La détection sensible et sélective des métaux lourds, en particulier les métaux detransition, est d’une grande importance pour la santé publique ainsi que pour la surveillancede l’environnement. Les méthodes actuelles de référence, de par leur non portabilité, limitentla possibilité de disposer de mesures à haute résolution spatiale et temporelle. Lesmicrocapteurs optiques offrent un moyen attrayant et pratique pour surmonter ces limitationsde coût global et de temps d’analyse, en permettant la mesure en temps réel sur site.Pour démontrer ce potentiel, ces travaux de thèse sont orientés sur la détermination duchrome hexavalent Cr(VI) en solution à l’aide d’une réaction colorimétrique avec le 1,5-diphénylcarbazide (DPC), permettant de créer un complexe présentant un maximumd’absorption dans le domaine du visible. Ces travaux s’inscrivent dans la volonté dedévelopper un véritable laboratoire sur puce, intégrant la fonction fluidique parélectromouillage sur diélectrique pour créer la réaction colorimétrique, ainsi que la fonctionde mesure par intégration d’un capteur optique dédié à la mesure d’absorption dans desmicrovolumes (< μL). Pour la mesure d'absorption sur de si faibles volumes, l'utilisation demicrorésonateurs vise à augmenter de façon importante le chemin optique effectif et ainsi lasensibilité du capteur.Nous décrivons nos travaux sur la conception, la fabrication de la plateformemicrofluidique digitale ainsi que du résonateur optique en anneaux à des dimensionssubmicroniques par photolithographie par projection. Les matériaux polymères sontprivilégiés pour une intégration totale bas coût à terme, ainsi qu’un substrat verre, dont lespropriétés sont particulièrement adaptées aux applications optiques dans le domaine duvisible. / The selective and sensitive detection of heavy metals, such as transition metals, is ofparamount importance for health and safety an environmental monitoring. Current referencemethods, due to their lack of portability, are limiting factors to obtain high-resolution spatialand temporal data. Optical sensors offer an attractive and convenient way to overcome theselimitations of cost and time per analysis by offering real time, on-site measurementcapabilities.In order to demonstrate this potential, this thesis is focused on the detection and quantificationof hexavalent chromium Cr(VI) in water samples by a colorimetric reaction based on areaction with the 1,5-diphenylcarbazide (DPC), that produces a complex possessing anabsorption maximum in the visible range. This works endorse the goal of creating a true labon-chip, integrating both the fluidic function based on ElectroWetting on Dielectric (EWOD)to create the colorimetric reaction, and the sensing function based on the integration of anoptical sensor able to measure absorption variations in micro-volumes (< μL). In order toobtain sufficient sensitivity on such small volumes, optical microring resonators are used inthis work, due to their ability to enhance the effective optical path length by constructiveinterferences.This thesis describes the conception and fabrication of the EWOD microfluidic platform, aswell as the conception, simulation and fabrication of submicronic microring resonators usingstepper lithography. Polymer materials and glass substrates are selected, due to their greatoptical properties in the visible range, their compatibility with the EWOD platform, and theirintegrability at a reasonable cost.

Ce travail est motivé par la nécessité de mieux comprendre la technique de récupération du pétrole par injection de polymères à l'échelle du pore. On considère deux fluides immiscibles dans un réseau de microcanaux. A cette échelle, le diamètre des canaux est de l'ordre de quelques dizaines de micromètres tandis que la vitesse est de l'ordre du centimètre par seconde. Cela nous permet d'utiliser les équations de Stokes incompressible pour décrire l'écoulement des fluides. Le modèle Olroyd-B est utilisé pour décrire l'écoulement du fluide viscoélastique. Afin d'effectuer des simulations numériques dans une géométrie complexe comme un réseau de microcanaux, une méthode de pénalisation est utilisée. Pour suivre l'interface entre les deux fluides, la méthode Level-Set est employée. Le modèle pour la dynamique de la ligne triple est basé sur les la loi de Cox. Enfin, on présente des résultats de simulations numériques avec des paramètres physiques réalistes. / This work is motivated by the need for better understanding the polymer Enhanced Oil Recovery (EOR) technique at the pore-scale. We consider two phase immiscible fluids in a microchannel network. In microfluidics, the diameter of the channels is of the order of a few tens of micrometers and the flow velocity is of the order of one centimeter per second. The incompressible Stokes equations are used to describe the fluid flow. The Oldroyd-B rheological model is used to capture the viscoelastic behavior. In order to perform numerical simulations in a complex geometry like a microchannel network, a penalization method is implemented. To follow the interface between the two fluids, the Level-Set method is employed. The dynamic contact line model used in this work is based on the Cox law. Finally, we perform simulations with realistic parameters.

L’ingénierie des protéines fonctionnelles est un processus d’amélioration des propriétés physiques ou catalytiques d’enzyme au travers d’approches rationnelles et d'évolution dirigée, aussi bien que la combinaison des deux méthodes. Malgré le progrès de la modélisation moléculaire des protéines, les méthodes de prédiction restent aléatoires et un grand nombre de variantes restent à tester. De ce fait, le développement et l’utilisation d’un système de criblage d’activité de protéines à très haut débit, comme la microfluidique en gouttes, est indispensable. Cette thèse de doctorat présente trois projets d’évolution dirigée de protéines en trois approches différentes avec expression d’enzyme in vitro et in vivo. Les plateformes microfluidiques ont été développées et validées pour chaque projet. De plus, plusieurs banques de variants ont été criblées avec, dans certains cas, isolement de molécules 5-10 fois que le clone parental. / This work describes the development of high-throughput droplet microfluidic platforms fine-tuned for protein of interest and their employment in directed evolution experiments. When not available, fluorogenic assay for monitoring desired enzyme activity (-ies) in droplets was developed. Moreover, the in vivo expression allowed the successive integration of microfluidic modules on the same chip. After a couple of evolution rounds the initial retro-aldolase variant was significantly improved. In other project, to meet industrial requirements a high-throughput screening platform for protease evolution in detergent has been assembled and validated. Two evolution rounds showed the accumulation of a certain pool of beneficial mutations over the selection rounds. The research described in this work highlighted that in vitro expression systems are sensitive to the amount of supplied DNA and reaction conditions. This observation led to the development of a multistep completely in vitro microfluidic platform.

Ce travail de thèse a démontré la possibilité de mesurer la relaxation d’un complexe biomoléculaire ainsi que son hétérogénéité structurale, en associant la microfluidique et la fluorescence résolue en temps (FRT). Je présente de quelle façon la FRT permet d’obtenir une information sur la structure d’une molécule et comment on la mesure, notamment grâce à une caméra à balayage de fente. J’introduis ensuite la microfluidique de gouttes, permettant de mélanger deux réactifs en quelques millisecondes et de suivre la relaxation du complexe au cours de la propagation des micro-réacteurs. Puis, la mesure d’une cinétique avec un couple de molécules modèle démontre la preuve de principe, faisant l’objet d’un article soumis. Enfin la mesure de FRT par comptage de photons uniques dans des gouttes uniques est décrite. Elle ouvre une perspective d’application pour le criblage à haut débit : un brevet a été déposé. / This thesis has proven the feasibility of measuring the relaxation of a biomolecular complex as well as its structural heterogeneity, by associating microfluidics and time resolved fluorescence (TRF). I present in which way TRF allows for probing the structure of a molecule and how it is measured, in particular by using a streak camera. I then introduce droplet microfluidics, which enables to mix two reagents in a few milliseconds and to follow the relaxation of the complex, along propagation of the micro-reactors. Next, the measurement of a kinetics with test molecules validates the proof of concept, reported in a submitted article. Finally, the measurement of TRF by single photon counting in single droplets is described. It opens a perspective for an application in high-throughput screening: a patent has been registered.

L’objectif de ce travail fut de développer et d’appliquer des technologies avancées de mélange et d’émulsification pour la préparation de nanovecteurs de morphologies complexes potentiellement utilisables en tant que produits pharmaceutiques. Premièrement, un procédé de nanoprécipitation assisté par micromélangeur fut utilisé pour obtenir et contrôler la taille de nanoparticules de PMMA chargées en Kétoprofène (100-200 nm). Combiné avec un appareil de séchage par pulvérisation, des nanoparticules sèches purent être obtenues dont les propriétés physico-chimiques furent proches de celles des particules non séchées. Ce microprocédé de nanoprécipitation permit également d’encapsuler des nanoparticules d’oxyde de fer (6 nm) dans des nanoparticules de PMMA de 200 nm avec une fraction massique de 60%. Pour augmenter la fraction solide de ces nanosuspensions et obtenir des particules sphériques de tailles plus petites (100 nm), une méthode de nanoémulsification basée sur un fort écoulement élongationnel fut employée. Deuxièmement, des émulsions et nanohydrogels doubles encapsulant un médicament hydrophile modèle dans leur cœur aqueux furent obtenus par couplage d’un microfluidiseur commercial pour l’obtention de l’émulsion primaire et d’une méthode d’émulsification basse énergie (émulsification spontanée) pour la double émulsification. La taille des nanovecteurs doubles a pu être variée grâce au rapport massique surfactant/huile (SOR) dans la gamme 80-80 nm. La colocation de deux sondes fluorescentes, placées dans le cœur et dans l’écorce, a pu être confirmée par microscopie confocale en fluorescence. La méthode d’émulsification spontanée fut également employée pour produire des nanolipogels (60 nm) chargées ou non de nanoparticules d’oxyde de fer et d’or (6 nm). / The aim of this work was to develop and apply advanced technologies in mixing and emulsification for the preparation of morphologically-complex nanocarriers for potential uses in pharmaceutics. Firstly, a micromixer- assisted nanoprecipitation process was used to get and to easily tune the size of Ketoprofen-loaded PMMA nanoparticles (100-200 nm). Combined with a commercial spray dryer, dry-state drug-loaded polymeric nanoparticles (NPs), which main physicochemical properties were close to those of non spray-dried NPs, were successfully produced. This nanoprecipitation microprocess also allowed encapsulating 6 nm iron oxide NPs into 200 nm PMMA nanoparticles with a weight ratio of 60%. To increase the solid content of the above nanosuspension and get spherical polymeric NPs of smaller sizes (100 nm), an elongational-flow nanoemulsification method was used. Secondly, double nanoemulsions/nanohydrogels encapsulating a hydrophilic model drug in the aqueous core droplets/hydrogel were obtained by the combination of a commercial microfluidizer for the primary emulsion and a low energy emulsification method (spontaneous emulsification) for the double emulsification. The size of the double nanocarriers was varied by means of the surfactant to oil ratio (SOR) in the range 80 to 180 nm. Colocation of two fluorescent probes located in the core and in the shell was confirmed by fluorescence confocal microscopy. The spontaneous emulsification method was also employed to produce nanolipogels whose size could be tuned down to 60 nm. These nanolipogels were also loaded with iron oxide nanoparticles (6 nm) or gold nanoparticles (6 nm).

La spectroscopie UV-Vis résolue en temps a été appliquée à l'étude de différents systèmes moléculaires dont la photophysique est contrôlée par leur interaction avec l’environnement, mais aussi comme outil pour révéler des interactions moléculaires ou des dynamiques structurelles à des échelles de temps comparativement lentes (sec à min.), en utilisant la microfluidique de gouttes pour déclencher une relaxation structurale par des conditions initiales hors équilibre. J'ai appliqué cette approche selon trois axes allant de 1) l'étude approfondie des propriétés émissives des biosenseurs afin de permettre leur utilisation quantitative dans les études d'interactions biomoléculaires, à 2) le développement d'une approche expérimentale originale pour permettre la résolution la cinétique de relaxation structurelle d'une répartition hors équilibre des structures biomoléculaires, et enfin 3) l'application aux biotechnologies à haut débit de la fluorescence résolue en temps pour des analyses d'interactions biomoléculaires précises et rapides, pertinente à la fois pour les domaines académiques et industriels. / In the context of the present thesis, UV-Vis time-resolved spectroscopy was applied targeting the photophysics investigation of different environmentally sensitive molecular systems, but also as a biosensing approach to reveal molecular interactions or structural dynamics on much slower time scales (sec to min), using droplet microfluidics triggering structural relaxation through out-of-equilibrium initial conditions. I thus investigated on a three-axis-target spanning from 1) the in-depth investigation of the emissive properties of biosensors in order to allow their quantitative use in biomolecular interaction studies, to 2) the development of an original experimental approach to enable resolving the structural relaxation kinetics of an out-of-equilibrium distribution of biomolecular structures, and finally 3) the technological application of time resolved fluorescence for precise, rapid, cost effective, biomolecular interaction assays, appealing both for academic and industrial arenas.

Optical microscopy is the simplest and the gold standard method adopted for the screening and subsequent diagnosis of various hematological and infectious diseases like malaria, sickle cell disease, tuberculosis etc. In addition to infectious disease diagnosis, its applications range from routine blood tests to the more sophisticated cancer biopsy sample analysis. Microscopy Tests (MTs) follow a common procedural workflow: (1) A technician prepares a smear of the given sample on a glass slide in a specific manner depending on the sample and the disease to be diagnosed; (2) The smeared slide is subsequently exposed to fixative agents and different histochemical stains specific to the diagnosis to be performed and (3) the prepared slide is then observed under a high quality bright- field bench-top microscope. An expert pathologist/cytologist is required to manually examine multiple fields-of-views of the prepared slide under appropriate magnification. Multiple re-adjustments in the focus and magnification makes the process of microscopic examination time consuming and tedious. Further, the manual intervention required in all the aforementioned steps involved in a typical MT, makes it inaccessible to rural/resource limited conditions and restricts the diagnostics to be performed by trained personnel in laboratory settings. To overcome these limitations, there has been considerable research interest in developing cost-effective systems that help in automating MTs. The work done in this thesis addresses these issues and proposes a two-step solution to the problem of affordable automation of MTs for cellular imaging and subsequent diagnostic assessment. The first step deals with the development of a low cost portable system that employs custom-built microscopy setup using o -the-shelf optical components, low cost motorized stage and camera modules to facilitate slide scanning and digital image acquisition. It incorporates a novel computational approach to generate good quality in-focus images, without the need for employing high-end precision translational stages, thereby reducing the overall system cost. The process of slide analysis for result generation is further automated by using image analysis and classification algorithms. The application of the developed platform in automating slide based quantitative detection of malaria is reported in this thesis. The second aspect of the thesis addresses the automation of slide preparation. A major factor that could influence the analysis results is the quality of the prepared smears. The feasibility of automating and standardizing the process of slide preparation using Microfluidics with appropriate surface fictionalization is explored and is demonstrated in the context of automated semen analysis. As an alternative to the mechanism of fixing the spermatozoa to the glass slide by smearing and chemical treatment with fixative, microfluidic chips pre-coated with adhesive protein are employed to capture and immobilize the cells. The subsequent histochemical staining is achieved by pumping the stains through the microfluidic device. The proof-of-principle experiments performed in this thesis demonstrate the feasibility of the developed system to provide an end-to-end cost-effective alternative solution to conventional MTs. This can further serve as an assistive tool for the pathologist or in some cases completely eliminate the manual intervention required in MTs enabling repeatability and reliability in diagnosis for clinical decision making

Nucleic acids are fundamental molecules of living organisms functioning essentially as the molecular information carriers of life. From how an organism is built to how it responds to external conditions, all of it, can be found in the form of nucleic acid sequences inside every single cell of every life form on earth. Therefore, accessing these sequences provides key information regarding the molecular identity and functional state of any living organism, this is very useful for areas like biomedicine, where accessing and understanding these molecular signatures is the key to develop strategies to understand, treat and diagnose diseases. Decades of research and technological advancements have led to the development of a number of molecular tools and engineering technologies that allow accessing the information contained in the nucleic acids. This thesis provides a general overview of the tools and technologies available for nucleic acid analysis, and proposes an illustrative concept on how molecular tools and emergent technologies can be combined in a modular fashion to design methods for addressing different biomedical questions. The studies included in this thesis, are focused on the particular use of the molecular tools named: padlock and selector probes, rolling circle amplification, and fluorescence detection of single molecules in combination with microfluidics and portable microscopy. By using this combination, it became possible to design and demonstrate novel approaches for integrated nucleic acid analysis, inexpensive digital quantification, mobile-phone based diagnostics and the description of viral infections. These studies represent a step forward towards the adoption of the selected group of tools and technologies, for the design and building of methods that can be used as powerful alternatives to conventional tools used in molecular diagnostics and virology. / <p>At the time of the doctoral defense, the following paper was unpublished and had a status as follows: Paper 1: Manuscript.</p>

L’effet thermocapillaire (ou Marangoni) est la résultante mécanique d’un gradient de tensioninterfaciale induit par la présence d’un gradient de température sur une interface fluide. Il semanifeste par (i) la migration d’un objet fini (goutte, bulle) immergé, et (ii) une déflexion del’interface. Sa nature interfaciale le rend particulièrement pertinent à petite échelle, notammenten microfluidique diphasique. Ce travail de thèse montre comment un effet thermocapillaireinduit localement par chauffage laser peut être utilisé pour produire des composants optofluidiquesélémentaires (vanne, aiguillage, échantillonneur), et en présente une étude quantitative.La déstabilisation d’un jet microfluidique forcée par laser, conduisant à sa rupture, est égalementprésentée et caractérisée. Cette « boîte à outils » optique fournit ainsi une approche sans contact,pour produire et manipuler des gouttes en microfluidique digitale sans nécessité d’une microfabricationdédiée. Par ailleurs, afin de caractériser sur des temps longs les gouttes produites,et ainsi considérer des populations statistiquement significatives, un dispositif optoélectroniquesimple pour mesurer les gouttes et leur vitesse en temps réel a également été développé. / The thermocapillary (or Marangoni) effect is the mechanical result of an interfacial tension gradientinduced by a temperature gradient on a fluid interface. This effect manifests itself byinducing (i) the migration of an immersed finite-size object (droplet, bubble), and (ii) a deflexionof the interface. Due to its interfacial nature, the Marangoni effect is particularly relevantat small length scales, especially in the context of two-phase microfluidics. This thesis aims atapplying the thermocapillary effect locally induced by laser heating, in order to create some basicoptofluidic actuators (valve, switch, sampler). A quantitative study of these actuators is presented.The laser-forced destabilization of a co-flowing microfluidic jet, leading to its breakup,is also investigated. This “optical toolbox” represents a non-contacting, and microfabricationfreeapproach for the production and handling of droplets in digital microfluidics. Moreover, tocharacterize these droplet over long times, thus considering statistically significant populations,a simple optoelectronic device has been developed for measuring the size and velocity of thedroplets in real time.

Les théories évolutives du vieillissement et la théorie du «disposable soma» en particulier ont été la base théorique d'une avance récente de recherche sur le vieillissement animal. Pourtant, leur hypothèse centrale sur la physiologie de l'entretien et de la réparation cellulaires n'a pas été testée empiriquement. Dans cette thèse, j'ai analysé la physiologie du vieillissement de Escherichia coli sous restriction de carbone, en tant que système modèle pour valider empiriquement les théories évolutives du vieillissement. Les outils microfluidiques sont utilisés pour isoler de larges populations de cellules isolées de E. coli et pour obtenir une restriction carbonée homogène. Malgré le partage de la même génétique et des conditions environnementales, les cellules individuelles de la population présentent des variations significatives de la durée de vie et de cause de décès. Les distributions de durée de vie présentent des caractéristiques typiques du processus de vieillissement, souvent observées en études démographiques animales et humaines. Le taux de vieillissement peut être modifié par des mutations de la réponse générale au stress. Comme la longévité induite par la restriction calorique, la réponse générale au stress prolonge la durée de vie d'E.coli en atténuant l'effet du vieillissement au détriment des besoins immédiats des cellules. Un modèle quantitatif de ce compromis physiologique est construit et correctement prédit des observations expérimentales. En conclusion, je confirme la théorie du «disposable soma» du vieillissement avec les détails physiologiques du vieillissement de E.coli en famine. / The evolutionary theories of aging and the disposable soma theory in particular, have been the theoretical basis for a recent surge of animal aging research. Yet their central assumption about the physiology of cellular maintenance and repair has not been empirically tested. In this thesis, I analysed the physiology of E.coli aging under carbon starvation, as a model system to empirically validate evolutionary theories of aging. Microfluidic tools are used to isolate large populations of isogenic single E.coli cells, and to achieve homogenous carbon starvation. Despite sharing the same genetical background and environmental conditions, individual cells in the population exhibit significant variations in lifespans and causes of death. Distributions of lifespans exhibit typical features of the aging process, often seen in animal and human demographic studies. The rate of aging can be altered by mutations of the general stress response pathway. Resembling caloric restriction induced longevity, the general stress response pathway extends starvation lifespans of E.coli by attenuating the effect of aging at the expense of immediate needs of the cells. A quantitative model of this physiological trade-off is constructed and correctly predicted experimental observations. As a conclusion, I substantiate the disposable soma theory of aging with the physiological details of E.coli aging in starvation.