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L’intestin est un organe majeur de l’organisme de par ses fonctions et sa localisation, établissant une barrière active avec un environnement complexe composé du microbiote intestinal, des aliments digérés et d’éléments sécrétés par l’hôte. Outre ses fonctions digestives, absorptives et immuno-modulatrices, l’intestin est également un important organe endocrinien, sécrétant une vingtaine d’hormones régulant des fonctions physiologiques telles que la prise alimentaire, le métabolisme énergétique ou la digestion et le transit intestinal. Ces hormones sont produites par une famille de cellules épithéliales, les cellules entéroendocrines, et sécrétées en réponse à l’activation de récepteurs reconnaissant des éléments du contenu intestinal. En particulier, les cellules entéroendocrines de type L sécrètent GLP-1 et Peptide YY (PYY), impliqués respectivement dans le contrôle de la sécrétion d’insuline et dans la régulation de la prise alimentaire ainsi que le contôle du transit intestinal. Elles sont majoritairement localisées dans l’iléon et le côlon, là où le microbiote intestinal est le plus dense. Le microbiote intestinal permet notamment la fermentation des fibres en acides gras à chaîne courte (AGCC), la production de vitamines, la maturation du système immunitaire de l’hôte et joue lui-même un rôle de barrière contre les pathogènes. Un dialogue entre le microbiote intestinal et l’hôte est nécessaire dans le maintien de l’homéostasie intestinale, nécessitant la reconnaissance par l’hôte de produits bactériens. En particulier, les récepteurs Toll-Like (TLR) permettent la reconnaissance de motifs moléculaires microbiens conservés et sont impliqués dans l’immunité innée de l’hôte. Certains produits bactériens ont également un rôle physiologique tels que les AGCC qui sont une source d’énergie importante pour les colonocytes, en plus d’activer des voies de signalisation. Il a été montré que des régimes riches en fibres, et donc permettant une production accrue d’AGCC, ou plus directement l’administration d’AGCC dans le colon, induit chez l’Homme ou la souris une augmentation des concentrations plasmatiques de PYY, par des mécanismes encore peu compris. En utilisant des lignées cellulaires humaines modèles de cellules entéroendocrines, nous avons caractérisé les effets des AGCC et des motifs bactériens reconnus par les TLR sur l’expression et la sécrétion de PYY et les réponses calciques dans ces cellules. Nous avons pu démontrer que les TLR sont exprimés de manière fonctionnelle, à l’exception de TLR4 et TLR8 dans ces cellules, et que le butyrate augmente leur expression et leur activité. De plus, la stimulation des TLR augmente l’expression de Pyy d’un rapport de 2, mais a peu d’effet sur la sécrétion dans ces cellules. Les AGCC ont des effets divers sur l’expression et la sécrétion de PYY. Alors que le butyrate et le propionate augmentent très fortement l’expression de Pyy, par des rapports respectivement de 120 et 40, par un mécanisme d’inhibition des déacétylases d’histone et de lysine, l’acétate augmente l’expression de Pyy plus modestement par l’activation des récepteurs aux AGCC FFAR2 et FFAR3. L’activation de FFAR2 par les AGCC induit une forte réponse calcique oscillatoire induisant la sécrétion de PYY alors que l’activation de FFAR3 et de GPR109a par le butyrate diminue la concentration calcique cellulaire et réduit les réponses sécrétoires. Ainsi, les AGCC augmentent la production de PYY et régulent sa sécrétion, mais avec et par des effets différents. Ces travaux ont permis de montrer le rôle des cellules entéroendocrines humaines de type L dans la reconnaissance de produits bactériens par l’expression de TLR et par leurs réponses aux AGCCs modulant l’expression et de la sécrétion de PYY. De plus, ces résultats ont déterminés en partie les mécanismes impliqués dans la réponse bénéfique de l’hôte à la consommation de fibres et l’augmentation de la production d’AGCC. / The human gut exerts major functions, mainly due to its localization and by forming an active barrier between a complex environment made of the gut microbiota, digested food products and secreted elements by the host. The main functions of the gut are digestion and absorption of nutrients and it is the first pool of immune cells and a barrier against pathogens, but the gut is also a main endocrine organ secreting more than twenty different hormones. These hormones regulate a wide range physiological functions including food intake, energy metabolism or digestion. Enteroendocrine cells, a sparse family of intestinal epithelial cells, produce and secrete these hormones in response to the activation of a variety of receptors that sense luminal content. Among them, L-cells secrete GLP-1 and Peptide YY (PYY) that are implicated in the regulation of insulin secretion, food intake and intestinal motility. They are mainly found in the distal ileum and in the colon where the microbiota is the densest. Gut microbiota ferments fibers into short chain fatty acids (SCFAs), produces vitamins, participates in regulation of host immune system and is a barrier against pathogens. The cross talk between microbiota and intestinal epithelium is important to maintain the local homeostasis, and is mediated by host receptors recognizing microbial products. Among them, Toll-like receptors (TLRs) recognize conserved microbial associate molecular patterns (MAMPs) and participate to the host innate immunity. Some microbial products also have important functions for the host such has SCFAs that are an important energy substrate for colonocytes and can also activate different signaling pathways. It was shown that fiber-rich diets, increasing production of SCFAs, as well as direct administration of SCFAs in the colon in humans or mice increased PYY plasma levels through mechanisms still undeciphered. Taking advantage of human cell lines as L-cell models, we assessed the different effects of SCFAs and TLR stimulation on PYY expression and secretion and calcium signaling in these cells. We showed that TLRs are functionally expressed in these cells at the exception of TLR4 and TLR8, and that butyrate, one of the three main SCFAs produced by the microbiota increases cell sensitivity to TLR stimulation by increasing their expression. Moreover, TLR stimulation increases Pyy expression by a fold of two but has little effect on secretion. SCFAs differently regulate Pyy expression. Propionate and butyrate highly increase Pyy expression by a fold of 40 and 120 respectively, and their effects are mainly mediated by inhibition of lysine/histone deacetylases whereas acetate increases expression of Pyy by a fold of 1.8 through stimulation of FFAR2 and FFAR3. SCFAs also induce a strong FFAR2-dependent oscillatory response monitoring PYY secretion whereas butyrate via FFAR3 and GPR109a decreases cytosolic calcium concentration and consequently reduces secretory responses. Thus, SCFAs differently increase PYY production and secretion depending of their chain length. Altogether, these results highlight the role human L-cells in microbiota-host crosstalk by sensing microbial products through expression of TLRs and their responses to SCFAs modulating PYY production and secretion. Furthermore, we deciphered some of the mechanisms implicated in beneficial host response to enriched fiber diets and increased production of SCFAs.

La dépression représente l’affection neuropsychiatrique la plus répandue dans le monde. Son impact socio-économique est important et la prise en charge des patients est souvent confrontée aux limites d’efficacité des traitements actuels. Les mécanismes sous-jacents responsables de cette affection sont en partie inconnus. Néanmoins, un nombre grandissant de données désignent aujourd’hui le microbiote intestinal comme un acteur potentiel de la physiopathologie de la dépression. En particulier, des déséquilibres dans la nature et la quantité des métabolites bactériens qu’il produit pourraient être impliqués. L’indole est un métabolite du tryptophane produit par le microbiote intestinal. Il joue un rôle (i) dans la physiologie bactérienne et les relations bactérie-bactérie au sein du microbiote, (ii) dans le fonctionnement des cellules intestinales, et (iii) certains de ses dérivés sont connus pour être neuro-actifs. L’objectif de la thèse est de mieux comprendre comment un excès de production de ce métabolite bactérien peut influencer le cerveau et le comportement dans le contexte de la dépression et de troubles mentaux qui lui sont souvent associés, les troubles anxieux. Mon travail de thèse comporte 3 parties.La première a pour but de tester si une dysbiose du microbiote intestinal induisant une surproduction d’indole est un facteur de vulnérabilité aux troubles anxieux et dépressifs, et d’étudier les modifications biochimiques et moléculaires associées. Une étude comportementale chez des souris gnotoxéniques produisant de l’indole en excès ou n’en produisant pas montre qu’une surproduction intestinale d’indole exacerbe les comportements de type anxieux et dépressif induits par l’exposition à un stress chronique modéré. L’étude de l’expression de gènes des glandes surrénales impliqués dans la synthèse de la corticostérone et de l’adrénaline montre que les souris surproductrices d’indole et soumises au stress chronique surexpriment un gène impliqué dans la synthèse de l’adrénaline. Des dosages de neurotransmetteurs cérébraux et des analyses d’expression de gènes dans le cerveau et la muqueuse intestinale ont aussi été conduits. La seconde partie de la thèse porte sur l’identification des circuits neuronaux cérébraux activés par l’indole. Pour ce faire, des souris conventionelles ont été gavées avec de l’indole et la protéine c-Fos marquée par immunohistochimie dans toutes les régions du cerveau, du tronc cérébral au cortex préfrontal. La troisième partie de la thèse consiste à moduler la disponibilité du tryptophane alimentaire dans le tube digestif de souris conventionnelles, et à en étudier l’impact sur la composition bactérienne du microbiote intestinal et sa capacité à produire de l’indole. La composition du microbiote fécal des souris a été déterminée par séquençage de l’ADN codant l’ARNr 16S et les concentrations fécales de tryptophane et d’indole ont été déterminées par analyse HPLC.En conclusion, ce projet de thèse aura contribué à une meilleure compréhension du rôle de l’indole dans les réponses comportementales et neuro-endocrines au stress. Il aura également permis d’initier l’étude des circuits neuronaux activés par l’indole, et de tester comment la modulation de la digestibilité de protéines riches en tryptophane peut influencer l’équilibre du microbiote intestinal et ses capacités à produire de l’indole. / Depression is the most spread neuropsychiatric disorder worldwide. It is a socio-economical burden and efficacy of the treatments is very limited. Mechanisms underlying this disorder are mainly unknown. However, a growing number of data has highlighted the potential role of gut microbiota dysbioses in the pathophysiology of depression. Particularly, an unbalance in the diversity and abundance of metabolites produced by the gut microbiota might be implicated. Indole is a tryptophan derivative produced by the gut microbiota. It is known to influence (i) the bacterial physiology and quorum sensing within the gut microbial ecosystem, (ii) the intestinal cells functioning, and (iii) some of its derivatives are known to affect the brain. The aim of this work is to investigate how an overproduction of indole by the gut microbiota can modulate the brain and behaviour in the context of depression and its main co-morbidity, anxiety. This thesis work contains 3 sections.In the first one, we investigated whether an intestinal microbiota dysbiosis leading to an overproduction of indole could confer vulnerability toward anxiety and depression. We also looked for potentially associated biochemical and molecular changes. A behavioural study in gnotobiotic mice overproducing or non producing indole showed the overproduction of indole exacerbated the anxiety-like and depressive-like behaviours induced by a chronic mild stress. Gene expression analysis in the adrenal glands showed chronically stressed mice overproducing indole up-regulated the expression of one gene implicated in adrenaline synthesis. Brain neurotransmitters quantification and gene expression in the brain and intestinal mucosa were also carried out. The second part of the thesis work focused on the brain neurocircuitry of indole. Conventional mice were force-fed with indole and the c-Fos protein was labelled by immunohistochemistry in all brain areas from brainstem to prefrontal cortex. In the third and last part, we modulated dietary tryptophan availability in the gastro-intestinal tract of mice, to study how this modulation could affect the composition and the indole production ability of the gut microbiota. The mice fecal microbiota composition was determined by 16S rRNA sequencing, and fecal tryptophan and indole concentrations were measured by HPLC.In summary, this work improves the understanding of the role of indole in the behavioural and neuro-endocrine responses to stress. This study also initiated the deciphering of brain circuits activated by indole. Finally, it brings some evidence about how modulating food digestibility can impact the gut microbiota composition and its indole production capacity.

Les pertes alimentaires mondiales se chiffrent à environ un tiers des aliments destinés à la consommation humaine, soit environ 1,3 milliards de tonnes par an (FAO). Une large fraction de ces pertes est due aux altérations microbiologiques des denrées alimentaires. L’utilisation de produits phytosanitaires reste aujourd’hui la solution la plus largement utilisée en agriculture pour limiter ces pertes. Cependant, avec le plan EcoPhyto 2, le gouvernement français a pour objectif de réduire de 50% l’usage des pesticides chimiques d’ici 2025, en particulier en promouvant l’émergence du biocontrôle. Pour développer cette approche, il est cependant nécessaire de comprendre, pour mieux les maitriser, les mécanismes sous-jacents. Les différents modes d’action de biocontrôle par les microorganismes décrits sont la stimulation des défenses naturelles des plantes, la production de substances antimicrobienne et la compétition nutritionnelle. L'originalité de ce projet est d'intégrer le mode de vie en biofilm dans les mécanismes de bioprotection (compétition spatiale et nutritionnelle, libération de principes antimicrobiens). Dans la filière Française des champignons de couche (Agaricus bisporus), l’agent de biocontrôle utilisé depuis 2008 par plus de 80 % de la filière, est Bacillus subtilis QST713. Ce biofongicide montre une nette efficacité contre Trichoderma aggressivum, la principale moisissure à l’origine de pertes économiques lors de la culture d’A. bisporus. Afin d’accompagner la filière dans cette voie biologique, nous avons entrepris de séquencer et étudier le génome de cette souche, afin de déterminer son potentiel de biocontrôle et sa capacité à former des biofilms. Nous avons également évalué l’impact de ce biofongicide sur la dynamique des communautés microbiennes du compost de culture d’A. bisporus exposé ou non à T. aggressivum. Enfin, l'étude de la reprogrammation cellulaire de cet agent de biocontrôle lors de sa culture en micromodèles axéniques, nous a permis une meilleure compréhension des phénomènes de colonisation des substrats et d'inhibition des flores indésirables. Ce projet a permis d’enrichir les connaissances vis-à-vis des mécanismes de biocontrôle dans la filière des champignons et pourra permettre une possible application à d’autres filières agricoles. / Worldwide, food losses amount for about one-third of food for human consumption, 1.3 billion tons per year (FAO). A large fraction of these losses are due to microbiological alterations. The use of phytosanitary products remains today the most widely used solution in agriculture to limit these losses. However, with the EcoPhyto 2 plan, the French government aims to reduce the use of chemical pesticides by 50% by 2025, in particular by promoting the emergence of biocontrol. To develop this approach, it is necessary to understand the underlying mechanisms. The different modes of action of biocontrol by the microorganisms described are the stimulation of the natural defenses of the plants, the production of antimicrobial substances and the nutritional competition. The originality of this project is to integrate the biofilm mode of life into bioprotection mechanisms (spatial and nutritional competition, release of antimicrobial principles). In the French sector of the button mushrooms (Agaricus bisporus) culture, the biocontrol agent used since 2008 by more than 80% of the sector, is Bacillus subtilis QST713. This biofungicide shows a clear efficacy against Trichoderma aggressivum, the main mold causing economic losses during the cultivation of A. bisporus. To accompany the sector in this biological pathway, we have sequenced and studied the genome of this strain, in order to determine its biocontrol potential and its ability to form biofilms. We also evaluated the impact of this biofungicide on the dynamics of microbial communities in A. bisporus culture compost exposed or not to T. aggressivum. Finally, the study of the cellular reprogramming of this biocontrol agent during the culture in axenic micromodels allowed us a better understanding of the substrates colonization phenomenon and the inhibition of undesirable flora. This project will enrich the knowledge of the biocontrol mechanisms used in the mushroom industry and may allow a possible application to other agricultural sectors.

L’avènement du séquençage métagénomique aléatoire a révolutionné la microbiologie en permettant la caractérisation sans culture préalable de communautés microbiennes complexes telles que le microbiote intestinal humain. Des outils bioinformatiques récemment développés atteignent une résolution au niveau de la souche en recensant des gènes accessoires ou en capturant des variants nucléotidiques (SNPs). Toutefois, ces outils sont limités par l’étendue des génomes de référence disponibles qui sont loin de couvrir toute la variabilité microbienne. En effet, de nombreuses espèces n’ont pas encore été séquencées ou sont représentées par seulement quelques génomes.La création de catalogues de gènes non redondants par assemblage de novo suivie du regroupement des gènes co-abondants révèlent une partie de la matière noire microbienne en reconstituant le répertoire de gènes d’espèces potentiellement inconnues. Bien que les méthodes existantes identifient avec précision les gènes core présents dans toutes les souches d’une espèce, elles omettent de nombreux gènes accessoires ou les divisent en petits groupes de gènes qui ne sont pas associés aux core génomes. Or, capturer ces gènes accessoires est indispensable en recherche clinique et épidémiologique car ces derniers assurent des fonctions spécifiques à certaines souches telles que la pathogénicité ou la résistance aux antibiotiques.Lors de cette thèse, nous avons développé MSPminer, un logiciel performant qui reconstitue et structure des pan-génomes d’espèces métagénomiques (ou MSPs pour Metagenomic Species Pan-genomes) en regroupant les gènes co-abondants dans un ensemble d’échantillons métagénomiques. MSPminer s’appuie sur une nouvelle mesure robuste de la proportionnalité couplée à un classificateur empirique pour regrouper et distinguer les gènes core mais aussi les gènes accessoires des espèces microbiennes.Grâce à MSPminer, nous avons structuré un catalogue de 9,9 millions de gènes du microbiote intestinal humain en 1 661 MSPs. L’homogénéité de l’annotation taxonomique, de la composition nucléotidique ainsi que la présence de gènes essentiels indiquent que les MSPs ne correspondent pas à des chimères mais à des objets biologiquement cohérents regroupant des gènes provenant de la même espèce. Parmi ces MSPs, 1 301 (78%) n’ont pas pu être annotées au niveau espèce montrant que de nombreux microorganismes colonisant l’intestin humain demeurent inconnus malgré les progrès substantiels des techniques de culture microbienne. Remarquablement, les MSPs capturent bien plus de gènes que les clusters générés par les outils existants tout en garantissant une spécificité élevée.Cet ensemble de MSPs peut d’ores et déjà être utilisé pour le profilage taxonomique et la découverte de biomarqueurs dans des échantillons de selles humaines. Ainsi, nous tirons parti des MSPs pour comparer l’impact sur le microbiote intestinal des deux principaux types de chirurgie bariatrique, la gastrectomie par laparoscopie (LSG) et la dérivation gastrique de Roux-en-Y (LRYGB). Enfin, les MSPs ouvrent la voie à des analyses au niveau souche. Dans une autre cohorte, nous avons mis en évidence l’existence de sous-espèces associées à l’origine géographique de l’hôte en étudiant les profils de présence/absence des gènes accessoires groupés dans les MSPs. / The advent of shotgun metagenomic sequencing has revolutionized microbiology by allowing culture-independent characterization of complex microbial communities such as the human gut microbiota. Recently developed bioinformatics tools achieved strain-level resolution by making a census of accessory genes or by capturing nucleotide variants (SNPs). Yet, these tools are hampered by the extent of available reference genomes which are far from covering all the microbial variability. Indeed, many species are still not sequenced or are represented by only few genomes.Building of non-redundant gene catalogs followed by the binning of co-abundant genes reveals a part of the microbial dark matter by reconstituting the gene repertoire of species potentially unknown. While existing methods accurately identify core genes present in all the strains of a species, they miss many accessory genes or split them into small gene groups that remain unassociated to core genomes. However, capturing these accessory genes is essential in clinical research and epidemiology because they provide functions specific to certain strains such as pathogenicity or antibiotic resistance.In this thesis, we developed MSPminer, a computationally efficient software tool that reconstitutes Metagenomic Species Pan-genomes (MSPs) by binning co-abundant genes across metagenomic samples. MSPminer relies on a new robust measure of proportionality coupled with an empirical classifier to group and distinguish not only species core genes but accessory genes also.With MSPminer, we structured a catalog made up of 9.9 million genes of the human gut microbiota in 1 661 MSPs. The homogeneity of the taxonomic annotation, of the nucleotide composition as well as the presence of essential genes indicate that the MSPs do not correspond to chimeras but to biologically consistent objects grouping genes from the same species. Among these MSPs, 1 301 (78%) could not be annotated at species level showing that many microorganisms colonizing the human intestinal tract are still unknown despite the substantial improvements of microbial culture techniques. Remarkably, MSPs capture more genes than clusters generated by existing tools while ensuring high specificity.This set of MSPs can be readily used for taxonomic profiling and biomarkers discovery in human gut metagenomic samples. In this way, we take advantage of the MSPs to compare the impact of two main types of surgeries, the laparoscopic sleeve gastrectomy (LSG) and the Roux-En-Y gastric bypass (LRYGB). Finally, the MSPs open the way to strain-level analyses. In another cohort, we identified subspecies associated the host geographical origin by studying presence/absence patterns of the accessory genes grouped in the MSPs.

Plusieurs recherches ont été conduites pour déterminer les phases du cycle œstrus chez les vaches. Toutefois, peu est connue de leur microbiote vaginal. Cette étude a pour but de déterminer la composition du microbiote vaginal de vaches laitières durant les quatre phases du cycle œstrus, pour détecter son impact sur la fertilité de ces vaches. Cette information nous permettra d’un jour manipuler le microbiote vaginal d’autres vaches afin d’améliorer leur taux de fécondité. Vint-et- une vaches Holstein multipares de la même ferme ont subi l’insémination artificielle (IA) suite à la détection du début des chaleurs. Quatre frottis vaginaux ont été faits aux jours 1,3,15 et 19 du cycle. Au jour 31, une échographie a confirmé que neuf vaches étaient enceintes. Les données ont ensuite été analysées avec avec le séquençage rRNA 16S de la région hypervariable V4. Les résultats ont montré une prédominance nette de certains embranchements bactériens. Les firmicutes, bacteroidetes et protéobacteéries composait plus de 80% de la population microbiotique vaginale avec certaines fluctuations importantes. Une analyse statistique a déterminé qu’il y a eu des changements significatifs entre l’œstrus et le proestrus chez les vaches qui ne sont pas devenues enceintes de (P=0.028), et entre l’œstrus et le dioestrus chez les vaches enceintes de (P=0.043). Cette recherche est un premier pas important dans l’identification du microbiote vaginal et son impact possible sur la santé vaginale et la fertilité de vaches laitières. Cette recherche pourrait contribuer aux études futures tentant d’améliorer la fécondité bovine avec la manipulation du microbiote vaginal. / A great deal of research has been done on the four phases of the estrous cycle in cows, yet very few studies exist regarding their vaginal microbiota. This study explored the various differences in the vaginal microbiota in pregnant and non-pregnant multiparous Holstein dairy cows. This information will allow us to see what a healthy vaginal microbiota looks like in pregnant cows and to someday try to achieve similar microbiomes in other cows to aid in fertility issues on farms. The objective of this study is to investigate variations in microbiota populations during the estrous cycle and their possible association with pregnancy rates using next generation sequencing of the V4 hypervariable region of the 16S rRNA gene. Twenty-one multiparous Holstein cows on the same farm underwent artificial insemination (AI) after estrous detection. Vaginal swabs were collected four times, on days: 1 (before AI), 3, 15, and 19. Ultrasonography performed at day 31 confirmed that 9 cows became pregnant. A clear predominance of certain phyla was found, with Firmicutes, Bacteroidetes and Proteobacteria making up over 80% of the vaginal microbiota composition throughout, with notable variations between individuals. Differences in beta-diversity (community composition) that were proven statistically significant were between the estrus- proestrus phases in non-pregnant cows (P=0.028) and between the estrus and diestrus phase in pregnant cows at (P=0.043). These findings are a clear first step in identifying possible beneficial vaginal microbiota in pregnant cows that may help to determine how to proceed in manipulating other cows’ vaginal microbiota that have suffered from reproductive failure in the past.

Le rôle crucial du tractus gastrointestinal dans la pathogenèse et la pathophysiologie des troubles cardiométaboliques (TCM) et du syndrome métabolique (SM) est actuellement bien établi. Plusieurs facteurs, incluant le stress oxydatif (SOx), l'inflammation et la résistance à l'insuline (RI), perturbent l'homéostasie intestinale et causent des TCM. Les polyphénols (PP) ont des effets biologiques bénéfiques dans la prévention de pathologies métaboliques. Cependant, leurs mécanismes d'actions, surtout au niveau de l'axe intestin-foie, ne sont pas bien compris. Par ailleurs, malgré les nombreuses études sur les effets biologiques et la biodisponibilité des PP, il existe encore des zones d’ombres concernant les interactions entre le microbiote intestinal et les PP et les conséquences subséquentes sur la santé intestinale et métabolique. Dans ce travail de recherche, nous favorisons l’axiome selon lequel les PP, notamment ceux de grande taille moléculaire tels que les proanthocyanidines (PACs), pourraient être utile pour combattre les maladies métaboliques grâce à leurs actions antioxydante et anti-inflammatoire. Toutefois, ces actions précitées des PACs dépendraient d’une régulation en amont du microbiote intestinal. L’objectif central consiste à démontrer les effets bénéfiques des PACs dans la prévention des dérèglements métaboliques dans deux modèles distincts, l’un cellulaire et l’autre animal et d’en étudier les mécanismes. Les effets des PACs sur la RI, les dérangements métaboliques intestinaux grâce à la production de métabolites ont été étudiés. Dans une première étape, nous avons étudié les mécanismes d’actions des PACs et de l’un de leurs métabolites majeurs, le 4,5-dihydroxyphenyl valerolactone (DHPVL), dans la prévention des maladies métaboliques et dans le maintien de l’homéostasie intestinale en utilisant la lignée cellulaire intestinale Caco-2/15. Ces cellules constituent un outil de choix pour l’investigation du SOx, la défense antioxydante et l’inflammation en relation directe avec nos objectifs. Les résultats suggèrent que la capacité des PACs à augmenter la défense antioxydante et anti-inflammatoire et à améliorer l’homéostasie intestinale passeraient en partie probablement par leurs métabolites microbiens. Dans une deuxième étape, en utilisant le modèle murin C57BL6, nous avons déterminé l’impact des PACs sur l’homéostasie métabolique intestinale et hépatique, via l’atténuation du SOx et l’inflammation, le maintien de l’intégrité de la barrière intestinale, la prévention de l’endotoxémie métabolique et les modifications du profil lipidique et de la fonction du microbiote intestinal. Cette partie a évalué les aspects préventifs et thérapeutiques des PACs en spécifiant leurs bénéfices biologiques et voies mécanistiques dans des organes métaboliques clés. Pour étudier ces mécanismes et les comprendre, nous avons utilisé le modèle dysmétabolique de souris C57BL6 soumises à une diète riche en lipides et en sucrose (HFHS), servant à développer le SM et les complications cardio-métaboliques afin d’examiner l’action des PACs. Le développement de l’obésité, de la RI ainsi que la survenue d’autres altérations métaboliques ont été prévenus par l’administration de PACs. Les résultats de cette thèse permettent une meilleure compréhension des mécanismes d’actions qui sous-tendent les effets préventifs et thérapeutiques des PACs dans les désordres métaboliques, en particulier dans l’axe intestin-foie. / The crucial role of the gastrointestinal tract in the pathogenesis and pathophysiology of cardiometabolic disorders (CMD) and metabolic syndrome (MetS) is currently recognized. Several factors, including oxidative stress (OxS), inflammation and insulin resistance (IR), disrupt intestinal homeostasis and cause CMD. Polyphenols (PP) have beneficial biological effects in the prevention of metabolic pathologies. However, their mechanisms of action, especially in the gut-liver axis, are not well understood. Moreover, despite numerous studies on the biological effects and bioavailability of PP, there are still grey areas concerning the interactions between the intestinal microbiota and PP and the subsequent consequences for intestinal and metabolic health. In this research work, we promote the axiom that PP, particularly those of large molecular size such as proanthocyanidins (PACs), could be useful in combating metabolic diseases thanks to their antioxidant and anti-inflammatory actions. However, the aforementioned actions of PACs would depend on upstream regulation of the intestinal microbiota. The central objective is to demonstrate the beneficial effects of PACs in preventing metabolic disorders in two distinct models, one cellular and the other animal, and to study the mechanisms involved. The effects of PACs on IR and intestinal metabolic disturbances through metabolite production were studied. In a first step, we investigated the mechanisms of action of PACs and one of their major metabolites, 4,5-dihydroxyphenyl valerolactone (DHPVL), in the prevention of metabolic diseases and in the maintenance of intestinal homeostasis using the Caco-2/15 intestinal cell line. These cells are a tool of choice for investigating OxS, antioxidant defense and inflammation in direct relation to our objectives. The results suggest that the ability of PACs to enhance antioxidant and anti-inflammatory defense and improve intestinal homeostasis is probably partly mediated by their microbial metabolites. In a second step, using the C57BL6 mouse model, we determined the impact of PACs on intestinal and hepatic metabolic homeostasis, via attenuation of OxS and inflammation, maintenance of intestinal barrier integrity, prevention of metabolic endotoxemia and changes in lipid profile and gut microbiota function. This section assessed the preventive and therapeutic aspects of PACs, specifying their biological benefits and mechanistic pathways in key metabolic organs. To investigate and understand these mechanisms, we used the dysmetabolic model of C57BL6 mice subjected to a high-fat, high-sucrose diet (HFHS), used to develop MetS and cardio-metabolic complications to examine the action of PACs. The development of obesity, IR and other metabolic alterations was prevented by the administration of PACs. The results of this thesis provide a better understanding of the mechanisms of action underlying the preventive and therapeutic effects of PACs in metabolic disorders, particularly in the intestine-liver axis.

Les corticostéroïdes inhalés (ICs) utilisés dans le traitement de l'asthme ont un effet sur le microbiome pulmonaire. Il est toutefois difficile de séparer leurs effets sur les communautés bactériennes via leur rôle immunomodulateur, de leurs effets indirects via l’amélioration de la ventilation. Notre objectif est de déterminer si les ICs altèrent le microbiote pulmonaire indépendamment de leurs effets sur la fonction pulmonaire. Douze chevaux atteints d’asthme en exacerbation ont reçu des bronchodilatateurs à longue durée d'action (LABA, salmétérol) ou une combinaison ICs/LABA (fluticasone/salmétérol) pendant deux semaines. Des tests de fonction pulmonaire et des lavages broncho-alvéolaires (LBA) ont été effectués avant et après traitement. La quantification par PCR et le séquençage du gène codant pour l’ARNr 16S via une plateforme MiSeq-Illumina ont été réalisés sur les LBA. Les données ont été analysées avec mothur. La fonction pulmonaire s’est améliorée dans les deux groupes. Les abondances relatives de familles et genres appartenant au phylum Bacteroidetes ont augmenté suite au traitement ICs/LABA, tandis que les phyla Verrucomicrobia et Actinobacteria se sont appauvris avec les LABA. Une modification de la β-diversité et une diminution de la charge bactérienne ont été observées seulement après le traitement LABA. L’α-diversité n’a en revanche pas varié dans les deux groupes. Les différences observées entre les groupes ICs/LABA et LABA suggèrent que les changements au sein des communautés bactériennes ne sont pas seulement dus à l’amélioration de la ventilation. Il reste toutefois difficile de trancher quant à un effet positif ou bien néfaste des ICs sur le microbiote pulmonaire. / Inhaled corticosteroids (ICs) affect the respiratory microbiome in asthma. It remains difficult to separate the immunomodulatory effects of ICs on bacterial communities from their indirect effects via improvement of ventilation. Our objective was to determine if ICs alter the lung microbiota independently from their effects on lung function. Twelve horses with equine asthma in exacerbation were assigned to receive a long-acting bronchodilator (LABA, salmeterol) or the combination ICs/LABA (fluticasone/salmeterol) for 2 weeks. Lung function and bronchoalveolar lavages (BAL) were performed before and after treatment. 16S rRNA gene quantification and sequencing were performed on BAL fluid, using PCR and the Illumina MiSeq platform. Data were processed using the software package mothur. Lung function improved with both treatments. The relative abundances of families and genera belonging to the Bacteroidetes phylum increased with ICs/LABA, while the Verrucomicrobia and the Actinobacteria phyla decreased with LABA. Furthermore, β-diversity differed from baseline and the bacterial load decreased after LABA only. On the contrary, α-diversity indices did not vary in both groups. The differences observed between the ICs/LABA and LABA groups suggest that the changes in bacterial communities are not only due to improved ventilation. However, it remains difficult to clarify if the effects of ICs are positive or detrimental to the lung environment.

L’asthme équin, une maladie inflammatoire considérée non infectieuse, est néanmoins associé avec la présence de certains streptocoques et Pasteurellaceae. La similarité entre les espèces de Pasteurellaceae complexifie toutefois leur différenciation. L’objectif de cette étude est d’évaluer la présence de différents Pasteurellaceae dans les voies respiratoires de chevaux atteints d’asthme. Des amorces qPCR ont été optimisées pour [Pasteurella] caballi, Nicoletella semolina, Pasteurella multocida et Haemophilus influenzae, mais plusieurs espèces d'intérêt (notamment Actinobacillus spp.) n'ont pas pu être étudiées faute d'amorces spécifiques. Des lavages nasaux, oraux et bronchoalvéolaires de douze chevaux (six sains, six asthmatiques) gardés dans différents environnements ont été analysés. Pour N. semolina, les analyses ont été approfondies chez dix chevaux asthmatiques (phase II : lavages nasaux et bronchoalvéolaires), et chez dix chevaux sains (phase III : lavages nasaux). N. semolina a été identifié dans 0 à 66 % des échantillons et était retrouvé en plus forte quantité dans le nez de chevaux gardés à l’intérieur et nourris avec du foin. Dans les phases II et III, N. semolina a été identifié dans 90 à 100 % des échantillons nasaux, et dans six lavages bronchoalvéolaires. [P.] caballi a été identifié dans la cavité orale de 83 % des chevaux, indépendamment du statut de santé. H. influenzae et P. multocida n’ont pas été détectés. Aucun Pasteurellaceae analysé n’était associé à l’asthme équin sévère. N. semolina était fréquemment retrouvé dans les voies respiratoires et sa charge nasale était influencée par l’environnement. Les amorces synthétisées faciliteront de futures études sur les Pasteurellaceae. / Equine asthma, an inflammatory disease considered non-infectious, is associated with the presence of certain streptococci and Pasteurellaceae. Strong similarities between Pasteurellaceae species prevent specific differentiation. The objective of the study was to evaluate the presence of different Pasteurellaceae in the airways of horses with severe asthma. Quantitative PCR primers were optimized for [Pasteurella] caballi, Nicoletella semolina, Pasteurella multocida and Haemophilus influenzae. Several species of interest (in particular Actinobacillus spp.) could not be studied due to a lack in primer specificity. Nasal, oral and bronchoalveolar lavages from twelve horses (six healthy, six asthmatics) kept in different environments were analyzed. For N. semolina, further investigation was pursued through inclusion of ten asthmatic horses (phase II: nasal washes and bronchoalveolar lavages), and ten healthy horses (phase III: nasal washes). N. semolina was identified in 0 to 66 % of samples and was found in larger loads in the nose of horses kept inside and fed hay. In phases II and III, N. semolina was identified in 90 to 100 % of nasal samples and in six bronchoalveolar lavages. [P.] caballi was only identified in the oral cavity, with 83 % of positive horses regardless of health status. H. influenzae and P. multocida were not detected. No specific Pasteurellaceae studied here were associated with severe equine asthma. N. semolina was identified frequently in respiratory samples and its nasal load was influenced by the horse’s environment. The optimized primers will facilitate future studies on Pasteurellaceae.

La prise en compte du microbiote intestinal porcin est une approche de plus en plus considérée dans la qualification des mesures de contrôle des pathogènes alimentaires issus de cette filière de production. Toutefois, ces études, en conditions protégées, sont généralement réalisées in vivo, nécessitent des installations spécialisées, coûteuses en fonctionnement. Une alternative possible à l’utilisation des animaux serait la disponibilité d’un système in vitro mimant le microbiote intestinal cultivé en bioréacteur. Ce projet de recherche vise la mise au point d’un système de culture en bioréacteur pour la production d’un microbiote dérivé du microbiote intestinal porcin, puis la mesure de l’effet de deux huiles essentielles sur le microbiote. Un système, original par son alimentation continue par un digestat d’aliment conventionnel porcin, a été utilisé dans le cadre de ce projet. En effet, ce système est composé de huit réacteurs, dont un réacteur mère permettant la croissance du microbiote qui a été distribué dans les sept réacteurs fils afin de disposer de conditions reproductibles. Les résultats obtenus par séquençage métagénomique 16S par Illumina MiSeq des échantillons démontrent une grande évolution de la composition des échantillons à 48 h par rapport au contenu intestinal utilisé pour l’inoculation. Toutefois, cette variation a diminué considérablement entre 48h et 72h, pour offrir une fenêtre d’analyse de microbiotes complexes d’origine intestinale porcine pour l’évaluation d’additifs alimentaires. Dans le cadre de cette étude, l’introduction de deux huiles essentielles, le Thymol et le Carvacrol, a été testée dans le système à 48h, pour deux concentrations (200 ou 1000 ppm). Les résultats de PCR quantitative ont démontré une augmentation significative des populations de Lactobacilles dans les réacteurs contenant du Thymol à 1000 ppm en 24h (entre l’ajout à 48h et la fin de l’expérience, à 72 h) ou par comparaison avec le réacteur contrôle sans huile à la fin de l’essai, mais aucune différence significative n’a été observée pour le Carvacrol. Toutefois, aucune différence significative n’a été observée au niveau de la composition du microbiote entre les réacteurs comportant des additifs différents. Cette étude a permis le développement d’un système de bioréacteur permettant de maintenir un microbiote dérivé du microbiote intestinal porcin sur 72h, ainsi que sa mise en oeuvre pour mesurer l’effet de l’addition d’une huile essentielle dans un réacteur. / Pig intestinal microbiota is an approach more considered in the foodborne pathogen control qualification in the pig production. However, these studies are commonly conducted in vivo needing specific installation and significant costs. A possible alternative to the use of animals would be the used of an in vitro system to mimic the intestinal microbiota, in a bioreactor. This research project aims to setup a bioreactor system to produce a microbiota derived from the pig intestinal microbiota, and to assess the effect of two essentials oils on this microbiota. The system used in this project is unique by its design, continuously supplied using digested piglet feed as a culture media. This system is composed of eight reactors, including a mother reactor for the growth of the microbiota that was divided between seven daughter reactors to obtain reproducible conditions. Results obtained by 16S metagenomic sequencing using Illumina MiSeq of the samples showed an evolution of the sample composition at 48h compared to intestinal content used for inoculation. However, this variation decreases between 48h and 72h, offering a window for the analysis of food additives effect on the microbiota from piglet origin. In this study, two essentials’ oils, Thymol and Carvacrol, were added to the system at 48h, at a concentration of 200 and 1000 ppm, respectively. Quantitative PCR showed a significant increase of Lactobacilli in reactors containing Thymol at 1000 ppm in 24h (between the addition at 48h and the end of the experiment at 72h) or when comparing with the control reactor without oils at the end of the experiment, but no significative difference was observed for the Carvacrol. However, no significative difference was observed in microbiota composition between the reactors containing the different additives. This study enabled the development of a bioreactor system to maintain a microbiota derived from the pig intestinal microbiota over 72h, and the possibility to assess the effect of essential oils addition in a reactor.