p. 1-235 / Submitted by Santiago Fabio (fabio.ssantiago@hotmail.com) on 2013-05-09T18:36:34Z No. of bitstreams: 1 6666666666666666666.pdf: 1393284 bytes, checksum: 9920be0c0359ee78f71b402df0fc137f (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Meirelles(rodrigomei@ufba.br) on 2013-05-11T15:14:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 6666666666666666666.pdf: 1393284 bytes, checksum: 9920be0c0359ee78f71b402df0fc137f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-11T15:14:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6666666666666666666.pdf: 1393284 bytes, checksum: 9920be0c0359ee78f71b402df0fc137f (MD5) Previous issue date: 2010 / La leucemia se refiere a un grupo de canceres que afectan las células blancas de la sangre – leucocitos - que se producen excesivamente en la medula ósea, lo que disminuye la producción y funcionamiento de las células sanguíneas normales. Especialmente la Leucemia Mieloide Crónica - LMC - se caracteriza por la acumulación de células sanguíneas relativamente maduras, sin embargo, anormales. La única opción curativa para la LMC es el trasplante alógeno de medula ósea, pero infortunadamente, solo aproximadamente el 10% de las personas con el diagnostico tienen acceso a este. Debido a esto, el principal objetivo terapéutico de los pacientes con la enfermedad es la supervivencia global con cualidad de vida a través de tratamientos medicamentosos, algunos de ellos conocidos como terapias – objetivo, la gran mayoría de alto costo. Sumado a esto, para el control de la enfermedad es necesaria la realización de consultas médicas y exámenes periódicos, algunos de ellos de alta complejidad, así como del acompañamiento por parte de especialistas y la accesibilidad a los centros de referencia que ofrecen esa atención. La historia natural de la LMC, el monitoreo de las anormalidades cromosómicas, así como la condición etiologica desconocida de la enfermedad, colocan la problemática el enfrentamiento de la cronicidad, de las “imágenes del cáncer” y lo que esto implica en la vida cotidiana de las personas que conviven con la LMC. En esta investigación de carácter cualitativo, se analizan las experiencias de enfermedad de seis portadores de Leucemia Mieloide Crónica, usuarios del SUS y que reciben atención y control en la Unidad hematológica del Hospital Universitario Edgard Santos, en la ciudad de Salvador – BA, Brasil. Sustentado en la experiencia de enfermedad como categoría analítica, se analiza la forma como los individuos se sitúan o asumen la situación de la enfermedad, atribuyéndole significados y desarrollando rutinas de enfrentamiento en la vida cotidiana. Apuntando para la interpretación del “vivir con LMC”, los significados definidos en la interacción social y las percepciones de los problemas colocados por la enfermedad, incluyendo el acceso a la atención y los tratamientos, fue privilegiada la narrativa como herramienta para aprender esos significados de la acción frente a la enfermedad. El interés en esta comprensión a través de la narrativa, fue basado en los presupuestos de un nexo fundamental entre la experiencia y narración, desarrolladas a partir y alrededor del padecimiento, articulando circunstancias, acciones e interacciones, motivos, sentimientos y evaluaciones en una cierta sucesión temporal. En los resultados, se presentan las seis narrativas considerando cada caso subjetivamente, así como el análisis de las semejanzas y la intersubjetividad presente en la elaboración de los significados de la enfermedad. Teniendo como cuadro de fondo la cronicidad, el tratamiento permanente, el control a través de los exámenes, así como la carga significativa de la enfermedad y los tratamientos, se analiza la presencia de la enfermedad como una ruptura de la vida cotidiana, donde un “antes” y “después” se instala a partir del diagnostico, la percepción de esta como una amenaza a la vida, que enfrenta a la muerte, la incertidumbre, el aislamiento social y que lleva a desarrollar estrategias para evitar los prejuicios y experiencias estigmatizantes. Las imágenes tradicionales del cáncer se contrastan con la experiencia de tener LMC, donde nuevas expectativas de sobrevida son ofrecidas por los tratamientos, así como una percepcion de retorno a la vida “normal” con algunas reglas y ciertas restricciones. Al incluir las percepciones de acceso a la atención como ususarios del SUS y de la Unidad hematológica del Hospital Universitario Edgar Santos, se presenta también un análisis del contexto de atención, donde percepciones del acesso como un “privilegio” se contraponen a los presuspuestos de la salud como derecho. El interés y las motivaciones por esta temática, por parte de la investigadora, se enmarcan en el campo de los estudios socio-antropológicos que abordan la relación cultura y salud, por la relación entre esta enfermedad crónica y sus impactos en diferentes aspectos de la vida cotidiana; por los sistemas de cuidado en el proceso salud / atención y principalmente, por la focalización y valorización de las perspectivas de los enfermos. Metodológica y personalmente, supuso un reto interesante para la investigadora al enfrentar “lo familiar” por el hecho de ser portadora de la misma enfermedad, objetivo de este estudio. / Salvador

La leucemia mieloide aguda (LMA) es una proliferación neoplásica de células inmaduras de estirpe mieloide que se produce por una alteración en la regulación del crecimiento y la diferenciación de las células hematopoyéticas. Durante las décadas de los 80 y 90 se produjo un avance muy importante en el diagnóstico de la leucemia aguda que ha permitido un mayor refinamiento diagnóstico y por tanto un tratamiento más individualizado de los enfermos. Aproximadamente el 60-80% de los adultos con LMA consiguen remisión completa, pero sólo el 30-40% de estos pacientes está vivo y libre de enfermedad a los 5 años. Estos datos indican que a pesar del avance conseguido en los últimos años es necesario continuar estudiando esta enfermedad tan heterogénea. Los principales factores pronósticos en la LMA pueden dividirse entre los relacionados con características del paciente y los relacionados con características de la leucemia. En la actualidad la citogenética en el momento del diagnóstico constituye el factor pronóstico más importante para predecir la evolución clínica de los pacientes. La identificación de diferentes alteraciones moleculares está permitiendo refinar el pronóstico de determinados grupos de LMA, como el de citogenética normal. Los datos inmunofenotípicos obtenidos por citometría de flujo también son de utilidad pronóstica, especialmente durante el seguimiento de los pacientes mediante la detección de la enfermedad residual mínima (ERM). En los trabajos incluidos en esta tesis se analiza el significado pronóstico de determinados aspectos inmunofenotípicos y moleculares. En el primer trabajo se analiza la inestabilidad de microsatélites (MSI) en pacientes jóvenes (<60 años) con LMA de novo. La MSI es un fenómeno que provoca inestabilidad genética y que juega un papel muy importante en la patogénesis de las neoplasias sólidas. Su implicación en la leucemogénesis es controvertida. En nuestro estudio se observa que la MSI no es infrecuente en pacientes jóvenes con LMA de novo. No se ha observado una asociación entre la presencia de la MSI y el pronóstico de los pacientes. La MSI no se asocia de forma significativa con ninguna lesión molecular concreta lo que sugiere que esta alteración no es dependiente de ninguna vía molecular específica. En el segundo trabajo se analiza el seguimiento de la ERM mediante citometría de flujo y PCR cuantitativa en pacientes con LMA y citogenética de buen pronóstico [t(8;21)/inv(16)/t(16;16)]. Hemos observado que ambos métodos son útiles y eficaces para el seguimiento de la ERM en este grupo de pacientes. Se han podido definir unos valores críticos de ERM, tanto por citometría de flujo como por PCR cuantitativa, que permiten identificar pacientes con mayor riesgo de recaída al final del tratamiento quimioterápico y que serían, por tanto, candidatos a recibir un tratamiento más intensivo. Por último, se han analizado las características inmunofenotípicas al diagnóstico de pacientes jóvenes con LMA de novo y se ha estudiado la correlación de la expresión de determinados antígenos con las características clínicas, biológicas y con el pronóstico. CD2 es un marcador linfoide que se expresa con mayor frecuencia en LMA asociadas a la inv(16)/t(16;16), tal y como está descrito en la literatura. La expresión de CD2 no modifica el buen pronóstico de este tipo de leucemias, pero por el contrario, se asocia a una mayor tasa de refractariedad al tratamiento de inducción y por tanto, a una menor supervivencia cuando se expresa en otros tipos de LMA. CD36 se expresa en LMA con participación monocítica y, en nuestro estudio, se asocia con una menor supervivencia y un mayor riesgo de recaída. Este peor pronóstico es independiente de otros factores como la citogenética o la presencia de la FLT3-ITD. Por tanto, el perfil inmunofenotípico al diagnóstico puede aportar información pronóstica complementaria. / Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous group of diseases characterized by a neoplastic proliferation of immature myeloid lineage cells produced by an alteration in the regulation of growth and differentiation of hematopoietic cells. This alteration will cause the accumulation of immature myeloid precursors capable of replication, but has lost its ability to differentiate into mature hematopoietic cells. During the decades of 80 and 90 there was a major advance in the diagnosis of AML that has allowed a more refined diagnosis and therefore a more individualized treatment of patients. About 60-80% of adults with AML achieve complete remission, but only 30-40% of these patients are alive and free of disease at 5 years. These data indicate that despite the progress achieved in recent years in diagnosis and treatment of AML, it is necessary to continue studying this disease. Prognostic factors in AML can be divided into those related to patient characteristics and those related to leukemia features. Today cytogenetics at the time of diagnosis is the most important prognostic factor for predicting clinical outcome of patients. In recent years the identification of different molecular alterations are allowing to refine the prognosis of certain groups of AML, like normal cytogenetics. Immunophenotypic data obtained by flow cytometry are also of prognostic value, especially for the study of minimal residual disease (MRD) in patients in complete remission. The papers included in this thesis examine the prognostic significance of certain immunophenotypic and molecular aspects. In the first paper we analyzed the microsatellite instability (MSI) in young patients (<60 years) with de novo AML. The MSI is a phenomenon that causes genetic instability and plays an important role in the pathogenesis of solid tumors. Their involvement in leukemogenesis is controversial. Our study shows that MSI is not an uncommon finding in young patients with de novo AML. It was observed that the presence of the MSI does not affect the prognosis of patients. The MSI was not significantly associated with any particular molecular lesion suggesting that this alteration is not dependent on any specific molecular pathway. The second paper discusses the monitoring of MRD by flow cytometry and quantitative PCR in AML patients with good prognosis cytogenetic [t(8;21) and inv(16)]. We observed that both methods are useful and effective for monitoring MRD in these patients. It was possible to define a threshold of ERM, both by flow cytometry and by quantitative PCR, which can identify patients at increased risk of relapse at the end of chemotherapy. These patients would candidates for more intensive treatment. Finally, we have analyzed the immunophenotypic characteristics at diagnosis of young patients (<60 years) with de novo AML. We studied the correlation of the expression of specific antigens with the clinical and biological characteristics and prognosis. CD2 is a lymphoid marker that is expressed more frequently in AML associated with inv(16), as described in the literature. The expression of CD2 does not alter the good prognosis of this type of leukemia, but instead is associated with decreased survival when expressed in other types of AML due to a higher rate of refractory to induction therapy. CD36 is frequently expressed in AML with monocytic involvement and, in our study is associated with decreased survival and increased risk of relapse. A multivariate study shows that the prognostic value of CD36 is independent of other factors such as cytogenetics and FLT3-ITD. Therefore, the immunophenotypic profile of diagnosis may provide additional prognostic information in AML.

Orientadora : Profª Drª Juliana Ferreira de Moura / Coorientadora : Profª Drª Larissa M. Alvarenga / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 27/08/2014 / Inclui referências : f. 66-72 / Resumo: O cromossomo Philadelphia, encontrado principalmente em pacientes com leucemia mieloide crônica (LMC), expressa diferentes transcritos BCR-ABL1, sendo o principal deles o b2a2. Esses transcritos codificam proteínas que possuem atividade tirosina-quinase constitutivamente ativa e, consequentemente, ativam múltiplas cascatas resultando no desencadeamento da doença. Atualmente as principais metodologias empregadas no diagnóstico e monitoramento da LMC utilizam técnicas de biologia molecular que apresentam uma série de desvantagens tais como custo, necessidade de mão de obra qualificada, falta de sensibilidade e, ainda, não quantificam a proteína quimérica BCR-ABL1, a qual é o principal fator indutor da doença, principalmente porque a quantidade de RNAm não é fiel ao montante da quimera. No presente estudo, buscou-se identificar ligantes da proteína referente ao transcrito b2a2 que pudessem ser aplicados na detecção e quantificação da proteína BCR-ABL1, fornecendo um diagnóstico preciso além de uma alternativa para o monitoramento da doença residual mínima. Portanto, utilizou-se a técnica de Phage Display a fim de se obter peptídeos expressos em fagos com afinidade para um peptídeo sintético correspondente ao fragmento correspondente ao transcrito b2a2 (pepb2a2). Para tanto, diferentes estratégias de seleção desses peptídeos foram utilizadas, sendo a mais eficaz aquela em que se utilizou uma solução ácida concomitantemente à sonicação para a eluição. Foram identificados dois clones (25S e 13S) cujas reatividades frente ao pepb2a2 foram confirmadas por ELISA com absorbâncias de 0,97 e 1,34, respectivamente, próximas a absorbância de 1,30 do controle positivo (anticorpo monoclonal anti-b2a2). Ambos os clones apresentaram reatividade dose-dependente frente ao pepb2a2 confirmando a afinidade, fenômeno que também foi confirmado pelo ELISA de competição no qual os clones foram capazes de inibir a ligação ao anticorpo monoclonal em 27,15% e 38,12%, respectivamente. A especificidade ao pepb2a2 foi verificada quando se utilizou como alvo dois outros fragmentos BCR-ABL-1 cujas absorbâncias para o pepb3a2 foram de 0,18 e 0,26 e para o pepe1a2 foram de 0,36 e 0,42, respectivamente. Esses clones, após sequenciamento, poderão ter suas sequências amioacídicas sintetizadas e acopladas a enzimas ou nanopartículas com o intuito de testá-las frente a linhagens de células comerciais que expressam BCR-ABL1 e de pacientes. Esse trabalho é pioneiro na utilização da interação peptídeo-peptídeo na seleção de ligantes para fins diagnósticos e é primeiro passo para a elaboração de novos métodos para detecção de células remissivas na doença residual mínima em leucemias. Palavras chaves: phage display; leucemia mieloide crônica; peptídeo; diagnóstico; monitoramento; doença residual mínima. / Abstract: The Philadelphia chromosome, found mainly in patients with chronic myeloid leukemia (CML), expresses different BCR-ABL1 transcripts, the b2a2 being the main one. These transcriptsencode proteins that have constitutively active tyrosine kinase activity and are able to active multiple cascades resulting on development of the disease. Currently the diagnostic and monitoring methods of CML use molecular biology techniques which have a number of disadvantages, such as cost, qualified professionals and lack of sensitivity. They do not quantify the chimeric protein BCR-ABL1, which is the main driving factor, and also the amount of mRNA is not equivalent to the amount of chimera. In the present study, we aimed to identify ligands of b2a2 transcript that could be applied in the detection and quantification of BCR-ABL1 protein, providing an accurate diagnosis as well as an alternative for monitoring minimal residual disease. Therefore, we used the phage display technique to obtain peptides expressed on phage with affinity for a synthetic peptide corresponding to the b2a2 transcript (pepb2a2). Different selection strategies were used for these peptides and the most effective one used an acid solution simultaneously with sonication for elution. Two clones (25S and 13S) had their reactivity to pepb2a2 confirmed by ELISA absorbance values of 0,97 and 1,34, respectively, close to absorbance value of 1,30 to the positive control (anti-b2a2 antibody). Both clones showed dose-dependence reactivity to pepb2a2 confirming their affinity, which was also confirmed by competition ELISA in which the clones were able to inhibit monoclonal antibody binding to 27,15% and 38,12%, respectively. The specificity to pepb2a2 was observed when using two other target BCR-ABL-1 transcripts whose reactivity to pepb3a2 were 0,18 and 0,26 and the pepe1a2 were 0,36 and 0,42, respectively. These clones once sequenced may have their aminoacid sequences synthesized and coupled to enzymes or nanoparticles in order to test them against commercial BCR-ABL1 cell lines and patients. This work is the first to use the peptide-peptide interaction in the selection of ligands for diagnostic purposes and is a first step towards the development of new methods for detection of remissive cells in minimal residual disease in leukemia. Keywords: phage display; chronic myeloid leukemia; peptide; diagnostics; monitoring; minimal residual disease.

Orientadores: Sara T.O. Saad, Irene Lorand-Metze / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-21T00:26:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vigorito_AfonsoCelso_M.pdf: 2605277 bytes, checksum: ebff13109ec6060642da73794a8481bc (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa clonal caracterizada, em mais de 90% dos casos, pela presença do cromossomo Philadelphia ('Ph POT. 1¿ Esta alteração cito genética resulta de uma translocação recíproca entre os cromossomos 9 e 22 com transferência do protooncogene c-abl do cromossomo 9 para uma região restrita de quebra no cromossomo 22, de 5,8 kilobases (kb), denominada breakpoint cluster region (bcr). Esta translocação leva à ativação do proto-oncogene abl que exerce um papel fundamental na pato gênese da neoplasia. Assim, foi objetivo deste trabalho caracterizar, numa população de 35 pacientes com diagnóstico de LMC em primeira fase crônica, o ponto de quebra no gene bcr e correlacioná-lo com as características histológicas da medula óssea, tamanho do baço, número de leucócitos, porcentagem de blastos, eosinófilos, basófilos no sangue periférico e medula óssea ,número de plaquetas, e citogenética. DNA genômico de leucócitos de sangue periférico foi digerido com as enzimas de restrição Bgl II, Bam HI e Hind III e, por técnica de Southern blotting, o local de quebra no bcr foi subdividido em extremidades 3' e 5', através da hibridização com as sondas Pr-1 (Oncogene Science) e 'Ph POT. 1' bcr 3 nos casos onde não conseguimos detectar o rearranjo com a primeira. O estudo cito genético foi realizado em 32/35 pacientes e o cromossomo 'Ph POT. 1¿ esteve presente em 30 deles. O rearranjo no gene bcr foi detectado, pela técnica de Southern blotting, nos 35 pacientes estudados, sendo que em 86% dos casos foi possível determinar a zona do ponto de quebra: 13% na zona 1, 33% na zona 2,27% na zona 3 e 27% na zona 4. Em um caso só detectamos o rearranjo com a utilização da sonda 'Ph POT. 1'bcr-3 sugerindo provável deleção da extremidade 3'. Assim, do total de pacientes, 43% tiveram rearranjo na extremidade 5' e 57% na extremidade 3'. Nenhuma correlação foi encontrada entre o local do rearranjo com os dados laboratoriais e clínico. Quanto à histologia da medula óssea, 50% dos casos GRAN-MEG apresentaram quebra na extremidade 5' e 50% na 3'. Trinta e três porcento dos casos GRAN apresentaram quebra na extremidade 5' e 67% na extremidade 3' (teste de Fischer p= 0,17 ).Assim, concluímos, que na nossa população houve uma freqüência alta do rearranjo bcr na zona 4 e na extremidade 3'; não houve correlação entre o ponto de quebra com as características laboratoriais e clínicas, assim como com os subtipos histológicos GRAN-MEG e GRAN. Além disso a técnica de Southern blotting foi útil na detecção do rearranjo no gene bcr em 2 casos 'Ph POT. 1' negativo / Abstract: Chronic myelogenous leukemia is a myeloproliferative disease characterized! by the presence of the Philadelphia chromosome ('Ph POT. 1') in more than 90% of patients. This chromosomal' abnormality results trom a reciprocal translocation between chromosomes 9 and 22 transfering the c-abl protooncogene trom chromosome 9 to the restricted breakpoint region on chromosome 22, of about 5.8 kilobases (kb), termed the breakpoint cluster region (bcr). The high specificity of this rearrangement strongly suggests a crucial role for bcr in the pathogenesis of CML. In this study we determined the breakpoint within the bcr in 35 CML patients with a first chronic phase and correlated it with clinical date (spleen size), laboratory parameters, cytogenetics and bone marrow histological subgroups, GRAN-MEG and GRAN. Genomic DNA was extracted trom peripheral blood white cells and digested with BgI lI, Hind IlI, Bam HI restriction endonucleases. By using the Southem blotting method, the specific breakpoint within the bcr could be assigned to one of four zones, after hybridization with the 1.2 kb probe Pr-1 (Oncogene science). DNAs for which the breakpoint could not be determined with this probe were analyzed with the 'Ph POT. 1'/bcr-3 probe (Oncogene science). Breakpoints in zones 1 and 2 were grouped as 5' and those in zones 3 and 4 as 3'. The chromosome analysis was done in 32/35 patients and the Ph1 was present in 30 of them. The bcr rearrangement was determined in all patients. The localization of the breakpoint was assigned in 86% of them : 13% within zone one, 33% in zone two; 27% in zone three, and 27% in zone four. In one patient, the rearrangement was only detected after hybridization with the 4.5 kb Phl/bcr-3 probe, suggesting that the 3' end of the bcr was deleted during the translocation. Thus, ih the 35 patients analyzed, 43% were grouped as 5' and 57% as 3'. No correlation between breakpoint site and clinical or hematological features was found. In addition, 50% trom the GRAN-MEG subgroup presented a bcr breakpoint on the 5' position and 50% on the 3' position; 33% from the GRAN subgroup presented the breakpoint on the 5' position and 67% on the 3' position (the difference was not significant; Fisher Test p= 0.17). In conclusion, our population has a higher frequency of bcr breakpoint in zone 4 and 3' position; there was no correlation between 5' and 3' positions and clinical or hematological features, including the histological subgroups GRAN-MEG and GRAN. Moreover, the Southem blotting was useful to detect the bcr rearrangement in 2 'Ph POT. 1' negative cases / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

A Leucemia Mieloide Aguda (LMA) é uma neoplasia originada a partir da expansão clonal de blastos da linhagem mieloide em medula óssea, sangue periférico e outros tecidos. Entre as mutações mais frequentemente detectadas nas LMAs, se encontra a mutação do tipo duplicação interna em tandem (FLT3-ITD) que é detectada em aproximadamente 25% dos pacientes adultos. Esta mutação no receptor de tirosina quinase FLT3 é uma inserção de 3 a 400 pares de base na região juxtamembrana do receptor, a qual é responsável pelo controle da atividade enzimática dos domínios tirosina quinase. Quando esta mutação se encontra presente, a região juxtamembrana perde a capacidade de controlar a ativação dos domínios tirosina quinase e o receptor fica constitutivamente ativo conferindo uma vantagem proliferativa ao clone leucêmico. Esta mutação é considerada de mal prognóstico e já foram desenvolvidos inibidores de tirosina quinase específicos para o receptor FLT3 (FLT3 TKI). Porém, os resultados dos primeiros ensaios clínicos não apresentaram a efetividade esperada e continua a busca de novas combinações de drogas que contribuam a aumentar a efetividade destes inibidores. É por isso que este trabalho teve por objetivo testar a combinação de FLT3 TKIs com o ácido trans-retinoico (ATRA) já aplicado no tratamento da Leucemia Promielocítica Aguda (LPA) com PML-RARA. A combinação de FLT3 TKIs com ATRA induziu a morte celular programada de forma precoce tanto na linhagem de LMA MV4-11 como na MOLM-13. Esta morte celular observada foi inibida com pré- tratamento com inibidor de caspases QVD. O tratamento combinado in vivo em camundongos Nod Scid Gamma (NSG) transplantados com células MOLM-13, aumentou a sobrevida dos animais e diminuiu a percentagem de células CD45 humanas em medula óssea, baço e sangue periférico. No seu conjunto, nossos dados sugerem que o ATRA aumenta o efeito citotóxico dos FLT3-TKIs. Este achado poderá ser relevante para o tratamento de pacientes com LMA portadores de mutaçãoes ITD no gene FLT3 / Acute Myeloid Leukemia (LMA) is hematological disease that arises from the clonal expansion of a myeloid blast in bone marrow, peripheral blood and other tissues. Among LMAs mutations most frequently detected, 25% of adult patients carry the FLT3-ITD mutation. This mutation is a pair base insertion of 3 to 400 in the juxtamembrane domain of the receptor and leads to the constitutive activation of the kinase domains. It gives the leukemic clone a proliferative advantage and it is associated with a bag prognosis. FLT3 tyrosine kinase inhibitors (FLT3 TKI) were already developed in order to improved patients\' treatment. However, results from the first clinical trials were not as promising as expected. Therefore, there is still room for testing new drug combinations that could improve FLT3 TKIs efficacy. The main objective of this work was to test FLT3 TKIs in combination with all-trans retinoic acid (ATRA) already used in Acute Promyelocytic Leukemia (APL) with PMLRARA treatment. The combination of FLT3-TKIs and ATRA induced early programmed cell death in both the MV4-11 and MOLM-13 LMA lines. This early cell death was inhibited with QVD caspase inhibitor pre-treatment. In vivo combined treatment in Nod Scid Gamma (NSG) mice transplanted with MOLM-13 cells, increased animals survival and decreased the percentage of human CD45 cells in bone marrow, spleen and peripheral blood. Taken together, our data suggest that ATRA increases the cytotoxic effect of FLT3- TKIs. This finding may be relevant for the treatment of patients with AML with ITD mutations in the FLT3 gene

Orientador: Antônio de Pádua Pithon Cyrino / Coorientador: Paula de Oliveira Montandon Hokama / Banca: Maria da Graça de Andrade / Resumo: O advento das drogas alvo específicas para o tratamento da Leucemia Mielóide Crônica (LMC) em 2001, talvez venham marcar mais alguns "dias de glória" na história do "combate" ao câncer. Esses são medicamentos fruto de alta tecnologia médica e prometem um melhor controle da LMC com reduzidos efeitos colaterais, por referência àqueles da quimioterapia convencional. O câncer é uma doença crônica temida e estigmatizada em nossa sociedade que, geralmente, produz um impacto no corpo físico e psíquico de seu portador. Todavia, cada vez mais o câncer vem sendo reconhecido como uma doença controlável e que pode dar uma longa sobrevida a seu portador, permitindo lhes manterem seus projetos de vida e suas atividades rotineiras em diferentes dimensões da vida cotidiana. Os mitos e crenças em torno do câncer assumem um caráter singular por referência às outras doenças crônico-degenerativas, com uma percepção de imprevisibilidade no portador e em sua familiar. Esse estudo buscou compreender a experiência de adoecimento e o impacto da LMC na vida diária, bem como a percepção do portador sobre o processo de adoecimento, seu tratamento e a repercussão da doença em sua vida de relação. Foram realizadas sete entrevistas semiestruturadas com duas mulheres e cinco homens portadores de LMC. A análise temática de conteúdo dos dados produzidos foi orientada por uma adaptação da proposta de Bardin. Verificamos que as experiências de adoecimento são inicialmente percebidas por meio de manifestações corporais variadas e, no geral, pouco intensas, mas suficientes para que alguns dos sujeitos buscassem esclarecê-las. O diagnóstico da LMC provocou um impacto na vida dos sujeitos, marcando um antes e um depois, provocado por diferentes mudanças no cotidiano: o tratamento de longa duração (embora mais leve que uma quimioterapia), a rotina de visitas ao hospital para consultas e exames, perturbações e transformações ... / Abstract: The advent of specific drug target for the treatment of Chronic Myeloid Leukemia (CML) in 2001, maybe will score a few more "glory days" in the history of "fighting" cancer. These drugs are the result of high medical technology and promise a better control of the CML with reduced side effects, by reference to those of conventional chemotherapy. Cancer is a chronic disease feared and stigmatized in our society that generally impacts the physical and mental body of its bearer. However, cancer has been recognized even more as a manageable disease and that it can take a long survival to its carrier, allowing them to maintain their life goals and their routine activities in different dimensions of everyday life. The myths and beliefs around cancer take on a singular character by reference to other chronic diseases, with a perception of unpredictability in the carrier and his family. This study investigated the experience of illness and the impact of CML in daily life as well as the perception of the carrier on the disease process, treatment and the impact of the disease in its life relationship. Seven semi-structured interviews with two women and five men with CML were performed. A thematic content analysis of the data produced was guided by an adaptation of the proposed Bardin. We found that experiences of illness are initially perceived by various physical manifestations and, in general, rather weak, but sufficient for some subjects seek to clarify them. The diagnosis of CML caused an impact on the lives of the subjects, marking a before and an after, caused by different changes in everyday life: the long-term treatment (although lighter than chemotherapy), routine visits to the hospital for appointments and tests, disturbances and changes in work relationships, personal and family. Subjects found different explanations for such misfortune, some of them linked to previously work and products used ... / Mestre

A Leucemia Mieloide Crônica é uma doença hematopoiética associada a células estaminais que se manifesta principalmente com a expansão mielopoese. O cromossomo Philadelphia positivo PH+ é gerado por uma translocação recíproca (9, 22) (Q34, Q11) e pela fusão entre o gene Abel- son, essa fusáo codifica e desregula á protéına Tirosina Quinase, o suficiente para a iniciação e manutenção da doença. Inibidores como o Mesilato de Imatinibe revolucionou o tratamento de pacientes com leucemia mieloide crônica. As mutaç ões no domínio de quinase do Bcr-Abl, constituindo o mecanismo mais frequente de resistência adquirida para a terapia com inibidores da tirosina quinase. A mutação T315I atualmente e maior desafio para manutenção da Leucemia mieloide crônica na fase crônica, uma vez que os inibidores de Tirosina Quinase atualmente en- contrados no mercado são incapazes de mantê-la na forma controlada. Métodos computacionais baseados em fragmentos moleculares surgiram como uma nova estratégia para a descoberta de fármacos. Foi usado o programa LigBuilder para fazer geração das novas moléculas candidatas a ffármacos, usando dois métodos o Grow e Linker, as moléculas foram selecionadas por meio de docking com programa Glide da suite Maestro em cada mutação selecionadas da tirosina quinase, usando os melhores Gscores, para cada mutac¸a˜o, posteriormente foram submetidas ao programa QikProp, que tem a função comparar as moléculas com banco de dados de fármacos conhecidos. No último passo, é feito o estudo do docking das moléculas selecionas no sítio usando os protocolos de Induced Fit docking, que realiza o docking flexível-flexível, ou seja, ligante flexível e sítio de ligação da proteína flexível. / Chronic myeloid leukemia is associated with hematopoietic stem cell disorder that manifests itself primarily with myelopoiesis the expansion. The Philadelphia chromosome positive PH is generated by a reciprocal translocation (9, 22) (q34, q11), and by the merger of the Abelson gene fusion that encodes and deregulates quinase Tyrosine protein enough for the initiation and maintenance of disease. Tyrosine quinase provides a therapeutic target, which used to inhi- bition of this protein Known as tyrosine Quinase. Inhibitors such as Imatinibe mesylate has revolutionized the treatment of patients with chronic myeloid leukemia. Mutations in domain quinase Bcr-Abl, constituting the most frequent mechanism acquired resistance to therapy with tyrosine quinase. The T315I mutation and currently biggest challenge for maintenance of chro- nic myeloid leukemia in chronic phase, since inhibitors of tyrosine Quinase currently found on the market are unable to it maintaining it in a controlled manner, leading the patient achieved. Methods based on fragment docking emerged as a new strategy for drug discovery. evaluating all possible input locations and connecting the inhibitor and protein, and thus may provide a new molecule will be able to make effective inhibition. The docking studies are divided into three parts. At first, the fragments are placed to interact within the possible interaction sites. In the second step, the molecules are created from the best fragments which interacted with a particular website. In the last step, the study of molecules created in the docking site using the protocols of Induced Fit Docking which performs flexible, flexible docking ie flexible linker protein is made flexible.

A introdução do Mesilato de Imatinibe (MI) como primeiro inibidor específico de BCR-ABL1 na prática clínica revolucionou o tratamento da Leucemia Mieloide Crônica (LMC), tornando-se a terapia padrão para o tratamento desta doença. Porém, cerca de 30% dos pacientes com LMC não respondem à terapia com MI e um número substancial destes casos de resistência não tem causa conhecida. O MI interage com transportadores de membrana ABCG2 e SLCO1A2. Este estudo teve como objetivo investigar a relação da expressão gênica de ABCG2 e de SLCO1A2 com marcadores de resposta ao tratamento com MI, em indivíduos com LMC e avaliar a influência dos polimorfismos ABCG2 c.421C>A e ABCG2 c.-19-99G>A na resposta ao MI. Foram incluídos 118 pacientes com LMC os quais foram classificados em dois grupos: Grupo Respondedor, constituído por 70 pacientes com resposta citogenética completa com a dose padrão de MI (400 mg/dia) por até 18 meses e, Grupo não Respondedor constituído por 48 pacientes sem resposta citogenética completa à dose inicial de 400 mg/dia de MI ou que perderam esta resposta ao longo do tratamento e foram reescalonados para doses de 600 ou 800 mg/dia. A resposta ao tratamento foi avaliada segundo os critérios da European LeukemiaNet. Foram excluídos pacientes com alterações citogenéticas diferentes do cromossomo Ph e mutações no gene BCR-ABL1. Amostras de sangue periférico foram utilizadas para: extração do RNA total para quantificação dos transcritos BCR-ABL1 e expressão gênica de ABCG2 e SLCO1A2; extração de DNA e análise citogenética de banda G. A expressão do gene ABCG2 e SLCO1A2 e as análises dos polimorfismos foram feitas por PCR em tempo real. A expressão de ABCG2 foi maior no grupo de não respondedores ao MI (P=0,028). Este resultado foi influenciado pelos pacientes com resistência primária (N= 34 P=0,029), mas não pelos que apresentaram resistência secundária (N=14 P=0,249) quando comparado com respondedores (N=70). A elevada expressão do gene ABCG2 foi também associada àqueles pacientes que não tiveram resposta molecular maior (número de transcritos BCR-ABL1 &#8804; 0,1%) (P=0,027) quando todos os pacientes foram analisados. O gene estudado não foi associado com a resposta molecular completa (número de transcritos BCR-ABL1 &#8804; 0,032%). Com relação ao gene SLCO1A2 não foi possível determinar sua expressão devido à baixa concentração do RNA obtido. Os polimorfismos c.421C>A e c.-19-99G>A não foram associados com a expressão do gene ABCG2 e a resposta ao MI. A RMC (no grupo de respondedores) foi associada com o genótipo 421CC e houve tendência a maior frequencia de portadores do genótipo -19-99GG neste mesmo grupo. Portadores do genótipo -19-99AA apresentaram tendência ao risco de ter LMC. Os resultados deste estudo nos permitem concluir que a maior expressão de ABCG2 está associada com a resistência primária ao MI podendo então ser um mediador da resistência ao MI. Os polimorfismos do gene ABCG2 não influenciaram na expressão gênica de ABCG2, mas impactaram na RMC no grupo respondedor ao MI. / The introduction of imatinib mesylate (IM) as the first specific inhibitor of BCR-ABL1 in clinical practice has revolutionized the treatment of chronic myeloid leukemia (CML), becoming the standard therapy for this disease. However, about 20% of CML patients do not respond to therapy with IM and a substantial number of these cases of resistance have no known cause. The MI interacts with membrane transporters ABCG2 and SLCO1A2. The aim of this study was to investigate the relationship of ABCG2 and SLCO1A2 gene expression with markers of response to MI in individuals with CML and evaluate the influence of polymorphisms ABCG2 c.421C> A and c. ABCG2-19-99G> A in response to the MI. One hundred and eighteen patients in chronic phase of CML were studied and classified in two groups: Responder Group comprised 70 patients who had a complete cytogenetic response within 18 months of treatment. The non-responder group comprised 48 patients who did not have a complete cytogenetic response with the initial dose (400 mg/day) of IM or who relapsed during treatment and were submitted to higher doses of 600 or 800 mg/day. Criteria of failed response to treatment were established by European LeukemiaNet. Patients with cytogenetic patterns other than the Philadelphia chromosome and patients with mutations in the BCR-ABL1 gene were excluded from this study. Blood samples were obtained for: total RNA extraction for quantification of BCR-ABL1 and gene expression of ABCG2 and SLCO1A2; genomic DNA extraction and band G cytogenetic analysis. The gene expression and the analysis of the polymorphisms were performed by real time PCR. Expression of ABCG2 in non-responder group was higher than in responder group (P=0.028). This result was influenced by patients with primary resistance (n= 34 P=0.029) but not secondary resistance (n=14 P=0.249) when compared with responders (n=70). The higher expression of ABCG2 gene was also associated with those patients who had major molecular response (number of BCR-ABL1 . 0.1%) (P=0.027) when all patients were analyzed. The studied gene was not associated with the complete molecular response (number of BCR-ABL1 .0.0032). Regarding to the gene SLCO1A2 was not possible to determine its expression due to low concentration of RNA obtained. The c.421C>A e c.-19-99G>A were not associated neither with the ABCG2 gene expression and MI response. CMR in responders group was associated with the 421CC genotype ant there was a trend for higher frequency of carriers of genotype -19-99GG in the same group. Carriers of 19-99AA genotype tended to the risk of having CML. The results of this study allow us to conclude that the higher expression of ABCG2 is associated with primary resistance to IM and may be a mediator of resistance to IM. The ABCG2 polymorphisms did not influence the gene expression of ABCG2 but impacted in CMR of the responders to IM.

INTRODUCCIÓN. La leucemia mieloide aguda (LMA) es una enfermedad heterogénea desde el punto de vista clínico y biológico. En los últimos años se vienen reconociendo diversas alteraciones moleculares que definen entidades específicas. En este contexto, la LMA con translocación t(8;16)(p11;p13) y reordenamiento MYST3 (MOZ)/CREBBP (CBP) es una variedad infrecuente mal caracterizada desde el punto de vista biológico. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS. La proteína quimérica MYST3-CREBBP, resultante de la translocación t(8;16)(p11;p13), podría conferir a este subtipo de LMA una individualidad biológica propia, con rasgos diferenciados respecto al resto de leucemias. Para confirmar esta hipótesis general los objetivos de la presente tesis doctoral fueron: 1) diseñar una técnica de PCR para el diagnóstico rápido y específico del reordenamiento MYST3-CREBBP; 2) caracterizar el punto de ruptura de los genes implicados en la translocación en una serie de pacientes y 3) estudiar el perfil de expresión génica de las LMA con reordenamiento MYST3-CREBBP y compararlo con el de otros subtipos bien definidos de LMA.PACIENTES Y MÉTODOS. Se estudió una serie de pacientes con LMA y reordenamiento MYST3-CREBBP (n=7) y se compararon sus características biológicas con otros casos de LMA. Para ello se diseñó una técnica de PCR nueva para la detección del reordenamiento MYST3-CREBBP, mientras que los puntos de ruptura de los genes implicados en la translocación se estudiaron mediante secuenciación directa. El estudio del perfil de expresión génica de la LMA con reordenamiento MYST3-CREBBP se abordó utilizando microarrays de oligonucleótidos (Affymetrix HU133A). La diferencia entre la expresión génica entre diferentes subtipos de leucemia se analizó con diversas técnicas estadísticas (ANOVA, t-test), utilizando diferentes programas informáticos. Los resultados de este análisis se validaron en una serie independiente de pacientes estudiados mediante RT-PCR cuantitativa utilizando arrays de baja densidad. RESULTADOS. Los pacientes afectos de LMA con reordenamiento MYST3-CREBBP presentaron un inmunofenotipo característico (CD34-, HLA-DR-, CD117-, CD56+, expresión de marcadores mielomonocíticos). Por otro lado, el análisis molecular reveló que el tránscrito tipo I del gen quimérico MYST3-CREBBP es el más común en estos pacientes. Por otra parte, el análisis sobre el perfil de expresión génica mostró una firma característica para las LMA con reordenamiento MYST3-CREBBP, consistente en la sobreexpresión de determinados genes HOX (HOXA9, HOXA10), de los oncogenes RET y PRL y la infraexpresión de genes como CCND2, STAT5 y WT1. Por otro lado, se observó una similitud en la expresión de algunos genes entre las leucemias MYST3-CREBBP y las LMA con reordenamiento de MLL, lo que sugiere un mecanismo de leucemogénesis parcialmente compartido por los dos tipos de leucemia.CONCLUSIONES. La técnica de RT-PCR implementada es útil para la detección rápida del reordenamiento MYST3-CREBBP. El denominado tránscrito tipo I del gen quimérico MYST3-CREBBP es el más común en la LMA con t(8;16). La LMA con reordenamiento MYST3-CREBBP posee un perfil de expresión característico, con sobreexpresión de diversos oncogenes como RET y PRL y la presencia de un patrón específico de expresión de los genes homeobox.

QUIXADA, A. T. S. Avaliação da equivalência terapêutica das cópias genéricas do mesilato de imatinibe no tratamento inicial da Leucemia Mieloide Crônica em primeira fase crônica em um centro de referência. 2016. 85 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by ciências farmacêuticas pgcf (pgcf.ufc@gmail.com) on 2017-07-07T13:48:34Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_atsquixada.pdf: 4671422 bytes, checksum: ae93066211e338bd336e0125e9a28902 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2017-07-07T14:12:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_atsquixada.pdf: 4671422 bytes, checksum: ae93066211e338bd336e0125e9a28902 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-07T14:12:39Z (GMT). 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The comparative analysis included 29 patients who used the brand medication and 32 who used the generic presentation for 12 consecutive months. Treatment response was assessed according to the European Leukemia Network (ELN) criteria. We analyzed the results of the monitoring tests for therapeutic response at three, six and twelve months of treatment with the brand product and generic copy. The statistical analysis used the Statistical Package Program for Social Sciences (SPSS) 22.0, and applied Kolmogorov Smirnov, Mann Whitney and Log-rank Mantel-Cox tests, with 5% significance level. With the original medicine, at three months, the optimal treatment response (BCR-ABL1IS ≤ 10%) was achieved by 62% (18/29) of patients. At six months, 41.4% (12/29) hit the optimal response with the reduction of at least 2 logs (BCR-ABL1IS ≤ 1%). Finally, at 12 months, 48.2% (14/29) of patients achieved major molecular response (MMR) which corresponds to the BCR-ABL1IS ≤ 0.1%. With the generic medication, major response at three months was achieved by 62.5% (20/32). At six months, 71.9% of patients achieved an optimal response (23/32). Finally, at twelve months, 53.1% (17/32) of patients achieved the target of RMM. A slight increase in the prevalence of non-hematological adverse events of the gastrointestinal tract in the generic group was observed. The results of this study suggests that the response profile of adult patients with CP-CML using imatinib 400 mg QD in its generic presentation is comparable in the first evaluation and even surpasses the results obtained with the brand medication. We conclude that, in this sample, does not exist inferiority of the drug in its generic presentation. / O imatinibe revolucionou o tratamento da Leucemia Mielóide Crônica (LMC) ao modificar sua história natural. Vários estudos já evidenciaram que alcançar e manter a resposta molecular maior é uma meta que, ao ser obtida, oferece ao paciente expectativa de vida semelhante à da população em geral. Entretanto, há poucos dados consistentes na literatura sobre a eficácia e efeitos adversos das apresentações genéricas do imatinibe. O presente estudo teve como objetivo avaliar a resposta ao tratamento com imatinibe genérico, 400 mg/dia em pacientes adultos de um hospital universitário, portadores de LMC em fase crônica e compará-la com a do grupo que fez uso do imatinibe de referência. O estudo, observacional e retrospectivo, analisou os registros de prontuários de 80 pacientes, 40 em cada grupo, sem incluir fase experimental. Foram incluídos na análise comparativa os 29 pacientes que usaram a medicação de referência e os 32 que fizeram uso da apresentação genérica, por 12 meses consecutivos. A resposta ao tratamento foi avaliada segundo os critérios da European Leukemia Network (ELN). Foram analisados os resultados de exames de monitorização da resposta terapêutica aos três, seis e doze meses de tratamento com o medicamento de referência e a cópia genérica. A análise estatística utilizou o programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS), versão 22.0, empregando os testes de Kolmogorov Smirnov, Mann Whitney e Log-rank Mantel-Cox, com nível de significância de 5%. Com a medicação de referência, aos três meses de tratamento a resposta ótima (BCRABL1EI ≤ 10%) foi alcançada por 62% (18/29) dos pacientes. Aos seis meses, 41,4% (12/29) atingiu a resposta ótima com redução de pelo menos 2 logs (BCR-ABL1EI ≤ 1%) e aos 12 meses, 48,3% (14/29) dos pacientes alcançou a resposta molecular maior (RMM) que corresponde ao BCR-ABL1EI ≤ 0,1%. Com a medicação genérica, uma resposta ótima aos três meses foi atingida por 62,5% (20/32). Aos seis meses, 71,9% dos pacientes conseguiu um resultado ótimo (23/32), E por fim, aos doze meses, 53,1% (17/32) dos pacientes obteve a meta de RMM. Foi observado um discreto aumento da prevalência dos eventos adversos não hematológicos do trato gastrointestinal no grupo genérico. Os resultados deste estudo sugerem que o perfil da resposta dos pacientes adultos portadores de LMC-FC em uso de imatinibe 400 mg/dia em sua apresentação genérica se equipara na primeira avaliação, e até ultrapassa, os resultados obtidos com a medicação de referência. Concluímos que inexistiu, nesta amostra, inferioridade de ação do medicamento em sua apresentação genérica.