Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificadores, de cerca de 20 bases de comprimento, capazes de regular negativamente a expressão gênica após a transcrição. A ação regulatória destas moléculas é indispensável para o funcionamento adequado de diversos processos biológicos, dentre eles o desenvolvimento e a manutenção da musculatura esquelética. Com o objetivo de caracterizar a população de miRNAs presentes na musculatura esquelética adulta de frangos, foi construída uma biblioteca de miRNAs a partir do músculo peitoral de indivíduos jovens (21 dias pós-eclosão). Um total de 576 clones foi sequenciado e as sequências obtidas foram agrupadas por similaridade em 98 grupos, dentre os quais 47 corresponderam à miRNAs conhecidos, 30 à outros tipos de RNA e seis à possíveis novos miRNAs. Estes dados poderão subsidiar estudos funcionais subsequentes, que visem entender a função exercida por cada uma destas moléculas na musculatura esquelética. Buscando-se associar a ocorrência e expressão dos miRNAs ao controle da miogênese, foi analisada a expressão de três miRNAs identificados na biblioteca (miR-125b, miR-221 e miR-206), envolvidos na regulação do balanço entre proliferação e diferenciação celular, mecanismo determinante da miogênese. A análise foi realizada por PCR quantitativa em diferentes estádios do desenvolvimento (nove e 17 dias embrionário e 21 dias pós-eclosão) e entre duas linhagens de frango com potencial divergente para crescimento e ganho de massa muscular. Não houve diferença significativa na expressão dos miRNAs entre as linhagens em nenhum dos estádios aferidos, entretanto, foi possível traçar a ontogenia destas moléculas ao longo do desenvolvimento do animal, o que permitiu inferências sobre as condições morfológicas e fisiológicas das células musculares em cada um dos estádios analisados. Por fim, com o objetivo de associar os dados de expressão obtidos para os miRNAs, à variações na expressão de genes alvo, aferimos a expressão de três genes: SRF, Fstl e Pola1; onde o primeiro é regulado pelo miR-133a (cuja expressão não foi aferida devido à questões metodológicas) e os dois últimos pelo miR-206. A análise foi feita também por PCR quantitativa, entre as linhagens e em diferentes estádios do desenvolvimento. Foi possível visualizar, apenas nos estádios embrionários, a relação entre a expressão do miR-206 e seus genes alvo, com uma coerência entre o aumento na expressão do miR-206 e a diminuição na expressão de Pola1 e Fstl1. A determinação do perfil de expressão dos três genes ao longo do desenvolvimento muscular permitiu inferências sobre a ação destas moléculas no balanço entre proliferação e diferenciação nas linhagens de corte e postura / MicroRNAs (miRNAs) represent a class of small and noncoding RNAs, about 20-nucleotides long that negatively regulate gene expression posttranscriptionally. The regulatory action of these molecules is essential for the proper functioning of various biological processes, including the development and maintenance of skeletal muscles. To identify miRNAs that might be important for the skeletal muscle development, we constructed a miRNA library from pectoral skeletal muscle of 21º days after birth chickens. A total of 576 clones were sequenced and these sequences were collapsed into 98 clusters. Sequence analysis identified 47 small RNAs that show significant similarities with published miRNAs, 30 with others noncoding RNAs and six sequences clusters could be identified as potentially novel miRNAs. These data may support subsequent functional studies aimed at understanding the function performed by each of these molecules in skeletal muscle of chicken. To further associate the miRNA presence with the gene expression in the controlling of myogenesis the expression patterns of tree miRNAs identified in the library (miR-125b, miR-221 e miR-206) were analyzed. These miRNAs are involved in the balance between proliferation and differentiation mechanisms that control myogenesis. The expressions of these miRNAs were measured using quantitative RT-PCR. We analyzed samples from two embryos stages (9 and 17 days) and one adult stage (21º days after birth) in two chicken lines with different potential to growth and gain of muscle mass. There were no significant differences between the lines about these miRNAs expression. But, we could predict an overview of these miRNAs expressions during the muscle development of chicken, which allowed inferences about the physiologic and morphologic conditions of the muscles cells in each analyzed stage. Also, to further associate the miRNAs results to variations in the target genes expressions, we analyzed the expression of three genes: SRF, Fstl e Pola1. The first one is target of miR-133a (not analyzed due to methodological problems), and the others are target of miR-206. We analyzed by quantitative RT-PCR different stages and two chicken lines. It was possible to observe, only in the earlier stages, a relationship between the miR-206 expression and the Pola1 and Fstl1 expression, with a consistency between the increased expression of mir-206 and decrease in expression of Pola1 and Fstl1. The determination of the profile of these three gene expressions during the muscle development allowed inferences about the action of these molecules in the balance between proliferation and differentiation process in chicken strains for broiler and layer

Orientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Coorientador: Paulo César Gomes / Banca: Maria Lúcia Taylor / Banca: Mário Sérgio Palma / Banca: Guilherme Targino Valente / Banca: Daniel Guariz Pinheiro / Resumo: Histoplasma capsulatum variedade capsulatum é um patógeno fúngico dimórfico causador de uma importante micose sistêmica, denominada histoplasmose. A patogenia da histoplasmose ocorre como resultado da inalação dos microconídios da fase miceliar, que afetam primariamente os pulmões onde ocorre a diferenciação em leveduras, que posteriormente, induzem uma infecção pulmonar e disseminação para outros órgãos, particularmente em indivíduos imunocomprometidos. Recentemente, foi estabelecida uma correlação entre o modo de infecção de H. capsulatum e a formação de biofilmes, estruturas caracterizadas como redes tridimensionais complexas que induzem, entre outros, a resistência antifúngica. Por esta razão, é emergente a identificação de um novo alvo e/ou biomarcador que possa ser selecionado, a fim de estabelecer um novo regime terapêutico e/ou ferramenta diagnóstica para a histoplasmose. Com base nisto, este trabalho tem como objetivo analisar a regulação transcricional codificante e metabólica diferencial entre as duas formas de crescimento de H. capsulatum, em biofilmes e em crescimento planctônico, bem como determinar o perfil de microRNAs (miRNAs) aberrantes em células hospedeiras em resposta à infecção com leveduras livres e biofilmes. O sequenciamento completo das regiões transcritas foi realizado utilizando a plataforma HiSeq da Illumina e a investigação do padrão de miRNAs em macrófagos (Mø) hospedeiros infectados foi conduzida empregando uma técnica de RT-qPCR (reverse trans... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Histoplasma capsulatum variety capsulatum is a dimorphic fungal pathogen that causes an important systemic mycosis, called histoplasmosis. The pathogenesis of histoplasmosis occurs as a result of the inhalation of mycelial microconidia, which primarily affect the lungs where differentiation occurs in yeast, which subsequently induce pulmonary infection and dissemination to other organs, particularly in immunocompromised individuals. Recently, a correlation was established between the mode of infection of H. capsulatum and the formation of biofilms, structures characterized as complex three-dimensional networks that induce, among others, antifungal resistance. For this reason, it is emerging the identification of a new target that can be selected in order to establish a new therapeutic strategy for histoplasmosis. Based on this, this work aims to analyze the differential transcriptional and coding transcriptional regulation between the two forms of growth of H. capsulatum in biofilms and planktonic growth, as well as to determine the profile of aberrant microRNAs (miRNAs) in host cells post-infection with free yeasts and biofilms. Complete sequencing of the transcribed regions was performed using the Illumina HiSeq platform and the investigation of the miRNA pattern in infected host macrophages (Mø) was conducted using a reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) technique. Subsequently, the production of total polysaccharides was determined in samples of planktonic cultures, biofilms and supernatant of the biofilms and, additionally, the abundance of non-protein metabolites and small peptides in these growth forms was established by LC-MS/MS. In summary, the data obtained showed that the structure of yeasts in biofilms induces a negative regulation in the direct (coding genome - mRNA) and indirectly... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Karen Cristiane Martinez de Moraes / Banca: Marcia Regina Brochetto Braga / Banca: Marcia Regina Cominetti / Resumo: As doenças hepáticas são consideradas um problema sério em todo o mundo e vários elementos influenciam o desenvolvimento dessas patologias. Diabetes, doenças de síndrome metabólica, problemas nutricionais e infecção por vírus são elementos responsáveis pelo surgimento de doenças hepáticas. Não há nenhuma estratégia terapêutica eficaz disponível para tais doenças e, por isso, são necessários mais estudos para elucidar um entendimento molecular dos mecanismos celulares. As células estreladas hepáticas (HSCs) sustentam o desenvolvimento da fibrogênese hepática pela produção exacerbada de colágeno e outros elementos da matriz, quando ativadas. Além disso, algumas terapias alternativas apontam o peptídeo Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)] como importante elemento modulador da fibrogênese hepática. Entre os elementos alvo do heptapeptídeo, os microRNAs (miRNAs) apresentam alterações em seu perfil de expressão gênica. Essas pequenas moléculas vêm sendo amplamente investigadas por suas múltiplas funções no equilíbrio celular. Assim, para o desenvolvimento de novos fármacos é muito importante entender a função moduladora da Ang-(1-7) e dos miRNAs sobre a homeostase celular. Neste estudo, foram investigados por meio da linhagem HSCs humana LX-2 elementos moduladores do citoesqueleto dessas células em diferentes condições de cultivo: culturas quiescidas, ativadas/ pró-fibrosadas, ativadas/ pró-fibrosadas e tratadas com o peptídeo vasoativo e ativadas/ pró-fibrosadas que superexpressam os miRNAs 1179 ou o miRNA 1254, por serem esses uns dos miRNAs superexpressos quando com o tratamento com o peptídeo vasoativo. Utilizando ensaios de microscopia de fluorescência e análise de expressão gênica, os resultados apontaram para efeito modulador do peptídio na reversão do processo fibrosante hepático; também foram apontados a característica deletéria .... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Liver diseases are considered a serious problem worldwide and several elements influence the development of these pathologies. Diabetes, diseases of metabolic syndrome, nutritional problems and virus infection are elements responsible for the emergence of liver diseases. However, no effective therapeutic strategy is available for such diseases, and therefore further studies are needed to elucidate a complete molecular view of cellular mechanisms. However, hepatic stellate cells (HSCs) are known to support the development of liver fibrogenesis by the exacerbated production of collagen and other matrix elements when activated. In addition, some alternative therapies point to the peptide Angiotensin-(1-7) [Ang-(1-7)] as a relevant modulatory element in the control of liver fibrogenesis. Considering the heptapetide target elements microRNAs (miRNAs) changes their expression pattern in cells under the effect of the ang-(1-7). Such small molecules have been widely investigated for their multiple roles in cell balance and homeostasis. Thus, for the development of new drugs, it is very important to understand the modulatory function of Ang-(1-7) and miRNAs on cellular homeostasis. In this study, the human HSC strain LX-2 was investigated by cytoskeletal modulators of these cells under different culture conditions: quiescent, activated / pro-fibrous, activated / pro-fibrous and vasoactive peptide-activated fibroblasts overexpressing the 1179 miRNAs or 1254 miRNA. Using fluorescence microscopy assays and gene expression analysis, the results indicated a modulatory effect of the peptidium on the reversal of the liver fibrosing process. The deleterious characteristic of clone-1179 and the potential controller of fibrogenesis modulated by clone 1254 were also demonstrated. Moreover, the combined results reinforce that the pepetide acts in system biolgy in a manner to compensate negative and ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Pedro Luiz Toledo de Arruda Lourenção / Resumo: Introdução: A Displasia Neuronal Intestinal tipo B (DNI-B) é uma entidade patológica caracterizada por anormalidades nos plexos nervosos submucosos do sistema nervoso entérico, comumente associada à constipação intestinal na infância. Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não-codificantes com um papel importante na regulação da expressão gênica, e têm sido considerados potenciais biomarcadores diagnósticos em diversas doenças. Objetivo: Determinar o perfil de expressão global de miRNAs em amostras de plasma e tecido de biópsia retal de pacientes com DNI-B. Métodos: Cinqüenta pacientes, com idade entre 0 e 15 anos, diagnosticados com DNI-B entre 1998 a 2010, foram incluídos no estudo. Amostras de sangue periférico foram coletadas de todos os 50 pacientes e 10 crianças saudáveis, sem sintomas intestinais (grupo controle). Dos 50 pacientes dos quais o sangue foi coletado, 29 também apresentavam fragmentos embolcados de tecido retal suficiente para extração de RNA. Estes materiais foram processados por microdissecção e agrupados de acordo com as diferentes camadas da parede intestinal. A extração de miRNA foi realizada utilizando o kit miRNeasy Serum / Plasma e o kit de recuperação de todos os Nucleic Acid Isolation para tecidos de biópsia. A análise global da expressão de miRNA foi realizada utilizando a plataforma TaqMan Array Human MicroRNA Card A. Análise de correlação entre a expressão de miRNA em amostras de plasma e biópsia, bem como entre os tecidos derivados das camada... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Introduction: Intestinal Neuronal Dysplasia type B (IND-B) is a pathological entity characterized by abnormalities in the submucous nerve plexuses of the enteric nervous system, commonly associated with intestinal constipation in childhood. microRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs with a potent role in gene expression regulation, and have been demonstrated as potential diagnostic biomarkers in several diseases. Objective: To determine the global expression profile of miRNAs in plasma and rectal biopsy tissue samples from patients with IND-B. Methods: Fifty patients, aged 0 to 15 years, who had been diagnosed with IND-B, from 1998 to 2010, were included in the study. Peripheral blood samples were collected from all 50 patients and an additional 10 healthy children, without intestinal symptoms (control group). Of the 50 patients from whom blood was collected, 29 also had sufficient rectal tissue for RNA extraction. Rectal biopsies were processed by microdissection and pooled according the different layers of the intestinal wall. miRNA extraction was performed using the miRNeasy Serum/Plasma Kit and the Recover All Total Nucleic Acid Isolation kit for biopsy tissues. Global miRNA expression analysis was performed using the TaqMan Array Human MicroRNA Card A platform. Correlation analysis between miRNA expression in plasma and biopsy samples as well as among tissues derived from the distinct intestinal layers was performed. Results: miRNA let-7a was over-expressed (~7 fold hi... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Introdução: O transplante renal (TR) é o tratamento de escolha para uma significativa porção de pacientes com perda crônica terminal da função renal. Apesar dos progressos obtidos, a disfunção inicial do enxerto (DIE) permanece como uma importante complicação precoce muitas vezes levando à necessidade da biópsia renal. Essa, apesar de suas limitações, riscos e custos, é considerada padrão ouro para a avaliação das disfunções dos enxertos renais. Assim sendo é imprescindível estudar e buscar biomarcadores não invasivos capazes de diagnosticar as agressões aos transplantes renais, em especial na fase de DIE, quando os parâmetros funcionais não estão disponíveis. Objetivo: Analisar e quantificar a expressão do micro Ácido Ribonucleico (miRNA) mi RNA-146a-5p em amostras de sangue periférico e tecido renal de pacientes que desenvolveram disfunção do enxerto associados a lesões de isquemia e reperfusão após transplante renal. Métodos: Trata-se de um estudo transversal. Os pacientes submetidos a transplante renal que necessitarem de biópsia devido à presença de DIE foram convidados a participar da pesquisa e a assinarem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. As amostras foram armazenadas no período de março de 2013 a abril de 2017. Posteriormente foi avaliada a expressão do micro RNA (miR-146 a-5p) em tecido renal e em sangue periférico. Resultados: Em amostras de biópsia renal, encontramos um aumento estatisticamente significativo na expressão de miR-146a-5p no grupo de disfunção inicial do enxerto (DIE, n=33) versus grupo de pacientes estáveis (STA, n=13), P= 0,019 no grupo de pacientes com rejeição aguda (RA, n=9) versus grupo de DIE não observamos diferença significativa, P=0,106, assim como o grupo de pacientes estáveis versus RA não observamos diferença significativa, P= 1,000. Diferença na análise global P = 0,008. No entanto, em amostras de sangue periférico encontramos aumento na expressão gênica de miR-146a-5p no grupo de DIE versus pacientes STA , porém, não foi estatisticamente significativo, P= 0,083. Não houve correlação entre a expressão miR-146a-5p nos diferentes grupos de biópsia e sangue periférico, P=0,541. Conclusão: A expressão do miR 146a-5p apresentou expressão gênica distinta na disfunção inicial do enxerto em amostras de biópsias, podendo vir a ser considerado potencial biomarcador de lesão de isquemia e reperfusão renal. / Introduction: Kidney transplantation is the treatment of choice for a significant portion of patients with chronic terminal loss of renal function. Despite the progress achieved, delayed graft function DGF remains an important early complication. Graft biopsy, despite its limitations, risks and costs, is considered a gold standard for the diagnosis of graft dysfunction. Therefore, it is imperative to study and search for noninvasive biomarkers capable of diagnosing injuries to kidney transplants, especially in the DGF period when functional parameters are not available. The objective of the present study was to analyze and quantify the expression of miRNA-146a -5p ribonucleic micro-acids (miRNAs) in peripheral blood and renal tissue samples obtained from patients who underwent renal transplantation and developed DGF which is associated with lesions of ischemia and reperfusion injuries, after renal transplantation. Methods: This is controlled cross-sectional study involving transplant recipients, between March 2013 and April 2017, that underwent DGF and received a graft biopsy. Patients had their tissue and peripheral blood samples stored and latter analyzed for the expression of the micro-RNA: miR-146a-5p in renal tissue and blood. (Continuatiation) Results: In graft tissue samples a statistically significant increase in miR-146a-5p expression in the initial graft dysfunction group (DIE, n=33) was observed in the comparison with the group of stable patients (STA, n=13) group, P=0,019. The difference wasn’t significant in the comparison with the acute rejection (AR, n=9) group versus group DIE, P=0,106, as well stable patients group versus AR we didn’t observe a significant difference, P=1,000 . Overall group significance P=0.008. However, in peripheral blood samples we found an increase in miR-146a-5p gene expression in the DIE group versus STA patients, however, it was not statistically significant, P = 0.083. There was no correlation between expression miR-146a-5p in the renal tissue and peripheral blood samples, P=0,541. Conclusion: We concluded that miR-146a-5p expression has a distinct pattern of expression in the setting of DGF and has the potential of becoming a biomarker for ischemia and reperfusion injury in kidney transplant recipients.

Plasma contains small, non-protein coding RNA species, microRNAs (miRNAs). Circulating miRNAs originate from tissues throughout the body and circulate in the blood bound to proteins or encapsulated in extracellular vesicles (EVs). The pattern of circulating miRNAs changes in different pathological states, leading to the hypothesis that they could act as biomarkers or mediators of inter-organ signalling. Acute kidney injury (AKI) is associated with high morbidity worldwide. Recent work has highlighted a potential role for EV signalling in the delivery of functional exogenous miRNA into kidney cells, which may contribute to the pathogenesis of AKI. The studies described in this thesis investigate the effects of circulating miRNAs on renal proximal tubular (PT) cells. Utilising next generation sequencing technology, circulating miRNA profiles were demonstrated to change significantly following myocardial injury. These findings were translated from humans into a mouse model of myocardial injury. Investigation of EV cell signalling, using flow cytometry and nanoparticle tracking analysis, demonstrated that PT cell EV uptake was not affected by known physiological agonists. By contrast, EV release from PT cells was regulated by purinergic P2Y1 and dopamine D1 receptors. Toxic cisplatin injury of PT cells resulted in increased EV release and reduced EV uptake in a dose-dependent manner. Cisplatin toxicity in PT cells was unaffected by EVs from mice with myocardial injury, but toxicity was reduced by EVs from mice with drug-induced liver injury (DILI). Circulating EVs from mice with DILI transferred the liver specific miRNA, miR-122, into PT cells in both in vivo and in vitro models. The consequence of miR-122 transfer was modulation of downstream target genes including Foxo3 which has been implicated in cell injury by apoptosis. These findings therefore show that circulatory miRNA profiles change in different models of organ injury and suggest miRNAs can be transferred to PT cells in vivo and in vitro. The improved viability of injured PT cells following co-incubation with DILI EVs, and subsequent transcriptomic work, suggests this may be as a consequence of miRNA transfer. In conclusion, circulatory miRNAs may act as mediators of inter-organ signalling and could play a crucial role in the propagation of systemic illness.

Orientador: Erika Veruska Paiva Ortolan / Resumo: Introdução: Por volta de oitenta por cento dos acidentes envolvendo ingestão de cáusticos ocorrem em crianças. A estenose cáustica do esôfago é a sua principal complicação com grande morbidade. Lesões neoplásicas esofágicas podem desenvolver-se como uma complicação tardia desta estenose com um tempo médio de aparecimento entre o acidente e o desenvolvimento neoplásico de 15 a 30 anos. Considerando este risco, biopsias seriadas do esôfago são recomendadas com o objetivo de detecção precoce de displasias. Assim, um conhecimento abrangente da relação biológica entre cáusticos e neoplasia esofágica é de grande importância na identificação de novos biomarcadores que possibilitariam tratamento precoce. MicroRNAs (miRNAs) são RNAs pequenos, não codificadores de proteínas que regulam importantes processos celulares e têm se mostrado como robustos biomarcadores. O perfil global de expressão de miRNAs nesta população, seguida da identificação dos miRNA-alvo, pode levar à identificação da presença e magnitude do dano ao material genético em amostra de tecido esofágico obtido de pacientes portadores de estenose cáustica. Objetivos: Determinar o perfil global da expressão de miRNAs em células da mucosa esofágica de crianças portadoras de lesões por ingestão de cáusticos, com o objetivo de identificar miRNAs como biomarcadores associados a tumorigênese esofágica nesta população específica. Materiais e Métodos: Vinte e sete amostras esofágicas fixadas em formalina e embebidas em parafina (F... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Background: 80% of the caustic ingestions occur in children. Esophageal stricture is a major chronic complication with great morbidity. Esophageal neoplasms may develop as a late complication of caustic injury with a mean time between caustic ingestion and cancer development of 15-30 years. Serial biopsies are recommended aiming early detection of premalignant changes. Thus a comprehensive knowledge of biological relation between caustic and esophageal cancer is of major importance to identify the biomarkers that could enable an early treatment. MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules and regulate key cellular processes during tumorigenesis and have been demonstrated as an useful diagnostic, prognostic and predictive biomarkers. Global miRNA expression profiling analysis in this population, followed by the identification of miRNA target genes, may lead to the identification of the presence and magnitude of damage to genetic material in a sample of esophageal tissue obtained from patients with caustic stenosis. Objectives: We aimed to identify global microRNA (miRNA) expression changes in cells of the esophageal mucosa from children with caustic lesions compared to paired macroscopic and microscopically normal esophageal tissue. Patient and Methods: 27 formalin fixed, paraffin embedded (FFPE) esophageal samples from 15 patients were divided into two groups according to the time elapsed after the injury (Group A: less than 5 years, Group B: more than 5 years). Tho... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

In the complex relationships of mammalian viruses with their hosts, it is currently unclear as to what role RNA silencing pathways play during the course of infection. RNA silencing-based immunity is the cornerstone of plant and invertebrate defense against viral pathogens, and examples of host defense mechanisms and numerous viral counterdefense mechanisms exist. Recent studies indicate that RNA silencing might also play an active role in the context of a mammalian virus infection. We show here that a mammalian virus, human adenovirus, interacts with RNA silencing pathways during infection, as the virus produces microRNAs (miRNAs) and regulates the expression of Dicer, a key component of RNA silencing mechanisms. Our work demonstrates that adenovirus encodes two miRNAs within the loci of the virus-associated RNA I (VA RNA I). We find that one of these miRNAs, miR-VA “g”, enters into a functional, Argonaute-2 (Ago-2)-containing silencing complex during infection. Currently, the cellular or viral target genes for these miRNAs remain unidentified. Inhibition of the function of the miRNAs during infection did not affect viral growth in a highly cytopathic cell culture model. However, studies from other viruses implicate viral miRNAs in the establishment of latent or chronic infections. Additionally, we find that adenovirus infection leads to the reduced expression of Dicer. This downregulation does not appear to be dependent on the presence of VA RNA or its associated miRNAs. Rather, Dicer levels appear to inversely correlate with the level of viral replication, indicating that another viral gene product is responsible for this activity. Misregulation of Dicer expression does not appear to influence viral growth in a cell culture model of infection, and also does not lead to gross changes in the pool of cellular miRNAs. Taken together, our results demonstrate that RNA silencing pathways are active participants in the process of infection with human adenovirus. The production of viral miRNAs and the regulation of cellular Dicer levels during infection implicate RNA silencing mechanisms in both viral fitness as well as potential host defense strategies.

TEÓFILO, C. R. Investigação da associação entre os mirnas 10a, 17, 29c e 31 e a expressão de il-6 e stat3 em lesões orais potencialmente malignas, no câncer bucal e campo de cancerização. 2017. 105 f. Tese (Doutorado em Odontologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-05-02T12:28:15Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_crteofilo.pdf: 2960055 bytes, checksum: 9b053dd115c86e0f4667ca5b49068d3c (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-05-02T12:28:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_crteofilo.pdf: 2960055 bytes, checksum: 9b053dd115c86e0f4667ca5b49068d3c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-02T12:28:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_crteofilo.pdf: 2960055 bytes, checksum: 9b053dd115c86e0f4667ca5b49068d3c (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / Oral cavity malignant neoplasms are a serious public health problem in Brazil and in the world. The most common histologic subtype in the mouth are squamous cell carcinoma (SCC). Often, before the onset of SCC, there are clinical and histological changes with a greater potential for malignant transformation, called potentially malignant disorders (PMD). Multiple molecular factors may contribute to the development of this neoplasms. Signal Transducers and Activators of Transcription-3 (STAT3) is a cytokine-activated signal transducer, which may be directly active in neoplastic. High levels of IL-6, a possible STAT3 activator, have been associated with poor prognosis in SCC. MicroRNAs (miRNAs) are a group of RNAs that act as gene-regulator in the post-transcriptional phase through the degradation or silencing of messenger RNAs. The present study aimed to quantify microRNAs miR-10a, miR-17, miR-29c and miR-31 in the field effect area of oral dysplasia and SCC. Additionally, it is intended to evaluate the expression of IL-6 and STAT3 in these lesions. For this, samples of 47 SCC, 21 PMD and 21 controls were collected. In the patients with SCC or PMD, in addition to the lesion area, a normal mucosa sample was collected, 1 cm away from the lesion. miRNAs were analyzed by real-time PCR and STAT3 and IL-6 by immunohistochemistry. The SCC sample was, most of them, moderately differentiated (91.5%), with growth in nets (73%) and non-keratinizing (52.6%). Dysplasia presented, more frequently, mild (52%), and 42.8% of them showed intense subepithelial inflammation. The mean age of the patients in the three groups was 52 ± 21 years. Males were predominant in the SCC group (67.3%) and female in DPM (57.1%). The most frequent localization site for both groups was tongue. Hyperexpression of all studied miRNAs were observed in SCC and PMD, as well as in the perilesional regions. Evaluating SCC, all the miRNAs studied were correlated with each other, while in SCC perilesion increase of miR-31 was accompanied by elevation of miR-17 levels, as well as hyperexpression of miR-29c was accompanied by miR-10a increase. There was an increase of miR-17 and miR-29c in SCC compared to PMD. In PMD, the increase of miR-10a was accompanied by an increase of miR-17 and miR-29c; a similar situation occurred between miR-31 and miR-17. In PMD perilesion, miR-10a and miR-29c presented positive correlation. High expression of IL-6 was obtained in 100% of the SCC and PMD samples. STAT3 presented positivity for 84.6% of SCC samples and 88.2% of DPM samples. Positive correlation between miR-29c and miR-10a was found in SCC, in dysplasias and perilesional areas, indicating that hyperexpression of these microRNAs is an early event in the oral carcinogenesis. / As neoplasias malignas de cavidade oral constituem um sério problema de saúde pública no Brasil e no mundo, sendo o tumor maligno mais comum em boca o Carcinoma de Células Escamosas (CCE). Frequentemente, antes do surgimento do CCE, ocorrem alterações clínicas e histológicas com maior potencial de transformação maligna, chamadas desordens potencialmente malignas (DPM). Fatores moleculares podem contribuir para o desenvolvimento dessa neoplasia. O Signal Transducers and Activators of Transcription-3 (STAT3) é um transdutor de sinais frequentemente ativado por citocinas, como IL-6, que pode atuar nesse processo. Já os microRNAs (miRNAs) regulam a expressão gênica pós-transcricional degradando ou silenciando RNAs mensageiros. O presente trabalho objetivou quantificar os níveis de microRNAs miR-10a, miR-17, miR-29c e miR-31 em campo de cancerização de displasias e CCE. Adicionalmente, avaliou-se o padrão de expressão de IL-6 e STAT3 nessas lesões. Para tanto, foram coletadas amostras de 47 CCEs, 21 displasias e 21 de mucosa normal. Nos grupos CCE e DPM, foi coletada amostra adicional de mucosa perilesional, distando 1 cm da lesão. Os miRNAs foram analisados por PCR em tempo real e STAT3 e IL-6 por imunoistoquímica (IQ). Os casos de CCE eram, predominantemente, moderadamente diferenciados (91,5%), com crescimento em lençóis ou ninhos (73%) e não-ceratinizantes (52,6%). As displasias leves apresentaram-se mais frequentemente (52%), sendo que 42,8% mostravam inflamação subepitelial intensa. A idade média dos pacientes dos três grupos foi de 52±21 anos. Houve predomínio do sexo masculino no grupo CCE (67,3%) e do feminino nas displasias (57,1%). Detectou-se hiperexpressão dos miRNAs estudados em CCE e displasias, assim como nas regiões perilesionais. Identificou-se correlação positiva entre todos os miRNAs estudados no grupo CCE, enquanto na área adjacente ao tumor o aumento de miR-31 foi acompanhado de elevação nos níveis de miR-17, assim como o aumento de miR-29c foi seguido por incremento de miR-10a. Houve aumento significativo da expressão de miR-17 e miR-29c em CCE em relação a displasias. Nestas, houve correlação positiva do miR-10a com miR-29c e miR-17, ocorrendo situação semelhante entre miR-31 e miR-17. Em região perilesional de DPM, os microRNAs miR-10a e miR-29c apresentaram correlação positiva. O aumento da expressão de miR-31 foi relacionado a displasias com classificação histológica mais severa. Obteve-se alta expressão de IL-6 em 100% das amostras de CCE e DPM. STAT3 apresentou positividade para 84,6% das amostras de CCE e 88,2% de DPM. Correlação positiva entre miR-29c e miR-10a foi encontrada no CCE, nas displasias e áreas perilesionais, indicando que a hiperexpressão desses microRNAs é um evento precoce no processo de carcinogênese oral.

Nas últimas décadas, a molécula HLA-G despontou como uma importante molécula imunossupressora. O fato de a molécula HLA-G estar envolvida em diversos mecanismos de imunorregulação e, considerando sua expressão em doenças inflamatórias, sugere a possibilidade de um papel dessa molécula na patogênese e no curso de doenças reumatológicas. Com base nisso, esta tese teve como objetivo avaliar a influência da molécula HLA-G, bem como das variantes genéticas do gene HLA-G na suscetibilidade e no curso de doenças reumatológicas, buscando correlacionar fatores genéticos, moleculares, clínicos e imunológicos. Neste trabalho, avaliamos a influência de variantes alélicas da região 3’ não traduzida do gene HLA-G na suscetibilidade e curso do lúpus eritematoso sistêmico (LES), na suscetibilidade à artrite reumatóide (AR) e avaliamos a expressão de HLA-G solúvel (sHLA-G) em pacientes com AR e artrite idiopática juvenil (AIJ). Observamos que o mesmo haplótipo (D/G) parece estar associado tanto à suscetibilidade ao LES quanto à AR, apontando para o gene HLA-G como um potencial fator de suscetibilidade comum às duas doenças. Em AR, observamos maiores níveis de HLA-G solúvel no líquido sinovial de pacientes fator reumatóide-negativos (FR-) em comparação com pacientes FR+, e diferentes padrões de correlação entre os níveis plasmáticos de sHLA-G e parâmetros de atividade de doença após estratificarmos os grupos de pacientes para positividade para FR e gênero. Nossas observações, portanto, colocam a molécula e o gene HLA-G como elementos diretamente envolvidos na patogênese e curso dessas doenças e encorajam estudos futuros que procurem elucidar o papel da molécula HLA-G no curso de doenças reumatológicas. / In the last decades, HLA-G has emerged as a major immunosuppressive molecule. The fact that HLA-G is involved in various mechanisms of immunoregulation and given its expression in inflammatory diseases suggests the possibility of a role of this molecule in the pathogenesis and course of rheumatic diseases. This thesis aimed to evaluate the influence of HLA-G, as well as genetic variants of the HLA-G gene in the susceptibility and course of rheumatic diseases, seeking to correlate genetic, molecular, clinical and immunological factors. We evaluated the influence of allelic variants of the HLA-G gene 3 'untranslated region (3”UTR) in susceptibility and course of systemic lupus erythematosus, in the susceptibility to rheumatoid arthritis and we have also evaluated the expression of soluble HLA-G in patients with rheumatoid arthritis (RA) and juvenile idiopathic arthritis (JIA). We noted that the same haplotype (D/G) seems to be associated with susceptibility to RA and SLE, pointing to the HLA-G gene as a potential common susceptibility factor to both diseases. In RA, we observed higher levels of soluble HLA-G (sHLA-G) in synovial fluid (SF) from rheumatoid factor negative (RF-) patients as compared to RF+ patients, and different patterns of correlation between sHLA-G plasma levels and disease activity parameters after stratifying patient groups for RF positivity and gender. Our observations, therefore, put the gene and molecule HLA-G as directly involved elements in the pathogenesis and course of these diseases and encourage future studies that seek to elucidate the role of HLA-G in the course of rheumatic diseases.