The final publication is available at http://dx.doi.org/10.1016/j.jtcvs.2013.11.054. Motoaki Ohnaka, Akira Marui, Kenichi Yamahara, Kenji Minakata, Kazuhiro Yamazaki, Motoyuki Kumagai, Hidetoshi Masumoto, Shiro Tanaka, Tadashi Ikeda, Ryuzo Sakata, Effect of microRNA-145 to prevent vein graft disease in rabbits by regulation of smooth muscle cell phenotype, The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Volume 148, Issue 2, August 2014, Pages 676-682.e2, ISSN 0022-5223. / 京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第18544号 / 医博第3937号 / 新制||医||1006(附属図書館) / 31444 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 木村 剛, 教授 野田 亮, 教授 瀬原 淳子 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Background: The physiological and pathophysiological roles of secreted membrane-enclosed vesicles known as extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. EVs and their encapsulated molecular material including microRNAs are key mediators of intercellular communication, making EVs analogous to a message in a bottle. This discovery has fundamentally changed the study of gene regulation, and understanding the central role of EVs and their cargo in health and disease will generate new opportunities for basic biology, diagnostics, and disease treatment. EV release and the packaging of molecular material into EVs can be altered by stressors such as air pollution exposure. Exposure to air pollution is associated with significant morbidity among individuals with asthma, especially children who participate in more frequent outdoor activities and are more susceptible to exposure due to their narrower airways and higher breathing rate. Thus, sensitive biomarkers of air pollution exposure are needed to identify children at risk of worsened symptoms and asthma exacerbations. Given their role in cell-to-cell communication, EVs also represent a plausible molecular mechanism in the etiology of disorders such as aging-related cognitive decline. Individuals with mild cognitive impairment and experiencing increased rates of cognitive decline are more likely to develop Alzheimer’s disease and other dementias, signifying the importance of identifying and treating cognitive impairment early. More precise identification of the neurobiological processes of cognitive decline in aging populations may provide critical insights into the precursors of late-life dementias and identify health interventions that can delay cognitive impairment or therapeutic targets for treatment. This dissertation evaluates the utility of EV-encapsulated microRNAs (EV-miRNAs) as biomarkers of environmental exposure (i.e., air pollution) and assesses their role in disease risk (i.e., cognitive decline) in two separate studies. First, in Chapters 2-3, using a cohort of children with asthma in the greater Boston area, we describe saliva EVs isolated from these children using a high-throughput method and explore the potential of salivary EV-miRNAs as easy-to-measure biomarkers of exposure to fine particulate matter (PM2.5), nitrogen dioxide (NO2), and ozone (O₃). Then, in Chapter 4, we evaluate the association between EV-miRNAs and cognitive function and rates of cognitive decline in a cohort of elderly men and discuss the utility of circulating EV-miRNAs as biomarkers of risk. Furthermore, we discuss the pathways that these EV-miRNAs target if they play a causal role in cognitive decline which could have implications for development of therapeutics. Methods: Drawing from the School Inner-City Asthma Study (SICAS), we isolated salivary EVs and EV-miRNA from children with asthma for analysis in relation to ambient exposure to PM₂.₅, NO₂, and O₃. In accordance with the recommended minimal experimental requirements for the definition of EVs, in Chapter 2 we employ multiple orthogonal methods to describe the EVs that were isolated from cell-free saliva using a high-throughput polymer-based reagent (ExoQuick-TC). In Chapter 3, we utilize EV-miRNA data generated via RNA sequencing and ambient air pollution data estimated using a validated spatiotemporal high-resolution model. We perform differential expression analyses to examine the effect of high exposure to PM₂.₅, NO₂, and O₃ on saliva EV-miRNA abundance. In Chapter 4, we leverage data from the Normative Aging Study, a longitudinal cohort of elderly men, to investigate whether circulating EV-miRNAs are associated with cognitive function and rates of cognitive decline. We used linear models to assess the relationship between plasma EV-miRNAs and cognitive function and linear mixed models to evaluate the relationship between plasma EV-miRNAs and rates of cognitive decline. We performed gene ontology functional enrichment and pathway enrichment analyses to identify the biological pathways that these EV-miRNAs would target if they play causal roles in cognitive decline. Results:In Chapter 2, we demonstrate that EVs can be isolated from human saliva using ExoQuick-TC. The saliva EVs isolated from ExoQuick (N=180) ranged in size but were mostly ~55 nm in diameter and expressed tetraspanins CD9 and CD63, canonical markers for EVs, but did not highly express the tetraspanin CD81. In Chapter 3, in a subset of the SICAS cohort (N=69), we show that relatively high (>19.37 parts per billion) short-term ambient NO2 exposure and relatively high (>38.38 parts per million) prior-day O3 exposure are associated with down-regulation of several saliva EV-miRNAs. We did not detect differential expression of any EV-miRNAs in relation to PM₂.₅ exposure over multiple time windows of exposure. Finally, in Chapter 4, multivariable linear and linear mixed models demonstrated a relationship between several plasma EV-miRNAs and global cognitive function and rates of global cognitive decline, measured by the Mini-Mental State Examination. Functional enrichment and pathway enrichment analyses revealed that the biological pathways targeted by these miRNAs are relevant in neurodegeneration, including pathways regulating synaptic function and plasticity and neuronal death. We found no association between EV-miRNAs and cognitive function or cognitive decline as assessed by cognitive tests measuring specific domains of cognitive function. Conclusion: This work demonstrates the opportunities that EV-miRNAs can create for advancing environmental health research. EV-miRNAs may serve as sensitive biomarkers of environmental exposures as well as biomarkers of risk and may play mechanistic roles in disease. We also make recommendations for integrating EV research into the field of environmental health. Future studies should continue to evaluate the potential of EV-miRNAs and seek to identify EV-miRNAs that can serve as mechanistic biomarkers between exposures and effect across all stages of life to (1) increase our understanding of the consequences of circulating miRNA changes and the contribution of the environment to heterogeneous disorders, (2) advance development of non-invasive diagnostics to allow for longitudinal monitoring, and (3) pave the way for new opportunities for disease prevention and treatment.

Biological systems, their physical structure and their functions, are built, maintained, and controlled by the activity of enzymes. Understanding how enzymes contribute to the regulation of various pathways and processes allows us to gain a deeper understanding of the entirety of the biological system. As changes in enzyme activity are often essential for the pathogenesis of multiple and varied diseases, identifying these changes represents a crucial step to both understanding the disease and preventing its progression within the individual. Enzymes’ functional output can be controlled by numerous different mechanisms, including control of transcription and translation, subcellular localisation, co-factor interactions, or chemical modification to specific amino acids. Activity-based protein profiling allows the potential for activity of target enzymes to be measured, thereby gaining a more accurate representation of the functional state of the biological system. In this work, profiling differential enzyme activity allows the discovery of previously unknown links between metabolic regulatory enzymes and infection by the hepatitis C virus (HCV). The novel probe wortmannin-yne is described and is shown to be able to report on the activity multiple kinases, including MAPK1, whose activity is dysregulated during HCV replication. Novel probes designed to target a smaller selection of kinases, phosphatidylinositol kinases, are reported and are shown to be capable of measuring HCV-induced changes to not only kinase activity but also regulatory protein-protein interactions with the phosphoinositide kinases. Lastly, the role of microRNA-27b in the HCV-induced dysregulation of lipid metabolic enzymes is examined. Three novel targets of microRNA-27b are identified, and their dysregulation is shown to have an effect on the life cycle of HCV. Altogether, this work has developed new tools for the study of metabolic enzymes and identified new avenues of investigation into the dysregulation of lipid metabolism.

Le phéochromocytome (PCC) est une tumeur neuroendocrine rare qui se développe principalement aux dépens des cellules chromaffines de la médullo-surrénale. Dans la majorité des cas, les PCCs sont caractérisés par une hypersécrétion de catécholamines responsables de divers effets délétères chez les patients dont le principal est une hypertension (phéochromocytomes symptomatiques, PS). Cependant, il existe également une forme particulière de PCCs asymptomatiques qui sécrètent des taux physiologiques de catécholamines (phéochromocytomes incidentaux, PI). Parmi les patients porteurs de PI, certains sont hypertendus (PIH) et d’autres non (PIN). Afin de mieux caractériser les différents profils sécrétoires de PCCs (PS et PI), nous avons recherché une implication potentielle des microARNs (miRNAs). Nous avons réalisé une analyse transcriptionnelle des miRNAs exprimés dans 32 échantillons de PCCs (12 PS, 12 PIN et 8 PIH). Le miRNome a été réalisé par qRT-PCR microfluidique (Taqman Low Density Array, TLDA) pour 671 miRNAs. L’analyse statistique (Limma) des données d’expression a permis d’identifier 4 miRNAs significativement sur-exprimés (hsa-miR-7-1-3p, 7-2-3p, 26a-1-3p et 550a-3p) et 3 miRNAs sous-exprimés (497-3p, 32-5p, 190b-5p) dans les tumeurs PIN par rapport aux PS. Pour identifier les cibles potentielles des miRNAs, de nombreux logiciels de prédictions bioinformatiques sont disponibles en ligne mais les résultats qu’ils génèrent sont très divergents. Afin de contourner ce problème nous avons développé miRabel, un nouvel outil de prédiction des cibles potentielles des miRNAs et des fonctions biologiques qui leurs sont associées. Le principe général consiste à agréger les résultats de 3 autres algorithmes de prédiction sélectionnés pour leur complémentarité. Au final, les analyses des courbes ROC (Receiver Operating Characteristic), de la précision et du Recall ont montré que cet outil est plus efficace i) que les algorithmes qu’il agrège et ii) que d’autres logiciels de prédictions couramment utilisés tels que miRWalk, MBSTAR et TargetScan. Une analyse d'enrichissement (Modular Enrichment Analysis ou MEA, Genecodis3) des cibles prédites pour les miRNAs différentiellement exprimés a révélé qu’ils peuvent moduler significativement l’activité de quelques dizaines de voies de signalisation dont celles du cytosquelette d’actine et des SNAREs (impliquées dans le transport vésiculaire). En se basant sur l’expression des miRNAs, leurs énergies d’hybridation avec leurs cibles ainsi que leurs effets physiologiques potentiels, les ARNm des gènes PAK3, MLCP, MLCK (cytosquelette d’actine), SNAP25 et STX1A (SNAREs) ont été retenus pour la suite de l’étude. Les essais luciférases ont mis en évidence une interaction entre la totalité de l’extrémité 3’UTR des ARNm de MLCK et miR-32, STX1A et miR-550a-3p, SNAP25 et miR-7-1-3p ainsi que miR-550a-3p. Les autres interactions testées se sont révélées négatives. Les analyses par RT-qPCR ont montré une diminution significative du niveau d’ARNm de MLCK et de STX1A suite à la transfection de miR-32-5p et miR-550a-3p respectivement. Concernant SNAP25, un effet inhibiteur de miR-550a-3p / 7-1-3p est observé. Cet effet a été confirmé au niveau protéique pour STX1A et SNAP25. / Pheochromocytomas (PCC) are rare neuroendocrine tumors which arise from chromaffin cells of the adrenal medulla. In most cases, PCCs are characterized by a hypersecretion of catecholamines, which is responsible for most of deleterious effects in the patients with hypertension being the main symptom (symptomatic pheochromocytomas, SP). However, some PCCs are asymptomatic and secrete physiological levels of catecholamines (Incidental Pheochromocytomas, IP). Among patients with an IP, some are hypertensive (HIP) and other are strictly normotensive (NIP). In order to better understand the different secretory profiles of PCCs (SP and IP), we investigated the potential role of microRNAs (miRNAs) in this process. We started by identifying differentially expressed miRNAs between 12 SP, 12 NIP and 8 SP. The miRNome was done by microfluidic qRT-PCR (Taqman Low Density Array, TLDA) for 671 miRNAs. Statistical analysis (Limma) of the expression results identified 4 miRNAs significantly over-expressed (hsa-miR-7-1-3p, 7-2-3p, 26a-1-3p et 550a-3p) and 3 under-expressed (497-3p, 32-5p, 190b-5p) in NIP tumors when compared to SP. To identify potential miRNAs’ targets, numerous bioinformatic prediction methods are available but their results are quite divergent. To circumvent this issue, we developed miRabel, a new miRNAs’ targets prediction tool and their associated biological functions. MiRabel aggregated the results of 3 other prediction algorithms selected for their features complementarity. The analysis of ROC, precision and recall curves showed that this tool is more efficient i) than the aggregated prediction methods and ii) than other recent or widely used tools such as miRWalk, MBSTAR and TargetScan. A Modular Enrichment Analysis (MEA, Genecodis3) of the miRNAs’ predicted targets revealed that they could potentially regulate the activity of a few pathways of which the actin cytoskeleton and the SNAREs (involved in vesicular transport). PAK3, MLCP, MLCK (Actin cytoskeleton), SNAP25 and STX1A (SNAREs) were selected to be experimentally validated based on miRNA’s expression, hybridization energy and potential physiological impact. Experimental validations of the selected interactions are achieved by luciferase gene reporter, RT-qPCR assays and western-blots following the transfection of studied miRNAs. Luciferase assays showed a direct interaction between the whole 3’UTR of MLCK mRNA and miR-32-5p, STX1A and miR-550a-3p, SNAP25 and miR-7-1-3p as well as miR-550a-3p. The other tested interactions came out to be negative. A significant decrease of MLCK mRNA and STX1A were observed by RT-qPCR analysis after transfecting miR-32-5p and miR-550a-3p respectively. As for SNAP25, the inhibitory effect of miR550a-3p/7-1-3p could be observed. This effect was confirmed at the protein level by western-blots for STX1A and SNAP25. We then evaluated the physiological effect of miR-550a-3p/7-1-3p on the regulated secretion of PC12 rat PCC cells. This was achieved using a nano-luciferase fused to growth hormone 1 (GH1). Once stimulated (59 mM potassium and 2 mM barium), miR-550a-3p over-expression decreased the secretory capacity of PC12 cells while miR-7-1-3p could not. This project represents the first study aiming to understand the regulation of the catecholamine secretion pathway by miRNAs in the pathophysiological context of PCC patients. Eventually, the characterization of this miRNA’s network should improve patient care in the field of hypersecreting neuroendocrine tumors.

Depuis la découverte fondatrice de la présence de cellules souches neurales (NSCs) multipotentes dans le cerveau des mammifères adultes, plusieurs études ont révélé l'importance de ces cellules pour le maintien de l'homéostasie du cerveau. Notamment, des perturbations dans l'équilibre des NSCs ont été associées au vieillissement et à diverses pathologies neurologiques, ce qui suscite un intérêt croissant pour ces cellules. Les NSCs résident dans des zones germinatives restreintes; dans le rongeur adulte les NSCs sont localisées principalement dans deux niches neurogéniques bien établies dans le télencéphale, ce qui contraste avec la situation chez le poisson zèbre adulte où des niches de NSCs actives ont été identifiées dans tout le cerveau, y compris dans le télencéphale dorsal (pallium). Aussi bien chez les rongeurs que le poisson zèbre, les NSCs adultes présentent les deux propriétés fondamentales des cellules souches: elles sont multipotentes, c’est-à-dire capables de générer de nouveaux neurones et cellules gliales, et ont la capacité d'auto-renouvellement à long terme, permettant leur maintien au long de la vie adulte. A la différence des progéniteurs neuronaux embryonnaires (NPCs), une caractéristique de ces NSCs adultes est qu’elles résident la plupart du temps dans un état d’arrêt réversible du cycle cellulaire appelé quiescence. Cet état, activement maintenu, est censé protéger la réserve de NSCs d’un épuisement prématuré, d’où l'importance de déchiffrer les mécanismes moléculaires de régulation de l’équilibre entre la quiescence et l’activation de ces cellules vers la neurogenèse.Les microARNs constituent une classe de petits ARN régulateurs, qui jouent un rôle crucial dans le contrôle d’états cellulaires et des transitions entre ces états. Ils sont capables de réagir rapidement à des signaux à la fois intra- et extracellulaires, qui peuvent moduler aussi bien leur niveau d’expression que leur impact fonctionnel, leur donnant ainsi la capacité de coordonner diverses signaux pour induire des transitions d'état cellulaire. Un microARN en particulier, miR-9, a été montré comme jouant un rôle clé et conservé au cours de la neurogenèse embryonnaire. L'objectif principal de cette étude était d'étudier, pour la première fois, un rôle potentiel de miR-9 dans le contrôle des NSCs, dans un contexte physiologique dans lequel la majorité des NSCs sont quiescentes - le pallium adulte du poisson zèbre. Nous avons constaté que miR-9 est exclusivement exprimé dans une sous-partie des NSCs, met vraisemblablement en évidence un « sous-état » de quiescence. De plus, nous avons pu montrer que miR-9 ancre les NSCs dans un état de quiescence, en partie via le maintien d’un niveau élevé d’activation de la voie de signalisation Notch. De façon surprenante, nous avons également identifié une modification de la localisation subcellulaire de miR-9 au cours du temps: alors que miR-9 est localisé dans le cytoplasme de tous les NPCs chez l’embryon ou le juvenile, chez le poisson adulte miR-9 est localisé dans le noyau des NSCs en quiescence. En outre, la localisation nucléaire de miR-9 dans ces NSCs quiescentes est fortement corrélée avec la localisation nucléaire des protéines effectrices des microARNs, les protéines Argonaute (Agos), ce qui suggère un rôle fonctionnel de miR-9 dans le noyau. De fait, l'élucidation du mécanisme de transport nucléo-cytoplasmique de miR-9/Agos nous a permis de manipuler leur localisation, et d’observer un impact de cette localisation sur l’état de quiescence vs activation des NSCs. L’ensemble des résultats de cette étude identifient ainsi miR-9 comme un régulateur essentiel de la quiescence des NSCs, fournissent pour la première fois un marqueur moléculaire d’un sous-état de quiescence spécifique du cerveau adulte et suggèrent l'implication d'un mécanisme inédit de régulation par les microARNs dans le maintien de l'homéostasie des réserves de NSCs. / Since the seminal discovery of multipotent neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian brain, multiple studies have unravelled the importance of these cells for maintaining brain homeostasis. Notably, disturbances in NSC equilibrium have been linked to physiological aging and various neurological pathologies thus sparkling interest in harnessing them for use in regenerative medicine. NSCs reside in distinct germinal zones; in the adult rodent brain NSCs are found mainly in two well-established neurogenic niches in the telencephalon which contrasts with the situation in the adult zebrafish where NSC niches are widespread throughout the brain, including in the dorsal telencephalon or pallium. In both the rodent and zebrafish brains, adult NSCs display fundamental stem cell properties: they are multipotent, e.g. capable of generating new neurons and glia throughout adult life, and have the capacity for long-term self-renewal. Similar to stem cells in other adult tissues, and in contrast to embryonic neural progenitors, a hallmark of these adult NSCs is their relative proliferative quiescence. Quiescence is an actively maintained, reversible state of cell-cycle arrest and generally thought to protect against exhaustion of the stem cell pool. In line with this, disrupting the balance between quiescent and activated NSCs leads to a premature depletion or permanent cell-cycle exit of these cells highlighting the importance of fully deciphering the mechanisms regulating this equilibrium. microRNAs, a major class of small pleiotropic regulatory RNAs, play crucial roles in reinforcing developmental and transitional states. They are capable of reacting to environmental cues, both cell-intrinsic and -extrinsic, with varying outputs such as changing their regulatory functions and expression levels, thus enabling them to coordinating diverse cues to induce cell-state transitions. One microRNA in particular, miR-9, is a highly conserved master regulator of embryonic neurogenesis and in the embryonic zebrafish brain, it establishes a primed neural progenitor state enabling them to quickly respond to cues to differentiate or proliferate. The primary goal of this study was to investigate, for the first time, a potential role for miR-9 in influencing NSC state in a physiological context in which the majority of NSCs are quiescent – the adult zebrafish pallium. We found that miR-9 is exclusively expressed in quiescent NSCs and highlights a “sub-state” within quiescence. In part by maintaining high levels of Notch signalling, a known quiescence promoting pathway, miR-9 anchors NSCs in the quiescent state. Strikingly, we identified a conserved age-associated change in the subcellular localization of the mature miR-9 from the cytoplasm of all embryonic/juvenile neural progenitors to the nucleus of a subset of quiescent NSCs in the adult brain. Moreover, the nuclear expression of miR-9 in these quiescent NSCs is highly correlated with nuclear localization of the microRNAs effector proteins Argonaute (Agos), suggestive of a functional role for nuclear miR-9. Indeed, the elucidation of the nuclear-cytoplasmic transport mechanism of miR-9/Agos enabled us to manipulate their nuclear to cytoplasmic ratios which directly impacted NSC state. Altogether, these results identify miR-9 as a crucial regulator of NSC quiescence, provide for the first time a molecular marker for an age-associated sub-state of quiescence and suggest the involvement of a novel and unconventional microRNA-mediated mechanism to maintain homeostasis of NSC pools.

Le cancer colorectal (CRC) est l'un des cancers les plus agressifs. Afin de rechercher de nouveaux marqueurs de progression de ce cancer, des puces tout transcriptome et épissage, ainsi que des puces microARNs, ont été précédemment utilisées au laboratoire.Dans une première partie, l’analyse des données transcriptomiques a permis de trouver un ensemble de transcrits dérégulés dans les adénomes et dans le CRC, dont la surexpression de TIMP1, associée à la diminution de rétention de l’intron 3, par rapport à la muqueuse normale. Ce transcrit aberrant n’est pas sujet au mécanisme de dégradation active des ARNm («Nonsense-Mediated mRNA Decay »). Nous avons alors analysé les mécanismes d’épissage de TIMP1, ce qui nous a conduits à identifier hnRNPA1 comme un régulateur important, à la fois in vitro et in vivo, de la rétention de l’intron 3 de TIMP1, via sa fixation au début de l’exon 4. Le rôle de TIMP1i3 (+) dans la progression du CRC reste à identifier.Dans une seconde partie, l’analyse des données de la puce microARNs (miRs) a permis de trouver un ensemble de miRs dérégulés dans les CRC. Nous avons sélectionné des gènes codant des facteurs d’épissage dont l’expression était modifiée au cours de la progression cancéreuse, en tant que cibles possibles de certains de ces miRs. Six interactions ont été montrées (PRMT5/miR145; SRSF6/miR375; RBMX/miR23a; RBMX/miR24; RBMX/miR125a5p; SRSF11/miR143).En utilisant la technique de « Luciferase Reporter Gene Assay » couplée à la mutagenèse dirigée, nous avons montré que le miR145 régule négativement l’expression de PRMT5 par interaction avec la région 3’ non traduite du gène. Du fait du contrôle de la machinerie d’épissage des ARN prémessagers par PRMT5, nous proposons que miR145 pourrait être un régulateur général de l’épissage. / Colorectal cancer (CRC) is one of the most vaggressive cancers in the world. In order to look for new markers in progression of this cancer, all transcriptome and splice chips, as well as microRNA chips, have been previously used in the laboratory.In the first part of my thesis, transcriptomic data analysis revealed a set of deregulated transcripts in adenoma and in CRC, including overexpression of TIMP1, associated with the decrease of intron 3 retention, compared to normal mucosae. This aberrant transcript is not subject to the active mechanism of mRNAs degradation ("Nonsense-Mediated mRNA Decay"). Then we analysed the splicing mechanisms of TIMP1, which led us to identify hnRNPA1 as a major regulator, both in vitro and in vivo, of TIMP1 intron 3 retention via its binding in the beginning of exon 4. TIMP1i3 (+) role in the progression of CRC remains to be identified.In a second part, the analysis of microRNA data (miRs) revealed a set of deregulated miRs in CRC. The aim was to identify target genes for these miRs.We selected genes encoding splice factors whose expression was modified during cancer progression as possible targets for some of these miRs. Six interactions were shown (PRMT5/miR145; SRSF6/miR375; RBMX/miR23a; RBMX/miR24; RBMX/miR125a5p; SRSF11/miR143).Using the "Luciferase Reporter Gene Assay" technique coupled with site directed mutagenesis, we have shown that miR145 negatively regulated the expression of PRMT5 by interaction with its 3’untranslated translated region. Due to the control of the premessenger RNA splicing machinery by PRMT5, we propose that miR145 could be a general splicing regulator.

Les mutations hétérozygotes du gène codant pour le facteur de transcription HNF1B sont à l'origine d'un syndrome multisystémique complexe connu sous le nom de « Renal Cysts and Diabetes » (RCAD). Un modèle de souris généré dans notre laboratoire s'est avéré reproduire plusieurs caractéristiques de la maladie humaine. Nous avons réalisé un séquençage ARNm-microARN à différents stades de développement (E14,5 ; E15,5 ; E17,5) de ce modèle. Nous avons montré que les gènes les plus dérégulés étaient impliqués dans les processus métaboliques de transport, de lipides et d’acides organiques et étaient exprimés dans les tubules proximaux et, dans une moindre mesure, dans l’anse de Henlé et les canaux collecteurs. Nous avons sélectionné quatre microARN (miR-802, 194-2, 192 et -30a), régulés à la baisse et potentiellement contrôlés par HNF1B. Des expériences de transactivation de gène rapporteur dans des cellules HEK-293 ont montré que HNF1B était capable de transactiver la transcription de ces microARN via des sites de liaison présents dans les séquences régulatrices de ces gènes. En utilisant des microARN MIMICS nous avons par la suite montré que mir-802, mir-194-2 et mir-192 étaient capables d'inhiber l’expression d’un gène rapporteur contenant la région 3'UTR de HNF1B. L'analyse d'échantillons d'urine de 22 patients RCAD et de 22 contrôles sains a permis d'identifier 146 peptides excrétés de manière différentielle et associés au syndrome. En utilisant ces résultats dans un modèle mathématique, classificateur prédit efficacement le syndrome RCAD avec une sensibilité de 91.7% et une spécificité de 91.1% sur une large population de patients. / Heterozygous mutations in the gene encoding the transcription factor HNF1B are the cause of a complex multisystem syndrome known as Renal Cysts And Diabetes (RCAD). A mouse model generated in our laboratory was shown to reproduce several features of the human disease. We performed high-throughput mRNA-microRNA sequencing at different developmental stages (E14.5, E15.5, E17.5). We showed that the most down-regulated genes were involved in transport, lipid and organic acid metabolic processes and expressed in proximal tubules and to a lesser extent in the loop of Henle and collecting ducts. We then selected four microRNAs (mir-802, 194-2, 192 and -30a), which were down-regulated and potentially controlled by HNF1B. Luciferase assays in HEK-293 cells showed that HNF1B was able to specifically transactivate in a dose response mode these microRNAs through binding HNF1B-binding sites in their regulatory promoter/enhancer upstream sequences. We subsequently showed by luciferase assays using miRNA MIMICS that mir-802, mir-194-2 and mir-192 were able to inhibit luciferase vectors containing the 3’UTR of Hnf1b. Analysis of urine samples from 22 RCAD patients and 22 healthy controls led to the identification of 146 peptides differentially excreted and associated with RCAD including a similarity regarding collagen and uromodulin fragments with the RCAD mouse model. Combining the peptides into a mathematical model we used independent cohorts of patients to validate the prediction of the RCAD syndrome. Our classifier efficiently predicted RCAD syndrome with 91.7% sensitivity and 91.1% specificity on a wide population.

Les microARN (miARN) constituent une classe de petits ARN non-codants qui jouent un rôle clé dans la régulation de l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel. De nombreuses études ont démontré que la surexpression de certains miARN est liée au développement de plusieurs types de cancer. C’est pour cette raison les miARN représentent une nouvelle classe de cibles thérapeutiques à haute potentielle. Dans ce contexte, l’objectif de mon travail de thèse était la découverte de nouveaux inhibiteurs de la production de miARN oncogène. Dans ce but, j’ai suivi deux approches, différentes mais complémentaires : (i) le criblage d’une petite librairie de composés et (ii) la conception et la synthèse de nouveaux conjugués en tant que ligands de précurseurs de miARN (pré-miARN). En particulier, nous avons ciblé les miARN-372 et -373 qui sont oncogènes dans plusieurs cancers, tels que le cancer gastrique. Nous avons ainsi démontré que certains des composés criblés ou synthétisés sont capables de se lier efficacement à la structure secondaire en tige-boucle de pré-miARN avec une haute affinité, conduisant à l’inhibition de la production des miARNs correspondants. Par ailleurs, nous avons montré que certains composés possèdent une activité anti-proliférative spécifique pour les cellules de cancer gastrique et que cette activité est directement liée à une diminution de la production de miARN ciblés et au rétablissement de la traduction de ARN messenger / MicroRNAs (miRs) are a class of small non-coding RNAs that act as regulators of gene expression at the post-transcriptional level. Increasing evidence has indicated that the deregulation of miR expression is linked to various human cancers and therefore, miRs represent a new class of potential drug targets. In this context, my PhD project focused on the discovery of new inhibitors of oncogenic miRs production. Toward this aim, two different but complementary approaches were followed: (i) the screening of small libraries of compounds and (ii) the design and synthesis of new classes of conjugates as binders of miRNA precursors (pre-miRs). In particular, we focused our attention on miR-372 and miR-373, two oncogenic miRs overexpressed in various cancers, such as gastric cancer. We showed that some of the screened or of the newly synthesized compounds are able to efficiently bind to stem-loop structured precursors of the targeted miRs with high affinity, thus inhibiting the production of their corresponding mature miRs at the level of Dicer cleavage. Moreover, we found compounds bearing a specific anti-proliferative activity in gastric cancer cells overexpressing targeted miRs and this activity is directly linked to a decrease in the production of oncogenic miR-372 and -373 and to the restoration of normal mRNA translation.

Les cellules multiciliées (MCC) possèdent à leur surface apicale des centaines de cils mobiles générant un flux directionnel liquidien nécessaire par exemple pour le nettoyage des voies respiratoires. La fabrication de ces cils (multiciliogénèse) requiert une séquence d’évènements cellulaires dont un arrêt du cycle cellulaire, une réorganisation du réseau apical d’actine, une multiplication massive des centrioles suivie de leur migration au pôle apicale et de leur maturation en corps basal, à partir desquels les cils s’allongent.Mon laboratoire d’accueil a mis en évidence le rôle conservé de la famille de microARN miR-34/449 dans le contrôle de la multiciliogénèse en inhibant la voie de signalisation Notch ainsi qu’en induisant un arrêt du cycle. Au cours de ma thèse, j’ai mis en évidence un nouveau niveau de régulation de ces microARN par lequel ils contrôlent la réorganisation apicale du cytosquelette d’actine, en modulant l’expression et l’activité de certaines petites GTPases. Par ailleurs, j’ai identifié et caractérisé des séquences variantes des miR-34/449 canoniques, appelées isomiR. Tandis que ces isomiR partagent des fonctions semblables à celles de leurs homologues canoniques, ils apportent également une complémentarité d’action en modulant des transcrits cibles spécifiques. Enfin, le dernier axe de mon travail a permis d’identifier le rôle de la voie de signalisation BMP dans la multiciliogénèse ainsi que d’élucider certains des mécanismes moléculaires par lesquels elle contrôle ce phénomène. L’ensemble de nos découvertes offre une opportunité inédite pour développer des stratégies thérapeutiques dans le traitement de maladies associées à des désordres ciliaires / Vertebrate multiciliated cells (MCC) project hundreds of motile cilia at their apical surface which coordinately beat to generate a directional fluid flow necessary for many biological functions including airway cleansing. Biogenesis of multiple cilia (multiciliogenesis) follows different key cellular steps corresponding to a cell cycle arrest, a massive multiplication of centrioles which then migrate to the apical surface to form basal bodies, from which cilia elongate. In 2011, my host laboratory evidenced that the miR-34/449 family of microRNAs control vertebrate multiciliogenesis by inducing the cell cycle arrest and by repressing the Notch pathway. My thesis work has revealed a new role of miR-34/449 by demonstrating that they modulate expression and activity of small GTPases to drive the apical reorganization of the actin network, a prerequisite for basal body anchoring. Besides, I have identified and characterized variant sequences of canonical miR-34/449 family, named isomiRs. Whereas these isomiRs share common biological functions with canonical miR-34/449 miRNAs, they may also contribute to a complementary effect by targeting specific transcripts. Finally, the last part of my work has contributed to the identification of the conserved role of the BMP pathway in the control of multiciliogenesis. I have evidenced some molecular mechanisms by which the BMP signal controls this phenomenon. Importantly, I demonstrated that BMP inhibition promotes regeneration of tracheal MCC in vivo in an asthmatic mouse model. Overall, our findings offer an unprecedented opportunity to develop novel therapeutic strategies to treat diseases associated with ciliary disorders

Les maladies fibroprolifératives se caractérisent par l’accumulation de constituants de la matrice extracellulaire en réponse à une agression chronique et répétée conduisant à la destruction de l’architecture tissulaire. Les myofibroblaste, sous l’influence du TGFβ, représentent les cellules effectrices majoritaires dans ce processus. Les miARN, régulateurs négatifs de l’expression génique, interviennent dans de nombreux mécanismes physio-pathologiques dont la fibrose tissulaire mais leur mécanismes d’action et la synergie potentielle entre miARN co-régulés au sein d’un même cluster restent mal compris. Nos travaux ont consisté à caractériser l’implication du cluster miR-199/214 généré à partir du LncARN DNM3os, dans la fibrose pulmonaire. Nous avons montré que les miARN de ce cluster participent à l’activation et à la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes via la régulation des voies canoniques et non canoniques du TGF-β. Ce cluster agit également en tant qu’inhibiteur de la réparation épithéliale. In vivo, l’inhibition de l’un de ces « fibromiRs », a permis, dans un modèle murin, de réduire significativement les lésions de fibrose. Par ailleurs, de par leur présence et leur stabilité dans les fluides biologiques, les miARN représentent également une nouvelle classe de biomarqueurs diagnostiques ou pronostiques non invasifs. Nous avons ainsi montré que les niveaux sériques de miR-21-5p étaient augmentés chez les patients présentant une fibrose rénale sévère. Ces travaux soulignent l’importance des miARN dans la pathogénèse des maladies fibroprolifératives et montrent qu’ils représentent de nouvelles cibles thérapeutiques ou des biomarqueurs non invasifs. / Fibrotic diseases are characterized by the accumulation of extracellular matrix components in response to chronic aggression leading to the destruction of tissue architecture. Myofibroblasts, controlled by TGFβ, are central effectors in this process. MiRNAs, negative regulator of gene expression, are involved in many patho-physiological mechanisms, including tissue fibrosis but their mechanisms of action and the potential synergistic activity between co-regulated miRNAs within the same cluster remain poorly understood. Our work consisted in characterizing the involvement of the miR-199/214 cluster, generated from LncRNA DNM3os, in pulmonary fibrosis. We have shown that these miRNAs are involved in the activation and the differentiation of fibroblasts to myofibroblasts through the regulation of canonical and non-canonical TGF-β pathways. This cluster also acts as an inhibitor of epithelial repair. In vivo, the inhibition of one of this “FibromiR”, significantly decrease fibrosis, in a murine lung fibrosis model. In addition, because of their presence and their stability in biological fluids, miRNAs also represent a new class of non-invasive diagnostic or prognostic biomarker. We showed that serum levels of miR-21-5p were increased in patients with severe kidney fibrosis. These studies highlight the importance of miRNAs in pathogenesis of fibrotic disorders and show that they represent new therapeutic targets or non-invasive biomarkers.