Orientador: Clarice Weis Arns / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T13:48:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Felippe_PauloAnselmoNunes_D.pdf: 7878570 bytes, checksum: bacb59d6d40fdf4e282eb9e5e89306a9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O Brasil figura entre os maiores produtores e exportadores do mundo de carne de frango e ovos, o que confere a avicultura a capacidade de interferir na construção do PIB nacional. Estes índices envolvem a necessidade de uma alta produtividade e consequentemente um manejo zoosanitário suficiente para atender a economicidade do setor. Este estudo focou dois gêneros virais de importância na avicultura, o Coronavirus e o Metapneumovirus, objetivando verificar a presença de vírus em aves silvestres e sinantrópicas da avifauna brasileira, visando compreender melhor a eco-epizootiologia das respectivas morbidades de que são agentes etiológicos. Para tanto se coletou 134 amostras através de swabs traqueais e cloacais de 53 aves silvestres brasileiras de 20 espécies diferentes e de 14 pombas (Columba livia), que não possuíam sinais de doença. Além destas aves, foi também objeto de estudo amostras de galinhas e frangos comerciais oriundos de vários estados da federação nos anos de 2003 a 2009, com sintomas respiratórios. O material genético dos vírus encontrados foi extraído e submetido à reação de nested RT-PCR, destinado a amplificar a região hipervariável do gene que codifica a proteína S1 dos coronavírus e o gene que codifica a proteína G dos metapneumovírus. Os amplificados foram então sequenciados e analisados construindo-se árvores filogenéticas e matrizes de similaridade através de recursos de bioinformática. Foi possível recuperar seis (06) amostras de coronavírus de Columba livia e vinte e três (23) de galinhas domésticas. No estudo filogenético se observou dois grandes clusteres; um agrupando-se com o genótipo Massachusetts e outro com D207; das amostras de pomba 5 agruparam-se com Massachusetts; 1 amostra de galinha e uma de pomba agruparam com o genótipo Connecticut e 1 de galinha com o Arkansas. As amostras oriundas de pomba e as de galinha compartilharam uma similaridade que chegou a 100%, para algumas delas. Quanto aos metapneumovírus recuperou-se vírus de 7 aves silvestres, 7 de pombas e 15 de galinhas domésticas, sendo que estas amostras agruparam-se em dois grandes clusteres, um com o subtipo A (5 de aves silvestres, 2 de pombas e 1 de galinha) e outro com o subtipo B (2 de aves silvestres, 5 de pombas e 14 de galinha). A identidade genética entre os amplificados de galinha e de aves não domésticas chegou a 100%. Tanto para os coronavirus como para os metapneumovirus o isolamento de vírus com um de seus genes mais variáveis apresentando até 100% de identidade com os das galinhas domésticas, pode representar uma possível recuperação dos vírus atenuados utilizados nas vacinações de rotina, ou mesmo a passagem dos vírus patogênicos para estes animais, fazendo com que estes mantenham o agente no ambiente. Aves de diferentes espécies podem ainda funcionar enquanto um ambiente seletivo para estes vírus, provocando a fixação de novos genótipos virais, o que seria uma provável explicação para o fato destes agravos continuarem a ocorrer em granjas de todo o mundo em detrimento da existência de vacinas, além da possibilidade de surgimento de vírus recombinantes capazes de infectar humanos, como é o caso da SARS / Abstract: Avian Coronavirus and Metapneumovirus in Brazilian Domestic and Wild Birds: Molecular Characterization and Phylogenetic. Brazil is among the largest producers and exporters of poultry meat and eggs in the world, which gives the poultry industry the capacity to interfere in the construction of national GDB. These indexes involve the need of a high productivity and consequently a sufficient zoosanitary management for the economy of the sector. This study focused on two important viral genera for this, Coronavirus and the Metapneumovirus, to verify the presence of virions in wild birds and synanthropic ones of Brazil, seeking a better understanding of those diseases and your ecoepizootiology. For that, were collected one hundred thirty-four samples (tracheal and cloacal swabs) from fifty three Brazilian wild birds of twenty different species and fourteen from pigeons (Columba livia), without symptoms, and samples of chickens from several states of the federation in the years from 2003 to 2009, with swollen head syndrome. The virus genetic material found was subjected to the reaction of nested RT PCR, to amplify the hypervariable region of the gene encoding the coronavirus S1 subunit of the S protein and the gene encoding the G protein of metapneumovirus. The amplified were then sequenced and analyzed by constructing phylogenetic trees and similarity matrices using bioinformatics resources. Were isolated six (6) coronavirus from Columba livia and twenty three (23) from domestic fowl. In the phylogenetic analysis, two major clusters were observed one grouped with Massachusetts genotype and the other with D207; samples of five pigeons grouped with Massachusetts as well, one chicken sample and one from pigeon were grouped with genotype Connecticut and other from chicken with Arkansas genotype. The samples from pigeons and chickens shared a similarity which reached 100%. As for metapneumovirus, virus was recovered from seven wild birds, seven pigeons and fifteen from chickens. These samples were grouped into two major clusters; with subtype A (five from wild birds, two from pigeons and one from chicken) and with subtype B (two wild birds, 5 pigeons and 14 chickens). The genetic similarity between chicken amplicons to non domestic birds reached 100%. For both coronavirus and metapneumovirus, virus isolation from non domestic birds and their great similarity (reached 100%) with those from chickens, may represent a possible recovery of the attenuated virus used in routine vaccinations, or even the passage of pathogenic viruses for these animals, causing them to keep the agent in the environment. Birds of different species can also function as a selective environment for these viruses, leading to the establishment of new viral genotypes, which would be a likely explanation for the fact that these injuries continue to occur on farms around the world, even with the use of vaccines, besides the possibility of emergence of recombinant viruses capable of infecting humans, as is the case with SARS / Doutorado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

RIBEIRO, Joyce Fonteles. Perfil clínico-epidemiológico das infecções respiratórias agudas causadas por metapneumovírus humano em crianças atendidas no Hospital Infantil Albert Sabin - Fortaleza/Ceará. 2008. 94 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2008. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-01-05T12:12:30Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_jfribeiro.pdf: 2268899 bytes, checksum: 31df8e028e25d45794437cdab4883903 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-02-02T16:25:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_jfribeiro.pdf: 2268899 bytes, checksum: 31df8e028e25d45794437cdab4883903 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-02T16:25:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_jfribeiro.pdf: 2268899 bytes, checksum: 31df8e028e25d45794437cdab4883903 (MD5) Previous issue date: 2008 / The human metapneumovírus (hMPV) is a newly discovered virus that has been considered as one of the most common agents of acute respiratory infections (ARI) virus in childhood. The objectives of this study were: 1) to observe the frequency of infections caused by hMPV among children attending Hospital Infantil Albert Sabin, a major pediatric hospital in Ceará, from January 2006 to December 2007; 2) to describe aspects of seasonality of these infections relating them to the occurrence of rain and the circulation of other respiratory viruses, 3) to describe the clinical and epidemiological characteristics of patients infected by hMPV, compared with positive and negative patients for other viruses; 4) to evaluate the IFI assay as a method of diagnosis for the detection of hMPV. Nasopharyngeal aspirates were collected from children with symptoms of ARI and submitted to indirect immunofluorescence assays for the detection of the following respiratory viruses: hMPV, respiratory syncytial virus (RSV), influenza A and B, adenovirus and parainfluenza 1, 2 and 3. During the 24 months of study, samples were collected from 1276 and respiratory viruses were demonstrated in 380 (29.78%) samples. The hMPV was the second most frequently detected respiratory viruses representing a total of 8.69% of all samples and 29% among the samples positive for the virus analyzed. It was not observed for hMPV a pattern of seasonality or correlation with the rainy season. Most patients positive for hMPV were attended in the emergence (89.2%). The mean age of patients infected by hMPV was 27 months, wich is significantly older than that for VSR (15 months), adenovirus (14 months) and parainfluenza virus 3 (18 months). Among patients infected by hMPV, 53.2% had a diagnosis of infections of the upper airways and 46.7% had a diagnosis of infections of the lower airways. The hMPV infections showed the same spectrum of infections caused by other viruses analyzed. The hMPV associated to more cases of pneumonia that led to the hospitalization of children infected than other viruses analyzed. More than half of these patients used the aerosol / salbutamol as conduct therapy (68.5%). The IFI assay proved to be quite effective as a method of diagnosis for the detection of hMPV in this study / O metapneumovírus humano (MPVh) é um vírus que tem se destacado como um dos agentes mais freqüentes de infecções respiratórias agudas (IRA) virais na infância. Este estudo teve como objetivos: observar a freqüência das infecções causadas pelo MPVh em crianças atendidas por IRA no Hospital Infantil Albert Sabin, hospital pediátrico de referência do estado do Ceará, no período de janeiro de 2006 a dezembro de 2007; descrever aspectos de sazonalidade dessas infecções relacionando-as com a ocorrência de chuvas e a circulação de outros vírus respiratórios; descrever as características clínico-epidemiológicas dos pacientes infectados pelo MPVh, comparando com os pacientes negativos e com os positivos para outros vírus e avaliar a técnica de IFI como método de diagnóstico para a detecção do MPVh. Amostras de secreção de nasofaringe foram coletadas de crianças com sintomas de IRA e submetidas à técnica de imunofluorescência indireta para detecção dos seguintes vírus respiratórios: MPVh, vírus sincicial respiratório (VSR), influenza A e B, adenovírus e parainfluenza 1, 2 e 3. Durante os 24 meses de estudo, foram colhidas amostras de 1276 crianças sendo detectado algum vírus respiratório em 380 (29,78%) amostras. O MPVh foi o segundo vírus respiratório mais encontrado representando um total de 8,69% de todas as amostras e de 29% dentre as amostras positivas para os vírus pesquisados. Não foi observado para o MPVh um padrão de sazonalidade nem correlação com período chuvoso. A maioria dos pacientes positivos para MPVh foram atendidos na emergência (89,2%). A média de idade dos pacientes positivos para o MPVh foi de 27 meses sendo significativamente superior que a das crianças infectadas pelo VSR (15 meses), adenovírus (14 meses) e vírus parainfluenza 3 (18 meses). Dentre os pacientes infectados pelo MPVh, 53,2% tiveram o diagnóstico de infecções das vias aéreas superiores e 46,7% tiveram o diagnóstico de infecções das vias aéreas inferiores. As infecções por MPVh apresentaram o mesmo espectro de infecções causadas pelos demais vírus pesquisados. O MPVh associou-se mais a casos de pneumonia que levaram à hospitalização das crianças infectadas do que outros vírus analisados. Mais da metade dos pacientes infectados pelo MPVh utilizaram o aerossol / salbutamol no seu tratamento (68,5%). A técnica de IFI mostrou-se bastante eficaz como método de diagnóstico para a detecção do MPVh nesse estudo

Orientadores: Clarice Weis Arns, Fernando Rosado Spilki / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T04:41:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_MarciaMercesAparecidaBianchidos_D.pdf: 3376725 bytes, checksum: 4e17791ec1d7e56265e067f2ce1f62bf (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O Metapneumovirus aviário (aMPV) pertence à família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae, gênero Metapneumovirus. O vírus, relatado pela primeira vez no Brasil em 1995, é o agente etiológico da Rinotraqueíte em perus (TRT) e está associado também à Síndrome da Cabeça Inchada (SHS) em frangos e poedeiras comerciais. O presente estudo foi dividido em três partes. Na primeira foi avaliada a suscetibilidades de oito sistemas celulares para a propagação de amostras virais do aMPV subtipos A e B. As células chicken embryo related (CER), Vero e baby hamster kidney cells (BHK-21) demonstraram ser as mais apropriadas para a multiplicação de ambos os subtipos. Além disso, cultivo de anel de traquéia (TOC) e cultivo primário de embrião de galinha (CEF) foram permissíveis à infecção por aMPV após terem sido isolados e propagados em CER. As curvas da cinética viral foram realizadas nas três linhagens celulares e ambos os subtipos tiveram títulos mais altos em CER durante as primeiras 30 horas após a infecção. Não foram observadas diferenças significativas entre os títulos obtidos em células CER e Vero, demonstrando que as células CER são tão adequadas à propagação do aMPV quanto as células Vero. A segunda parte do trabalho consistiu em analisar a virulência de uma amostra de aMPV subtipo B após sofrer passagens seriadas em células CER. Cinco variantes provenientes das passagens em CER foram inoculadas em galinhas e a excreção viral foi analisada. Os resultados obtidos com as amostras de traquéia demonstram que a virulência do aMPV diminui gradualmente enquanto o título viral aumenta com o número de passagens. Em contrapartida, nas amostras de seio nasal foi observado aumento da carga viral, demonstrando que não houve diminuição no fitness viral para este órgão. As seqüências do gene G das amostras utilizadas para desafio foram obtidas, porém este gene parece não ser afetado pela propagação em células CER. Na terceira e última parte deste estudo, foi avaliada a proteção viral conferida por uma vacina comercial contra isolados brasileiros do aMPV subtipos A e B em frangos de corte. Para tanto, uma amostra de cada subtipo foi avaliada quanto à sua virulência. O isolado do subtipo B foi detectado em um período mais longo e em maiores quantidades quando comparado ao subtipo A. Os resultados da analise da proteção demonstram que algumas aves imunizadas receberam proteção viral completa contra o vírus virulento heterólogo. Porém, a mesma vacina forneceu proteção viral parcial quando as aves foram desafiadas com o vírus virulento homologo ao vacinal / Abstract: Avian metapneumovirus (aMPV) belongs to the Paramyxoviridae family, Pneumovirinae subfamily, within the genus Metapneumovirus. The virus, first described in Brazil in 1995, is responsible for an acute rhinotracheitis in turkeys (TRT) and is associated with swollen head syndrome in broiler chickens and layer hens. The present study is divided in three parts. In the first part, eight cell culture systems were evaluate for the propagation of aMPV subtypes A and B. The chicken embryo related (CER) cells, Vero and baby hamster kidney cells (BHK-21) cells were shown to be the most appropriate for propagation of both subtypes of aMPV. In addition, propagation of aMPV in chicken embryo fibroblasts (CEF) and tracheal organ culture (TOC) remained efficient after the primary isolation and several passages of viruses in the CER cell line. The growth curves were created using CER, Vero and BHK-21 cell lines. Compared with growth, both yielded higher titres in CER cells during the first 30 hours after infection, but no significant difference was observed in the results obtained from CER and Vero cells. This data show that CER cell are adequate for aMPV propagation, giving similar results to Vero cells. The second part of this study was conducted to analyze the virulence of an aMPV subtype B strain after serial passage in CER cells. To accomplish this, chickens were infected with 5 different variants derived from serial passage and the amount of viral shedding was determined. The results of tracheal samples showed that the virulence decreases gradually with passage, while in vitro viral titre increases. However, an increase in viral shedding was observed in sinusal samples, demonstrating no decrease in fitness for this organ. The G gene sequences of challenge samples were analyzed, however this gene appears to not be affected when aMPV is propagated in CER cells. Finally, the last part of this study aimed to examine a commercially available vaccine in broiler chickens in terms of it ability to provide virological protection against aMPV subtypes A and B. To accomplish this, the virulence of each virulent strain was analyzed. The results demonstrate that the subtype B virulent strain could be observed longer and in larger quantities compared to subtype A. A complete heterologous virological protection was provided by the subtype B vaccine; however, a lack of complete homologous virological protection was observed when chickens were challenged with the homologous subtype B strain / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

ELOY, Ygor Raphael Gomes. Caracterização físico-química e estrutural de polissacarídeos obtidos de folhas da planta Aloe barbadensis Miller e avaliação de suas atividades antiviral e anti-hemorrágica. 2012. 186 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-28T15:19:36Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_yrgeloy.pdf: 4816746 bytes, checksum: df9405e734ec6c678912a942f68c57ad (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T14:43:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_yrgeloy.pdf: 4816746 bytes, checksum: df9405e734ec6c678912a942f68c57ad (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T14:43:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_yrgeloy.pdf: 4816746 bytes, checksum: df9405e734ec6c678912a942f68c57ad (MD5) Previous issue date: 2012 / The aim of this study was to investigate the physicochemical and structural parameters of polysaccharides obtained from Aloe barbadensis leaves and to evaluate the antiviral and cytotoxic activities and procoagulant, anti-bleeding effects. In addition, toxicological analysis was carried out. The pulp was submitted to aqueous extraction (70 °C) and the total polysaccharides (PT) obtained by ethanol precipitation, TCA was used to remove the protein contamination. The fractionation of PT with DEAE-celulose resulted in two fractions (PI and PII). The physicochemical characterization showed that PI fraction presents mannose (78,4%), glucose (7,3%), galactose (2,1%), fucose (2,8%) and uronic acid (10,0%). Sulfate esters were not detected in PI fraction. On the other hand, PII fraction presents the monosaccharides mannose (39,2%), glucose (22,2%), galactose (26,3%), arabinose (3,8%), xylose (1,1%), uronic acids (8,0%) and sulfate esters groups (12,0%). The polysaccharidics of PII obtained by PAGE and agarose gel electrophoresis were revealed with toluidine blue and stainsall dye showing the presence of two different bands, one purple (indicative of sulfate) and another cyan (indicative of carboxilated groups). Structural analysis of PI and PII fractions by IR spectroscopy demonstrated that PI fraction is composed of residues of â-mannose O-acetylated (812.2 and 960 cm-1) and uronic acids (1738 cm-1). In contrast, the PII fraction is composed of mannose (1014.7 cm-1), galactose (1078.2 cm-1), negatively charged uronic acids (1635 cm-1) and sulfate ester (1329.5 and 1260.9 cm-1). These results corroborate with NMR analyses that suggest the presence of sulfate groups in PII structure. The cytotoxicity evaluation showed that PT and the fractions PI and PII did not show toxicity against most of tested cells and the same fractions were not effective against non-enveloped virus (Ad 19 and Ad 41) inhibition. However, the PT and PI fraction were able to inhibit the infection caused by HSV-1 and HSV-2. In addition, PII fraction presents antiviral activity against metapneumovirus. Although the PT and the fractions PI and PII did not show activity against dengue virus serotype 1 (DENV-1), PT could inhibit the bleeding effects in rats, reducing the bleeding and prothrombin time. The PT showed no toxicity in mice, but increased spleen size and number of blood platelets. In conclusion, A. barbadensis leaves contain neutral or negatively charged carboxylated/sulfated polysaccharides. In addition, besides having inhibitory activity against HSV-1, HSV-2 and HMPV, they can also anti-bleeding and procoagulant effect. Moreover, the PT of A. barbadensis showed no significant toxicity and can be used as a safe and effective therapeutic agent. / Este trabalho teve como objetivos caracterizar físico-química e estruturalmente polissacarídeos obtidos de folhas de Aloe barbadensis e avaliar suas atividades antiviral, anti-hemorrágica e pró-coagulante e possíveis sinais de toxicidade. Foi realizada extração aquosa de polissacarídeos totais (PT) de A. barbadensis, seguido de precipitação por etanol e remoção dos contaminantes proteicos com TCA. A cromatografia em DEAE-celulose foi eficiente no fracionamento dos PT, onde foram obtidas as frações PI e PII. A caracterização físico-química mostrou que a fração PI é composta por manose (78,4%), glucose (7,3%), galactose (2,1%), fucose (2,8%) e ácidos urônicos (10,0%), e isenta de grupos éster sulfato. Enquanto, a fração PII é constituída por manose (39,2%), glucose (22,2%), galactose (26,3%), arabinose (3,8%), xilose (1,1%), ácidos urônicos (8,0%) e grupos éster sulfato (12,0%). Na revelação das bandas polissacarídicas da fração PII, obtidas por PAGE e gel de agarose corados com stainsall foi constatado a presença de duas bandas que apresentaram diferentes colorações, roxa e ciana, correspondentes a presença de grupos sulfato e carboxilados, respectivamente. Na análise estrutural das frações PI e PII, por espectroscopia no IR, foi demonstrado que a fração PI apresenta unidades monossacarídicas de â-manose O-acetiladas (812,2 e 960 onda.cm-1) e ácidos urônicos neutros (1738 onda.cm-1) em sua estrutura. Diferentemente, a fração PII, mostrou-se ser constituída por unidades monossacarídicas de manose (1014,7 onda.cm-1), galactose (1078,2 onda.cm-1), ácidos urônicos carregados negativamente (1635 onda.cm-1) e éster sulfato (1329,5 e 1260,9 onda.cm-1). Na avaliação estrutural da fração PII por RMN foi comprovado à presença do grupo éster sulfato. Em relação às atividades biológicas, o teste de citotoxicidade mostrou que os PT e as frações PI e PII não apresentaram toxicidade para a maioria das células testadas e não foram eficientes na inibição de vírus não envelopados Ad-19 e Ad-41. No entanto, os PT e a fração PI foram capazes de inibir a infecção causada por HSV-1 e HSV-2. Em ensaios com metapneumovírus (HMPV), a fração PII apresentou atividade antiviral superior à ribavirina. Embora os PT e as frações PI e PII não terem apresentado atividade contra dengue vírus sorotipo 1 (DENV-1), os PT puderam inibir a hemorragia em ratos, diminuindo o tempo de sangramento e o tempo de protrombina. Os PT não apresentaram toxicidade em camundongos, mas aumentaram o tamanho do baço e o número de plaquetas sanguíneas. Pode ser concluído que extratos foliares de A. barbadensis podem apresentar polissacarídeos neutros ou carregados negativamente por grupos carboxilados/sulfatados. Em adição, além de apresentar atividade inibitória contra os vírus HSV-1, HSV-2 e HMPV, podem também apresentar efeito anti-hemorrágico e prócoagulante, propriedades essas, importantes, visto que a complicação de muitas viroses leva a quadros hemorrágicos. Além disso, os PT de A. barbadensis não apresentaram toxicidade expressiva, podendo ser utilizada como agente terapêutico seguro e eficaz.

Orientador: Clarice Weis Arns, Renata Servan de Almeida / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T01:41:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_HelenaLage_D.pdf: 2290087 bytes, checksum: 244512a14adbf81da5ab74893d3c12b2 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O metapneumovírus aviário (AMPV) é o agente primário da rinotraqueíte dos perus (TRT). O AMPV pertence à família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae, gênero Metapneumovirus. Também está associado à síndrome da cabeça inchada (SHS) em galinhas e é responsável por significativas perdas econômicas em sua produção. O presente estudo foi dividido em três partes. A primeira parte do trabalho consistiu em avaliar a beta-actina, gene utilizado como controle interno das técnicas moleculares de detecção viral, das células chicken embryo related (CER). Para isso, foi realizado o sequenciamento dos amplicons gerados pelo PCR do gene da beta-actina. A beta-actina das células BHK21 e CER foram detectadas utilizando oligonucleotídeos hamster-específicos. Além disso, pela análise filogenética as células CER e BHK21 apresentaram uma alta similaridade genética (p>0.996). Estes resultados sugerem que as células CER não deveriam ser mais consideradas como células aviárias. A segunda parte do estudo consistiu em comparar a especificidade e limite de detecção de duas novas técnicas de RT-PCR convencional (genes da nucleoproteína (N) e da proteína de fusão -F) e de duas novas técnicas de real time RT-PCR (RRT-PCR; genes F e N) com um RT-PCR (gene da glicoproteína -G) previamente estabelecido para a detecção do AMPV. Todos estes métodos foram capazes de detectar os isolados AMPV subtipo A (AMPV/A). As técnicas RRT-PCR (genes F e N) foram capazes de amplificar os maiores limites de detecção (diluições 10-5 e 10-5, respectivamente). Além disso, o RRT-PCR gera resultados rápidos e sensíveis, o que o torna uma ferramenta alternativa para o isolamento viral. Na terceira parte, foi realizado o silenciamento gênico de AMPV pela aplicação de seqüências curtas e específicas de RNA (siRNAs, do inglês short interfering RNA) para regiões alvo do genoma viral. Assim, foram desenhadas moléculas de siRNA contra os genes N e F do AMPV. Três dias após a infecção viral, o efeito do siRNA na replicação viral foi verificado por titulação viral, RRT-PCR e RT-PCR. Os títulos virais das células CER transfectadas com o siRNA/N apresentaram queda de até 99,9% em relação ao controle. A produção de mRNAs para os genes N, F e G do AMPV também apresentou uma redução de até 99,7%. Desta forma, a molécula de siRNA contra o gene N foi capaz de inibir a replicação do AMPV in vitro. Em estudos futuros, a associação de siRNAs tendo como alvo o complexo da RNA polimerase deve ser avaliada como uma eficiente ferramenta para evitar o escape viral na terapia antiviral / Abstract: Avian metapneumovirus (AMPV) is the primary causative agent of severe rhinotracheitis in turkeys. AMPV belongs to the Paramyxoviridae family, Pneumovirinae subfamily, within the genus Metapneumovirus. It is associated with swollen head syndrome in chickens and is the source of significant economic losses to animal food production. The present study is divided in three parts. In the first part, the chicken embryo related (CER) cells beta-actin was evaluated. The CER beta actin gene was amplified by RT-PCR, and the amplicon was sequenced. The BHK21 and CER beta-actins were detected using hamster-specific primers. The results showed that such cells are closely related to BHK21 (p > 0.966), having a p-distance of 0.7 from chicken embryo fibroblasts. This confirms that CER cells are phylogenetically closely related to BHK21 cells. The second part of the study, we compared the specificity and detection limits of two newly designed conventional RT-PCRs (F and N genes) and two newly defined real time RT-PCR (RRT-PCR; (F and N genes), with an established RT-PCR (G gene) for AMPV detection. All the RT-PCR tested assays were able to detect the six isolates. The higher detection limits were observed at 10-5- fold and 10-5-fold dilutions of the N- and F- based RRT-PCR, respectively. Important to note that RRT-PCR assays generate fast and sensitive results, becoming a feasible alternative for virus isolation. In the third part, the silencing of AMPV by targeting its viral regions was promoted. We designed specific short interfering RNA (siRNA) targeting the nucleoprotein (N) and fusion (F) genes. Three days after the virus infection, the effect of siRNA in the virus replication was verified by virus titration, real time RT-PCR, and RT-PCR assays. AMPV titers presented reduction by 99.9%, when compared to the siRNA/F and siRNA/GFP treated samples. Also, real time RT-PCR results presented reduction of AMPV N, F and G mRNAs by 99.7%, when transfected with siRNA/N. Therefore, an siRNA sequence targeting the N gene was able to inhibit the AMPV production in vitro. In future studies, a combination of siRNAs targeting the RNA-polymerase complex may be used as a tool to study AMPV-infected cells or as an antiviral therapy / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Clarice Weis Arns, Dagmar Ruth Stach-Machado / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T14:40:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Coswig_LiaTreptow_D.pdf: 19863975 bytes, checksum: 7e0e923baa4947ed3f77ff3ca34747e9 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: o Metapneumovírus Aviário (AMPV), também denominado vírus da rinotraqueíte dos perus (TRT), é um vírus que acomete e causa infecção no trato aéreo superior das galinhas e perus. Além da infecção respiratória, em poedeiras e matrizes está associado com uma queda significativa na produção de ovos. Em galinhas o vírus está relacionado com a Síndrome da Cabeça Inchada (SCI), uma enfermidade multifatorial, e por este motivo é importante o diagnóstico diferencial. Testes realizados com anticorpos monoclonais (Mabs) e técnicas moleculares são capazes de detectar diferenças entre os subtipos do vírus. Os métodos de diagnóstico incluem isolamento ou detecção da partícula viral ou testes sorológicos. O isolamento das amostras virais SHS-BR-121 (subtipo A) e STG-SHS-1439 (subtipo B) foi realizado em cultura de anel de traquéia, em fibroblasto de embrião de galinha (FEG) e em células chicken embryo related (CER). A comparação das médias dos títulos obtidos para as duas amostras virais, em célula CER, apresentou diferença estatisticamente significativa (P=0,014) com p< 0,05. Neste projeto foi avaliada a suscetibilidades de seis sistemas celulares (CER, Vero, BHK-21, HEp-2, MDBK e ED) para a multiplicação das duas amostras virais (subtipos A e B). Destes sistemas as células CER, Vero e BHK-21 demonstraram ser apropriadas para a replicação vira!. Os títulos nestas células variaram de 105.5 a 107,o/mL DICC50 , para o vírus SHS-BR-121, e 105,5 a 106.0/mL DICC50 para o vírus STG-SHS-1439. As diferenças entre as médias dos títulos nos diferentes sistemas celulares foi estatisticamente significativa para a amostra SHS-BR-121 inoculada em CER em relação as células Vero e BHK-21 (P= 0,01 e P=0,004, respectivamente) com p< 0,05. Para a amostra STG-SHS-1439 não houve diferença estatística significativa, com p<0,05. A curva da cinética viral foi realizada para as duas amostras virais, em três sistemas celulares, CER, Vero e BHK-21, demonstrando estas diferenças. Foram produzidos anticorpos monoclonais contra o AMPV isolado no Brasil, sendo obtidos cinco anticorpos monoclonais para o antígeno viral através da fusão celular que apresentaram os isotipos IgG1, IgG2a e IgG2b quando da isotipagem. Dos cinco anticorpos monoclonais, três possuíam atividade neutralizante e quatro deles inibiram a fusão invitro. No teste de soroneutralização cruzada foram utilizadas três amostras virais para a análise, sendo elas SHS-Br-121, STG 854/88 e TRT-SHS-1439. Todos os anticorpos monoclonais apresentaram resultado positivo em relação à amostra homóloga, sendo que três apresentaram resultados positivos também para as amostras heterólogas. Os resultados confirmam que os dois anticorpos monoclonais descritos podem ser utilizados com importante ferramenta nos estudos epizootiológicos e para o diagnóstico específico dos subtipos na infecção pelo Metapneumovírus Aviário / Abstract: Avian Metapneumovirus (AM PV) , also denominated virus of the rhinotracheitis of the turkeys, it is a virus that attacks and it causes infection in the upper respirator) tract of chickens and turkeys. Besides the respiratory infection, in breeders and layers is associated with a significant fall in the production of eggs. In chickens the virus is related with the Swollen Head Syndrome (SHS), an illness multifactorial and for this reason it is very important the differential diagnosis. Tests accomplished with monoclonal antibodies (Mabs) and molecular techniques are capable to detect differences among the subtypes of the virus. Methods for the diagnosis of AMPV infections include detection or isolation of the virus itself, demonstration of a specific antibody response to the virus. For the primary isolation of the two samples of AMPV SHS-BR-121 (subtype A) and STG-SHS-1439 (subtype B) was it accomplished ir chicken embryo tracheal" organ culture (TOC), in chicken embryo fibroblast cell culture (CEF) and was it accomplished in cell line chicken embryo related (CER). Done the comparison of the averages of the titers obtain for the two strains, in cellline CER, did present statistically significant difference (P=0,014) with p< 0,05. The growth of SHS121-BR and STG-SHS-1439 was evaluated in six different celllines (CER, Vero, BHK21, HEp-2, MDBK and ED). CER, Vero and BHK-21 showed to be the most appropriate for virus multiplication. The titers in these cells varied from 105.5 to 107,o/mL !CID50, for the virus SHS-BR-121, and 105,5 to 106,o/mL TCID50 for the virus STG-SHS71439. The differences among the averages of the titers in the different cell lines was statistically significant differences (P=0,01) with p<0,05 for the strain SHS-BR-121 in CER cellline. One-step growth curves of the strains SHS-BR-121 and STG-SHS-1439 in CER, Vero and BHK-21 showed that there was not statistically significant difference in the infectious virus titers from 0 to 60 hours after infection. Five monoclonal antibodies were obtained for the viral antigen through the cell fusion that showed the isotypes IgG1, IgG2a and IgG2b, when of the characterization of Mabs. Three of them showed neutralizing activity and four inhibited the fusion in vitro. These MAbs were used to investigate antigenic relationship among three strains (SHS-BR-121, STG 854/8o/and TRT1439/91) of a MPV subtypes A and B using cross-neutralization test. When the five hybridomas were analyzed showed result positive for the homologus virus. In relation t4 two samples of heterologus AMPV three Mabs were positive to heterologus AMPV. Th4 results confirm that the two monoclonal antibodies described can be used as a valuable tool in the epizootiological and serological studies, and also for the specific diagnosis o the subtypes in the infection for Avian Metapneumovirus / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-12-08T12:17:08Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - João Paulo Gomes de Sousa - 2017.pdf: 1886122 bytes, checksum: 3663c656c9cf7fc3f9f9b7cecfcfc03d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-12-08T12:17:43Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - João Paulo Gomes de Sousa - 2017.pdf: 1886122 bytes, checksum: 3663c656c9cf7fc3f9f9b7cecfcfc03d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-08T12:17:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - João Paulo Gomes de Sousa - 2017.pdf: 1886122 bytes, checksum: 3663c656c9cf7fc3f9f9b7cecfcfc03d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-11-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The human metapneumovirus, first discovered and described in 2001, has been related to infections in the upper and lower respiratory tract, in all age groups, with severe cases frequently associated with children under five years old, elderlies and immune-compromised people. The present study aims to investigate the occurrence of hMPV in the pediatric population attended in the pediatry referral hospital, in the city of Goiânia - Goiás, evaluating symptomatic and asymptomatic patients. During the period of may/2014 and may/2015 251 nasal swab samples were collected from kids with age up to six years old, with respiratory infection symptoms or asymptomatic. The viral RNA was extracted using the QIAamp cador pathogen mini kit, and the extraction products were submitted to the reverse transcription reaction. The cDNA was submited a nested-PCR using specific primers to the amplification of a conserved region corresponded to the M gene. It was observed a global positivity index for the hMPV of 14.7% (37/251). In the group of children with respiratory infection, the positivity index was 16.6%, however, a significant index was also observed among asymptomatic children (12.3%). Analysis regarding the sample collection period did not show a statistically significant difference, reinforcing literature data that describe the circulation of this pathogen all year long. In Brazil there are few studies regarding the epidemiology of hMPV infections, being this the first report of hMPV occurrence in midwest, contributing to a better understanding of the role played by hMPV in the context of respiratory tract infections. / O Metapneumovírus Humano (hMPV), descoberto e descrito em 2001, vem sendo relacionado a infecções no trato respiratório superior e inferior, em todas as faixas etárias, com quadros graves mais frequentemente associados a crianças menores que cinco anos, idosos e imunocomprometidos. O presente estudo teve como objetivo investigar a ocorrência do hMPV em população pediátrica atendida em hospital de referência pediátrica do município de Goiânia-Goiás, avaliando pacientes sintomáticos e assintomáticos. Para isso, durante o período de maio/2014 a maio/2015 foram coletadas 251 amostras de swab nasal de crianças com idade inferior a seis anos de idade, apresentando quadro de infecção respiratória ou assintomáticas para a mesma. O RNA viral foi extraído utilizando o Kit QIAamp® cador® Pathogen Mini Kit e os produtos de extração foram submetidos à reação de transcrição reversa. A partir do DNA complementar obtido foi realizada uma nested-PCR utilizando iniciadores específicos para amplificação de uma região conservada correspondente ao gene M. Do total de amostras investigadas, foi observado um índice global de positividade para o hMPV de 14,7% (37/251). No grupo de crianças com quadro de infecção respiratória o índice de positividade foi de 16,6%, entretanto índice significativo também foi observado entre crianças assintomáticas (12,3%). Análise em relação ao período de coleta não demonstrou diferença estatisticamente significativa, reforçando dados da literatura que descrevem a circulação deste agente durante todo o ano. No Brasil, existem poucos estudos a respeito da epidemiologia das infecções por hMPV, sendo este o primeiro relato de ocorrência do hMPV na região centro-oeste, contribuindo para uma melhor compreensão do papel deste agente no contexto das infecções do trato respiratório.

Orientadores: Clarice Weis Arns, Luciana Konecny Kohn / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T18:01:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martini_MatheusCavalheiro_M.pdf: 571995 bytes, checksum: 52ec8a0bed8fa3efd4434ec2a2e6a100 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Para avaliar a atividade antiviral dos extratos de plantas brasileiras foram eleitos o Metapneumovirus aviário (aMPV) e o vírus Respiratório sincicial bovino (BRSV) pertences à família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae, gêneros Metapneumovirus e Pneumovirus respectivamente. Tanto o aMPV quanto o BRSV são vírus semelhantes aos que causam doenças em humanos como o vírus respiratório sincicial humano (HRSV) e metapneumovírus humano (hMPV). O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade antiviral de 12 diferentes espécies de plantas: Pterodon emarginatus Vogel.; Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc.; Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen; Virola sebifera Aubl.; Gaylussacia brasiliensis (Spreng.) Meisn.; Maytenus ilicifolia (Schrad.) Planch.; Bursera aloexylon (Schiede ex Schltdl.) Engl.; Aspidosperma tomentosum Mart.; Copaifera langsdorffii Desf; Baccharis dracunculifolia DC.; Arrabideae chica (Humb. & Bonpl.) B.Verl.; Aniba rosaeodora Ducke (Lin 3). Para realizar os estudos antivirais foi utilizada concentrações máximas não tóxicas para as diferentes linhagens celulares utilizadas frente aos dois vírus. Para os ensaios antivirais foram utilizadas a linhagens CER (Chicken embryo related cells) e CRIB (bovine viral diarrhea virus-resistant clone of MDBK cells) para o aMPV e BRSV respectivamente. Os extratos brutos com atividade antiviral foram submetidos a uma curva concentração resposta com diferentes concentrações de extrato na presença de 100 DICC/mL de cada amostra viral através do ensaio colorimétrico MTT [3-(4,5- dimetiltiazol-z-yl)-2,5 difeniltertrazolim brometo] determinando assim a concentração antiviral 50% (EC50). Para determinar o mecanismo de ação dos extratos e os vírus nas células foram utilizados três diferentes tratamentos: (i) Pré-tratamento (célula tratada com extrato e posterior inoculação com a amostra viral); (ii) Pós-tratamento (célula inoculada com a amostra viral e depois tratada com o extrato); (iii) Virucida (extrato e vírus mantidos juntos e posterior inoculação na cultura celular). O extrato foi considerado ativo quando houve diminuição do título viral em 1,5 log em relação ao titulo viral controle. Os resultados mostraram que todos os extratos testados obtiveram concentrações não tóxicas para as diferentes linhagens celulares. Em relação à atividade antiviral o extrato da espécie Aspidosperma tomentosum apresentou atividade frente ao BRSV e aMPV, ambos no pré-tratamento. Os extratos das espécies Virola sebifera; Arrabidaea chica; Gaylussacia brasiliensis e Anniba rosaeodora apresentaram atividade antiviral para o aMPV no pós-tratamento. Nenhum extrato bruto apresentou atividade de "vírus-inativação" em relação aos vírus avaliados. Os demais extratos não apresentaram atividade antiviral significativa para nenhum destas espécies virais. O ensaio antiviral deste estudo poderá continuar sendo utilizado como triagem para outras espécies em busca de substâncias com potencial medicinal. As diferentes atividades de ação dos extratos sugerem a ocorrência de mecanismo de ação distinto entre os vírus avaliados / Abstract: To evaluate the antiviral activity of extracts from Brazilian plants two different viruses were elected Avian metapneumovirus (aMPV) and bovine respiratory syncytial virus (BRSV) members of the family Paramyxoviridae, subfamily Pneumovirinae, Pneumovirus and Metapneumovirus genera respectively. Both viruses are similar to those that cause humans diseases such as respiratory syncytial virus (HRSV) and human metapneumovirus (hMPV). The purpose of this study was to assess the antiviral activity of 12 different plant species: Pterodon emarginatus Vogel; Kielmeyera coriácea Mart. & Zucc.; Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen; Virola sebifera Aubl.; Gaylussacia brasiliensis (Spreng.) Meisn.; Maytenus ilicifolia (Schrad.) Planch. ex. Reiss; Bursera aloexylon (Schiede ex Schltdl.) Engl.; Aspidosperma tomentosum Mart.; Copaífera langsdorffii Desf.; Baccharis dracunculifolia DC.; Arrabideae chica (Humb. & Bonpl.) B.Verl.; Aniba rosaeodora Ducke. (Lin 3). To perform the antiviral assay we used non toxic maximum concentrations of the plants extracts with different cell lines used against the two viruses. The cell lines used were CER (Chicken embryo related cells) and CRIB (bovine viral diarrhea resistant clone of MDBK cells) for AMPV and BRSV, respectively. The extracts with antiviral activity were subjected to a concentration response curve with varying concentrations of extract in the presence of 100 TCID / mL of each viral sample by colorimetric MTT assay [3 - (4,5- dimethylthiazol-z-yl) -2 , 5-diphenyltetrazolium bromide] to identify the antiviral 50% concentration (EC50). To define the mechanism of action of extracts and viruses in cells three different treatments were used: (i) pre-treatment (cells treated with plants extracts and subsequent inoculation with a viral sample), (ii) Post-treatment (cells inoculated with the viral sample and afterwards treated with the extract), (iii) Virucidal (viruses and plants extracts were kept together and after that inoculated into cell cultures). The extract was considered active when there was a decrease of virus titers by 1.5 log in contrast to the control viral titer. The results revealed that all tested extracts had no toxic concentrations for the different cell lines and detected the antiviral activity of the extract of the species Aspidosperma tomentosum against the BRSV and aMPV, both in the pretreatment conditions. The extracts of the species Virola sebifera; Arrabidaea chica; Gaylussacia brasiliensis and Anniba rosaeodora (Lin 3) exhibited antiviral activity for aMPV after treatment. The other extracts showed no significant antiviral activity for any of these viral species. The antiviral test of this study may still be used as screening for other species in search for substances with medicinal potential. The varied action activities of the extracts suggest that the occurrence of distinct mechanism of action between the viruses evaluated / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Clarice Weis Arns, Luciana Konecny Kohn / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T17:08:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sakata_SoniaTatsumi_M.pdf: 14113239 bytes, checksum: 26dfdfbc0c87c2a3a37c6143072df6c6 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Produtos naturais isolados a partir de invertebrados e organismos marinhos tem sido objeto de pesquisas contínuas ao longo dos últimos cinquenta anos, principalmente devido à sua complexidade estrutural e potentes atividades biológicas. O presente trabalho teve como proposta ampliar e aprofundar a investigação de substâncias bioativas em extratos de organismos marinhos, junto ao IQSC-USP/Projeto temático, realizando bioensaios de atividade antiviral no laboratório de virologia da Unicamp. Com o objetivo de realizar uma triagem para pesquisar substâncias com ação antiviral, foram eleitas duas espécies de vírus de destaque na avicultura, o Metapneumovirus aviário (aMPV) e o vírus da Doença de Newcastle (NDV), representantes da família Paramyxoviridae. As propriedades em comum dos vírus dentro das respectivas subfamílias, como a organização genômica, sequências das proteínas e suas atividades biológicas, permitem a utilização do aMPV como modelo de estudo para importantes agentes infecciosos da subfamília Pneumovirinae, e o NDV da subfamília Paramyxovirinae. Para a triagem de compostos antivirais foi realizada a avaliação in vitro na linhagem celular Chicken Embryo Related (CER) para a propagação dos vírus e analisar os resultados de inibição viral frente a diferentes extratos e substâncias. Dos cento e vinte e cinco extratos testados frente ao aMPV, sete demonstraram ser ativos, e seis com alto potencial antiviral. Inicialmente, cento e quarenta e sete extratos foram testados frente ao NDV, porém, o resultado foi inconclusivo devido a problema com o título da amostra viral. Assim, os sete extratos ativos e os seis com alto potencial antiviral contra o aMPV foram testados quanto à capacidade de inibição do NDV. Apesar das similaridades dos vírus da família Paramyxoviridae, os extratos não tiveram atividade contra o NDV, como ocorreu frente ao aMPV. As amostras ativas foram estudadas em três tipos de tratamento a fim de determinar os possíveis mecanismos de ação dos extratos: Pré-tratamento, fases de adsorção e/ou penetração do vírus na célula; Pós-tratamento, etapas intracelulares de replicação do vírus; e Inativação Viral. Pela análise visual do efeito citopático, os sete extratos ativos contra aMPV, quatro interrompem as etapas intracelulares de replicação do vírus, dois agem nas fases de adsorção e/ou penetração do vírus à célula, e um não tinha quantidade suficiente para realizar o teste. Com a finalidade de avaliar os possíveis mecanismos de ação com maior objetividade, menor risco de contaminação e alta especificidade, testou-se a metodologia de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. Utilizando um composto puro (pirocina A) frente ao aMPV em CER, a metodologia se demonstrou eficiente. Esse dado foi confirmando pela diminuição de RNA viral quando ocorre a atividade antiviral, dando indícios de atuação do composto em etapas intracelulares de replicação do aMPV. A detecção de extratos com atividade antiviral nas situações testadas neste trabalho corrobora o valor da biodiversidade marinha como fonte de produtos promissores na terapêutica de enfermidades virais. Portanto, a necessidade de estudos sobre esses vírus e do desenvolvimento de novos insumos a serem utilizados nos seus controles é de grande importância ponderado a crescente projeção da indústria avícola brasileira no comércio mundial / Abstract: Natural products isolated from invertebrates and marine organisms have been studied over the past fifty years, mainly due to their structural complexity and potent biological activities. This project was proposed to broaden and deepen the research of bioactive substances in extracts of marine organisms, with the IQSC-USP group, performing bioassays antiviral activity in the laboratory of virology at Unicamp. In order to perform a screening to search antiviral substances were elected two species prominent in poultry, the avian Metapneumovirus (aMPV) and Newcastle disease virus (NDV), representatives of the family Paramyxoviridae. The common properties of the virus within their respective subfamilies, such as genomic organization, sequences of proteins and their biological activities, allow the use of aMPV as a study model for important infectious agents of Pneumovirinae subfamily, and NDV Paramyxovirinae subfamily. For antiviral screening, compounds were tested in vitro using Chicken Embryo Related (CER) cell lineage for the propagation of the virus and analyze the results of viral inhibition against various substances. Among one hundred twenty five extracts tested against aMPV, seven were actives and six have been shown high antiviral potential against the virus. Initially, one hundred fourty seven extracts were tested against NDV. However, the result was inconclusive due to problems with the titer of the viral sample. Thus, the seven active extracts and six extracts with high antiviral potential against the aMPV were tested for the ability to inhibit NDV. Despite the similarities of viruses of the family Paramyxoviridae, the extracts had no activity against NDV, as occurred against aMPV. The active samples were studied in three types of treatment in order to determine the possible mechanisms of action of the extracts: Pre-treatment, stages of adsorption and / or penetration of the virus into the cell; Post-treatment, intracellular steps of virus replication; and Viral Inactivation. At visual analysis of cytopathic effect, from all 7 extracts active against aMPV, 4 disrupt intracellular steps of virus replication, 2 acts on adsorption and / or penetration stages of the virus into the cell, and 1 was not enough to perform the test. In order to assess the possible mechanisms of action more objectively, lower contamination risk and high specificity, the polymerase chain reaction (PCR) in real time methodology was tested. Using a pure compound (pirocina A) against aMPV in CER cell lineage, the methodology is demonstrated efficient. This was confirmed by the decrease of viral RNA when occurs antiviral activity, an evidence of compound's action on intracellular steps of aMPV replication. The detection of extracts with antiviral activity in this study confirms the value of marine biodiversity as a source of promising products in the viral diseases therapeutic. Therefore, the primordiality for more studies and the development of new inputs to control these viruses is extremely important to increasing of Brazilian poultry industry in world trade / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Clarice Weis Arns / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T02:57:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barros_AlyneVieira_M.pdf: 608733 bytes, checksum: 93e4d814c0f99c65741a343e76d35fc4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Estudos de plantas medicinais com conhecimento tradicional têm sido uma fonte potencial de substâncias com atividades farmacológicas e biológicas significantes. Guettarda angelica Mart. ex Müll. Arg. (Rubiaceae) é uma planta medicinal no qual suas raízes são popularmente utilizadas para diversos fins terapêuticos, incluindo veterinário. Estudos antimicrobianos com raízes desta planta também relataram uma atividade in vitro contra bactérias. Como as infecções virais ainda continuam sendo um sério problema mundial, a etnofarmacologia fornece uma abordagem alternativa para descoberta de novos agentes antivirais. O objetivo do presente trabalho foi o estudo antiviral de extratos da casca das raízes, folhas e sementes de G. angelica frente aos herpesvírus bovino (BoHV-1), suíno (SuHV-1) e equino (EHV-1), reovírus (ARV) e metapneumovírus aviário (aMPV). A atividade antiviral foi testada in vitro em células Vero e MDBK utilizando os ensaios de redução do título viral e o ensaio quantitativo colorimétrico através do MTT. Inicialmente, a concentração máxima não-citotóxica (MNCC) dos extratos foi determinada nas células através da observação de suas alterações morfológicas. Estudos realizados através da redução dos títulos virais mostrou que apenas o extrato aquoso de sementes (AEs) apresentou uma atividade antiviral contra o BoHV-1, SuHV-1, EHV-1 e ARV. Assim, esse extrato foi posteriormente avaliado pelo método MTT para determinação do CC50 (concentração citotóxica a 50%), IC50 (concentração inibitória a 50%) e o SI (índice de seletividade). Os valores de CC50 do extrato AEs foram 400,60 e 920,50 para células Vero e MDBK, respectivamente. E os valores de IC50 e SI foram 22, 79 e 40,39 para BoHV-1; 91,30 e 10,08 para SuHV-1; 19,95 e 20,08 para EHV-1; e 23,59 e 17,00 para ARV. Esses resultados indicam que a semente de G. angelica contém compostos com atividade antiviral promissora e baixa toxicidade / Abstract: Study of medicinal plants with traditional knowledge has been a potential source of substances with significant pharmacological and biological activities. Guettarda angelica M. (Rubiaceae) is a medicinal plant where its roots are popularly used for various therapeutic purposes including veterinary. In vitro antimicrobial studies also related antibacterial activity of these roots against bacteria. Like viral infections still remain a serious worldwide problem, the ethnopharmacology provides an alternative approach for discovery of new antiviral agents. The aim of the present work was the antiviral study of extracts from roots bark, leaves and seeds of G. angelica against bovine (BoHV-1), swine (SuHV-1) and equine (EHV-1) herpesviruses, avian reovirus (ARV) and metapneumovirus (aMPV) The antiviral activity was tested in vitro on Vero and MDBK cells using the viral titer assay and the quantitative colorimetric assay through MTT. Initially, the maximum non-citotoxic concentration (MNCC) of extracts was determined in cells by observation of their morphological alterations. Studies through the reduction of viral titers showed that only the aqueous extract from seeds (AEs) presented an antiviral activity against BoHV-1, SuHV-1, EHV-1 and ARV. Then, this extract was further evaluated by MTT method to determine the CC50 (50% cytotoxic concentration), IC50 (50% inhibitory concentration) and SI (selectivity index). The values of CC50 of AEs extract were 400.60 and 920.60 to Vero and MDBK cells, respectively. And the values of IC50 and SI were 22.79 and 40.39 for BoHV-1; 91.30 e 10.08 for SuHV-1; 19.95 and 20.08 for EHV-1; 23.59 and 17.00 for ARV. These results indicate that the seeds from G. angelica contain composts with promising antiviral activity and low toxicity / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica