Resumo: A produção de biodiesel por catálise enzimática tem sido uma área de grande investigação, vários pesquisadores vem tentando otimizar diferentes parâmetros da reação de transesterificação, o tipo e a concentração da enzima utilizada, a razão molar álcool:óleo:água, temperatura, pH, tipo de solvente e ácidos graxos livres são alguns fatores importantes que influenciam esse tipo de reação. O presente trabalho tem como objetivo principal a produção de biodiesel por transesterificação de óleos vegetais com etanol anidro e hidratado utilizando cepas fúngicas termofílicas e lipase comercial em diferentes condições estequiométricas, tempo, teor de água, temperatura, agitação, superfície de contato e irradiação de ultrassom. As linhagens fúngicas Myceliophthora sp F2.1.3 e Thermomyces lanuginosus TO-05 foram selecionadas através da detecção de atividade lipolítica em placas de Petri com ágar e Rodamina B. Os extratos enzimáticos foram obtidos por fermentação em estado sólido para determinação das atividades de hidrólise e esterificação. E as imobilizações das hifas dos fungos Myceliophthora sp F2.1.3 e Thermomyces lanuginosus TO-05 foram realizadas em bucha vegetal, bagaço de cana de açúcar e farelo de soja e as imobilizações de lipases em quitosana. Os microrganismos Myceliophthora sp F2.1.3 e Thermomyces lanuginosus TO-05 apresentaram maiores atividades de hidrólise com as hifas imobilizadas em bagaço de cana de açúcar, 12 e 6 U/g, respectivamente. Nos ensaios para determinação da atividade de xv esterificação a hifa imobilizada em bagaço de cana de açúcar do Thermomyces lanuginosus TO-05 apresentou atividade de 107 U/g. A produção de biodiesel etílico foi realizada utilizando-se a enzima comercial LTL e as hifas imobilizadas em farelo de soja do fungo Thermomyces... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Biodiesel production by enzymatic catalysis have been widely area of research, several researchers have been trying to optimize different parameters of the transesterification reaction, source and concentration of enzyme, molar ratio of alcohol:oil:water, temperature, pH, type of solvent and free fatty acids are some important factor that influence this type of reaction. The main goal of the present work is the production of biodiesel by transesterification of vegetable oils with ethanol anhydrous and hydrated using thermophilic fungal strains and commercial lipase in different stoichiometric conditions, time, water content, temperature, stirring, surface contact and ultrasound irradiation. Strains of Myceliophthora sp F2.1.3 and Thermomyces lanuginosus TO-05 were screened by detection of lipolytic activity in Petri dishes with agar and Rhodamine B. Lipases were obtained by solid state fermentation and their hydrolysis and esterification activities was determined. The hyphae immobilization of Myceliophthora sp F2.1.3 and Thermomyces lanuginosus TO-05 was performed in loofah vegetable, sugar cane bagasse and soybean bran and lipase immobilization on chitosan. Microorganisms Myceliophthora sp F2.1.3 and Thermomyces lanuginosus TO-05 showed higher hydrolysis activities with the hyphae immobilized in sugarcane bagasse, 12 and 6 U/g, respectively. The hyphae immobilized in sugar cane bagasse from Thermomyces lanuginosus TO-05 showed sterification activity of 107 U/g. The production of ethylic biodiesel was performed using commercial enzyme LTL and immobilized hyphae in soybean bran from Thermomyces lanuginosus TO-05, wich showed higher transesterification yield. Yields above 10% were obtained with immobilized hyphae in soybean bran from Thermomyces lanuginosus TO-05 in biodiesel... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Roberto da Silva / Coorientador: Maurício Boscolo / Banca: Vera Aparecida de Oliveira / Banca: Débora de Oliveira / Mestre

Orientador: Hamilton Cabral / Banca: Eleni Gomes / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Fernanda Canduri / Banca: Wagner Alves de Souza Júdice / Resumo: Aspártico (E.C. 3.4.23), cisteíno (E.C. 3.4.22) e serino peptidases (E.C. 3.4.21) são endopeptidases, cujos modos de ação são dependentes de resíduos de ácido aspártico, cisteína e serina presentes no sítio catalítico, respectivamente. Atualmente, vários estudos são realizados na busca por novas enzimas com relevantes propriedades bioquímicas para aplicação industrial. Neste contexto, nós propomos a produção de enzimas em bioprocesso submerso, purificação, estudo das propriedades bioquímicas e determinação da especificidade catalítica das peptidases secretadas pelos fungos filamentosos Rhizomucor miehei, Phanerochaete chrysosporium e Leptosphaeria sp. Inicialmente, após produção por bioprocesso submerso, estas enzimas foram purificadas utilizando cromatografias de exclusão molecular e troca iônica. Em ensaios de inibidores na atividade enzimática, notamos inibição das peptidases por pepstatina A (R. miehei), ácido iodoacético/N-Etilmaleimida (P. chrysosporium) e fluoreto de fenil metil sulfonila (Leptosphaeria sp), sendo então definidas como aspártico, cisteíno e serino peptidases, respectivamente. Por SDS-PAGE (12%), as massas moleculares foram estimadas em 37 kDa (aspártico), 23 kDa (cisteíno) e 35 kDa (serino). O máximo de atividade proteolítica foi alcançado em pH 5,5 e 55 ºC para peptidase aspártica secretada por R. miehei; pH 7 e faixa de temperatura 45-55 ºC para cisteíno peptidase secretada por P. chrysosporium, e pH 7 e 45 ºC para serino peptidase secretada por Leptosphaeria sp. Sob efeito de incubação a diferentes pH, a peptidase aspártica mostrou-se estável em condições ácidas (pH 3-5); cisteíno peptidase foi estável em ampla faixa de pH (pH 4-9), e serino peptidase mostrou-se mais estável em condições com tendências alcalinas e pH ligeiramente ácido (pH 5-9). Em todas estas faixas de pH citadas, as peptidases apresentaram atividade proteolítica acima de 80% por 1 hora... / Abstract: Aspartic (EC 3.4.23), cysteine (EC 3.4.22) and serine peptidases (EC 3.4.21) are endopeptidases whose modes of action are dependent on aspartic acid, cysteine and serine residues present in the catalytic site, respectively. Currently, several studies are conducted in the search for new enzymes with relevant biochemical properties for industrial application. In this context, we propose the production of enzymes in submerged bioprocess, purification, the study of biochemical properties and determining the catalytic specificity peptidases secreted by the filamentous fungus Rhizomucor miehei, Phanerochaete chrysosporium and Leptosphaeria sp. Initially, after production submerged bioprocess, these enzymes have been purified using size-exclusion and ion exchange chromatographies. In the effect of inhibitors on enzyme activity, we note peptidase inhibition by pepstatin A (R. miehei), iodoacetic acid/ N-Ethylmaleimide (P. chrysosporium) and phenyl methyl sulfonyl fluoride (Leptosphaeria sp), suggesting that these enzymes are aspartic, cysteine and serine peptidases, respectively. For SDS-PAGE (12%), molecular weights were estimated at 37 kDa (aspartic), 23 kDa (cysteine) and 35 kDa (serine). Maximum proteolytic activity was achieved at pH 5.5 and 55 °C for aspartic peptidase secreted by R. miehei; pH 7 and temperature range 45-55 °C for cysteine peptidase secreted by P. chrysosporium and pH 7 and 45 °C for serine peptidase secreted by Leptosphaeria sp. Under incubation at different pH effect, aspartic peptidase was stable under acidic conditions (pH 3-5); cysteine peptidase was stable in wide pH range (pH 4-9), and serine peptidase was more stable under alkaline conditions and pH slightly acidic (pH 5-9). In all these pH ranges mentioned, peptidases showed proteolytic activity above 80% by 1 hour incubation. As regards the thermal stability, cysteine peptidase was more thermostable enzyme and serine peptidase described the lowest temperature ... / Doutor

Orientador: Fernando Leite Hoffmann / Banca: Maria Luiza Silva Fazio / Banca: Crispin Humberto Garcia-Cruz / Resumo: É crescente o número de consumidores que têm exigido da indústria alimentícia a adoção de políticas que visem à segurança de seus produtos. Dentro deste âmbito, a adoção de medidas que reduzam o uso de aditivos químicos torna-se cada vez mais iminente. Verifica-se um crescente interesse em pesquisas pela busca de compostos alternativos para um emprego racional como conservantes de alimentos, dentre os quais pode-se destacar o uso de especiarias, seus óleos e extratos como agentes antimicrobianos. O presente estudo teve por intuito avaliar a atividade antibacteriana in vitro de óleos essenciais de algumas especiarias, em concentrações de 1%, 2% e 5% (v/v), sobre bactérias contaminantes de alimentos. O estudo in situ foi realizado com o óleo essencial que resultou em maior inibição bacteriana in vitro. Fez-se uso amostras comerciais de óleos essenciais de alecrim (Rosmarinus officinalis L.), coentro (Coriandrum sativum L.), cravo (Eugenia caryophyllata Thumb), manjericão (Ocimum basilicum L.), orégano (Origanum vulgare L.), sálvia (Salvia officinalis) e tomilho (Thymus vulgares L.), sobre as seguintes cepas de micro-organismos: Bacillus cereus (ATCC 11778), Bacillus subtilis (ATCC 6633), Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Salmonella typhimurium (ATCC 14028) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923). O estudo da atividade antibacteriana in vitro dos óleos essenciais foi efetuado por meio do procedimento de difusão em meio sólido, por disco e por poço. Os micro-organismos foram inoculados na concentração de 108 UFC.mL-1. Halos de inibição superiores a 10 mm foram considerados significativos de atividade antibacteriana. Para o estudo da atividade antibacteriana in situ optou-se pela utilização do óleo essencial que resultou na maior atividade antimicrobiana... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The study aimed to evaluate the antibacterial activity in vitro of essential oils of some spices in concentrations of 1%, 2% and 5% on foodborne pathogens. Commercial samples of essential oils of rosemary (Rosmarinus officinalis L.), coriander (Coriandrum sativum L.), clove (Eugenia caryophyllata Thumb), basil (Ocimum basilicum L.), oregano (Origanum vulgare L.), sage (Salvia officinalis) and thyme (Thymus vulgares L.) was evaluated against the following strains of microorganisms: Bacillus cereus (ATCC 11778), Bacillus subtilis (ATCC 6633), Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Salmonella Typhimurium (ATCC 14028) and Staphylococcus aureus (ATCC 25923). Antibacterial activity in vitro of essential oils was carried out by the diffusion method, for disk and well. The microorganisms were inoculated at a concentration of 108 CFU.mL-1. Inhibition halos exceeding 10 mm were considered significant for antibacterial activity. Antibacterial activity in situ was evaluated using the essential oil which resulted in the highest antimicrobial activity in vitro. Regarding the micro-organism to be used, the bacterium E. coli was chosen because it has high incidence rates in food products. Minas Frescal cheeses were produced with the addition of three concentrations of essential oil mentioned and without the addition of oil (control). The cheeses were contaminated with 108 CFU.g-1, at package, and the count of E. coli was evaluated during product storage. Results showed highest bacterial activity for the oregano oil. Essential oils of clove and thyme also presented microbial inhibition. The most resistant microorganism, P. aeruginosa, wasn't inhibited by any compound. In situ antibacterial activity of oregano... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / A carcinicultura à o segmento da aquicultura que mais cresce no mundo. No Brasil, o Cearà à o maior produtor com 50% de toda a produÃÃo. Sabe-se que aproximadamente 40% do peso do camarÃo sejam considerados resÃduos, como a cabeÃa, a cauda e a casca, gerando grandes quantidades de resÃduos que devem ser descartados adequadamente. Assim, o reaproveitamento de resÃduos da carcinicultura atravÃs de recursos biotecnolÃgicos surge como uma alternativa inovadora para reduzir a poluiÃÃo ambiental causada por essa atividade. O presente estudo teve por objetivo aperfeiÃoar um processo biotecnolÃgico baseado na utilizaÃÃo de consÃrcio bacteriano capaz de fermentar os resÃduos da carcinicultura transformando-os em lÃquor para ser utilizado na alimentaÃÃo de pÃs-larvas de TilÃpia do Nilo (Oreochromis niloticus) em fase de reversÃo sexual. As linhagens de bactÃrias lÃticas utilizadas foram identificadas atravÃs do sequenciamento dos genes RNAr 16S, rpoA e pheS e por testes bioquÃmicos envolvendo a habilidade de fermentar carboidratos. Para a seleÃÃo do consÃrcio foram realizados estudos de cinÃtica quÃmica, modelos matemÃticos de Monod, Andrews e Levenspiel para determinar possÃveis tipos de inibiÃÃo do processo de fermentaÃÃo lÃtica de cabeÃas de camarÃo. Para avaliar o potencial do lÃquor resultante da fermentaÃÃo como suplemento na alimentaÃÃo de pÃs-larvas de tilÃpia foram confeccionadas raÃÃes com inclusÃes de lÃquor na proporÃÃo de 15, 30 e 45 %, monitorando-se a qualidade da Ãgua e os parÃmetros de temperatura, oxigÃnio dissolvido, pH, salinidade, nitrogÃnio amoniacal total, nitrito, nitrato e ortofosfato, alÃm do desempenho zootÃcnico. Para tanto, foram avaliados a taxa de sobrevivÃncia, taxa de crescimento especÃfico, ganho em peso e comprimento, fator de conversÃo alimentar e seleÃÃo por tamanho. Como resultados deste trabalho foram identificadas linhagens de lactobacilos nomeadas Lact7, Lact8, Lact9 e Lact14 como pertencentes a espÃcie Lactobacillus plantarum, Lact6 como L. futsaii e Lact11 como Pediococcus acidilactici. Quantos aos parÃmetros cinÃticos da fermentaÃÃo, as linhagens Lacts6, Lact7 e Lact14 apresentaram os melhores resultados e nÃo houve indÃcios de inibiÃÃo pelo substrato ou produto. Durante a fermentaÃÃo das cabeÃas de camarÃo o consÃrcio formado pelas linhagens Lact6 e Lact14 produziram os mais altos rendimentos de Ãcido lÃtico, cerca de 100 g.L-1. InclusÃes do lÃquor resultante da fermentaÃÃo lÃtica dos resÃduos de camarÃo nas proporÃÃes de 15 e 30 % proporcionaram os melhores resultados para sobrevivÃncias, ganho em peso e comprimento, taxa de crescimento especÃfico e biomassa de pÃs-larvas de TilÃpia do Nilo. A conversÃo alimentar nÃo diferiu entre os tratamentos. Nitrito, nitrato e ortofosfato aumentaram significativamente ao longo das semanas, embora as concentraÃÃes tenham se mantido em nÃveis aceitÃveis, bem como os demais parÃmetros se mantiveram dentro do recomendado durante o desenvolvimento da tilÃpia. Os dados desse estudo mostraram que à tecnologicamente viÃvel transformar resÃduos da carcinicultura em produtos de valor agregado por fermentaÃÃo lÃtica. O lÃquor resultante da fermentaÃÃo, rico em proteÃnas, pigmentos e minerais pode ser incorporado na proporÃÃo de atà 30% na raÃÃo, sem causar nenhum impactado no desenvolvimento de pÃs-larva da tilÃpia e portanto, trazendo benefÃcios econÃmicos e destinaÃÃo apropriada para resÃduos da carcinicultura. / Shrimp farming is the fastest growing segment in aquiculture in the world. In Brazil, Ceara is the largest producer with 50 % of all production. Approximately 40 % of the shrimp weight is considered waste as the head, tail and bark, generating large amounts of waste that must be properly discarded. Thus, the reuse of shrimp farming waste through biotechnological resources emerges as an innovative alternative to reduce environmental pollution caused by that activity. This study aimed to perform a biotechnological process based on bacterial consortium capable to fermenting shrimp waste turning them into a liquor used in feed for Nile tilapia (Oreochromis niloticus) post-larvae in sex reversal process. Lactic acid bacteria strains used were identified by sequencing of the 16S rRNA, rpoA and pheS genes and biochemical tests involving the ability to ferment carbohydrates. For the consortium selection some studies were performed such as chemical kinetics use of Monod, Andrews and Levenspiel mathematical models to determine possible types of inhibition. To evaluate the liquor potential from fermentation as a supplement in feed for tilapia post-larvae were prepared feed diets with liquor inclusions of 15, 30 and 45 %, by monitoring the water quality and temperature parameters, dissolved oxygen, pH, salinity, total ammonia nitrogen, nitrite, nitrate and orthophosphate in addition to growth performance. For that, we evaluated the survival rate, specific growth rate, weight and length gain, feed conversion factor and selection by size. This work identified lactobacilli strains named Lact 7, Lact 8, Lact 9 and Lact 14 as belonging to Lactobacillus plantarum species, Lact 6 as L. futsaii and Lact 11 as Pediococcus acidilactici. As to fermentation kinetic parameters, Lact 6, Lact 7 and Lact 14 strains showed the best results and there was no evidence of inhibition by substrate or product. During shrimp heads fermentation Lact 6 and Lact 14 consortium produced the highest lactic acid yields, about 100 g.L-1. Liquor inclusions of 15 and 30 % provided the best results for survival, weight and length gain, specific growth rate and biomass of Nile tilapia post-larvae. Feed conversion did not differ between treatments, being slightly higher in treatment with 30 % of liquor. Nitrite, nitrate and orthophosphate increased significantly over the weeks, although concentrations have remained at acceptable levels and other parameters remained within the recommended during the tilapia development. The data from this study showed that it is technologically feasible to transform shrimp farming waste into added-value products by lactic fermentation. The resulting liquor fermentation, rich in protein, minerals and pigments can be incorporated in a proportion of up to 30% in tilapia feed, without causing, any impact the development of tilapia post-larvae and thus bringing economic benefits and proper disposition of shrimp farming waste.

O crescimento nas atividades agroindustriais e industriais torna eminente o problema referente à destinação de resíduos gerados nestas atividades. Atualmente, a maior parte dos resíduos gerados são destinados para aterros de resíduos industriais e, no caso de estercos suínos para esterqueiras devido a viabilidade ambiental e econômica. No entanto, a digestão anaeróbia (DA) é uma solução para o tratamento de resíduos, sendo ambiental e economicamente viável, pois através de microrganismos realiza a conversão de subprodutos indesejados em energia renovável na forma de biogás. O presente trabalho teve como objetivo isolar, selecionar e identificar microrganismos capazes de auxiliar na conversão de resíduos agrícolas e industriais em biogás. Os resíduos de arroz, couro, esterco suíno (R) e (A), lodo de ETE de curtume e lodo de ETE UCS foram caracterizados através da determinação de concentração de carbono orgânico, teor de sólidos totais antes e após os ensaios de degradação. A adição de inóculos de microrganismos isolados a partir das amostras que geraram maior volume de biogás foram avaliados, entretanto apresentaram baixa fração molar de metano. Assim, realizou-se novo isolamento de microrganismos provenientes de amostras do lodo de ETE da UCS que durante o processo de DA apresentou fração molar de 76% de metano. Foram realizados isolamentos sucessivos dos microrganismos presentes no lodo, o primeiro isolamento foi após 24h de ensaio e posteriormente foi realizado o isolamento a cada 7 dias totalizando 5 isolamentos. Os microrganismos isolados foram identificados como Bacillus toyonensys e B. thurigiensis e foram adicionados em amostras que continham resíduo de esterco (A) e (R), resíduo de couro pré-tratado quimicamente e termicamente, resíduo de arroz e resíduo de arroz com lodo de ETE de curtume. Verificou-se que a adição de inóculos aumentou a fração molar de metano dos resíduos de esterco (A) em (55%), esterco (R) de 0,4 para 0,7. A amostra de arroz e lodo de ETE de curtume gerou uma fração molar de hidrogênio de aproximadamente (1,0). Assim, conclui-se que a presença de microrganismos no processo de DA é fundamental para o aumento da fração molar do gás de interesse, visto que estes produzem enzimas capazes de degradar resíduos e transformá-los em energia na forma de biogás. O efetivo processo de DA é caracterizado pela redução dos teores de carbono, o resíduo de arroz com adição de lodo de ETE de curtume e adição de inóculo apresentou maior redução no teor de carbono (77,88%) e no teor de sólidos totais (90,34%). / The growth in agro-industrial and industrial activities becomes imminent problem concerning the disposal of waste generated in these activities. Currently, most of the waste generated is intended for industrial waste landfills and in the case of pig manure to esterqueiras due to environmental and economic viability. However, anaerobic digestion (AD) is a solution for treating waste being environmentally and economically feasible for the treatment of waste, as by microorganisms performs conversion of unwanted by-products in renewable energy. This study aimed to isolate, select and identify microorganisms capable of assisting in the conversion of agricultural and industrial waste into biogas. Rice residues, leather, pig manure (R) and (A), tannery sludge ETE and ETE UCS sludge were characterized by determination of organic carbon, total solids content before and after the degradation tests. The addition of an inoculum of microorganisms isolated from samples of larger volume of biogas generated were evaluated, however showed low molar fraction of methane. Thus, there was re-isolation of microorganisms from WWTP sludge samples during the UCS process showed 76% mole fraction of methane and 73,3mL accumulated volume of biogas. Successive isolation of microorganisms were performed in the mud, the first isolation was after 24 hours test with later isolation every 7 days a total of 5 isolates. The microorganisms were added to samples containing manure residue (A) and (R) pre-treated leather residues chemically and thermally, rice and rice residue with tannery waste sludge WWTP. It has been found that the addition of inoculum increased the mole fraction of methane from manure waste (A) (55%), manure (R) of 0.4 to 0.7. The sample of rice and tannery WWTP sludge generated a mole fraction of hydrogen approximately (1.0). Thus, it is concluded that the presence of microorganisms in the process is essential to the increase of the molar fraction of the gas of interest, since these produce enzymes capable of degrading wastes and convert them into energy in the form of biogas. The actual process of AD is characterized by the reduction of carbon, rice residue with addition of WWTP sludge tanning and adding inoculum greater reduction in carbon content (77.88%) and total solids content (90.34%).

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Nisina, um antimicrobiano produzido por cepas de Lactococcus lactis subsp. Lactis, pode ser utilizada como preservante em alimentos e, possivelmente, como agente antimicrobiano. Para aumentar sua produção por Lactococcus lactis ATCC 11454 em meio MRS (pH = 6,5) realizamos ensaios em agitador rotativo (100 rpm/ 30 °C/ 36h) a partir de 3 grupos de ensaios, designados por desenho fatorial de dois níveis (2 (4-1) no grupo 01) e 2(3) nos grupos 2 e 3. As concentrações de sacarose (2,2 a 15 g/L), asparagina (7,5 a 75 g/L), fosfato de potássio (6 a 18 g/L) e Tween 80 (1,0 a 6,6 g/L) foram adicionadas ao meio MRS (pH = 6,5). A produção de nisina foi acompanhada a partir do método de difusão em ágar a partir de utilização de Lactobacillus sake ATCC 9924 como microorganismo sensível. Os melhores níveis de nisina atingidos foram de 1,6 x 104 AU/mL (grupo 2) a 1,8 x 104 AU/mL (grupo 1) e obtidos para os níveis máximos de sacarose e asparagina. Dependendo das proporções entre as concentrações dos outros nutrientes, quando a concentração final de sacarose variou entre 0,33 g/L a 3,64 g/L, o pH oscilou entre 5,10 to 6,01, o acido lático produzido variou de 1,19 g/L a 4,44 g/L e a concentração celular variou de 0,99 a 4,184 mg/L. produção de nisina mostrou-se independente das velocidades de crescimento, as quais variaram de 0,0070 h-1 a 0,0401 h-1. A analise de regressão mostrou se adequar a um modelo polinomial quadrático: Log AU/mL = 1,98905 - 0,213558 x2 + 1,80028 x3 - 1,40776 x4 + 0,23436 x1 x2 + 0,35936 x1 x3 +1,47217 x3 x4 (equação principal). Onde os índices representam as concentrações de sacarose; asparagina; fosfato e tween 80 respectivamente. A análise de variância foi realizada para os parâmetros fixados para demonstrar a adequação do modelo proposto. (x são os índices dos nutrientes adicionados). / Nisin, an antimicrobial substance tha is produced by Lactococcus lactis, can be utilized as a preservative and therapeutic agent. To improve its production by Lactococcus lactis ATCC 11454 in MRS broth (pH =6.5), in rotatory shaker (100 rpm/ 30 °C/ 36h), three groups of assays, set up by a fractional factorial design of two-levels (2 (4-1) in group 01), and 2(3) in groups 2 and 3 were carried out. The minimum and maximum concentrations of sucrose (5 to 12.5 g/L), asparagine (7.5 to 75 g/L), potassium phosphate (6 to 18 g/L) and Tween 80 (1.0 to 6.6 g/L) were added to the MRS broth (pH = 6.5). The nisin production was accompanied through the agar diffusion assay using Lactobacillus sake ATCC 9924 as a sensitive microorganism. The best nisin activities ranged from 1.67 x 104 AU/mL (group 2) to 1.84 x 104 AU/mL (group 1) and were obtained for maximum levels of sucrose and asparagine, dependending of the proportions of the other nutrients concentrations, when the final sucrose content varied from 0.33 g/L to 3.64 g/L, the pH value oscillated beTween 5.10 to 6.01, the produced lactic acid was ranged from 1.19 g/L to 4.44 g/L and the dry-cell content was about 0.99 to 4,184 mg (DCW)/L. Nisin production was shown to be independent of growth rates, which ranged from 0.0070 h-1 to 0.0401 h-1. The regression analysis attained a quadratic polynomial model: Log AU/mL = 1.98905 - 0.213558 x2 + 1.80028 x3 - 1.40776 x4 + 0.23436 x1 x2 + 0.35936 x1 x3 +1.47217 x3 x4 (main equation). The analysis of variance performed to the fitted parameters of the independent variables was performed for checking model fitting results adequacy. (x are the index for the nutrients added).

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-09T09:20:33Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1613973 bytes, checksum: 68e6cb9b2db2276aab154d130130c331 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-09T09:20:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1613973 bytes, checksum: 68e6cb9b2db2276aab154d130130c331 (MD5) Previous issue date: 2011-04-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O Ácido L-ascórbico (L-AA), popularmente conhecido como vitamina C é naturalmente sintetizado pelas plantas a partir de D-glicose por uma via de 10 etapas. L- galactose é o intermediário chave para a biossíntese de L-ascórbico, cuja via de biossíntese foi recentemente elucidada. As leveduras produzem um composto análogo ao L-AA, o ácido D-eritroascórbico, mas em presença de um de seus precursors tais como L-galactose, L galactono-1,4-lactona, ou L-gulono-1 ,4-lactona, as leveduras são capazes de sintetizar o L-AA. Para evitar alimentar a cultura de levedura com o "L" enantiômero, a levedura Kluyveromyces lactis CBS2359 foi engenheirada com genes da via de biossíntese de L-galactose: GDP-manose-3 ,5-epimerase (GME), GDP-L- galactose fosforilase (VTC2) e L-galactose-1-fosfato fosfatase (VTC4) isolados de Arabidopsis thaliana. Com este objetivo plasmídeos foram construídos visando a integração por recombinação homóloga dos cassetes de expressão no Locus LAC4 (beta- galactosidase) Após o processo de transformação, o promotor do gene LAC4 promove a transcrição do gene GME, enquanto que genes VTC2 e VTC4 estão sob o controle dos promotores GPD1 e ADH1 respectivamente provenientes da levedura S. cerevisiae. A expressão dos genes da via de biossíntese de L-galactose em K. lactis foi determinada por RT-PCR e western blot. As leveduras recombinantes foram capazes de produzir cerca de 23 mg.L-1 de ácido L-ascórbico após 48 horas de cultivo, quando cultivados em meio YP suplementado com 2% (p/v) de D-galactose. A biossíntese de L-AA foi também realizada quando as linhagens recombinantes foram cultivadas em meio de soro de queijo, fonte alternativa rica em lactose proveniente da indústria de laticínios. Este trabalho é um dos primeiros relatos de engenharia metabólica na levedura K. lactis visando a biossíntese de ácido L-ascórbico por um processo fermentativo sem a adição de intermediários precursores no meio de cultura. / L-ascorbic acid is naturally synthesized in plants from D-glucose via a ten-step pathway. The branch pathway to synthesize L-galactose, the key intermediate for L- ascorbic biosynthesis, has been recently elucidated. Budding yeast is only able to synthesize L-ascorbic acid if it is cultivated in the presence of one of its precursors: L- galactose, L-galactono-1,4-lactone, or L-gulono-1,4-lactone extracted from plants or animals. To avoid feeding the yeast culture with this “L” enantiomer, we engineered Kluyveromyces lactis with L-galactose biosynthesis pathway genes: GDP-mannose-3,5- epimerase (GME), GDP-L-galactose phosphorylase (VTC2) and L-galactose-1- phosphate phosphatase (VTC4) isolated from Arabidopsis thaliana. Plasmids were constructed to target the cloned plant genes to the K. lactis LAC4 Locus by homologous recombination and the expression was associated to the growth of the cells on D- galactose or lactose. Upon K. lactis transformation, GME was under the control of the native LAC4 promoter while VTC2 and VTC4 genes were transcribed by the S. cerevisiae promoters GPD1 and ADH1 respectively. The expression in K. lactis of the endogenous L-galactose biosynthesis plant genes was determined by RT-PCR and western blotting. The recombinant yeasts were able to produce about 23 mg.L-1 of L- ascorbic acid in 48 hours of cultivation when cultured on rich medium with 2% (w/v) D-galactose. We have also successfully evaluated the L-AA production culturing recombinant strains in cheese whey as an alternative source of lactose and which is a waste product during cheese production. This work is the first attempt to engineering K. lactis cells for L-ascorbic acid biosynthesis through a fermentation process without any trace of “L” isomers precursors in the culture medium.

O projeto visou aumentar a produção de celulases em fungos T. harzianum IPT 821 e T. reesei QM 9414. Esporos foram submetidos à radiação UV-C. Células das colônias mais capacitadas ao crescimento foram sucessivamente cultivadas em meio solidificado, contendo concentrações progressivamente reduzidas fonte de carbono, de modo a resultar pressão ambiental seletiva e crescente. Após esta etapa as linhagens isoladas foram cultivadas em meio composto por bagaço de cana/farelo de trigo na proporção 80/20, 60% de umidade, 30°C por 72h. Uma linhagem, originária da cepa IPT 821, apresentou atividade de 3,7 FP U/gms, 50% superior em relação à parental: 2,6 U/gms (p=0,001; p<0,05). Análises das frações enzimáticas indicaram uma diferença significativa (p=0,001; p<0,05) na atividade de xilanase: 4,7 U/gms (mutante) e 4 U/gms (parental). Ensaios de hidrólise, Avicel como substrato (1% de sólidos; w/v) indicaram um aumento de quase 70% na hidrólise em 48h, da mutante em comparação à parental (8,7% (mutante) e 4,8% (parental), concentração enzimática de 2,5 FP U/gms). / This project aimed to increase cellulase production in fungi T. harzianum IPT 821 and T. reesei QM 9414. Spores were exposed to UV-C radiation. Colonies were plated and those showing best growth were successively cultivated in plates containing increasingly stress conditions reduced concentrations of the carbon source thus creating a progressive selective pressure. After this pre-selection step isolated strains were cultivated in medium comprising sugar cane bagasse and wheat straw, in the proportion of 80/20 respectively, 60% of moisture, 30°C for 72h. One strain, originated from IPT 821 strain, showed a cellulolytic activity of 3,7 U/gdw; 50% superior to the parental strain: 2,6 U/gdw (p=0,001; p<0,05). Analysis of the enzymatic cocktail showed significant difference (p=0,001; for p <0,05) on xylanase activity: 4,7 U/gdw (mutant strain) and 4 U/gdw (parental strain). Hydrolysis assays, using Avicel as substrate (1% w/v) showed an increase on hydrolysis of about 70%, in 48h (8,7% (mutant strain) and 4,8% (parental strain), enzyme load of about 2,5 U/gdw).

O objetivo desse estudo foi investigar o efeito protetor do íon magnésio em células de levedura Saccharomyces cerevisiae submetidas aos estresses térmico e etanólico. No processo industrial de fermentação as leveduras estão sujeitas ao estresse térmico, originado pelo calor produzido pela própria fermentação, e ao estresse pelo etanol, originado pelos efeitos adversos do álcool etílico produzido pelo catabolismo dos açúcares pelas leveduras. O magnésio tem a capacidade de atenuar os efeitos nocivos de estresse em leveduras S. cerevisae, principalmente através da estabilização da membrana celular. Foi cultivada a levedura Saccharomyces cerevisiae Y-904, a 30&#176;C por 24h sob agitação de 80 rpm em meio YEPD e em meio à base de caldo de cana-de-açúcar, acrescido ou não de 20 mmol de magnésio, na forma de sulfato de magnésio hepta-hidratado. As culturas foram expostas ao estresse térmico, através da elevação da temperatura de incubação de 30 para 42&#176;C e/ou ao estresse etanólico, em meio com 10% (v/v) de etanol. A viabilidade celular da levedura foi determinada por microscopia ótica às 0, 1, 2, 3, 4, 5, 24 e 48 horas do período de incubação sob as condições de estresse. A concentração de magnésio nas células e nos meios foi determinada por espectroscopia de absorção atômica. Os resultados foram analisados estatisticamente através de Análise de Variância, com posterior aplicação de Teste de Tukey. O enriquecimento do meio YEPD e/ou das células da levedura com magnésio proporcionou maior população e viabilidade celular da levedura. Em meio à base de caldo de cana o enriquecimento com magnésio não influenciou a população ou a viabilidade celular da levedura, provavelmente porque tal meio de cultivo já apresentava concentração suficiente de magnésio para a proteção da levedura contra os estresses térmico e etanólico. / The aim of this study was to investigate the protective effect of the ion magnesium in cells of Saccharomyces cerevisiae under thermal and ethanolic stresses. In the industrial process of fermentation the yeasts might be submitted either to thermal stress, originated from the heat produced by fermentation, or to ethanol stress, originated from the damages effect of ethylic alcohol produced by the catabolism of the sugars by the yeasts. Magnesium has the capability to attenuate harmful effects of stresses in yeast, mainly through the stabilization of the cellular membrane. The strain Y-904 of Saccharomyces cerevisiae was cultivated at 30&#176;C during 24h under 80 rpm agitation in medium YEPD or in a broth from sugar cane, both added or not with 20 mmol of magnesium from magnesium sulphate hepta-hydrated (MgSO4 7H2O). The cultures were exposed either to heat shock, by rising of the temperature of incubation from 30 to 42&#176;C, either/or to ethanol shock, in broth with 10% (v/v) of ethanol. The cellular viability of the yeasts was determined by optical microscopy at 0, 1, 2, 3, 4, 5, 24 and 48 hours of the period of incubation under the stress conditions. The magnesium concentration in the cells and in the mediums was determined for atomic absorption spectroscopy. The results were statistically analyzed by variance analysis and Tukey test. The yeast population and cell viability were higher in the medium YEPD enriched with magnesium (intra or extracellular) compared the same medium without magnesium supplementation. However it was not observed difference in population or viability of the yeasts in the broths from sugar cane enriched or not with magnesium. This happened probably because the broth from sugar cane already presented a concentration of magnesium enough to protect the yeast cells against the thermal and ethanolic stresses.