INTRODUÇÃO: A microbiota intestinal tem sido alvo de diversos estudos moleculares, principalmente através da introdução de plataformas de sequenciamento de nova geração, devido à sua importância e amplo relacionamento com o hospedeiro humano. Entretanto, o armazenamento de amostras fecais antes da extração do DNA é crítico ao caracterizar a composição da microbiota intestinal. Com base nesses dados, o presente estudo buscou compreender os efeitos de diferentes métodos de armazenamento de amostras fecais para caracterizar a microbiota intestinal através do sequenciamento da nova geração, bem como estabelecer um método alternativo de conservação do material genético bacteriano nessas amostras, utilizando guanidina. MÉTODO: Foram coletadas amostras de fezes de 10 voluntários saudáveis. Cada amostra foi dividida em cinco alíquotas, uma alíquota extraída imediatamente após a coleta (fresca) e duas alíquotas submetidas ao congelamento, à temperaturas de -20°C e -80°C e extraídas após 48 horas. As outras duas alíquotas restantes foram armazenadas em guanidina à temperatura ambiente e a 4°C e extraídas após 48 horas. Para observar a presença de alterações na microbiota intestinal, durante um período de armazenamento maior das amostras de fezes, três amostras foram armazenadas em guanidina à temperatura ambiente e a 4ºC e extraídas após o período de 60 dias. A região hipervariável v4 do gene 16S rRNA bacteriano foi amplificada por PCR. Os amplicons gerados foram sequenciados utilizando a plataforma Ion PGM Torrent e os dados analisados utilizando o software QIIME. A determinação da significância estatística foi realizada utilizando-se o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. RESULTADOS: Não foram encontradas diferenças significativas em nenhum dos níveis taxonômicos (filo, classe, família, ordem e gênero) entre amostras frescas analisadas e os métodos de armazenamento testados. As análises de coordenadas principais (PCoA) mostraram que as amostras se agruparam de acordo com os indivíduos analisados, tendo as amostras referentes a cada indivíduo agrupado-se com maior proximidade do que com outras amostras do mesmo grupo de armazenamento. CONCLUSÃO: Nossos dados sugerem que o congelamento e o uso de guanidina para armazenamento de amostras de fezes, para a caracterização da microbiota intestinal, podem efetivamente preservar o material genético bacteriano nessas amostras ao longo de um período de 48 horas para amostras submetidas ao congelamento e durante 60 dias para amostras armazenadas em guanidina / INTRODUCTION: The gut microbiota has been the target of several molecular studies, mainly through the introduction of next generation sequencing platforms, due to its importance and wide relationship with the human host. However, the storage of fecal samples prior to DNA extraction is critical when characterizing the composition of the intestinal microbiota. Based on these facts, the present study aimed to understand the effects of different methods of storage of fecal samples to characterize the intestinal microbiota by next generation sequence, as well as establishing an alternative conservation method of the bacterial genetic material in these samples using guanidine. METHODS: Stool samples from 10 healthy volunteers were collected. Each collected sample was divided into five aliquots, one aliquot extracted immediately after collection (fresh) and two aliquots subjected to freezing at -20°C and -80°C temperatures and extracted after 48 hours. The others two remaining aliquots were stored in guanidine at room temperature and at 4°C and extracted after 48 hours. In order to observe the presence of alterations in the intestinal microbiota, during a longer storage period of the stool samples, three samples were stored in guanidine at room temperature and at 4°C and extracted after 60 day period. The v4 hypervariable region of bacterial and archeal 16S rRNA gene were amplified by PCR. The generated amplicons were sequenced using Ion PGM Torrent platform and the data analyzed using the software QIIME. Determination of statistical significance was performed using non-parametric Kruskal-Wallis test. RESULTS: No significant differences were found in any of the taxonomic levels (phylum, class, family, order and genus) between analyzed fresh samples and the others different storage methods. The principal coordinates analysis (PCoA) unweighted showed that the samples clustered based on the host each sample originated from, rather than by storage group. CONCLUSION: Our data suggest that both freezing and the use of guanidine to store stool samples for gut microbiota characterization can effectively preserve the bacterial genetic material in these samples over a 48 hours period for samples subjected to freezing and for up to 60 days for samples stored in guanidine

Nesta pesquisa, estudaram-se as variações ocorridas na relação entre autólise de culturas lácticas e o desenvolvimento da proteólise de queijo Prato produzido em quatro regiões brasileiras: Santa Catarina (Queijo A), Goiás (Queijo B), São Paulo (Queijo C) e Minas Gerais (Queijo D). A análise quantitativa da população de bactérias lácticas durante a maturação mostrou perfis microbiológicos similares para todas as amostras de queijos examinadas. Após 5 dias de maturação, lactococos e estreptococos estavam presentes em números mais elevados do que lactobacilos mesofílicos e termofílicos, leuconostoc e fermentadores de lactato. Contudo, essas populações aumentaram consideravelmente no final do processo de maturação. Enterococos e fermentadores de citrato permaneceram em números relativamente reduzidos ao longo da maturação. A análise qualitativa mostrou a predominância de \"non starter lactic acid bactéria\" (NSLAB) nos queijos das quatro origens, principalmente de Lactobacillus sp. Outros gêneros foram identificados em menor proporção: Enterococcus sp., Pediococcus sp., Aerococcus sp., Tetragenococcus sp. e Streptococcus sp. O queijo C diferiu dos demais por não apresentar Pediococcus sp. e Streptococcus sp. As culturas lácticas adicionadas Lactococcus lacfis sp. e Leuconostoc sp. estavam presentes em populações menores. A autólise foi estudada pela determinação da atividade de aminopeptidases e detecção de autolisinas por zimogramas e de enzimas intracelulares por \"imunoblotting\". Uma maior liberação de aminopeptidases ocorreu no queijo D, seguido dos queijos C, B e A. Não foram detectadas bandas de atividade lítica nos zimogramas dos queijos A e B em todas as condições avaliadas. Nos zimogramas, detectou-se uma banda de 30 KDa nos queijos C e D a pH 7,4 e 44°C, e uma outra de 40 KDa, exclusiva no queijo D, ambas de fraca intensidade. A pH 6,8 e 42°C, detectou-se bandas de 40KDa de fraca intensidade no queijo C e forte no D, além de mais duas de fraca intensidade de 90KDa e 110KDa no queijo D. Na análise em \"imunnoblotting\" com o antisoro anti-Lc, foi observado apenas sinais fracos de reação positiva e em números inferiores àquelas reveladas com o citoplasma bruto de Lac. Lacfis subsp. lacfis (controle positivo), indicando que a autólise foi praticamente inexistente. Com o antisoro anti-D-LDH, também não se detectou sinais de reação positiva nos queijos A e B, enquanto nos queijos C e D, verificou-se sinais positivos de 37KDa, de forte intensidade e correspondentes à proteína D-LDH, indicando a lise de Lab. helveticus. A evolução da proteólise foi determinada quantitativamente durante a maturação e avaliada com base nos índices: NS-pH4,6/NT% e NNP/NT%, teor de tirosina, eletroforese (Uréia-PAGE) e quantificação de aminoácidos individuais livres. Não foram detectadas diferenças significativas entre os queijos A. B, C e D no início da maturação. Contudo, com a fragmentação das proteínas, ocorreu um aumento gradual desses índices, tendo-se observado valores mais elevados no queijo D, seguido dos queijos C, B e A. Os perfis eletroforéticos de proteínas foram similares para os queijos das quatro origens e mostraram claramente que o coagulante e a plasmina foram os responsáveis pela degradação inicial das caseínas. A taxa de degradação da αs1- e β-caseína apresentou a seguinte ordem: D > C ≥ B > A. O acúmulo de aminoácidos livres também foi mais rápido no queijo D, seguido dos queijos C, B e A. Portanto, a autólise de Lab. helveticus no queijo D acelerou a proteólise, diminuindo o período de maturação em 45% e não afetando negativamente o desenvolvimento de \"flavour\" e nem a textura. No final da maturação (45 dias), os compostos voláteis foram determinados por meio de cromatografia gasosa com espectrometria de massa (CG-MS). Com raras exceções, os queijos das quatro origens continham os mesmos compostos voláteis, embora em quantidades distintas. Os álcoois e ésters foram os compostos majoritários nos queijos A e B e benzaldeído, 3-metil-butanal-2 e hexanal nos C e D. O perfil de textura instrumental (TPA) e a análise sensorial descritiva e quantitativa foram realizados. Os queijos B, C e D apresentaram características mais típicas de queijo Prato, independentemente do fato de que o aroma de manteiga e o sabor doce serem mais acentuados no queijo D. O queijo A foi classificado como tendo as menores características de queijo Prato e apresentou maior nível de defeitos de \"flavour\", principalmente residual e amargor. Os queijos avaliados não apresentaram diferenças significativas quanto à elasticidade e coesividade. Pequenas alterações na composição físico-química dos queijos, principalmente os teores de umidade e de caseína, influenciaram nos parâmetros como a firmeza e a adesividade. O presente estudo demonstrou pela primeira vez a ausência de autólise de Lc. Lacfis sp. em queijo Prato de quatro origens, bem como a ocorrência de autólise de Lab. helveticus nos queijos de duas origens, C e D. A pronunciada autólise dessa espécie teve um impacto positivo na proteólise e foi a responsável pelo aumento da concentração de aminoácidos livres nesses queijos. As diferenças na evolução da proteólise observada entre os queijos C e D, com taxas mais baixas no queijo C, independentemente da autólise pronunciada de Lab. helveticus, foram atribuídas à falta de uniformidade na composição físico-química dos queijos, principalmente pH e os teores de sal na umidade (S/U). / This paper reports a study aimed at evaluating the variations that occur in the interrelationship between autolysis of lactic starter bacteria and the development of proteolysis in Prato cheese produced in four different regions of Brazil: Santa Catarina (Cheese A), Goiás (Cheese B), São Paulo (Cheese C) and Minas Gerais (Cheese D). Quantitative analysis of microbial population yielded similar microbiological profiles for all the cheese samples investigated. After 5 days ripening, lactococci and streptococci were present in higher numbers than mesophilic and thermophilic lactobacilli, leuconostoc and lactate fermenting bacteria. However, the populations of the latter species had considerably increased by the time the ripening process completed 45 days. Enterococci and citrate fermenting bacteria remained present in relatively low numbers throughout ripening. The findings from qualitative analysis confirmed the predominance of non-starter lactic acid bacteria (NSLAB) in the cheeses from four different origins, especially Lactobacillus sp. Other genera of non-starter lactic acid bacteria (NSLAB) were identified in smaller proportions: Enterococcus sp., Pediococcus sp., Aerococcus sp., Tetragenococcus sp. and Streptococcus sp. Cheese C differed from the cheeses in that it no evidence was found of the presence of Pediococcus sp. and Streptococcus sp. The bacteria of the lactic starter culture Lactococcus lactis sp. and Leuconostoc sp. were also found to be present, although in lower numbers. Autolysis was studied by: (1) determination of aminopeptidase activity; (2) detection of autolysins by zymograms and (3) detection of intracellular enzymes by immunoblotting. The release of aminopeptidase was highest in cheese D, followed by C, B and A. No bands of lytic activity were appeared in the zymograms of Cheeses A and B in all conditions evaluated. At pH 7,4 and 44°C, a low-intensity band of 30 KDa was found in cheeses C e D, whereas another low-intensity band was observed only in cheese D. At pH 6,8 and 42°C, bands of 40KDa were observed in cheese C (low intensity) and cheese D (high intensity), in addition to two more low-intensity bands of 90KDa and 110KDa in cheese D. Immunoblotting with antiserum anti-Lc produced only minor signs of positive reaction, evidenced by the formation of low-intensity bands of 100 Kda in cheeses A and B and two high-intensity bands of 75 Kda and 100 Kda in cheeses C and D. Since these were present in smaller numbers to those revealed with crude cytoplasm of Lac. lactis subsp. lactis, it was concluded that autolysis did practically non occur. Immunoblotting with antiserum anti-D-LDH also detected sings of positive reaction in cheeses A and B, whereas in cheeses C e D positive high-intensity signs of 37Kda were found relative to D-LDH protein, indicating lysis of Lab. helveticus. The evolution of proteolysis was determined quantitatively during the ripening process and evaluated on the basis of the following parameters: NS-pH4,6/NT% and NNP/NT% indexes, tyrosine content, electrophoresis (Urea-PAGE) and quantification of free amino acids. No significant differences were found between cheeses A, B, C and D in the ear1y stages of ripening. However, with the on-going fragmentation of proteins during ripening, a gradual increase of the ripening indexes occurred, with the highest values being observed in cheese D, followed by C, B e A. The electrophoretic profiles were similar for the four cheeses investigated and clear1y showed that the clotting agent or milk coagulant and plasmin were responsible for the initial breakdown of the caseins. The degradation rate of Q.sl- and p-casein followed the following order: D > C ≥ B > A. The buildup of free amino acids was also faster in cheese D, followed by cheeses C, B e A. At the end of the ripening process studied (45 days), the volatile compounds were identified using gas chromatography and mass spectrometry (GC-MS), whereas the instrumental texture profile was measured and evaluated by Texture Profile Analysis (TPA). Cheese samples were evaluated by descriptive and quantitative sensory analysis. With rare exceptions, the cheeses of four different origins contained the same volatile compounds, although in different quantities. Alcohols and esters were the predominant volatile compounds in cheeses A and B and benzaldehyde, 3-methyl-butanal-2 and hexanal in cheeses C and D. Autolysis of Lb. helveticus accelerated proteolysis in cheese D, thereby reducing ripening time by 45% without any negative effect on either flavor or texture development. Cheeses B, C and D exhibited the most typical Prato cheese characteristics, in spite of the fact that the buttery aroma and sweet taste were more pronounced in cheese D. Cheese A was rated as the cheese with the less typical overall Prato cheese profile and was also the one that exhibited the highest degree and number of flavor defects, notably aftertaste and bitterness. The cheeses investigated did not present any significant differences as to elasticity and cohesiveness. Minor changes in the physical-chemical composition of the cheeses - mainly related to the moisture and casein levels - influenced parameters such as firmness and adhesiveness. The present study demonstrates for the very first time the absence of autolysis of Lc. Lactis sp. in Prato cheese from four different origins, as well as the occurrence of autolysis of Lb. helveticus in two of the cheeses analyzed (cheeses C and D). The pronounced autolysis of this species had a positive impact on proteolysis and was responsible for the release of increased quantities of free amino acids in these cheeses. The differences in the evolution of proteolysis observed between cheeses C and D - lower rate of proteolysis in cheese C, in spite of pronounced autolysis of Lb. helveticus - were attributed to poor uniformity of the physical-chemical composition of this cheese, particularly as related to pH and the salt and moisture levels (S/M).

A presente investigação teve como objetivo avaliar a prática de cirurgiões dentistas em uma unidade de terapia intensiva (UTI) de um hospital militar, o estabelecimento de um protocolo de higiene oral e os seus efeitos sobre a redução de pneumonias associadas à ventilação mecânica (PAVM). As percepções da equipe da UTI sobre as atividades dos cirurgiões dentistas também foram avaliadas por meio de um questionário. O perfil de colonização microbiana da mucosa oral antes e depois do estabelecimento das medidas de higiene oral também foi avaliado tanto por diluição e plaqueamento em meios de cultura microbiológicos seletivos e enriquecidos e através da amplificação pelo método de PCR e eletroforese em gel desnaturante em gradiente (DGGE), subsequente ao sequenciamento dos amplicons. A carga microbiana foi avaliada após a contagem de placas de agar e através da amplificação por PCR em tempo real (qPCR) do gene rrs nas amostras. O protocolo de higiene oral, realizado pelos cirurgiões dentistas, foi capaz de reduzir a incidência de PAVM (p <0,05). O questionário revelou que a modificação da halitose foi percebida por 93,33% dos participantes. A redução da ocorrência das úlceras orais e dos lábios durante a internação dos pacientes foi observada por 80% da equipe da UTI. Foi observada a redução da produção das secreções nasais e bucais por 70% da equipe dos profissionais da UTI. Para 86,66% dos participantes a assistência aos pacientes tornou-se mais agradável após a instituição dos cuidados bucais. O protocolo, realizado com a utilização de solução 0,12% de clorexidina, não foi capaz de evitar a colonização da mucosa oral por patógenos microbianos usualmente encontrados no ambiente hospitalar tais como os bastonetes Gram-negativos entéricos e não fermentadores, nem foi capaz de eliminá-los quando tais micro-organismos já se encontravam presentes antes dos procedimentos de higiene bucal. Alguns Bastonetes Gram-positivos (Lactobacillus sp e corinebactérias) e Staphylococcus epidermidis permaneceram após a realização dos procedimentos. O protocolo de higiene oral permitiu a redução da carga microbiana na mucosa oral de 50% dos pacientes considerando-se o método de contagem microbiana e para 35% dos pacientes pela avaliação dos números de cópias de genes rrs através de qPCR. Em conclusão, o protocolo de higiene oral desenvolvido pelos cirurgiões dentistas foi capaz de reduzir a incidência de PAV na UTI, embora não tenha sido capaz de prevenir a colonização da mucosa oral por supostos patógenos microbianos. O protocolo de higiene oral com a participação ativa dos cirurgiões dentistas foi bem aceito pelos profissionais da UTI e foi capaz de melhorar a qualidade da assistência aos pacientes críticos. / This investigation aimed to evaluate the practice of dentists in an intensive care unit (ICU) of a military hospital, the establishment of a protocol for oral hygiene, and the effect of the protocol on the reduction of ventilator associated pneumonia (VAP) after the introduction of the oral hygiene protocol. The opinion of the ICU staff about the activity of the dentists was also evaluated by means of a questionnaire. In addition, the microbial colonization profile of the oral mucosa before and after the establishment of the oral hygiene measures was evaluated by means of both dilution and plating the samples in microbiological culture mediums (both selective and rich agar media) and DGGE technique, with sequencing of amplicons. The microbial load was evaluated after counting agar plates and by real time rrs gene PCR amplification (qPCR) in the samples. The oral hygiene protocol performed by dentists was capable to reduce the incidence of VAP (p< 0.05). The questionnaire revealed that the change of the oral odor was noticed by 93.33% of the participants. The reduction of oral and lip ulcers during the hospitalization of the patients was observed by 80% of the staff. The patients were observed to reduce the production of oral and nasal secretions after the establishment of the oral hygiene procedures by 70% of the ICU professionals. The approach to the patients developed by the staff became more pleasant after the establishment of the oral protocol for 86.66%. The protocol, with the use of 0,12% chlorhexidine solution, was not capable to avoid the colonization of the oral mucosa by the microbial pathogens usually found in nosocomial environment, in especial Gram-negative enteric and non-fermentative rods, nor eliminated these organisms previously found before the oral care procedures. Gram-positive rods (Lactobacillus sp, and corynebacteria) and Staphylococcus epidermidis remained after the procedures. The protocol reduced the microbial load in the oral mucosa of 50% of the patients considering the microbial counting and in 35% of the patients evaluated by the numbers of copies of rrs genes by qPCR. In conclusion, the oral hygiene protocol developed by dentists was capable to reduce the incidence of VAP in the studied ICU, though was not capable to prevent the colonization of oral mucosa by putative microbial pathogens. The oral hygiene protocol with active participation of dentists was well accepted by the ICU professionals and was capable to improve the quality of assistance to critically ill patients.

A presente investigação teve como objetivo avaliar a prática de cirurgiões dentistas em uma unidade de terapia intensiva (UTI) de um hospital militar, o estabelecimento de um protocolo de higiene oral e os seus efeitos sobre a redução de pneumonias associadas à ventilação mecânica (PAVM). As percepções da equipe da UTI sobre as atividades dos cirurgiões dentistas também foram avaliadas por meio de um questionário. O perfil de colonização microbiana da mucosa oral antes e depois do estabelecimento das medidas de higiene oral também foi avaliado tanto por diluição e plaqueamento em meios de cultura microbiológicos seletivos e enriquecidos e através da amplificação pelo método de PCR e eletroforese em gel desnaturante em gradiente (DGGE), subsequente ao sequenciamento dos amplicons. A carga microbiana foi avaliada após a contagem de placas de agar e através da amplificação por PCR em tempo real (qPCR) do gene rrs nas amostras. O protocolo de higiene oral, realizado pelos cirurgiões dentistas, foi capaz de reduzir a incidência de PAVM (p <0,05). O questionário revelou que a modificação da halitose foi percebida por 93,33% dos participantes. A redução da ocorrência das úlceras orais e dos lábios durante a internação dos pacientes foi observada por 80% da equipe da UTI. Foi observada a redução da produção das secreções nasais e bucais por 70% da equipe dos profissionais da UTI. Para 86,66% dos participantes a assistência aos pacientes tornou-se mais agradável após a instituição dos cuidados bucais. O protocolo, realizado com a utilização de solução 0,12% de clorexidina, não foi capaz de evitar a colonização da mucosa oral por patógenos microbianos usualmente encontrados no ambiente hospitalar tais como os bastonetes Gram-negativos entéricos e não fermentadores, nem foi capaz de eliminá-los quando tais micro-organismos já se encontravam presentes antes dos procedimentos de higiene bucal. Alguns Bastonetes Gram-positivos (Lactobacillus sp e corinebactérias) e Staphylococcus epidermidis permaneceram após a realização dos procedimentos. O protocolo de higiene oral permitiu a redução da carga microbiana na mucosa oral de 50% dos pacientes considerando-se o método de contagem microbiana e para 35% dos pacientes pela avaliação dos números de cópias de genes rrs através de qPCR. Em conclusão, o protocolo de higiene oral desenvolvido pelos cirurgiões dentistas foi capaz de reduzir a incidência de PAV na UTI, embora não tenha sido capaz de prevenir a colonização da mucosa oral por supostos patógenos microbianos. O protocolo de higiene oral com a participação ativa dos cirurgiões dentistas foi bem aceito pelos profissionais da UTI e foi capaz de melhorar a qualidade da assistência aos pacientes críticos. / This investigation aimed to evaluate the practice of dentists in an intensive care unit (ICU) of a military hospital, the establishment of a protocol for oral hygiene, and the effect of the protocol on the reduction of ventilator associated pneumonia (VAP) after the introduction of the oral hygiene protocol. The opinion of the ICU staff about the activity of the dentists was also evaluated by means of a questionnaire. In addition, the microbial colonization profile of the oral mucosa before and after the establishment of the oral hygiene measures was evaluated by means of both dilution and plating the samples in microbiological culture mediums (both selective and rich agar media) and DGGE technique, with sequencing of amplicons. The microbial load was evaluated after counting agar plates and by real time rrs gene PCR amplification (qPCR) in the samples. The oral hygiene protocol performed by dentists was capable to reduce the incidence of VAP (p< 0.05). The questionnaire revealed that the change of the oral odor was noticed by 93.33% of the participants. The reduction of oral and lip ulcers during the hospitalization of the patients was observed by 80% of the staff. The patients were observed to reduce the production of oral and nasal secretions after the establishment of the oral hygiene procedures by 70% of the ICU professionals. The approach to the patients developed by the staff became more pleasant after the establishment of the oral protocol for 86.66%. The protocol, with the use of 0,12% chlorhexidine solution, was not capable to avoid the colonization of the oral mucosa by the microbial pathogens usually found in nosocomial environment, in especial Gram-negative enteric and non-fermentative rods, nor eliminated these organisms previously found before the oral care procedures. Gram-positive rods (Lactobacillus sp, and corynebacteria) and Staphylococcus epidermidis remained after the procedures. The protocol reduced the microbial load in the oral mucosa of 50% of the patients considering the microbial counting and in 35% of the patients evaluated by the numbers of copies of rrs genes by qPCR. In conclusion, the oral hygiene protocol developed by dentists was capable to reduce the incidence of VAP in the studied ICU, though was not capable to prevent the colonization of oral mucosa by putative microbial pathogens. The oral hygiene protocol with active participation of dentists was well accepted by the ICU professionals and was capable to improve the quality of assistance to critically ill patients.

INTRODUÇÃO: A microbiota intestinal tem sido alvo de diversos estudos moleculares, principalmente através da introdução de plataformas de sequenciamento de nova geração, devido à sua importância e amplo relacionamento com o hospedeiro humano. Entretanto, o armazenamento de amostras fecais antes da extração do DNA é crítico ao caracterizar a composição da microbiota intestinal. Com base nesses dados, o presente estudo buscou compreender os efeitos de diferentes métodos de armazenamento de amostras fecais para caracterizar a microbiota intestinal através do sequenciamento da nova geração, bem como estabelecer um método alternativo de conservação do material genético bacteriano nessas amostras, utilizando guanidina. MÉTODO: Foram coletadas amostras de fezes de 10 voluntários saudáveis. Cada amostra foi dividida em cinco alíquotas, uma alíquota extraída imediatamente após a coleta (fresca) e duas alíquotas submetidas ao congelamento, à temperaturas de -20°C e -80°C e extraídas após 48 horas. As outras duas alíquotas restantes foram armazenadas em guanidina à temperatura ambiente e a 4°C e extraídas após 48 horas. Para observar a presença de alterações na microbiota intestinal, durante um período de armazenamento maior das amostras de fezes, três amostras foram armazenadas em guanidina à temperatura ambiente e a 4ºC e extraídas após o período de 60 dias. A região hipervariável v4 do gene 16S rRNA bacteriano foi amplificada por PCR. Os amplicons gerados foram sequenciados utilizando a plataforma Ion PGM Torrent e os dados analisados utilizando o software QIIME. A determinação da significância estatística foi realizada utilizando-se o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. RESULTADOS: Não foram encontradas diferenças significativas em nenhum dos níveis taxonômicos (filo, classe, família, ordem e gênero) entre amostras frescas analisadas e os métodos de armazenamento testados. As análises de coordenadas principais (PCoA) mostraram que as amostras se agruparam de acordo com os indivíduos analisados, tendo as amostras referentes a cada indivíduo agrupado-se com maior proximidade do que com outras amostras do mesmo grupo de armazenamento. CONCLUSÃO: Nossos dados sugerem que o congelamento e o uso de guanidina para armazenamento de amostras de fezes, para a caracterização da microbiota intestinal, podem efetivamente preservar o material genético bacteriano nessas amostras ao longo de um período de 48 horas para amostras submetidas ao congelamento e durante 60 dias para amostras armazenadas em guanidina / INTRODUCTION: The gut microbiota has been the target of several molecular studies, mainly through the introduction of next generation sequencing platforms, due to its importance and wide relationship with the human host. However, the storage of fecal samples prior to DNA extraction is critical when characterizing the composition of the intestinal microbiota. Based on these facts, the present study aimed to understand the effects of different methods of storage of fecal samples to characterize the intestinal microbiota by next generation sequence, as well as establishing an alternative conservation method of the bacterial genetic material in these samples using guanidine. METHODS: Stool samples from 10 healthy volunteers were collected. Each collected sample was divided into five aliquots, one aliquot extracted immediately after collection (fresh) and two aliquots subjected to freezing at -20°C and -80°C temperatures and extracted after 48 hours. The others two remaining aliquots were stored in guanidine at room temperature and at 4°C and extracted after 48 hours. In order to observe the presence of alterations in the intestinal microbiota, during a longer storage period of the stool samples, three samples were stored in guanidine at room temperature and at 4°C and extracted after 60 day period. The v4 hypervariable region of bacterial and archeal 16S rRNA gene were amplified by PCR. The generated amplicons were sequenced using Ion PGM Torrent platform and the data analyzed using the software QIIME. Determination of statistical significance was performed using non-parametric Kruskal-Wallis test. RESULTS: No significant differences were found in any of the taxonomic levels (phylum, class, family, order and genus) between analyzed fresh samples and the others different storage methods. The principal coordinates analysis (PCoA) unweighted showed that the samples clustered based on the host each sample originated from, rather than by storage group. CONCLUSION: Our data suggest that both freezing and the use of guanidine to store stool samples for gut microbiota characterization can effectively preserve the bacterial genetic material in these samples over a 48 hours period for samples subjected to freezing and for up to 60 days for samples stored in guanidine

Nesta pesquisa, estudaram-se as variações ocorridas na relação entre autólise de culturas lácticas e o desenvolvimento da proteólise de queijo Prato produzido em quatro regiões brasileiras: Santa Catarina (Queijo A), Goiás (Queijo B), São Paulo (Queijo C) e Minas Gerais (Queijo D). A análise quantitativa da população de bactérias lácticas durante a maturação mostrou perfis microbiológicos similares para todas as amostras de queijos examinadas. Após 5 dias de maturação, lactococos e estreptococos estavam presentes em números mais elevados do que lactobacilos mesofílicos e termofílicos, leuconostoc e fermentadores de lactato. Contudo, essas populações aumentaram consideravelmente no final do processo de maturação. Enterococos e fermentadores de citrato permaneceram em números relativamente reduzidos ao longo da maturação. A análise qualitativa mostrou a predominância de \"non starter lactic acid bactéria\" (NSLAB) nos queijos das quatro origens, principalmente de Lactobacillus sp. Outros gêneros foram identificados em menor proporção: Enterococcus sp., Pediococcus sp., Aerococcus sp., Tetragenococcus sp. e Streptococcus sp. O queijo C diferiu dos demais por não apresentar Pediococcus sp. e Streptococcus sp. As culturas lácticas adicionadas Lactococcus lacfis sp. e Leuconostoc sp. estavam presentes em populações menores. A autólise foi estudada pela determinação da atividade de aminopeptidases e detecção de autolisinas por zimogramas e de enzimas intracelulares por \"imunoblotting\". Uma maior liberação de aminopeptidases ocorreu no queijo D, seguido dos queijos C, B e A. Não foram detectadas bandas de atividade lítica nos zimogramas dos queijos A e B em todas as condições avaliadas. Nos zimogramas, detectou-se uma banda de 30 KDa nos queijos C e D a pH 7,4 e 44&#176;C, e uma outra de 40 KDa, exclusiva no queijo D, ambas de fraca intensidade. A pH 6,8 e 42&#176;C, detectou-se bandas de 40KDa de fraca intensidade no queijo C e forte no D, além de mais duas de fraca intensidade de 90KDa e 110KDa no queijo D. Na análise em \"imunnoblotting\" com o antisoro anti-Lc, foi observado apenas sinais fracos de reação positiva e em números inferiores àquelas reveladas com o citoplasma bruto de Lac. Lacfis subsp. lacfis (controle positivo), indicando que a autólise foi praticamente inexistente. Com o antisoro anti-D-LDH, também não se detectou sinais de reação positiva nos queijos A e B, enquanto nos queijos C e D, verificou-se sinais positivos de 37KDa, de forte intensidade e correspondentes à proteína D-LDH, indicando a lise de Lab. helveticus. A evolução da proteólise foi determinada quantitativamente durante a maturação e avaliada com base nos índices: NS-pH4,6/NT% e NNP/NT%, teor de tirosina, eletroforese (Uréia-PAGE) e quantificação de aminoácidos individuais livres. Não foram detectadas diferenças significativas entre os queijos A. B, C e D no início da maturação. Contudo, com a fragmentação das proteínas, ocorreu um aumento gradual desses índices, tendo-se observado valores mais elevados no queijo D, seguido dos queijos C, B e A. Os perfis eletroforéticos de proteínas foram similares para os queijos das quatro origens e mostraram claramente que o coagulante e a plasmina foram os responsáveis pela degradação inicial das caseínas. A taxa de degradação da &#945;s1- e &#946;-caseína apresentou a seguinte ordem: D &gt; C &#8805; B &gt; A. O acúmulo de aminoácidos livres também foi mais rápido no queijo D, seguido dos queijos C, B e A. Portanto, a autólise de Lab. helveticus no queijo D acelerou a proteólise, diminuindo o período de maturação em 45% e não afetando negativamente o desenvolvimento de \"flavour\" e nem a textura. No final da maturação (45 dias), os compostos voláteis foram determinados por meio de cromatografia gasosa com espectrometria de massa (CG-MS). Com raras exceções, os queijos das quatro origens continham os mesmos compostos voláteis, embora em quantidades distintas. Os álcoois e ésters foram os compostos majoritários nos queijos A e B e benzaldeído, 3-metil-butanal-2 e hexanal nos C e D. O perfil de textura instrumental (TPA) e a análise sensorial descritiva e quantitativa foram realizados. Os queijos B, C e D apresentaram características mais típicas de queijo Prato, independentemente do fato de que o aroma de manteiga e o sabor doce serem mais acentuados no queijo D. O queijo A foi classificado como tendo as menores características de queijo Prato e apresentou maior nível de defeitos de \"flavour\", principalmente residual e amargor. Os queijos avaliados não apresentaram diferenças significativas quanto à elasticidade e coesividade. Pequenas alterações na composição físico-química dos queijos, principalmente os teores de umidade e de caseína, influenciaram nos parâmetros como a firmeza e a adesividade. O presente estudo demonstrou pela primeira vez a ausência de autólise de Lc. Lacfis sp. em queijo Prato de quatro origens, bem como a ocorrência de autólise de Lab. helveticus nos queijos de duas origens, C e D. A pronunciada autólise dessa espécie teve um impacto positivo na proteólise e foi a responsável pelo aumento da concentração de aminoácidos livres nesses queijos. As diferenças na evolução da proteólise observada entre os queijos C e D, com taxas mais baixas no queijo C, independentemente da autólise pronunciada de Lab. helveticus, foram atribuídas à falta de uniformidade na composição físico-química dos queijos, principalmente pH e os teores de sal na umidade (S/U). / This paper reports a study aimed at evaluating the variations that occur in the interrelationship between autolysis of lactic starter bacteria and the development of proteolysis in Prato cheese produced in four different regions of Brazil: Santa Catarina (Cheese A), Goiás (Cheese B), São Paulo (Cheese C) and Minas Gerais (Cheese D). Quantitative analysis of microbial population yielded similar microbiological profiles for all the cheese samples investigated. After 5 days ripening, lactococci and streptococci were present in higher numbers than mesophilic and thermophilic lactobacilli, leuconostoc and lactate fermenting bacteria. However, the populations of the latter species had considerably increased by the time the ripening process completed 45 days. Enterococci and citrate fermenting bacteria remained present in relatively low numbers throughout ripening. The findings from qualitative analysis confirmed the predominance of non-starter lactic acid bacteria (NSLAB) in the cheeses from four different origins, especially Lactobacillus sp. Other genera of non-starter lactic acid bacteria (NSLAB) were identified in smaller proportions: Enterococcus sp., Pediococcus sp., Aerococcus sp., Tetragenococcus sp. and Streptococcus sp. Cheese C differed from the cheeses in that it no evidence was found of the presence of Pediococcus sp. and Streptococcus sp. The bacteria of the lactic starter culture Lactococcus lactis sp. and Leuconostoc sp. were also found to be present, although in lower numbers. Autolysis was studied by: (1) determination of aminopeptidase activity; (2) detection of autolysins by zymograms and (3) detection of intracellular enzymes by immunoblotting. The release of aminopeptidase was highest in cheese D, followed by C, B and A. No bands of lytic activity were appeared in the zymograms of Cheeses A and B in all conditions evaluated. At pH 7,4 and 44&#176;C, a low-intensity band of 30 KDa was found in cheeses C e D, whereas another low-intensity band was observed only in cheese D. At pH 6,8 and 42&#176;C, bands of 40KDa were observed in cheese C (low intensity) and cheese D (high intensity), in addition to two more low-intensity bands of 90KDa and 110KDa in cheese D. Immunoblotting with antiserum anti-Lc produced only minor signs of positive reaction, evidenced by the formation of low-intensity bands of 100 Kda in cheeses A and B and two high-intensity bands of 75 Kda and 100 Kda in cheeses C and D. Since these were present in smaller numbers to those revealed with crude cytoplasm of Lac. lactis subsp. lactis, it was concluded that autolysis did practically non occur. Immunoblotting with antiserum anti-D-LDH also detected sings of positive reaction in cheeses A and B, whereas in cheeses C e D positive high-intensity signs of 37Kda were found relative to D-LDH protein, indicating lysis of Lab. helveticus. The evolution of proteolysis was determined quantitatively during the ripening process and evaluated on the basis of the following parameters: NS-pH4,6/NT% and NNP/NT% indexes, tyrosine content, electrophoresis (Urea-PAGE) and quantification of free amino acids. No significant differences were found between cheeses A, B, C and D in the ear1y stages of ripening. However, with the on-going fragmentation of proteins during ripening, a gradual increase of the ripening indexes occurred, with the highest values being observed in cheese D, followed by C, B e A. The electrophoretic profiles were similar for the four cheeses investigated and clear1y showed that the clotting agent or milk coagulant and plasmin were responsible for the initial breakdown of the caseins. The degradation rate of Q.sl- and p-casein followed the following order: D &gt; C &#8805; B &gt; A. The buildup of free amino acids was also faster in cheese D, followed by cheeses C, B e A. At the end of the ripening process studied (45 days), the volatile compounds were identified using gas chromatography and mass spectrometry (GC-MS), whereas the instrumental texture profile was measured and evaluated by Texture Profile Analysis (TPA). Cheese samples were evaluated by descriptive and quantitative sensory analysis. With rare exceptions, the cheeses of four different origins contained the same volatile compounds, although in different quantities. Alcohols and esters were the predominant volatile compounds in cheeses A and B and benzaldehyde, 3-methyl-butanal-2 and hexanal in cheeses C and D. Autolysis of Lb. helveticus accelerated proteolysis in cheese D, thereby reducing ripening time by 45% without any negative effect on either flavor or texture development. Cheeses B, C and D exhibited the most typical Prato cheese characteristics, in spite of the fact that the buttery aroma and sweet taste were more pronounced in cheese D. Cheese A was rated as the cheese with the less typical overall Prato cheese profile and was also the one that exhibited the highest degree and number of flavor defects, notably aftertaste and bitterness. The cheeses investigated did not present any significant differences as to elasticity and cohesiveness. Minor changes in the physical-chemical composition of the cheeses - mainly related to the moisture and casein levels - influenced parameters such as firmness and adhesiveness. The present study demonstrates for the very first time the absence of autolysis of Lc. Lactis sp. in Prato cheese from four different origins, as well as the occurrence of autolysis of Lb. helveticus in two of the cheeses analyzed (cheeses C and D). The pronounced autolysis of this species had a positive impact on proteolysis and was responsible for the release of increased quantities of free amino acids in these cheeses. The differences in the evolution of proteolysis observed between cheeses C and D - lower rate of proteolysis in cheese C, in spite of pronounced autolysis of Lb. helveticus - were attributed to poor uniformity of the physical-chemical composition of this cheese, particularly as related to pH and the salt and moisture levels (S/M).

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Einleitung Angesichts des besorgniserregenden Anstiegs der weltweiten Inzidenz von Übergewicht und Adipositas sowie der damit assoziierten Komorbiditäten, bedarf es neben weitreichenden präventiven Maßnahmen vor allem der Entwicklung neuer, nachhaltig effizienter Strategien zum langfristigen Gewichts- und Stoffwechselmanagement. Als wichtiger Ausgangspunkt für solch non-invasive Behandlungsalternativen, könnte das Verständnis der zugrundeliegenden Wirkmechanismen der „bariatrisch-metabolischen Chirurgie“, mit dem Roux-en-Y Magenbypass (Roux-en-Y gastric bypass, RYGB) als eines der am häufigsten angewandten Verfahren, genutzt werden. Zumal der langfristige Erfolg der RYGB-Operation nicht nur auf die restriktiv-malabsorptiven Modifikationen zurückzuführen ist, sondern auch mit zahlreichen vom Gewichtsverlust unabhängigen Faktoren, wie einer erheblichen Umgestaltung der mikrobiellen Darmbesiedlung, in Verbindung gebracht wird. Inwieweit es sich hierbei um eine kausale Verbindung zwischen der RYGB-modulierten intestinalen Mikrobiota und den durch den chirurgischen Eingriff induzierten Gesundheitsvorteilen handelt, blieb bislang jedoch ungeklärt. Ziel der Untersuchung Die vorliegende Arbeit dient der Darstellung der funktionellen Beziehung zwischen der RYGB-spezifischen Darm-Mikrobiota und den positiven therapeutischen Effekten der Roux-en-Y Magenbypass-Operation bei diätetisch-induzierter Adipositas. Hierbei ist vor allem die Rolle der postoperativen „RYGB-Mikrobiota“ beim Erreichen der nachhaltigen Gewichtsreduktion und verbesserten Stoffwechselfunktion von besonderem Interesse. Im Weiteren wird die Mikrobiota-basierte Übertragbarkeit jener vorteilhaften Auswirkungen des bariatrischen Eingriffs auf ein konventionelles Adipositasmodell untersucht. Ergebnisse Mithilfe der gezielten Dezimierung der mikrobiellen Darmflora von RYGB-operierten Tieren, ließ sich die grundlegende Bedeutung derselben für die postoperativen Verbesserungen der Gewichts-, Stoffwechsel- und Energiekontrolle des Wirtes verdeutlichen. So führte die kontinuierliche Antibiotikagabe zu einer signifikanten Minderung der positiven klinischen Effekte des Eingriffes, was als Beweis für die essenzielle Bedeutung der intestinalen „RYGB-Mikrobiota“ zum Erreichen des vollen Ausmaßes der therapeutischen Wirksamkeit der Operation bewertet werden kann. Basierend auf Versuchen, die die Übertragbarkeit bariatrischer Therapieeffekte auf keimfreie, metabolisch unbelastete Versuchstiere belegen, gelang es uns zudem nachzuweisen, dass der fäkale Mikrobiota-Transfer der post-RYGB veränderten mikrobiellen Darmbesiedlung auch bei konventionell aufgezogenen, nicht-operierten Kleinnagern mit diätetisch-induzierter Adipositas ausreicht, um die positiven Auswirkungen der Operation auf die Stoffwechselgesundheit des Empfängers nachzuahmen. Schlussfolgerungen So unterstreichen die Ergebnisse unseres konventionellen Adipositas-Krankheitsmodells zum einen die entscheidende Rolle der intestinalen Mikrobiota als Schlüsselfaktor für den Operationserfolg des Roux-en-Y Magenbypasses und veranschaulichen zum anderen eine innovative Möglichkeit zur Behandlung von Adipositas und den damit verbundenen Stoffwechselerkrankungen auf der Grundlage von Mikrobiota-Modulation.:INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 2 LITERATURÜBERSICHT 2.1 Adipositas in unserer Gesellschaft 2.2 Therapiemöglichkeiten von Adipositas 2.2.1 konservative Behandlungsansätze 2.2.2 bariatrische Chirurgie 2.3 Auswirkungen der Roux-en-Y Magenbypass-Operation auf das Körpergewicht, den Stoffwechsel und die intestinale Mikrobiota bei Adipositas 2.4 Rolle der intestinalen Mikrobiota bei physiologischen und pathologischen Stoffwechselprozessen im Wirtsorganismus 2.5 Behandlung von Darmerkrankungen und extraintestinalen Krankheiten durch fäkalen Mikrobiota-Transfer 2.6 Evidenz für die Übertragung des metabolischen Phänotyps durch fäkalen Mikrobiota-Transfer 2.7 Bisherige Evidenz zur Wirkung der nach RYGB-Operation modulierten intestinalen Mikrobiota auf den Wirtsstoffwechsel 2.8 Fragestellungen und Hypothesen 3 TIERE, MATERIALIEN UND METHODEN 3.1 Versuchstiere 3.2 Materialien 3.2.1 Materialien des allgemeinen Versuchsablaufs und der In-vivo-Tests 3.2.2 Materialien der Roux-en-Y Magenbypass-Operation 3.2.3 Materialien der Ex-vivo-Analysen 3.3 Methoden 3.3.1 Allgemeiner Versuchsablauf 3.3.2 Roux-en-Y Magenbypass-Operation in der Ratte 3.3.2.1 Präoperative Versorgung 3.3.2.2 OP-Ablauf 3.3.2.3 Postoperative Versorgung 3.3.3 In-vivo-Tests 3.3.3.1 Glukosetoleranztest 3.3.3.2 Insulintoleranztest 3.3.3.3 Kälteexposition und Wärmebildaufnahme 3.3.3.4 Echo MRI 3.3.4 Ex-vivo-Analysen 3.3.4.1 Gewebeentnahme und -konservierung 3.3.4.2 Histologische Gewebeaufarbeitung 3.3.4.2.1 Generierung histologischer Gewebeschnitte 3.3.4.2.2 Immunhistochemische/Histologische Färbeverfahren 3.3.4.2.3 Mikroskopische Gewebsanalyse 3.3.4.3 Absorptionsphotometrie 3.3.4.4 Statistische Auswertung 4 ERGEBNISSE 4.1 Dezimierung der intestinalen Mikrobiota post-RYGB beeinflusst die therapeutischen Effekte der operativen Intervention auf den Wirtsorganismus 4.1.1 Dezimierung der „RYGB-Mikrobiota“ verändert den Einfluss der Operation auf die Futterpräferenz, Energiezufuhr und das Körpergewicht 4.1.2 Dezimierung der „RYGB-Mikrobiota“ modifiziert die Auswirkungen der chirurgischen Intervention auf die Glukose-Homöostase 4.1.3 Dezimierung der „RYGB-Mikrobiota“ beeinflusst die Folgen des bariatrischen Eingriffs auf den Lipidmetabolismus 4.1.4 Auswirkung der Dezimierung der „RYGB-Mikrobiota“ auf die postoperativ auftretenden Veränderungen des Energiehaushaltes (Thermogenese) 4.1.5 Dezimierung der „RYGB-Mikrobiota“ verändert die Effekte der Operation auf die Morphologie des Darms 4.2 Übertragung der post-RYGB veränderten intestinalen Mikrobiota auf ein konventionelles Adipositasmodell imitiert die therapeutischen Effekte der operativen Intervention 4.2.1 Einfluss des Transfers der fäkalen „RYGB-Mikrobiota“ auf die Futterpräferenz, Energiezufuhr und das Körpergewicht im konventionellen Adipositasmodell 4.2.2 Auswirkung des Transfers der fäkalen „RYGB-Mikrobiota“ auf die Glukose- Homöostase im konventionellen Adipositasmodell 4.2.3 Beeinflussung des Lipidmetabolismus durch den Transfer der fäkalen „RYGB-Mikrobiota“ im konventionellen Adipositasmodell 4.2.4 Veränderung des Energiehaushaltes (Thermogenese) durch den Transfer der fäkalen „RYGB-Mikrobiota“ im konventionellen Adipositasmodell 4.2.5 Transfer der fäkalen „RYGB-Mikrobiota“ modifiziert die Morphologie des Darms im konventionellen Adipositasmodell 5 DISKUSSION 5.1 Kausale Rolle der postoperativ veränderten intestinalen „RYGB-Mikrobiota“ für den Therapieerfolg der Operation 5.2 Therapeutische Bedeutung der RYGB-spezifischen intestinalen Mikrobiota auf Gewicht und Stoffwechsel bei konventioneller Adipositas 5.3 Fazit und Ausblick 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 SUMMARY 8 LITERATURVERZEICHNIS / Introduction In view of the alarming increase in the global incidence of overweight and obesity and the associated comorbidities, there is a particular need for the development of new, sustainably efficient strategies for long-term weight and metabolic management, in addition to far-reaching preventive measures. As an important starting point for such noninvasive treatment alternatives, the understanding of the underlying mechanisms of action of 'bariatric metabolic surgery', with Roux-en-Y gastric bypass (RYGB) as one of the most commonly used procedures, could be used. Especially since the long-term success of RYGB surgery is not only due to the restrictive malabsorptive modifications, but also associated with numerous factors independent of weight loss, such as significant transformation of the intestinal microbial colonization. However, the extent to which this constitutes a causal link between the RYGB-modulated intestinal microbiota and the health benefits induced by the surgical intervention has so far remained unclear. Aims of the Study The aim of this investigation is to present the functional relationship between the RYGB-specific gut microbiota and the beneficial therapeutic effects of Roux-en-Y gastric bypass surgery for diet-induced obesity. Here, the role of the postoperative 'RYGB-microbiota' in achieving sustained weight loss and improved metabolic function is of particular interest. Furthermore, the microbiota-based transferability of those beneficial effects of bariatric surgery to a conventional obesity model is investigated. Results Using deliberate depletion of the intestinal microbial flora of RYGB-operated animals, our experiments in the RYGB small animal model allowed us to elucidate the fundamental importance of surgery-induced modulation of the intestinal microbiota for the postoperative improvements in the host's weight as well as metabolic, and energy control. In fact, continuous administration of antibiotics significantly attenuated the beneficial clinical effects of the Roux-en-Y gastric bypass, which can be interpreted as evidence of the essential importance of the intestinal 'RYGB-microbiota' for the full extent of the therapeutic efficacy of surgery. Based on experiments demonstrating the transferability of the effects of bariatric therapy to germ-free, metabolically unaffected experimental animals, we were also able to demonstrate that fecal microbiota transfer of the altered post-RYGB intestinal microbial colonization was sufficient to mimic the beneficial effects of surgery on the metabolic health of the recipient, even in non-operated, conventionally reared small rodents with diet-induced obesity. Conclusions Thus, the results of our conventional obesity disease model both highlight the critical role of intestinal microbiota as a key factor in the surgical success of Roux-en-Y gastric bypass and illustrate an innovative way to treat obesity and associated metabolic diseases through microbiota modulation.:INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 2 LITERATURÜBERSICHT 2.1 Adipositas in unserer Gesellschaft 2.2 Therapiemöglichkeiten von Adipositas 2.2.1 konservative Behandlungsansätze 2.2.2 bariatrische Chirurgie 2.3 Auswirkungen der Roux-en-Y Magenbypass-Operation auf das Körpergewicht, den Stoffwechsel und die intestinale Mikrobiota bei Adipositas 2.4 Rolle der intestinalen Mikrobiota bei physiologischen und pathologischen Stoffwechselprozessen im Wirtsorganismus 2.5 Behandlung von Darmerkrankungen und extraintestinalen Krankheiten durch fäkalen Mikrobiota-Transfer 2.6 Evidenz für die Übertragung des metabolischen Phänotyps durch fäkalen Mikrobiota-Transfer 2.7 Bisherige Evidenz zur Wirkung der nach RYGB-Operation modulierten intestinalen Mikrobiota auf den Wirtsstoffwechsel 2.8 Fragestellungen und Hypothesen 3 TIERE, MATERIALIEN UND METHODEN 3.1 Versuchstiere 3.2 Materialien 3.2.1 Materialien des allgemeinen Versuchsablaufs und der In-vivo-Tests 3.2.2 Materialien der Roux-en-Y Magenbypass-Operation 3.2.3 Materialien der Ex-vivo-Analysen 3.3 Methoden 3.3.1 Allgemeiner Versuchsablauf 3.3.2 Roux-en-Y Magenbypass-Operation in der Ratte 3.3.2.1 Präoperative Versorgung 3.3.2.2 OP-Ablauf 3.3.2.3 Postoperative Versorgung 3.3.3 In-vivo-Tests 3.3.3.1 Glukosetoleranztest 3.3.3.2 Insulintoleranztest 3.3.3.3 Kälteexposition und Wärmebildaufnahme 3.3.3.4 Echo MRI 3.3.4 Ex-vivo-Analysen 3.3.4.1 Gewebeentnahme und -konservierung 3.3.4.2 Histologische Gewebeaufarbeitung 3.3.4.2.1 Generierung histologischer Gewebeschnitte 3.3.4.2.2 Immunhistochemische/Histologische Färbeverfahren 3.3.4.2.3 Mikroskopische Gewebsanalyse 3.3.4.3 Absorptionsphotometrie 3.3.4.4 Statistische Auswertung 4 ERGEBNISSE 4.1 Dezimierung der intestinalen Mikrobiota post-RYGB beeinflusst die therapeutischen Effekte der operativen Intervention auf den Wirtsorganismus 4.1.1 Dezimierung der „RYGB-Mikrobiota“ verändert den Einfluss der Operation auf die Futterpräferenz, Energiezufuhr und das Körpergewicht 4.1.2 Dezimierung der „RYGB-Mikrobiota“ modifiziert die Auswirkungen der chirurgischen Intervention auf die Glukose-Homöostase 4.1.3 Dezimierung der „RYGB-Mikrobiota“ beeinflusst die Folgen des bariatrischen Eingriffs auf den Lipidmetabolismus 4.1.4 Auswirkung der Dezimierung der „RYGB-Mikrobiota“ auf die postoperativ auftretenden Veränderungen des Energiehaushaltes (Thermogenese) 4.1.5 Dezimierung der „RYGB-Mikrobiota“ verändert die Effekte der Operation auf die Morphologie des Darms 4.2 Übertragung der post-RYGB veränderten intestinalen Mikrobiota auf ein konventionelles Adipositasmodell imitiert die therapeutischen Effekte der operativen Intervention 4.2.1 Einfluss des Transfers der fäkalen „RYGB-Mikrobiota“ auf die Futterpräferenz, Energiezufuhr und das Körpergewicht im konventionellen Adipositasmodell 4.2.2 Auswirkung des Transfers der fäkalen „RYGB-Mikrobiota“ auf die Glukose- Homöostase im konventionellen Adipositasmodell 4.2.3 Beeinflussung des Lipidmetabolismus durch den Transfer der fäkalen „RYGB-Mikrobiota“ im konventionellen Adipositasmodell 4.2.4 Veränderung des Energiehaushaltes (Thermogenese) durch den Transfer der fäkalen „RYGB-Mikrobiota“ im konventionellen Adipositasmodell 4.2.5 Transfer der fäkalen „RYGB-Mikrobiota“ modifiziert die Morphologie des Darms im konventionellen Adipositasmodell 5 DISKUSSION 5.1 Kausale Rolle der postoperativ veränderten intestinalen „RYGB-Mikrobiota“ für den Therapieerfolg der Operation 5.2 Therapeutische Bedeutung der RYGB-spezifischen intestinalen Mikrobiota auf Gewicht und Stoffwechsel bei konventioneller Adipositas 5.3 Fazit und Ausblick 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 SUMMARY 8 LITERATURVERZEICHNIS

Many studies show the ability of gut microbes to modulate the anti-tumour immune response by direct triggering the immune cells or by bacterial metabolites. Interestingly bacteria may even migrate to the tumour tissue and orchestrate the immune response on site. These anti-tumour effects can be improved by the administration of immune checkpoint inhibitors (ICI). Notably, some microbial effects occur only in the presence of ICI. On the contrary, microbiota may also promote tumour growth and negatively impact the effects of ICI therapy. We have disrupted the gut microbiota homeostasis by antibiotics (ATB) to study the effects of gut microbiota on the ICI. This disturbance led surprisingly to reduced tumour growth and enhanced pro-inflammatory immune response not only in the gut but also within the tumour tissue, where especially IFN-γ orchestrated the anti-tumour immune response. Importantly the anti-tumour immune response could be transferred through colonisation of germ-free mice by ATB-changed gut microbiota if concomitantly anti- programmed cell death protein 1 (αPD-1) monoclonal antibody was administrated. These mice had elevated levels of segmented filamentous bacteria (SFB), which induced systemic immune response with increased expression of IL-17 and elevated amounts of Th 17 cells,...

Tesis por compendio / [ES] Se ha estimado que obtenemos más de las tres cuartas partes del nitrato que ingerimos de la fruta y la verdura. Los vegetales ricos en nitratos incluyen verduras de hoja verde y ciertos tubérculos (p. ej., remolachas y rábanos). Las glándulas salivales concentran activamente el nitrato plasmático, lo que da lugar a concentraciones elevadas de nitrato en la saliva (5 a 8 mM) después de una comida rica en nitratos. El nitrato es un factor ecológico que puede inducir cambios rápidos en la estructura y función de las comunidades polimicrobianas. Sin embargo, los efectos sobre la microbiota oral no se han estudiado en detalle, mientras que un número limitado de estudios previos a esta tesis indican que es probable que el nitrato sea beneficioso para la salud bucal. El objetivo de esta tesis es, por tanto, estudiar los cambios microbiológicos inducidos por nitratos e identificar posibles mecanismos de homeostasis generados por este compuesto, con el fin de determinar si el nitrato puede considerarse un prebiótico para la salud bucal. Un segundo objetivo fue aislar cepas reductoras de nitrato y probar su potencial probiótico in vitro. En el capítulo 1, se realizó un estudio in vitro para testar el efecto del nitrato 6,5 mM en comunidades orales cultivadas a partir de la saliva de 12 individuos sanos. En el capítulo 2, se obtuvieron 53 aislados de bacterias reductoras de nitrato y se probó el efecto de seis candidatos a probióticos en comunidades orales sanas cultivadas a partir de saliva de diferentes donantes con o sin nitrato 6,5 mM. En el capítulo 3, se estudió el efecto de un extracto de remolacha rico en nitrato sobre la acidificación oral después de un enjuague con azúcar en 24 individuos sin caries activas. Se tomaron sobrenadantes (capítulos 1 y 2) o muestras de saliva (capítulo 3) para mediciones de nitrato, nitrito, amonio, lactato y pH. Además, la composición bacteriana de la biopelícula in vitro y del pellet salivar se determinó usando secuenciación Illumina del rRNA 16S y/o qPCR del género nitratorreductor Rothia. Los datos demuestran que el nitrato estimula el crecimiento de los géneros beneficiosos Rothia y Neisseria en nuestro modelo in vitro, mientras que potencialmente disminuye las bacterias asociadas a la caries, la halitosis y la enfermedad periodontal. Además, los datos in vitro e in vivo presentados en esta tesis indican que el nitrato puede limitar o prevenir caídas de pH cuando los azúcares son fermentados por la microbiota oral, un mecanismo de resiliencia que podría ser estimulado por el consumo de extractos vegetales ricos en nitratos. Los principales mecanismos de amortiguación del pH por parte del nitrato son el uso de acido láctico durante la desnitrificación (observado tanto in vivo como in vitro) y durante la reducción de nitrito a amonio, así como la producción potencial de amoníaco (observado in vitro). En esta tesis, los efectos del nitrato se observaron después de períodos cortos, es decir, después de 5-9 h de incubación in vitro y 1-4 horas después de la ingesta del suplemento de nitrato in vivo. Los estudios futuros deberían centrarse en los efectos longitudinales de la ingesta diaria de nitratos. En el capítulo 2, se aislaron bacterias reductoras de nitrato pertenecientes a los géneros Rothia y Actinomyces. Una selección de aislados de Rothia aumentó el uso de lactato y la capacidad de reducción de nitratos de las comunidades bucales, lo que potencialmente beneficiaría la salud dental y la salud sistémica, respectivamente. Los datos in vitro e in vivo presentados en esta tesis sugieren que el nitrato puede modular la microbiota oral en aspectos que son beneficiosas para el huésped y, por lo tanto, podría considerarse una sustancia prebiótica para la microbiota oral. Además, los aislados reductores de nitratos pueden estimular los efectos beneficiosos del metabolismo del nitrato, sobre todo en personas con bajos niveles de estas bacterias. / [CA] S'ha estimat que obtenim més de les tres quartes parts del nitrat que ingerim de la fruita i la verdura. Els vegetals rics en nitrats inclouen verdures de fulla verda i uns certs tubercles (p. ex., remolatxes i raves). Les glàndules salivals concentren activament el nitrat plasmàtic, la qual cosa dona lloc a concentracions elevades de nitrat a la saliva (5 a 8 mm) després d'un menjar ric en nitrats. El nitrat és un factor ecològic que pot induir canvis ràpids en l'estructura i funció de les comunitats polimicrobianes. No obstant això, els efectes sobre la microbiota oral no s'han estudiat detalladament, mentre que un nombre limitat d'estudis previs a aquesta tesi indiquen que és probable que el nitrat siga beneficiós per a la salut bucal. L'objectiu d'aquesta tesi és, per tant, estudiar els canvis microbiològics induïts per nitrats i identificar possibles mecanismes d'homeòstasi generats per aquest compost, amb la finalitat de determinar si el nitrat pot considerar-se un prebiòtic per a la salut bucal. Un segon objectiu va ser aïllar soques reductores de nitrat i provar el seu potencial probiòtic in vitro. En el capítol 1, es va realitzar un estudi in vitro per a testar l'efecte del nitrat 6,5 mm en comunitats orals cultivades a partir de la saliva de 12 individus sans. En el capítol 2, es van obtindre 53 aïllats de bacteris reductors de nitrat i es va provar l'efecte de sis candidats a probiòtics en comunitats orals sanes cultivades a partir de saliva de diferents donants amb o sense nitrat 6,5 mm. En el capítol 3, es va estudiar l'efecte d'un extracte de remolatxa ric en nitrat sobre l'acidificació oral després d'un glopeig amb sucre en 24 individus sense càries actives. Es van prendre sobrenadants (capítols 1 i 2) o mostres de saliva (capítol 3) per a mesuraments de nitrat, nitrit, amoni, lactat i pH. A més, la composició bacteriana de la biopel·lícula in vitro i del pèl·let salivar es va determinar usant seqüenciació Illumina del RNAr 16S i/o qPCR del gènere nitratorreductor Rothia. Les dades demostren que el nitrat estimula el creixement dels gèneres beneficiosos Rothia i Neisseria en el nostre model in vitro, mentre que potencialment disminueix els bacteris associats a la càries, l'halitosi i la malaltia periodontal. A més a més, les dades in vitro i in vivo presentades en aquesta tesi indiquen que el nitrat pot limitar o previndre caigudes de pH quan els sucres són fermentats per la microbiota oral, un mecanisme de resiliència que podria ser estimulat pel consum d'extractes vegetals rics en nitrats. Els principals mecanismes d'amortiment del pH per part del nitrat són l'ús de àcid làctic durant la desnitrificació (observat tant in vivo com in vitro) i durant la reducció de nitrit a amoni, així com la producció potencial d'amoníac (observat in vitro). En aquesta tesi, els efectes del nitrat es van observar després de períodes curts, és a dir, després de 5-9 h d'incubació in vitro i 1-4 hores després de la ingesta del suplement de nitrat in vivo. Els estudis futurs haurien de centrar-se en els efectes longitudinals de la ingesta diària de nitrats. En aquesta tesi es van aïllar bacteris reductors de nitrat pertanyents als gèneres Rothia i Actinomyces. Una selecció d'aïllats de Rothia va augmentar l'ús de lactat i la capacitat de reducció de nitrats de les comunitats bucals, la qual cosa potencialment beneficiaria la salut dental i la salut sistèmica, respectivament. Les dades in vitro i in vivo presentats en aquesta tesi suggereixen que el nitrat pot modular la microbiota oral en aspectes que són beneficiosos per a l'hoste i, per tant, podria considerar-se una substància prebiòtica per a la microbiota oral. A més, els aïllats reductors de nitrats poden estimular els efectes beneficiosos del metabolisme del nitrat, sobretot en persones amb baixos nivells d'aquests bacteris. El nitrat i els bacteris reductors de nitrat són, per tant, components prometedors per a futurs productes de salut oral. / [EN] It has been estimated that we obtain over three quarters of dietary nitrate from vegetables and fruits. Nitrate-rich vegetable types include leafy greens and certain root vegetables (e.g., beetroots and radishes). The salivary glands actively concentrate plasma nitrate, leading to high salivary nitrate concentrations (5-8 mM) after a nitrate-rich meal. Nitrate is an ecological factor that can induce rapid changes in structure and function of polymicrobial communities. However, the effects on the oral microbiota have not been clarified, whilst a limited number of previous studies did indicate that nitrate is likely to be beneficial for oral health. The aim of this thesis was therefore to study nitrate-induced microbiome changes and identify potential mechanisms for nitrate-induced homeostasis, in order to determine if nitrate can be considered a prebiotic compound for oral health. A second aim was to isolate nitrate-reducing isolates and test their probiotic potential in vitro. In chapter 1, an in vitro study was set up testing the effect of 6.5 mM nitrate on oral communities grown from saliva of 12 healthy individuals. In chapter 2, fifty-three nitrate-reducing isolates were obtained and the effect of six probiotic candidates was tested on healthy oral communities grown from saliva of different donors with or without 6.5 mM nitrate. In chapter 3, the effects of nitrate-rich beetroot extracts on oral acidification after sugar rinsing was tested in 24 individuals without active caries. Supernatants (chapters 1 and 2) or saliva samples (chapter 3) were taken for nitrate, nitrite, ammonium, lactate and pH measurements. Additionally, the bacterial composition of in vitro biofilms and salivary pellets were determined using 16S rRNA gene Illumina sequencing and/or qPCR of the nitrate-reducing genus Rothia. We showed that nitrate stimulates the growth of the beneficial genera Rothia and Neisseria in our in vitro model, while potentially decreasing caries-, halitosis- and periodontal disease-associated bacteria. Additionally, the in vitro and in vivo data presented in this thesis indicate that nitrate can limit or prevent pH drops when sugars are fermented by the oral microbiota - a mechanism of resilience that could be stimulated by the consumption of nitrate-rich vegetable extracts. The main pH buffering mechanisms of nitrate were lactic acid usage during denitrification (observed both in vivo and in vitro) and during the reduction of nitrite to ammonium, as well as the potential production of ammonia (observed in vitro). In this thesis, the effects of nitrate were observed after short periods, i.e., after 5-9 h incubation in vitro and/or after 1-4 hours after nitrate supplement intake in vivo. Future studies should focus on the longitudinal effects of daily nitrate intake. In chapter 2, nitrate-reducing species belonging to the genera Rothia and Actinomyces were isolated. A selection of Rothia isolates increased lactate usage and nitrate reduction capacities of oral communities, potentially benefitting dental health and systemic health, respectively. The in vitro and in vivo data presented in the current thesis suggest that nitrate can modulate the oral microbiota in ways that are beneficial for the host and could thus be considered a prebiotic substance for the oral microbiota. Additionally, nitrate-reducing isolates can stimulate certain beneficial effects of nitrate metabolism. Nitrate and nitrate-reducing bacteria are thus promising components for future oral care products to prevent or treat oral diseases and this should be further investigated. / Rosier, BT. (2022). Nitrate as a Prebiotic and Nitrate-Reducing Bacteria as Probiotics for Oral Health [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/181578 / Compendio