistaken as grafted sites. Due to the discrepancy between literature - assigning this onset of blisters in grafts and our experience opposite we have decided to carry out this study. To do so we have studied the dermal-epidermal junction in 23 burned patients who underwent skin grafting so that we could verify whether or not there could be any alteration in the dermal-epidermal junction structure that may explain this fact. Among the 23 studied patients, two biopsies were carried out: the first one just before harvesting the skin graft from donor site healthy skin. The so called sample was regarded as an ordinary standard one of the dermal-epidermal junction STANDARD SAMPLE - DS. After graft take, by ten days, a second biopsy was performed with the same punch, close to the first biopsy TEST SAMPLE GS. Both samples were split into two equal parts (46 samples) and studied using light microscopy and direct immunofluorescence (immune mapping), searching for possible alterations in basement membrane zone in the dermal-epidermal junction through bullous pemphigoid, laminin and types IV and VII collagen antigens. On light microscopy, relation between the linear measure of dermal-epidermal junction projection and that of stratum granulosum surface, just underneath the stratum corneum, corresponding to skin surface, was studied in each biopsy. The four analyses of the antigens by light microscopy and direct immunofluorescence in the 46 samples clearly showed the keeping of the same pattern, either for STANDARD SAMPLE DS or TEST SAMPLE GS. There were no differences on the immune mapping. Regarding the relation of the linear measures it was noted a mean of 1.17 for STANDARD SAMPLE DS and a mean of 1.44 for TEST SAMPLE GS. Such difference was statistically significant. Nevertheless, it maintained the keeping of the same pattern of dermal-epidermal junction when compared to healthy skin.

O gene AGT1 do locus mal1g, do sistema de transporte de maltose de S. cerevisiae, codifica uma proteína de 67 kDa, que tem 75% de similaridade e 58% de identidade com o transportador de maltose do locus MAL1. Sua expressão é ativada por genes reguladores constitutivos do sistema MAL, e é reprimida pela glicose. A cepa AP68-7A carrega o gene AGT1, e possivelmente o gene transportador MAL31, e transporta trealose ao final da primeira fase de crescimento anaeróbico. SDS-PAGE comparando proteínas de membranas de células reprimidas pela glicose (taxa de transporte <0,5 U/mg), com aquelas de células induzidas por α-metilglicosídeo (taxa de transporte de ~35 U/mg), verificou-se 2 bandas (PMs 57 e 66 kDa) exclusivas em membranas de células induzidas. As 2 bandas foram isoladas por três métodos diferentes (cromatografia de troca iônica, lavagens da membrana com tampão de alta força iônica e cromatografia de afinidade) e testadas para ligação de 14C-trealose. A ligação foi enriquecida ~3 X após a cromatografia de troca iônica. O transporte de trealose na cepa AP77-4C (que não tem nenhum dos genes transportadores dos loci MAL) foi recuperado após sua transformação com plasmídeo YEp366-AGT1. De membranas plasmáticas destas células (transporte de trealose ~25 U/mg) foram isoladas por cromatografia de afinidade, 2 bandas cujos PMs em SDS-PAGE são idênticos aos das proteínas isoladas das membranas da cepa AP68-7A. Estes resultados permitem concluir que o transportador de trealose de leveduras é codificado pelo gene AGT1. / The AGT1 gene presente in the mal1g locus from S. cerevisiae maltose transport system encodes a 67 kDa protein which shares 75% similarity and 58% identity with the maltose transporter protein encoded in MAL6 locus. The expression of this gene is regulatory genes from MAL system and is repressed by glucose. The strain AP68-7A which harbors the AGT1 gene and probably the MAL31 transporter gene, expresses trehalose transport activity at the end of first anaerobic growth. The comparison from the SDS-PAGE of membrane proteins from glucose repressed cells (trehalose transport activity of <0.5 U/mg), and α-methylglucoside induced cells (trehalose transport activity of ~35 U/mg), revealed 2 bands (Mr 57 and 66 kDa) present only in the induced cells membranes. Those bands were isolated by 3 different methods (ionic exchange chromatography, high strength ionic washes and affinity chromatography, and tested for 14C-trehalose binding. Both bands bind trehalose and this activity was enriched about 3 times after the ionic exchange chromatography. The trehalose transport activity was recovered by strain AP77-4C, (which does not harbor any MAL transporter gene) after its transformation with a plasmid containing the AGT1 gene. From the membranes of these cells (trehalose transport activity of ~25 U/mg) 2 bands were isolated by affinity chromatography with similar Mrs to those isolated from AP68-7A strain. The results permit to conclude that the AGT1 gene encodes the yeast trehalose transporter.

Este trabalho aborda um estudo detalhado sobre o sistema digestivo da cigarrinha sugadora de xilema, Bucephalogonia xanthophis (Hemiptera: Cicadellidae), num enfoque morfofuncional. Sob o ponto de vista anatômico, o sistema digestivo é constituído, como na maioria dos insetos, por três regiões: o intestino anterior, o intestino médio e o intestino posterior. O intestino anterior é formado por um tubo simples, o esôfago, sem qualquer diferenciação anatômica. O intestino médio tem início na câmara de filtração (CF) e segue por um ventrículo com dois domínios, o cônico (VC) e o tubular (VT), retornando para a câmara de filtração. A CF é uma estrutura característica principalmente de insetos sugadores de xilema de uma infraordem da ordem Hemiptera, a Cicadomorpha, e consiste na aposição entre o intestino médio anterior com o posterior, além dos segmentos proximais dos quatro túbulos de Malpighi. A função da CF é permitir a passagem do excesso de água presente no xilema diretamente do intestino médio anterior para o posterior, concentrando, assim, seus nutrientes no ventrículo. O sistema digestivo continua por um intestino posterior, apresentando, antes de terminar no ânus, um reto dilatado, ao qual se associam as extremidades distais dos quatro túbulos de Malpighi, livres na hemocela. Análises por microscopia de luz revelaram que o intestino anterior é formado por um epitélio simples, composto por células pavimentosas revestidas por cutícula. O epitélio da CF é bastante fino e não há diferenças significativas entre as células do ventrículo e dos túbulos de Malpighi. O VC e o VT são compostos por células cúbicas, os enterócitos, e células regenerativas. A transição do intestino médio para o posterior, denominada de piloro, ocorre no interior da CF. Nesta região, inserem-se os quatro túbulos de Malpighi, órgãos do sistema excretor. O intestino posterior é formado por um epitélio pavimentoso, recoberto por uma camada de quitina. Observadas através da microscopia eletrônica de transmissão, as células da CF possuem sua superfície apical modificada em microvilosidades e a membrana plasmática basal com invaginações desenvolvidas associadas a mitocôndrias, além de um citoplasma bastante reduzido. Estas características sugerem que se trata de células especializadas no transporte de água e íons, provavelmente a partir do intestino médio para os túbulos de Malpighi. O VC e o VT são formados por enterócitos e células regenerativas. Estas últimas são raras, estão localizadas na base do epitélio, sem formar agrupamentos (ninhos), e possuem características típicas de células indiferenciadas, com núcleos grandes e poucas organelas. Os enterócitos, as células mais importantes no processo digestivo, possuem sua membrana plasmática apical modificada em microvilosidades e invaginações da membrana plasmática basal, menos desenvolvidas do que as das células do CF. No que diz respeito à atividade de secreção observada nos enterócitos de B. xanthophis, verifica-se a existência de grandes quantidades de retículo endoplasmático granular, diversas áreas de Golgi e algumas vesículas de secreção concentradas no citoplasma apical. Parece haver apenas um mecanismo de secreção, o merócrino, ao longo de todo o ventrículo. No lúmen do ventrículo de B. xanthophis, não foi constatada a presença de uma membrana peritrófica, comum em insetos de diversas ordens, exceto Hemiptera e Thysanoptera. Ao invés disso, nas regiões do VC e nos dois terços iniciais do VT (o ventrículo tubular anterior VTA e o médio VTM), se observa um complexo sistema luminal de membranas associado às microvilosidades dos enterócitos, formando padrões em forma de chama, sendo denominados de membranas luminais em forma de chama (MLC). Este sistema se origina, aparentemente, a partir de constrições das extremidades das microvilosidades que formando membranas que avançam pelo lúmen ventricular, mantendo-se associadas às microvilosidades. Originalmente, acreditava-se que os insetos das ordens Hemiptera e Thysanoptera possuíam um sistema luminal de membranas associadas às microvilosidades, denominado de membranas perimicrovilares (MPM). Este modelo foi considerado como padrão para a ordem Hemiptera, sendo descrito, principalmente, em espécies da subordem Heteroptera. Estudos posteriores com o afídeo Acyrthosiphon pisum, revelaram um sistema luminal de membranas diferente das MPM, que foi denominado, na ocasião, de membranas perimicrovilares modificadas (MPMm). A ocorrência de um novo tipo de organização deste sistema luminal de membranas, as MLC, evidencia uma possível diversidade de tipos de organização destas membranas em Hemiptera. Acredita-se, com base nas características destes sistemas luminais de membranas, que as MLC sejam equivalentes às MPM e às MPMm. Preparações deste material utilizando o lantânio como traçador, revelaram que o MLC forma, aparentemente, compartimentos fechados. A descoberta de um terceiro sistema de organização de membranas em B. xanthophis, que difere significativamente das MPM e das MPMm, abre uma nova discussão sobre o panorama atual da morfofisiologia digestiva da ordem Hemiptera, que pode fornecer subsídios importantes no sentido de melhor compreender as relações filogenéticas entre os grupos de espécies que compõem esta ordem. Com base nos resultados obtidos neste e em outros trabalhos sobre a organização do sistema digestivo dos Hemiptera, fica evidente a importância de estudos mais abrangentes, sob este ponto de vista, envolvendo outras espécies integrantes das diferentes subordens de Hemiptera. Do mesmo modo, um maior detalhamento das funções exercidas por estes sistemas luminais de membrana mostra-se de extrema importância para uma melhor compreensão dos processos digestivos que ocorrem nestes insetos. / This work presents a detailed study concerning the digestive system of the xylem-sucking sharpshooter Bucephalogonia xanthophis (Hemiptera: Cicadellidae), in a morphofunctional approach. In the majority of insects, three anatomical regions constitute the digestive system: the foregut, the midgut, and the hindgut. A simple tube, the esophagus, without any anatomical differentiation, forms the foregut. The midgut starts in the filter chamber (FC) and proceeds in a ventriculum with two domains, the conical one (CV) and the tubular one (TV), returning to the filter chamber. The FC is a structure normally found in the xylem-sucking insects of the infraorder Cicadomorpha. It is formed by the apposition between the fore-midgut and the hind-midgut, along with the proximal segments of the four Malpighian tubules. The function of the FC is to allow the passage of the excess of water in the xylem directly from the fore-midgut to the hind-midgut, concentrating its nutrients in the mid-midgut. The digestive system proceeds through a hindgut, presenting, before ending in the anus, a dilated rectum, to which the distal ends of the Malpighian tubules associate. Light microscopy analysis revealed that the midgut is formed by a simple epithelium, composed of flattened cells covered by a cuticle. The epithelium of the FC is very thin and there are no significant differences between ventricular cells and Malpighian tubule cells. Cubic enterocytes and regenerative cells compose the CV and TV. The transition between the midgut and the hindgut occurs inside the FC and is called pylorus, where four Malpighian tubules insert, presenting excretory function. The hindgut is made up by flattened cells, covered by a layer of chithin. Observed by transmission electron microscopy, the FC cells have a reduced cytoplasm with their apical surface modified into microvilli, whereas the basal plasma membrane presents several invaginations associated with mitochondria. These features suggest that these cells are specialized in the transport of water and ions, probably from the midgut to the Malpighian tubules. The CV and TV are formed by enterocytes and regenerative cells. The latter are very rare and are localized at the base of the epithelium, without forming clusters (nests or nidi), and have typical undifferentiated cell features, such as large nuclei and few organelles. The enterocyte, the most important cell type in the digestive process, have their apical plasma membrane modified into microvilli and basal plasma membrane showing infoldings, less developed than the FC cells. The B. xanthophis enterocytes exhibit signs of secretory activity, with large amounts of rough endoplasmic reticulum, many Golgi areas and some secretory vesicles mainly clustered in the apical cytoplasm. This secretory vesicles seems to be eliminated by a merocrine secretion process throughout the ventriculum. In the ventricular lumen of B. xanthophis, a peritrophic membrane, observed in most insects other than Hemiptera and Thysanoptera, is note presente. Instead, in the CV and the two initial thirds of the TV (the anterior tubular ventriculum ATV and the medium tubular ventriculum MTV), a complex luminal membrane system associated with the enterocyte microvilli can be detected, forming flame-like patterns, named flame-like luminal membranes (FLM). This system originates, apparently, from constrictions of the microvillar tips, which form membranes that projects into the ventricular lumen, keeping their association with the microvilli. Formerly, it was assumed that Hemiptera and Thysanoptera insects have a luminal membrane system associated with the microvilli, called permicrovillar membranes (PMM). This membrane system was considered as a structure present in the whole order Hemiptera, mainly in Heteroptera suborder species. Posterior studies with the aphid Acyrthosiphon pisum, revealed the occurrence of a luminal membrane system very different from the PMM model. This system was called modified perimicrovillar membranes (MPM). The occurrence of a new kind of luminal membranes system, the FLM, suggests the existence of a not yet described diversity in these luminal membranes organizations in Hemiptera. Thus, it is assumed that FLM, PMM and MPM are probably homologous luminal membranes systems with similar function roles. The use of lanthanum as a tracer revealed that the FLM forms, apparently, closed compartments, as postulated to PMM. The discovery of a third type of luminal membrane organization system in B. xanthophis, which differs significantly from PMM and MPM, opens a new discussion concerning the actual origin and function of these complex luminal membranes system in the digestive system of Hemiptera. More detailed studies of the occurrence of different types of luminal membranes systems in Hemiptera species, may improve the knowledge about the phylogenetic relationships among the several groups, which constitutes this order. Furthermore, the actual role of the luminal membranes system in the digestive process has to be investigated in detail.

O sorotipo O125ac:H6 compreende amostras de Escherichia coli enteropatogênica atípicas que apresentam o padrão de adesão agregativa (AA) em células HEp-2. A construção de um banco de mutantes da amostra protótipo Ec292/84 com o transposon TnphoA gerou quatro mutantes não aderentes. O objetivo deste estudo foi a caracterização genotípica e fenotípica desses mutantes. As regiões adjacentes à inserção do TnphoA no mutante Ec2921/84::01 foram amplificadas, clonadas e seqüenciadas, revelando que a inserção do TnphoA ocorreu no gene secD, parte do sistema de secreção de proteínas do tipo 2 (SST2). O perfil de proteínas de membrana externa (OMP) dos mutantes, em comparação com a amostra selvagem, revelou a ausência de proteínas de 21 e 30 kDa nos mutantes. Um antissoro obtido contra o extrato de OMP da amostra protótipo inibiu o padrão AA e reconheceu a proteína de 30 kDa em immunoblottings com extratos de OMP. Esses dados indicam que esta proteína está envolvida no estabelecimento do padrão AA de E. coli O125ac:H6 e que essa proteína é transportada através do SST2. / The serotype O125ac:H6 comprises atypical Enteropathogenic Escherichia coli strains that express the aggregative adherence (AA) pattern to HEp-2 cells. We obtained four nonadherent mutants using TnphoA insertion in the Ec292/84 strain. The aim of this study was the genetic and phenotypic characterization of these mutants. The genetic analysis of the mutants revealed that the insertion of TnphoA ocurred in the secD gene, part of the bacterial type 2 secretion system (T2SS). The mutant outer membrane proteins (OMP) profile, in comparison to the prototype strain, demonstrated the lack of expression of proteins of 21 and 30 kDa in the mutant profile. An antiserum raised against the OMP extract of the prototype strain, in addition to inhibit the AA pattern, recognized the 30 kDa protein in immunoblotting assays with OMP extract. These data indicate this OMP is involved in the establishment of the AA pattern presented by the atypical EPEC strains of the O125ac:H6 serotype, and that this protein is transported via the T2SS.

A membrana amniótica é a camada interna das membranas fetais (placenta), amplamente utilizada em transplantes por ser um tecido que combina propriedades anti-inflamatórias, antimicrobianas e antifibróticas, além da limitada capacidade de provocar reações imunológicas. O uso da membrana fresca tem algumas limitações, como a necessidade de rápida utilização e a impossibilidade de obter total segurança diante de certas infecções. Qualquer tecido biológico utilizado para transplante deve ser estéril. A radioesterilização é uma alternativa para garantir a qualidade e segurança dos tecidos usados em transplantes e outras aplicações clínicas, a fim de minimizar os riscos de contaminação do receptor do tecido, porém a mesma pode causar alterações indesejáveis no tecido. No presente trabalho, foram testadas doses de 10, 15, 25 e 35 kGy, utilizando duas fontes de radiação ionizante: raios gama proveniente de fonte de Cobalto-60 e feixe de elétrons. Na análise qualitativa visual e táctil foi observado que, nas doses mais elevadas (a partir de 25 kGy) para ambas as fontes de radiação, as membranas irradiadas sofreram maior alteração de cor, tornando-se mais amareladas e com diminuição da elasticidade, deixando-as mais rígidas. A colorimetria sólida possibilitou minimizar a subjetividade da análise visual e a microscopia óptica foi essencial para avaliar as alterações histológicas comprovando, respectivamente, que a alteração de cor da membrana e o grau de degradação das camadas subjacentes do tecido tem relação direta com a dose de radiação empregada. Desse modo, as doses de 10-35 kGy podem ser aplicadas nas membranas amnióticas para sua utilização como bandagem biológica, porém, para as doses a partir de 25 kGy deve-se levar em consideração a alteração de coloração e condensação das camadas da membrana se estas forem destinadas para o uso oftálmico ou como substrato transportador para transplante de tecido cultivado in vitro. Com as técnicas de OCT, TG e ensaio de tração não foi possível avaliar as alterações biomecânicas encontradas na análise qualitativa, nas condições experimentais realizadas devido aos desvios-padrão obtidos para as cinco membranas testadas. / The amniotic membrane is the inner layer of the fetal membranes (placenta), widely used in transplantation as it is a tissue that combines properties anti-inflammatory and antifibrotic antimicrobial, and limited ability to induce immune reactions. The use of fresh membrane has some limitations such as the need for rapid deployment and not being completely safe against of certain infections. Any biological tissue used for transplantation should be sterile. The radiosterilization is an alternative to ensure the quality and safety of tissues used in transplants, and other clinical applications to minimize the risk of contamination of the tissue´s receptor, but it can cause undesirable changes in the tissue. In this study, we tested doses of 10, 15, 25 and 35 kGy, using two sources of ionizing radiation: gamma rays from cobalt-60 source and electron beam. In qualitative, visual and tactile analysis it has been observed that higher doses (25 kGy and up, to both sources of radiation) irradiated membranes had a greater color change, becoming yellowed and decreased elasticity, becoming more rigid. The solid colorimetry minimized the subjectivity of visual analysis and optical microscopy was essential to evaluate the histological changes showing, respectively, the color change of the membrane and the degree of degradation of the underlying layers of tissue is directly related to the dose of radiation employed. Thus, doses of 10-35 kGy can be applied in the amniotic membranes for application as a biological bandage, however doses from 25 kGy and up should take into account the changes in color and condensation of the layers of the membrane for ophthalmic use or as a carrier substrate for transplantation of cultured tissue in vitro. With the techniques of OCT, TG and tensile testing was not possible to evaluate the biomechanical findings in the qualitative analysis, the experimental conditions due to the standard-deviations obtained for the five membranes tested.

O princípio da regeneração tecidual guiada (RTG) baseia-se na utilização de membranas biocompatíveis com a finalidade de impedir a migração dos tecidos conjuntivo e epitelial para a ferida, permitindo que células do ligamento periodontal repovoem a superfície radicular e regenerem o aparato de inserção do dente. A RTG tem sido utilizada em diversas situações clínicas para facilitar o reparo de defeitos ósseos e periodontais, sendo as membranas de politetrafluoretileno expandido (e-PTFE) as mais utilizadas. O objetivo deste estudo foi avaliar a biocompatibilidade in vitro de uma nova membrana do compósito de poli(vinilideno-trifluoretileno)/titanato de bário (P(VDF-TrFE)/BT). Para isso, osteoblastos, fibroblastos e queratinócitos, células com as quais a membrana entrará em contato durante o processo de RTG, foram cultivados sobre membranas de P(VDF-TrFE)/BT e PTFE (controle). Os seguintes parâmetros foram avaliados: 1) adesão celular por contagem em hemocitômetro; 2) proliferação celular por MTT e 3) adesão e morfologia celular por fluorescência, para as linhagens osteoblástica, fibroblástica e de queratinócitos; 1) medida do conteúdo de proteína total; 2) medida da atividade de fosfatase alcalina (ALP) e 3) formação de matriz mineralizada, para as linhagens osteoblástica e fibroblástica; 1) imunolocalização de ALP por fluorescência; 2) detecção histoquímica in situ da atividade de ALP e 3) expressão dos genes Runx2, Colágeno I (COL I), Ostepontina (OPN), ALP, Sialoproteína óssea (BSP), Osteocalcina (OC), Bax, Bcl-2 e Survivina (SUR) por PCR em tempo real, para a linhagem osteoblástica; 1) expressão dos genes Periostin (PRT), Periodontal Ligament Specific 17 (PDLs17), Calcium-binding protein (S100A4), Fibromodulina (FBM), Bax, Bcl-2 e SUR por PCR em tempo real, para a linhagem fibroblástica e 1) expressão dos genes Involucrina (IVL), Queratina 1 (QRT-1), Queratina 10 (QRT-10), Queratina 14 (QRT-14), Bax, Bcl-2 e SUR por PCR em tempo real, para a linhagem de queratinócitos. Os dados quantitativos foram submetidos ao teste estatístico Mann-Whitney (nível de significância: 5%). A adesão de células osteoblásticas foi semelhante entre P(VDF-TrFE)/BT e PTFE em 30 min, 2 e 4 h (p>0,05). A proliferação de células osteoblásticas foi maior em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 1, 7 e 10 dias (p<0,05). A epifluorescência indicou que as células osteoblásticas estavam aderidas e mais espraiadas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 30 min, 4 e 24 h. A imunofluorescência revelou presença de ALP apenas em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 7 e 14 dias. O conteúdo de proteína total foi semelhante entre as duas membranas em 10 dias (p>0,05) e maior sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 7 e 14 dias (p<0,05). Não houve diferença estatisticamente significante para atividade de ALP em 7 dias (p>0,05), entretanto em 10 e 14 dias (p<0,05) a atividade de ALP foi maior em culturas sobre o P(VDFTrFE)/ BT. A detecção histoquímica in situ revelou atividade de ALP apenas em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT, tanto aos 7 quanto aos 14 dias. A formação de matriz mineralizada ocorreu apenas em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT. A expressão dos genes Runx2, COL I, OPN, ALP, BSP, OC, Bax e SUR foi maior em células cultivadas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 7 e 14 dias (p<0,05). Não houve expressão de Bcl-2 em culturas sobre as duas membranas. A adesão de células fibroblásticas foi semelhante entre P(VDFTrFE)/ BT e PTFE em 30 min (p>0,05) e maior sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 2 e 4 h (p<0,05). A proliferação de células fibroblásticas foi estatisticamente semelhante entre as duas membranas em 3 dias (p>0,05) e maior em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 1 e 7 dias (p<0,05). Os ensaios de fluorescência direta revelaram que as células fibroblásticas estavam aderidas sobre as duas membranas, porém em estágios mais avançados de espraiamento sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 30 min, 2 e 4 h. O conteúdo de proteína total foi maior sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 10, 14 e 21 dias (p<0,05). Não se observou atividade de ALP em culturas fibroblásticas sobre as membranas de P(VDF-TrFE)/BT e PTFE aos 7 dias. Contudo, em 14 dias (p>0,05) a atividade de ALP foi semelhante entre as duas membranas e em 21 dias (p<0,05) foi estatisticamente significante em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT. Aos 21 dias não se notou formação de matriz mineralizada em ambas as membranas. A expressão dos genes PRT, PDLs17, S100A4, FBM, Bax e SUR foi maior em culturas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 7 e 14 dias (p<0,05). A expressão de Bcl-2 foi maior em células fibroblásticas cultivadas sobre o PTFE em 7 e 14 dias (p<0,05). A adesão de queratinócitos foi semelhante entre P(VDF-TrFE)/BT e PTFE em 30 min, 2 e 4 h (p>0,05). A proliferação de queratinócitos foi estatisticamente semelhante entre as duas membranas em 4, 7, 10 e 14 dias (p>0,05) e maior sobre culturas crescidas sobre P(VDF-TrFE)/BT em 1, 17 e 21 dias (p<0,05). Por fluorescência direta notou-se que células cultivadas sobre ambas as membranas exibiam morfologia predominantemente arredondada em 30 min, 4 e 24 h. A expressão do gene IVL foi semelhante em culturas crescidas sobre as duas membranas em 7 dias (p>0,05) e maior sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 14 dias (p<0,05). Os genes QRT-1, QRT -10 e QRT -14, Bax e SUR estavam mais expressos em culturas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 7 e 14 dias (p<0,05). A expressão de Bcl-2 foi maior em queratinócitos crescidos sobre o PTFE em 7 dias (p<0,05) e semelhante entre as duas membranas em 14 dias (p>0,05). Por favorecer eventos relacionados ao desenvolvimento tecidual, como a adesão, proliferação e diferenciação celular, a membrana de P(VDF-TrFE)/BT pode representar uma boa alternativa ao PTFE para procedimentos de RTG. / The principle of guided tissue regeneration (GTR) is based on the use of physical barrier to isolate periodontal defects of the gingival connective and epithelial tissues so that bone, periodontal ligament, and cementum can be regenerated from their own cells. RTG procedure has been used in many clinical situations to promote bone and periodontal regeneration. Membranes of expanded polytetrafluoroethylene (e-PTFE) are the most commonly used material for GTR. However, several membranes have been tested to be applied in GTR. The purpose of this study was to evaluate the in vitro biocompatibility of the membrane of poly(vinylidene-trifluoroethylene/barium titanate (P(VDF-TrFE)/BT) composite. For that, osteoblasts, fibroblasts and keratinocytes, cells that will interact with the membrane during RTG, were culture P(VDF-TrFE)/BT and PTFE (control) membranes for up to 21 days. The following parameters were evaluated: 1) cell adhesion by counting in hemocytometer, 2) cell proliferation and 3) cell morphology by fluorescent labeling, for osteoblastic, fibroblastic and keratinocyte lineages; 1) total protein content; 2) alkaline phosphatase (ALP) activity and 3) mineralized bone-like nodule formation, for osteblastic and fibroblastic lineages; 1) immunolocalization of ALP by fluorescent labeling; 2) histochemistry detection in situ of ALP activity and 3) gene expression of Runx2, Collagen I (COL I), Ostepontin (OPN), ALP, Bone Sialoprotein (BSP), Osteocalcin (OC), Bax, Bcl-2 and Survivin (SUR) by real-time PCR, for osteoblastic lineage; 1) gene expression of Periostin (PRT), Periodontal ligament specific (PDLs17), Calcium-binding protein (S100A4), Fibromodulin (FBM), Bax, Bcl-2 and SUR by real-time PCR, for fibroblastic lineage; 1) gene expression of Involucrin (IVL), Keratin-1 (QRT-1), Keratin-10 (QRT-10), Keratin-14 (QRT- 14), Bax, Bcl-2 and SUR days by real-time PCR, for keratinocyte lineage. Data were submitted to Mann-Whitney test (level of significance: 5%). The adhesion of osteoblastic cells was similar between P(VDF-TrFE)/BT and PTFE at 30 min, 2 and 4 h (p>0.05). Cell proliferation was higher in ostegenic cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT at 1, 7 and 10 days (p<0.05). Epifluorescence showed that osteoblastic cells grown on P(VDF-TrFE)/BT were more adhered and spread compared to PTFE at 30 min, 4 and 24 h. Immunofluorescence revealed the presence of ALP only in osteogenic cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT at 7 and 14 days. Total protein content was similar between the membranes at 10 days (p>0.05) and higher on the P(VDF-TrFE)/BT at 7 and 14 days (p<0.05). There was no differences in ALP activity at 7 days (p>0.05). However, ALP activity was higher in osteogenic cultures on the P(VDF-TrFE)/BT at 10 and 14 days (p<0.05). The histochemistry reveals that only ostegenic cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT had ALP activity in situ at 7 and 14 days. Bone-like nodule formation occurred only in cultures on the P(VDF-TrFE)/BT at 21 days. Gene expression of Runx2, COL I, OPN, ALP, BSP, OC, Bax and SUR was higher in cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT at 7 and 14 days (p<0.05). There was no expression of Bcl-2 in cultures on both membranes. The adhesion of fibroblastic cells was similar between P(VDFTrFE)/ BT and PTFE at 30 min (p>0.05) and greater in fibroblastic cultures on P(VDFTrFE)/ BT at 2 and 4 h (p<0.05). Cell proliferation was similar in fibroblastic cultures grown on both membranes at 3 days (p>0.05) and higher in cultures on P(VDF-TrFE)/BT at 1 and 7 days (p<0.05). Epifluorescence showed that fibroblastic cells grown on P(VDF-TrFE)/BT were more adhered and more spread compared to PTFE at 30 min, 4 and 24 h. Total protein content was greater on P(VDF-TrFE)/BT at 10, 14 and 21 days (p<0.05). There was no ALP activity in fibroblastic cultures grown on both membranes at 7 days. The ALP activity was similar between P(VDF-TrFE)/BT and PTFE at 14 day (p>0.05) and higher on P(VDFTrFE)/ BT at 21 days (p<0.05). Bone-like nodule formation was not observed in fibroblastic cultures on both membranes at 21 days. Gene expression of PRT, PDLs17, S100A4, FBM, Bax and SUR was higher in cultures on the P(VDF-TrFE)/BT at 7 and 14 days (p<0.05). Bcl- 2 expression was higher in fibroblastic cultures on the PTFE at 7 and 14 days (p<0.05). Keratinocyte adhesion was similar for P(VDF-TrFE)/BT and PTFE at 30 min, 2 and 4 h (p>0.05). Keratinocyte proliferation was statistically similar on both membranes at 4, 7, 10 and 14 days (p>0.05) and higher in cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT at 1, 17 and 21 days (p<0.05). Keratinocytes displayed a round morphology and was not observed any evidence of cell spreading at 30 min, 4 and 24 h. The gene expression of IVL was similar in cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT and PTFE at 7 days (p>0.05) and higher on the P(VDF-TrFE)/BT at 14 days (p<0.05). Genes expression of QRT-1, QRT-10, QRT-14, Bax and SUR was greater in keratinocytes grown on P(VDF-TrFE)/BT at 7 and 14 days (p<0.05). Bcl-2 expression was higher in keratinocytes cultured on PTFE at 7 days (p<0.05) and similar on both membranes at 14 days (p>0.05). Our study indicates that P(VDF-TrFE)/BT membrane promote events related to tissue development/regeneration, such as cell adhesion, proliferation and differentiation. Thus, the membrane of P(VDF-TrFE)/BT could be used as an advantageous alternative to PTFE in GTR procedures.

O acesso à permeabilidade é uma etapa crucial na definição da via de administração de um fármaco, além de ser um dos parâmetros utilizados para a avaliação e seleção de moléculas durante as fases iniciais da pesquisa por novos fármacos. Diversos modelos in vitro têm sido descritos para a realização dos estudos de permeabilidade, mas ainda é evidente a carência de padronização de seus protocolos. O modelo de Permeabilidade em Membrana Artificial Paralela (PAMPA) é rápido e simples, podendo ser facilmente incorporado à rotina de um laboratório. Não obstante, tem apresentado excelente correlação com modelos in vitro quando na avaliação da permeabilidade de fármacos transportados pela via passiva transcelular. O principal objetivo deste trabalho foi investigar a influência das principais variáveis do método de PAMPA e seu impacto na permeabilidade de fármacos. Para tanto, foram selecionados 9 fármacos com características físico-químicas distintas, em função dos seguintes critérios: lipofilicidade (logP); Área de Superfície Polar (PSA); Volume Molecular (VM); pKa; Peso Molecular (PM); Número doadores de ligação de hidrogênio (HBD) e Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB). Os fármacos selecionados foram listados quanto à sua permeabilidade em jejuno humano (Peff) e em cultura de células Caco-2, além de Fração de Absorção (FA%) em humanos. Para o estudo das variáveis da técnica de PAMPA, a ferramenta de Desenho de Experimentos (DOE) foi utilizada e as seguintes condições de ensaio foram exploradas: gradiente de pH do meio do compartimento doador, presença ou ausência de ácido glicocólico no meio do compartimento receptor, variação do tempo de incubação, presença ou ausência de agitação das placas durante a incubação e variação da composição lipídica da membrana artificial. A combinação fatorial completa das condições de ensaio a serem exploradas resultou em 96 experimentos, os quais foram executados em triplicata. Os resultados obtidos apontaram que as variações do pH do meio do compartimento doador, do tempo de incubação e da composição do meio do compartimento receptor foram as condições do ensaio de PAMPA que mais impactaram a permeabilidade dos fármacos. Os resultados obtidos nos 96 experimentos do DOE foram relacionados, a partir de regressão linear, com os parâmetros fisico-químicos e dados de permeabilidade dos fármacos do estudo. O experimento de DOE que apresentou melhor correlação com os dados de permeabilidade em jejuno humano para os fármacos contemplados neste estudo teve um R2=0,858. As condições de ensaio consideradas para este experimento foram: pH 4,5 no compartimento doador, incubação de 15 horas, ausência de agitação das placas, membrana composta por fosfatidilcolina 10% (p/v) e colesterol 0,5% (p/v) e presença de ácido glicocólico 0,5% (p/v) no compartimento receptor. Dentre as propriedades físico-químicas, o PM, PSA e VM foram propriedades comuns a grupos de fármacos cuja permeabilidade foi favorecida pelas mesmas condições de ensaio de PAMPA. Os maiores valores de permeabilidade em PAMPA foram obtidos para fármacos com Peff entre 1 e 2 *10-4 cm/s, permeabilidade em células Caco-2 entre 20 e 27 *10-6 cm/s, faixa de logP entre 0 e 3 além de PM abaixo de 300 Da e PSA abaixo de 90&#197;2. / The permeability access is a critical step when defining the route of administration of a drug, besides from being one of the parameters considered for selecting the best candidates during the initial stages of new molecules discovery. For this reason, there is a need to implement high capacity and low cost models, which have a high correlation with in vivo permeability. Several in vitro models have been described for the studies of permeability, but the lack of standardization of protocols is still evident. Parallel Artificial Membrane Permeability Assay (PAMPA) is fast and simple and can be easily incorporated into the routine of a laboratory. Nevertheless, it has shown excellent correlation with in vitro models when evaluating the permeability of drugs that are transported primarily by passive transcellular route. The aim of this project was to investigate the influence of key variables of PAMPA on the permeability of drugs. Therefore, nine drugs with different physicochemical characteristics were selected based on the following criteria: lipophilicity (logP), Polar Surface Area (PSA), Molecular Volume (MV), pKa, Molecular Weight (MW), number of Hydrogen Bond Donors (HBD) and Biopharmaceutical Classification System (BCS). In addition, the drugs were listed for their permeability in human jejunum, Caco-2 and Fraction of Absorption (FA%) in humans. Design of Experiments (DOE) was considered to plan the PAMPA experiments, and the following assay conditions were explored: pH gradient in the donor compartment, glycocholic acid presence or absence in the acceptor compartment, variations in the incubation time, presence or absence of plate agitation and variations in the lipid composition of the artificial membranes. Full factorial combination of the assay variables resulted in 96 experiments, which were performed in triplicate. The results showed that the pH of the donor compartment, the incubation time and acceptor compartment composition were the assay conditions which most impacted the PAMPA results of drugs. The 96 DOE experiments results were then correlated, by linear regression, with both the physic-chemical and permeability data of the selected drugs. The DOE experiment that showed the best correlation with the permeability in human jejunum (R2 = 0.858) for the drugs included in this study had the following test conditions: pH 4.0 in the donor compartment, incubation of 15 hours, without plate agitation, artificial membrane composed of phosphatidylcholine 10% (w/v) and cholesterol 0.5% (w/v) in dodecane and presence of glycocholic acid 0.5% (w/v) in the receptor compartment. Among the studied physicochemical properties, the molecular weight (MW), polar surface area (PSA) and molecular volume (VM) were the best drivers for determining PAMPA most suitable assay conditions. The highest PAMPA values were obtained for drugs with Peff between 1 and 2 *10-4 cm/s and Caco-2 permeability between 20 and 27 *10-6 cm/s, besides from logP between 0 and 3, MW below 300 Da and PSA below 90&#197;2.

A thimet oligopeptidase (EP24.15) foi originariamente descrita como uma enzima metabolizadora de neuropeptídeos que não possui um peptídeo sinal para entrada na via secretória clássica, mas é secretada pelas células através de um mecanismo não-convencional. Nesse trabalho, identificamos uma nova interação cálcio-dependente entre EP24.15 e calmodulina I (CaM), que é importante para a secreção estimulada, mas não constitutiva, da EP24.15. A superexpressão da CaM em células HEK293 aumenta a secreção estimulada da EP24.15, podendo ser inibida pelo inibidor da CaM. O inibidor específico da PKA reduz a secreção estimulada de EP24.15. Nossos dados sugerem que a interação entre EP24.15 e calmodulina é regulada e relevante para a secreção estimulada da EP24.15 em células HEK293. Surpreendentemente, experimentos com slices (fatias) de cérebros de ratos sugerem que, fisiologicamente, a EP24.15 é secretada predominantemente de forma constitutiva, embora o tratamento com A23187 e forskolin sejam capazes de aumentar modestamente a secreção dessa enzima nessas preparações. / Thimet oligopeptidase (EC3.4.24.15; EP24.15) was originally described as a neuropeptide-metabolising enzyme that lacks a typical signal-peptide sequence for entry into the secretory pathway and is secreted by cells via an unconventional and unknown mechanism. Here, we identify a novel calcium-dependent interaction between EP24.15 and calmodulin I (CaM) that is important for the stimulated, but not constitutive, secretion of EP24.15. Overexpression of CaM in HEK293 cells increase the stimulated secretion of EP24.15, which can be inhibited by the CaM inhibitor. The specific inhibition of PKA with reduced the A23187-stimulated secretion of EP24.15. Our data suggest that the interaction between EP24.15 and calmodulin is regulated within cells and is important for the stimulated secretion of EP24.15 from HEK293 cells. Surprising, the rats brain slices experiments showed that, physiological, EP24.15 has a constitutive secretion, although the A23187 and forskolin treatment are able to increase a little this enzyme secretion in these preparations.

Neste trabalho aborda-se o desenvolvimento de um elemento finito de membrana com graus de liberdade rotacionais e sua implementação a um sistema computacional em elementos finitos. O trabalho é baseado na formulação livre de BERGAN & NYGARD (1984) que produz um elemento simples e de bom desempenho. Aspectos fundamentais da formulação livre, do desenvolvimento do elemento e sua implementação ao sistema são apresentados. Resultados obtidos em alguns exemplos comprovam a eficiência do procedimento. / In this work the formulation of a membrane finite element with rotational degrees of freedom and its implementation to a finite element computational system is presented. The development is based on the free formulation of BERGAN & NYGARD (1984) that produce a simple and efficient element. Fundamental aspects of the free formulation, of the element evaluation and its implementation to the system are shown. The results obtained in some examples indicate the accuracy of the procedure.

Recentemente um efeito piezoelétrico foi encontrado quando um filme polimérico, separando duas soluções de eletrólitos em diferentes concentrações, foi deformado. Este efeito foi atribuído à modulação da mobilidade dos íons no polímero. Foi observado que o efeito diminui com o aumento da concentração de eletrólitos. Para entender mais profundamente este último efeito, foram realizados estudos sobre o transporte de água e sal através do polímero, com e sem deformação, e os resultados podem ser resumidos como segue: a) O aumento da hidratação acarreta um aumento na porosidade e um decréscimo na cristalinidade do polímero. b) O aumento da concentração de sal, no interior do polímero acarreta um aumento na permeabilidade, sendo mais pronunciado na presença de deformação. Esses efeitos tornam mais difícil a modulação dos íons, diminuindo o sinal piezoelétrico observado. / Recently a piezoelectric effect was found when a polymeric film, separating two electrolyte solutions at different concentrations, was deformed. This effect was attributed to the modulation of the mobility of the íons in the polymer. It was observed that the effect decreases as the electrolyte concentrations increases. In order to understand more deeply this last effect a study on water and salt transport through the polymer with and without deformation was carried out, and the results may be summarized as follows: a) An increase in hydration of the polymer leads to an increase in porosity and a decrease in cristallinity. b) An increase in the concentration of the salt leads to an increase in permeability, which is more pronounced in the presence of deformation. The effects make more difficult the modulation of the íons, so lower piezoelectric signals are observed.