As vacinas antimeningocócicas têm se demonstrado efetivas contra os sorogrupos A e C, no entanto ainda não existe vacina contra o sorogrupo B devido à similaridade entre a estrutura capsular do polissacáride B e o ácido polisiálico que faz parte do tecido cerebral humano, podendo levar à autoimunidade. O objetivo deste estudo foi investigar as propriedades adjuvantes dos toxóides Stx1 e Stx2 (STEC) de Escherichia coli, administrados em preparações antigênicas com vesículas de membrana externa nativa (NOMV) de Neisseria meningitidis B, comparando duas vias de imunização prime-boost ou intramuscular, em camundongos BALB/c com idade entre 6-8 semanas. A determinação dos níveis de anticorpos empregando a técnica de ELISA, mostrou elevadas concentrações de anticorpos IgG em soros de animais imunizados pela via intramuscular com Stx1+NOMV, mas não com NOMV, o que sugere que por esta via (intramuscular apenas) Stx1 possa ter atuado como adjuvante. No ensaio de Immunoblotting, soros de animais imunizados com Stx1+NOMV reconheceram maior número de antígenos de NOMV quando comparado ao grupo que recebeu Stx2+NOMV. O sistema prime-boost mostrou-se efetivo quando comparamos os níveis de anticorpos presentes no soro após a dose intramuscular (reforço), entretanto, não melhor do que quando utilizamos duas doses apenas pela via intramuscular. Este estudo poderá contribuir no desenvolvimento de tecnologias associadas a novas preparações antigênicas utilizando antígenos de membrana externa de N. meningitidis B , empregando toxóides como adjuvantes. / The meningococcal vaccines have been shown to be effective against serogroups A and C, however there is still no vaccine against serogroup B. The capsular polysaccharide from serogroup B meningococci polysialic acid moiety mimetic of many human glycoproteins including the neural cell adhesion molecules and may lead to autoimmunity. This study aimed to investigate the adjuvant properties of toxoids Stx1 and Stx2 (STEC) from Escherichia coli and native outer membrane vesicles (NOMV) of Neisseria meningitidis B, comparing two ways of immunization prime-boost or only intramuscular in BALB/c mice. The results showed high concentrations of IgG antibodies in sera of animals immunized intramuscularly with Stx1+NOMV, suggesting that in this way may have Stx1 acted as an adjuvant. In the Immunoblotting assay, sera from animals immunized with Stx1+NOMV recognized more antigens of NOMV when compared to the group that received Stx2+NOMV. The prime-boost was effective however, no better than only two doses intramuscularly. This study may contribute to the development of new technologies and strategies against N. meningitidis B employing toxoids as adjuvants.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-12-04T17:14:15Z No. of bitstreams: 1 Cristiane Wanderley Cardoso.2014.pdf: 6973850 bytes, checksum: 2b778663b6a0d8b4c10a7a53b6fa3e4d (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-04T17:14:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristiane Wanderley Cardoso.2014.pdf: 6973850 bytes, checksum: 2b778663b6a0d8b4c10a7a53b6fa3e4d (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Introdução: A doença meningocócica (DM) é causada pela bactéria Neisseria meningitidis, sendo um importante problema de saúde pública no mundo. Atualmente, a Neisseria meningitidis sorogrupo C (NmC) tem sido o principal agente da DM na Bahia. Em 2010 ocorreu uma epidemia de DM pela NmC em Salvador, e a fim de contê-la, a Secretaria Estadual de Saúde introduziu em fevereiro de 2010, a vacina meningocócica C conjugada (MenC) para crianças menores de cinco anos, incluindo campanhas de vacinação para indivíduos de 10 a 24 anos. Objetivos: Descrever a incidência da DM, avaliar a efetividade da vacina MenC e caracterizar os fenótipos e genótipos das cepas circulantes da N. meningitidis nos períodos pré e pós-introdução da vacina MenC. Metodologia: Realizamos um estudo descritivo-analítico, comparando incidências nas coortes de vacinados e não vacinados nos períodos pré e pós-introdução da vacina MenC. Analisamos a efetividade da vacina MenC utilizando o método “screening” e um estudo tipo caso-controle. A efetividade da vacina MenC foi baseada no odds-ratio (IC 95%; pvalor <0,05). Para caracterização molecular da NmC, utilizamos a técnica de Eletroforese em Campo Pulsátil (PFGE) e da Tipagem de Sequências Multilocus (MLST). Resultados: Entre crianças <5 anos, a incidência da DM (2,00 p/100.000 hab.) no período pós-vacina foi significativamente menor (RR 0,27; IC 95%, 0,09-0,75) do que as taxas médias (7,49 p/100.000 hab.) no período pré-vacina. Em ambos estudos, a efetividade de uma única dose da vacina MenC foi elevada, variando entre 79-100% e 89-100% (IC 95%), respectivamente. O fenótipo C:23:P1.14-6 foi o mais prevalente entre os isolados e os casos atribuídos à NmC foram associados ao tipo de sequências 3779 e 3780, ambas pertencentes ao complexo clonal 103. Conclusão: Os resultados dos estudos demonstraram elevada efetividade (100%) da vacina MenC introduzida em Salvador através de campanhas. No ano seguinte à introdução da vacina MenC, houve redução de 50% na incidência da DM em Salvador. Em 2010, a epidemia da DM em Salvador deveuse à expansão do fenótipo C:23:P1.14-6, pertencente ao complexo clonal ST103, o qual já circulava em Salvador desde 1996. / Introduction: Meningococcal disease (MD) is caused by bacterium Neisseria meningitidis and is a major public health problem worldwide. Currently the Neisseria meningitidis serogroup C (NmC) has been the main cause of MD in Bahia, Brazil. In order to contain the 2010 epidemic of MD caused by NmC that occurred in the city of Salvador, the State Department of Health introduced in February 2010 the meningococcal C conjugate vaccine (MenC) to <5 year-old children, including vaccination campaigns for individuals from 10-24 years. Objectives: Describe trends in incidence of MD, estimate the effectiveness of MenC vaccine, and characterize the phenotypes and genotypes of the circulating strains of N. meningitidis in the pre and post-introduction of the MenC vaccine. Methods: A descriptiveanalytical study was realized comparing incidences in cohorts vaccinated and unvaccinated pre and post introduction of the MenC vaccine. We analyze the effectiveness of MenC vaccine using the screening method and a case-control study. The effectiveness of MenC vaccine was based on the odds-ratio (CI 95%). We performed molecular analyses by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and by multi-locus sequencing typing (MLST). Results: Among children <5 years, the incidence of DM in the post-vaccine period (2.00 p/ 100,000 inhabitants) was significantly lower (RR 0.27, 95% CI 0.09 to 0.75) than the rates averages in the pre-vaccine period (7.49 p/ 100,000 inhab.). In both studies the effectiveness of a single dose of MenC vaccine was 100%, CI ranging from 79-100% and 89-100% (CI 95%), respectively. The phenotype C:23:P1.14-6 was the most prevalent among isolates and cases assigned to NmC were associated with the sequences types 3779 and 3780, both belonging to the clonal complex 103 which has been circulating in Salvador since 1996. Conclusions: The results of the studies showed high effectiveness (100%) of MenC vaccine introduced in Salvador through campaigns. In following the introduction of the MenC vaccine, there was a 50% reduction in the incidence of DM in Salvador. In 2010, the epidemic of DM in Salvador was due to the expansion of the phenotype C: 23: P1.14-6 belonging to the ST103 clonal complex, which was circulating in Salvador since 1996.

INTRODUÇÃO: Neisseria meningitidis é uma das principais causas de meningite bacteriana em todo o mundo. No Brasil, a vacina meningocócica conjugada C foi introduzida no calendário básico do Programa Nacional de Imunizações em 2010 para a população abaixo de 2 anos de idade. Este estudo teve como objetivos avaliar a taxa de portadores sadios de meningococo em nasofaringe entre estudantes de medicina através de métodos fenotípicos e genotípicos. Além disso, foram analisados os fatores de risco associados ao estado de portador sadio. MÉTODOS: Trezentos e setenta e cinco (375) estudantes da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo foram submetidos à coleta de swabs de nasofaringe, de outubro a novembro de 2010: desta casuística, 190 estudantes foram submetidos à coleta de dois swabs. Os swabs foram encaminhados ao Laboratório de Investigação Médica (LIM) de Bacteriologia para isolamento e caracterização das cepas: o primeiro swab foi submetido a cultivo em meio seletivo, testes bioquímicos e reação em cadeia da polimerase com primers específicos para dois genes de Neisseria meningitidis, ctrA e crgA. O segundo swab foi submetido à extração direta de DNA, sem cultivo prévio. Todas as cepas isoladas foram genogrupadas com primers específicos direcionados aos genogrupos A, B, C, Y e W. RESULTADOS: A prevalência geral de portadores sadios foi 45,6%. A taxa de portadores obtida após cultivo em meio seletivo e testes bioquímicos foi 6,1%. A taxa de colonização resultante da PCR dos produtos de cultivo em meio seletivo foi 15.4%. Destas cepas, a maioria pertencia ao genogrupo B. A partir da extração direta de DNA de 190 amostras clínicas, obtivemos 69,5% de positividade de portadores sadios, sendo o genogrupo C predominante nestas amostras. A PFGE mostrou que todas as cepas isoladas eram policlonais. Não houve relação estatisticamente significativa entre os fatores de risco avaliados e o estado de portador sadio. CONCLUSÕES: Este estudo avaliou a prevalência de portadores sadios em adultos jovens no Brasil antes da introdução da vacina meningocócica C conjugada no calendário vacinal de rotina. A prevalência variou de 6,1% a 69,5% dentre os diferentes métodos utilizados, com uma prevalência geral de 45,6%. Comparando-se os diferentes métodos, os métodos genotípicos mostraram-se superiores na detecção de portadores sadios, especialmente quando o DNA é extraído diretamente da amostra clínica / BACKGROUND: Neisseria meningitidis is one of the leading causes of bacterial meningitis worldwide. In Brazil, the meningococcal C conjugate vaccine was introduced as a part of basic vaccination schedule in the public health system in 2010 to the population under 2 years old. The objectives of this study were to evaluate the rate of asymptomatic carriers of meningococci in the nasopharynx among medical students by phenotypic and genotypic methods. Furthermore, the risk factors for carriage were also analyzed. METHODS: Three hundred seventy-five (375) students from University of São Paulo Medical School underwent nasopharyngeal swab collection from October to November, 2010. From those students, 190 of them underwent collection of two swabs; they were sent to the laboratory for isolation and characterization of strains: the first one were submitted to culture on solid plates with selective medium, biochemical tests, and Polymerase Chain Reaction (PCR) with specific primers for two genes of Neisseria meningitidis, ctrA and crgA. From the second swab, direct DNA extraction to PCR reactions were performed, with no previous culture. All strains isolated were genogrouped with specific primers targeting A, B, C, Y and W groups. RESULTS: The overall carriage rate was 45,6%. Carriage rate by culture on solid plates and biochemical tests was 6.1%. The rate obtained from PCR targeting genes ctrA and crgA of colony growth on selective medium was 15.4%. From those strains, the majority belongs to genogroup B. With direct extraction of DNA from 190 clinical samples, we obtained a positivity of 69.5% of meningococcal carriage, and the genogroup C was the main genogroup from those samples. The PFGE showed that the samples were polyclonal. CONCLUSIONS: This study has evaluated the rate of asymptomatic carriers in young people in Brazil before the vaccine introduction in the vaccine routine schedule of infants. The prevalence of nasopharyngeal carriage by meningoccoci among medical students was 6.1% for the phenotypic method, 15.4% by PCR after growth in selective medium and 69.5% by PCR from DNA extracted from clinical samples. In the comparison of the phenotypic and genotypic methods, it was observed that genotypic are superior to phenotypic methods, especially when direct DNA extraction from clinical specimen is performed

Orientador: Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Insituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T17:20:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_RafaellaFabianaCarneiro_M.pdf: 1664553 bytes, checksum: 346b9075da4d999b30fc615fe83733fd (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Neisseria meningitdis, ou meningococo, é uma bactéria comensal da nasofaringe humana. Contudo, algumas linhagens meningocócicas ocasionalmente ultrapassam a mucosa respiratória e a barreira hematoencefálica e causam enfermidades como meningite e septicemia. Como a espécie humana é o único hospedeiro natural para esse patógeno, estudos in vitro com modelos celulares são uma ferramenta importante para a análise da interação entre o meningococo e seu hospedeiro. Este trabalho teve por objetivo avaliar a influência de diferentes linhagens de N. meningitidis na adesão celular, morfologia e expressão de quimiocinas inflamatórias em culturas in vitro de células humanas. Tais parâmetros também foram avaliados em um sistema in vitro de co-cultura celular entre células de origem nervosa e endotelial a fim de mimetizar a barrreira hematoencefálica humana. Os resultados obtidos indicam que a adesão de diferentes linhagens bacterianas em células humanas de sítios específicos do processo infeccioso do meningococo, como Hep-2 (laringe), NCIH460 (pulmão), Hec1b (endotelial) e NG97 (neuroglia) foi capaz de mimetizar o processo fisiopatológico deste microrganismo. Em condições in vitro, células de origem nervosa mostraram-se mais suscetíveis à infecção nos parâmetros avaliados como uma elevada expressão de TNF-?, quimiocina característica em infecções meningocócicas. A linhagem B4 destacou-se entre as linhagens meningocócicas estudadas, apresentando elevados percentuais de adesão em células humanas com valor máximo de adesão em NG97. Células HEp-2 apresentaram poucas alterações morfológicas significativas frente à infecção por N. meningitidis. Tais resultados podem estar associados ao fato do trato respiratório superior ser o habitat natural do meningococo, no qual a interação entre este patógeno e as células hospedeiras seja comensal e não-invasiva. O modelo mimético de barreira hematoencefálica, realizado em transwell, indicou comunicação entre as células que o compõem e uma maior expressão dos níveis de quimiocinas inflamatórias quando comparada à infecção desta bactéria por cada uma das células estudadas isoladamente. Tal modelo foi capaz de mimetizar a barreira hematoencefálica, fato o que torna possível sua aplicação em estudos da passagem de fármacos e outros patógenos por essa barreira. / Abstract: Neisseria meningitidis,or meningococci, is a commensal bacterium of the human nasopharynx. However, occasionally some meningococcal strains can cross the respiratory mucosa and the blood-brain barrier and cause life-threatening diseases such as meningitis and septicaemia. Since the human species is the only natural host for this pathogen, in vitro studies with cellular models are an important tool for the analysis of the meningococci and its host. The aim of this present work was to value the influence of several strains of N. meningitidis in cellular adhesion, morphology and inflammatory chemokines expression in human cells cultivated in vitro. These parameters were also evaluated in a co-cultivated cellular system with glial and endothelial cells aiming mimicking the human blood brain barrier. The results indicate that the adhesion of different bacterial strains from specific sites of infectious process of meningococci as Hep-2 (larynges), NCIH460 (lung), Hec1b (endothelial) and NG97 (glial cells) was capable of mimicking, partially, the pathophysiology of this microorganism. In in vitro conditions, cells from nervous origin showed more susceptibility to infection then others in this evaluated parameters such as a high TNF-? expression, a common chemokine in meningococcals diseases. The B4 strain distinguished from the others by presenting high rates of adhesion in human cells with maximum value on NG97. HEp-2 cells showed few expressives morphologic alterations after meningococcal infection. These results may be associated with the fact that the upper human respiratory tract is the meningoccci natural habitat, in which the interaction between this pathogen and host cells are commensal and not-invasive.The mimicking blood-brain barrier model, performed in transweel, has demonstrated some communication between the cells and greater expression of inflammatory chemokines when compared to the infection in isolated cells. This model was capable of mimicing the blood-brain barrier, which makes its application possible in studies of drugs and others pathogens who might crossover though this barrier. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

As vacinas antimeningocócicas têm se demonstrado efetivas contra os sorogrupos A e C, no entanto ainda não existe vacina contra o sorogrupo B devido à similaridade entre a estrutura capsular do polissacáride B e o ácido polisiálico que faz parte do tecido cerebral humano, podendo levar à autoimunidade. O objetivo deste estudo foi investigar as propriedades adjuvantes dos toxóides Stx1 e Stx2 (STEC) de Escherichia coli, administrados em preparações antigênicas com vesículas de membrana externa nativa (NOMV) de Neisseria meningitidis B, comparando duas vias de imunização prime-boost ou intramuscular, em camundongos BALB/c com idade entre 6-8 semanas. A determinação dos níveis de anticorpos empregando a técnica de ELISA, mostrou elevadas concentrações de anticorpos IgG em soros de animais imunizados pela via intramuscular com Stx1+NOMV, mas não com NOMV, o que sugere que por esta via (intramuscular apenas) Stx1 possa ter atuado como adjuvante. No ensaio de Immunoblotting, soros de animais imunizados com Stx1+NOMV reconheceram maior número de antígenos de NOMV quando comparado ao grupo que recebeu Stx2+NOMV. O sistema prime-boost mostrou-se efetivo quando comparamos os níveis de anticorpos presentes no soro após a dose intramuscular (reforço), entretanto, não melhor do que quando utilizamos duas doses apenas pela via intramuscular. Este estudo poderá contribuir no desenvolvimento de tecnologias associadas a novas preparações antigênicas utilizando antígenos de membrana externa de N. meningitidis B , empregando toxóides como adjuvantes. / The meningococcal vaccines have been shown to be effective against serogroups A and C, however there is still no vaccine against serogroup B. The capsular polysaccharide from serogroup B meningococci polysialic acid moiety mimetic of many human glycoproteins including the neural cell adhesion molecules and may lead to autoimmunity. This study aimed to investigate the adjuvant properties of toxoids Stx1 and Stx2 (STEC) from Escherichia coli and native outer membrane vesicles (NOMV) of Neisseria meningitidis B, comparing two ways of immunization prime-boost or only intramuscular in BALB/c mice. The results showed high concentrations of IgG antibodies in sera of animals immunized intramuscularly with Stx1+NOMV, suggesting that in this way may have Stx1 acted as an adjuvant. In the Immunoblotting assay, sera from animals immunized with Stx1+NOMV recognized more antigens of NOMV when compared to the group that received Stx2+NOMV. The prime-boost was effective however, no better than only two doses intramuscularly. This study may contribute to the development of new technologies and strategies against N. meningitidis B employing toxoids as adjuvants.

Orientador: Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T11:46:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mattos_IvesBernardellide_M.pdf: 15060536 bytes, checksum: 32a633419d15c105fec735cb5753d5b2 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital quando liberada / Abstract: The abstract is available with the full electronic document when available / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T19:47:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alves_DaniloAntonini_M.pdf: 4789463 bytes, checksum: cb7f3cabfd7df63e9dc00316cb7c8a10 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Vesículas da membrana externa ou outer membrane vesicles (OMV) são nanopartículas liberadas no meio de cultura durante o crescimento bacteriano resultantes de evaginações da membrana externa. A OMV é composta por antígenos presentes na membrana externa bacteriana, como porinas e lipo-oligossacarídeos - LOS, proporcionando a estas estruturas um efeito imuno-estimulatório, sendo alvo potencial para a produção de vacinas. Este trabalho teve como objetivo analisar a utilização de OMV de Neisseria meningitidis IAL 2443, linhagem pertencente ao sorogrupo B causadora de meningites no estado de São Paulo, com nanopartículas de sílica mesoporosa SBA-15 e SBA-16 no processo de imunização vacinal. Utilizou-se o processo fermentativo em estado semi-sólido para o crescimento bacteriano e um processo de ultracentrifugação para isolamento da OMV. Comparou-se a produção de OMV de linhagens de N. meningitidis selvagens IAL 2443 e C2135 e mutante knock-out para o gene responsável pela produção de pilina - C2135_pilE. A atividade imunológica foi verificada por meio da imunização em camundongos Swiss e a verificação da citotoxicidade foi realizada em cultura celular utilizando células VERO e NHI 3T3. Os resultados mostraram que as diferentes linhagens de N. meningitidis possuem cinéticas de produção de OMVs distintas em tempo e quantidade. A não expressão de pilE também afeta a cinética da produção dessas estruturas. O uso de adjuvantes de sílica mesoporosa SBA- 15 e SBA- 16 com a OMV IAL 2443 aumenta o reconhecimento pelo sistema imunológico, consequentemente elevando o número de anticorpos específicos frente a mesma cepa bacteriana e a outras linhagens do mesmo sorotipo e sorotipos diferentes. O teste de citotoxicidade em células VERO e NHI 3T3 demonstrou inocuidade nas preparações com SBA- 15 e SBA- 16, atestando a segurança no uso destas preparações como adjuvantes vacinais. O estudo demonstrou que a metodologia utilizada para produção de OMV é vantajosa do ponto de vista quantitativo e econômico e o uso de SBA- 15 e SBA- 16 apresenta potencial como adjuvante em vacinas baseadas em OMV / Abstract: Outer membrane vesicles or OMV are nanoparticles released into the culture medium during bacterial growth resulting from evaginations of the outer membrane. The OMV consists of antigens present in the bacterial outer membrane, like porins and lipooligosaccharides - LOS, these structures provide an immuno-stimulatory effect, and potential target for vaccine production. This study aimed to analyze the use OMV of Neisseria meningitidis IAL2443, belonging to serogroup B strain causing meningitis in São Paulo, as vaccine using the mesoporous silica SBA-15 and SBA-16 in the immunization process. Fermentation process was used in semi-solid state for bacterial growth and a process of ultracentrifugation for the isolation these OMV. It was compared to OMV production of strains of N.meningitidis strains IAL 2443 and C2135, and knock-out mutant for the gene responsible for producing pilin - C2135_pilE. The immunological activity was measured by immunization in Swiss mice and verification of cytotoxicity was performed in cell culture using VERO cells and NIH 3T3. The results showed that different strains of N. meningitidis have OMVs kinetics of production of different time and quantity. The expression does not pile also affects the kinetics of production of these structures. The use of adjuvants mesoporous silica SBA-15 and SBA-16 with the IAL2443 OMV increases the recognition by the immune system, thus bringing the number of specific antibodies against the same bacterial strain and other strains of the same serotype and different serotypes. The cytotoxicity test in NIH 3T3 cells showed VERO and safety in preparation adjuvanted with SBA-15 and SBA-16, confirming the safe use of these preparations as vaccine adjuvants. The study showed that the methodology used for the production of OMV is advantageous from the point of view of quantity and cost and use of SBA-15 and SBA-16 has potential as an adjuvant in vaccines based on OMV / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Neisseria meningitidis B libera vesículas de membrana externa, conhecidas pela sigla OMV. Essas possuem os mesmos componentes da membrana externa da bactéria e podem ser utilizadas como antígenos em vacinas contra a meningite B. As vesículas devem, também, expressar proteínas da membrana externa (OMP) e proteínas reguladoras do íon ferro (IRP). O objetivo deste trabalho é estudar a cinética de crescimento bacteriano, consumo das fontes de carbono e nitrogênio - especialmente os limitantes de crescimento ? e produção de OMV visando melhorar a produção desse antígeno. Realizaram-se cultivos descontínuos em biorreator, com duração de 20 h, empregando meio de Catlin com limitação de ferro e modificações nas concentrações de lactato, aminoácidos e glicerol. As condições do cultivo foram: 4,2 L de meio, temperatura de 36°C, pressão de 0,5 atm, vazão de ar 1 L/min, agitação entre 250-850 rpm, controle de oxigênio dissolvido em 10% de saturação. Constatou-se que o lactato é a principal fonte de carbono limitante, embora somente se tem a hipótese de que o glicerol age como protetor mecânico. O ácido L-glutâmico é a principal fonte de nitrogênio consumida durante o cultivo. As OMV começaram a ser liberadas quantitativamente no início da fase estacionária de crescimento. Sendo que a melhor condição para a produção de OMV, valor 162,3 mg/L, é aquela em que as concentrações iniciais de lactato e aminoácidos foram duplicadas, 15,00 g/L e 2,93 g/L respectivamente. Através da análise do padrão eletroforético, confirmou-se a presença das principais proteínas de superfície, inclusive das IRPs. A integridade da OMV foi constatada por microscopia eletrônica. Assim, o antígeno obtido mostra-se passível de utilização na composição de vacina anti-meningocócica. / Neisseria meningitidis B liberates outer membrane vesicles known by the abbreviation OMV. These vesicles have the same components of the outer membrane of the bacteria and may be used as antigens in vaccines against meningitis B. The vesicles must also express outer membrane proteins (OMP) and iron regulated proteins (IRP). The aim of this paper is to study bacterial growth kinetics, carbon and nitrogen sources consumption ? specially those which limit growth ? and OMV production, seeking to improve the production of this antigen. Discontinuous bioreactor cultivations were carried out for a period of 20 hours in Catlin medium with iron restriction and modifications in lactate, amino acid, and glycerol concentrations. Cultivation conditions were: 4,2 L of medium, temperature at 36ºC, 0,5 atm, air flow rate of 1 L/min, agitation between 250-850 rpm, and dissolved oxygen control at 10% of saturation. It was verified that lactate is the main limiting carbon source, although there is just a hypothesis that glycerol acts as a mechanic protector. The L-glutamic acid is the main source of nitrogen consumed during the cultivation. The OMV started to be liberated quantitatively at the beginning of the stationary phase of growth. The best condition for production of OMV, value 162,3 mg/L, is that where the initial concentrations of lactate and amino acids were duplicated, 15,00 g/L and 2,93 g/L, respectively. Through an analysis of the electroforetic pattern, the presence of the main surface proteins was confirmed, including the IRPs. The integrity of the OMV was testified by electronic microscopy. So, the antigen thus obtained may be used in the antimeningococcal vaccine composition.

Neste trabalho foi avaliado o potencial antigênico das vesículas de membrana externa, OMV, de N. meningitidis, das OMV e componetes protéicos selecionados de N. lactamica. Para tal foram realizados cultivos de ambas as espécies em biorreatores, ensaios de imunização em camundongos, análises de espectrometria de massas, e análises de tamanho das partículas, polidispersabilidade e potencial zeta. As análises da cinética de cultivos levaram a dados inéditos possibilitando uma nova discussão sobre o metabolismo e sobre a produtividade de OMV destas bactérias. N. lactamica obteve valores 5 vezes maiores de concentração máxima de OMV de 152 mg/L e 2,5 vezes maiores de produtividade de OMV de 0,32 g/L.h comparado aos obtidos para N. meningitidis nas mesmas condições de cultivo. OMV obtidas nos cultivos de ambas e componentes proteicos de N. lactamica foram utilizadas para imunizar camundongos com 3 doses subcutâneas. Ensaios de imunoblote e ELISA demonstraram que soros gerados contra as proteínas isoladas de N. lactamica foram reativos com proteínas de N. meningitidis, assim como o soro anti-OMV de N. lactamica que reagiu com 6 proteínas de N. meningitidis, as proteínas de membrana App, Omp85, PilQ, PorA, PorB, e ComL ou Opa/Opc. Análises de espectrometria de massas identificaram 229 proteínas na OMV de N. lactamica, sendo 77 proteínas de membrana e 243 proteínas de N. meningitidis, sendo 54 proteínas de membrana. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem a possibilidade do uso das OMV de Neisseria lactamica como abordagem alternativa para o desenvolvimento de vacinas contra a doença meningocócica. / In these studies we evaluated the antigenic potential of outer membrane vesicles (OMV) from N. meningitidis, OMV from N. lactamica and proteic components from N. lactamica. Outer membrane vesicles were obtained from cultures of both species in bioreactors. Immunization tests were conducted in mice. Western-blotting and ELISA techniques were used to evaluate the cross-reactivity of murine sera against outer-membrane proteins from Neisseria meningitidis and Neisseria lactamica. Analysis of mass spectrometry and determination of particle size, polydispersity and zeta potential were also performed. Analysis of bacterial growth kinetics led to new data enabling a discussion about metabolism and OMV productivity. When both species were cultured in the same medium OMV concentration of N. lactamica (152 mg/L) is 5 times higher than that in N. meningitidis and OMV productivity of N. lactamica (0.32 g/L.h) is 2.5 times higher. Mice were vaccinated subcutaneously with 3 doses of OMV from both species and proteins from N. lactamica. These vaccines induced antibodies against N. meningitidis proteins. By mass spectrometry it was possible to identify these membrane proteins as App, Omp85, PilQ, PorA, PorB, and ComL or Opa/Opc. Mass spectrometry analyses also identified 229 proteins in N. lactamica OMV, with 77 predicted as membrane proteins and 243 in N. meningitidis OMV with 54 predicted as membrane proteins. Ours results suggested that OMV from Neisseria lactamica provides protection against N. meningitidis and could be used as an alternative approach for the development of a vaccine against meningococcal disease.

Neisseria meningitidis, ou méningocoque, est une bactérie responsable de méningites et de septicémies, dont la forme la plus grave, purpura fulminans, est souvent fatale. Cette bactérie, qui réside naturellement dans le rhinopharynx de l’Homme, est pathogène lorsqu’elle atteint la circulation sanguine et entre en contact avec les cellules endothéliales. L’établissement d’une interaction étroite entre le méningocoque et les cellules endothéliales est essentiel à la résistance des bactéries au flux sanguin et à la colonisation vasculaire. Cette interaction peut conduire à une désorganisation massive des endothéliums périphériques et cérébraux permettant la dissémination de la bactérie. Ces processus dépendent de la primo-interaction des pili de type IV du méningocoque avec le récepteur endothélial CD147 et de l’activation du récepteur β2-adrénergique (β2AR). L’activation de voies de signalisation en aval du β2AR dans les cellules hôtes permet l’adhérence efficace et intime des bactéries à la surface des cellules endothéliales. Toutefois, comment les récepteurs CD147 et β2AR coopèrent pour promouvoir une interaction initiale efficace et rapide n’était pas connu. Au cours de ma thèse, j’ai donc analysé les éventuelles interactions et liens fonctionnels existants entre les récepteurs CD147 et β2AR et suivi, à l’aide de nouvelles approches d’imagerie à haute résolution, leur organisation moléculaire aux sites de contact bactéries/cellule. Mes travaux ont permis de révéler l’existence d’une interaction fonctionnelle entre les récepteurs CD147 et β2AR, et d’identifier un nouveau partenaire cytosolique interagissant directement avec ces récepteurs, l’α-actinine4 (Actn4). L’expression de l’Actn4 est requise pour l’assemblage organisé de ces récepteurs en complexes multimoléculaires aux sites de contact bactéries/cellule endothéliale. Cette organisation est déterminante pour générer une force suffisante à l’interaction initiale du méningocoque aux cellules endothéliales, et promouvoir l’activation rapide des voies de signalisation nécessaires à la consolidation de cette interaction. L’infection des cellules endothéliales par le méningocoque s’accompagne de la désorganisation des jonctions intercellulaires et l’ouverture d’une voie paracellulaire favorisant la dissémination tissulaire des bactéries. Ces évènements dépendent de l’activation de la petite GTPase Cdc42 et, en aval, de la relocalisation du complexe de polarité Par3/Par6/aPKC au site d’adhérence bactérien. Ce complexe moléculaire très conservé est impliqué dans la mise en place de la polarité baso-apicale des cellules endothéliales. La perte de la polarité cellulaire constituant un élément déterminant de la perte de l’intégrité vasculaire, dans une seconde partie de ma thèse, j’ai donc entrepris une analyse des événements de signalisation précoces conduisant au remodelage de l’organisation apico-basale des cellules endothéliales par N. meningitidis. Mes travaux montrent que rapidement après adhésion aux cellules endothéliales, le méningocoque induit la ré-orientation de l’axe de polarité noyau-centrosome des cellules en direction des bactéries et mettant en jeu un mécanisme original indépendant de l’activation de Cdc42 par le β2AR. Le recrutement des ERM (Ezrine et Moesin) et la polymérisation d’actine corticale au site d’infection semblent constituer des facteurs clé de cette étape précoce de modification de la polarité endothéliale induite par le méningocoque. Ainsi, ces études ont permis une avancée majeure dans notre compréhension du mécanisme d’adhésion du méningocoque aux cellules endothéliales et des événements moléculaires précoces conduisant à l’altération de l’intégrité vasculaire, deux étapes clés au cœur de la pathogénèse des infections invasives à méningocoque. / Neisseria meningitidis or meningococcus is a commensal bacterium of the human nasopharynx responsible for septicemia and meningitis. Establishment of a close interaction between meningococcus and endothelial cells is an important step in meningococcal pathogenesis as it promotes bacterial resistance to blood flow and vascular colonization, leading to major endothelial dysfunctions and bacterial dissemination into perivascular tissues. This process depends on the interaction of meningococcal type IV pili with the endothelial receptor CD147 and the activation of the β2 adrenergic receptor (β2AR). Activation of a cellular response downstream of β2AR activation is important to allow the efficient adhesion of meningococci at the endothelial cell surface. However, how CD147 and the β2AR cooperate to promote a rapid and efficient initial adhesion remained to be explored. During my thesis, I have analyzed the interaction and the functional link between these two receptors and, using super resolution microscopy, I have investigated their molecular organization at sites of bacterial adhesion. My work revealed a functional interaction in cis between CD147 and the β2AR and binding of these receptors complexes to the molecular scaffold protein α-actinin 4 (Actn4). Actn4 expression is required for the organized assembly of these receptors in highly-ordered complexes at bacterial adhesion sites. This specific organization is decisive to provide a sufficient binding strength of meningococcal type IV pili with endothelial receptors and to promote a rapid activation of downstream signaling events in a short time frame. Endothelial cell infection by N. meningitidis is associated with the disruption of intercellular junctions and the opening of a paracellular route favoring bacterial dissemination into tissues. These events are dependent on Cdc42 activation and on the relocalization of the Par3/Par6/aPKC polarity complex at bacterial adhesion sites. This molecular complex is conserved and involved in baso-apical polarity establishment in endothelial cells. Since endothelial polarity is essential in maintaining junction integrity, in a second part of my thesis work I have analyzed the early signaling events triggered by meningococcal infection with a particular emphasis on endothelial cell polarity modifications. I observed that bacterial adhesion rapidly induced a re-orientation of the nucleus-centrosome axis toward bacterial adhesion sites. Unexpectedly, this re-orientation was independent of Cdc42 activation downstream of the β2AR. In place, the ERM proteins (Ezrin and Moesin), along with cortical actin polymerization seem to be key factors in this process. This work contributes to the understanding of the meningococcal adhesion mechanism to endothelial cells and the early molecular events leading to the loss of vascular integrity. These two key steps are very important in the meningococcal pathogenesis.