Submitted by Francine Silva (francine.silva@unipampa.edu.br) on 2019-03-27T13:53:55Z No. of bitstreams: 1 Ancestralidade e demografia genética de uma amostra da população humana do Rio Grande do Sul.pdf: 850877 bytes, checksum: 04f5841bad6d5ec7f458676b481d270b (MD5) / Made available in DSpace on 2019-03-27T13:53:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ancestralidade e demografia genética de uma amostra da população humana do Rio Grande do Sul.pdf: 850877 bytes, checksum: 04f5841bad6d5ec7f458676b481d270b (MD5) Previous issue date: 2013-02-19 / Os marcadores mitocondriais (mtDNA) e cromossomo Y têm sido utilizados para avaliar o grau de miscigenação. No caso da América Latina, três estoques principais originaram a população atual: europeus, ameríndios e africanos. No Rio Grande do Sul além de portugueses e espanhóis, foi marcante a imigração de outros europeus, especialmente alemães e italianos. O presente trabalho busca avaliar a contribuição europeia, ameríndia e africana, para a formação da população gaúcha. Para isso foram utilizados os dois sistemas uniparentais e sobrenomes dos indivíduos. Foram analisados 190 voluntários, nascidos nas sete mesorregiões que compõem o Rio Grande do Sul, dos quais se coletou uma amostra de sangue. Observou-se uma elevada frequência de contribuição europeia (87% no cromossomo Y e 76% no mtDNA), condizente com a vinda de casais de imigrantes portugueses, alemães e italianos. Os dados de sobrenomes demonstram também serem estes os sobrenomes mais encontrados na população gaúcha. / Mitochondrial markers (mtDNA) and Y chromosome have been used to assess degree of miscigenation. In case of Latin America, main three stocks generated current population: Europeans, Amerindians and Africans. In Rio Grande do Sul as well as Portuguese and Spanish, was significant immigration from other European, especially Germans and Italians. This study aims to evaluate the European, Amerindian and African contribution to formation of gaucho population. For this we used the two uniparental systems and surnames of individuals. Has been analysed 190 volunteers, borned in the seven mesoregions has compound Rio Grande do Sul, those colected a blood sample. It was observed that a high frequency of European contribution (87% on the Y chromosome and 76% in mtDNA), consistent with the couple’s coming of Portuguese immigrants, Germans and Italians. Surnames’ data demonstrate also these surnames are most commonly found in gaucho population.

Em abelhas, como nos demais himenópteros, a haplodiploidia e o mecanismo de determinação do sexo restringem o tamanho efetivo da população. Ademais, a nidificação próxima ao sítio natal pelas fêmeas das espécies solitárias restringe o fluxo gênico materno e causa alta viscosidade populacional. Centris é um gênero de abelhas solitárias da tribo Centridini, encontradas em distintos locais, como matas contínuas ou fragmentos florestais, bem como em ambientes urbanos; as espécies C. analis e C. tarsata se destacam no gênero pela abundância com que são encontradas nestas localidades. São abelhas poliléticas ou generalistas na coleta de pólen e nidificam em cavidades pré-existentes. Em razão de seu porte médio, presume-se que não apresentem alta capacidade de dispersão. Fêmeas de algumas espécies do gênero apresentam comportamento filopátrico. Estes dados nos levam a supor que espécies com traços biológicos similares tenham suas populações naturalmente estruturadas (subdivididas). Para testar esta hipótese, foram analisadas algumas regiões do genoma mitocondrial (DNAmt) de abelhas Centridini residentes em áreas urbanas. As duas subunidades da citocromo c oxidase (COI e COII), bem como o RNA transportador de leucina (RNAtLeu), apresentaram baixo nível de variação intra-específica, e a dificuldade em amplificar estas regiões para uma das espécies impediu a utilização destas regiões para análises populacionais. Desta forma, foram selecionadas duas regiões gênicas com taxas de variação intra-específicas distintas, o gene citocromo b (cytb) e a subunidade maior do DNA ribossômico (16S). Por ser uma molécula de herança materna, a análise destas regiões gênicas nos permitiu obter informações a respeito de colonização e o número de linhagens maternas. Os resultados deste trabalho sugerem que as populações de Centris tarsata e Centris trigonoides apresentam baixa e moderada estruturação, respectivamente. Para C. analis, a espécie mais bem amostrada, o excesso de picos duplos apresentados nos eletroferogramas dificultou a interpretação dos resultados. Foi possível ainda verificar diferenças na distribuição haplotípica de machos e fêmeas de C. tarsata, sugerindo a ocorrência de uma dispersão enviesada para machos, caracterizando uma dispersão sexo-assimétrica. / In bees, as in other hymenopterans, the haplodiploidy and mechanism of sex determination constrain the effective population size. Moreover, the nesting close to home site by the females of solitary species restricts maternal gene flow and causes high population viscosity. Centris is a genus of solitary bees of the tribe Centridini found in different locations, such as continuous forests or forest fragments, as well as in urban environments; the species C. analis and C. tarsata stand out in the genre for the abundance that are found in these locations. They are polyletics bees, or generalists in collecting pollen, and nest in cavities pre-existing. In reason of its medium size, it is presumed that do not present high dispersal capacity. How some species of the genus are phylopatric, we presume that other also presenting similar behavior. These data lead us to suppose that species with similar traits have their populations naturally structured (subdivided). To test this hypothesis, we analyzed urban populations of four species of Centris for some regions of mitochondrial genome (mtDNA). The two subunits of cytochrome c oxidase (COI and COII) and the tRNA leucine (tRNALeu) showed a low level of intraspecific variation, and the difficulty to amplify those regions for one species prevented the use of these regions to population analysis. Thus, we selected two gene regions with distinct rates of intra-specific variation, the gene cytochrome b (cytb) and the large subunit ribosomal DNA (16S). As a molecule maternally inherited, the analysis of the mitochondrial genes enabled us to obtain informations about colonization through the number of maternal lineages. Our results suggest that Centris tarsata and Centris trigonoides populations exhibit low and moderate genetic structuring, respectively. In C. analis, the species most well sampled, the excess of double peaks showed in the electropherograms difficults the interpretation of results. Also, for the species C. tarsata was possible to verify differences between males and females, suggesting the occurrence of a male skewed dispersion and an asymmetrical dispersion.

Orientador: Daisy Maria Fávero Salvadori / Resumo: A cardiotoxicidade induzida pela doxorrubicina (DOX), antraciclina isolada da actinobacteria Streptomyces peucetius e amplamente utilizada na terapia antineoplásica, corresponde a um dos mais importantes eventos patofisiológicos que limitam sua aplicação clínica. No entanto, não são completamente conhecidos todos os mecanismos envolvidos nessa toxicidade, o que diminui as possiblidades de intervenção e a redução dos efeitos colaterais para os pacientes sob tratamento. Uma das hipósteses é que os aldeídos gerados pela ação da DOX atuam sobre membranas mitocondriais, alterando o estado redox e formando adutos com proteínas, os quais prejudicam o correto funcionamento da organela. Atividades deletérias da DOX sobre outros componentes celulares, como, por exemplo, os ácidos ribonucleicos, são, também, possíveis mecanismos de toxicidade do antineoplásico. Várias estratégias têm sido utilizadas para minimizar os efeitos adversos da DOX. Uma delas, é a busca por compostos que possam proteger as células da ação citotóxica. Nesse sentido, a Alda-1, pertencente ao grupo das chaperonas e agonista da enzima aldeído desidrogenase mitocondrial (ALDH2), vem sendo testada com o objetivo de reduzir os efeitos adversos dos metabólitos e radicais gerados pelo antineoplásico. Para investigar outros possíveis mecanismos de ação da DOX e o efeito cardiprotetor da Alda-1, este estudo foi delineado utilizando duas abordagens distintas: experimentos in vivo, com ratos Wistar machos submetidos a trata... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The cardiotoxicity induced by doxorubicin (DOX), anthracycline isolated from the actinobacteria Streptomyces peucetius, and widely used as an antineoplastic drug, is one of the most important pathophysiological events that limit its clinical application. However, all the mechanisms involved in this toxicity are not fully understood. One hypothesis is that the aldehydes generated by DOX act on mitochondrial membranes, modifying the redox state and proting adducts with proteins. DOX activities on other cellular components, such as ribonucleic acids, are also possible mechanisms of toxicity. Several strategies have been used to reduce the DOX adverse effects. One of them is the identification of compounds that can protect cells against cytotoxic. Alda-1, which belongs to a group of chaperones and is an agonist of the mitochondrial aldehyde dehydrogenase (ALDH2), has been tested to reduce the adverse effects of metabolites and radicals generated by DOX. To investigate other possible DOX mechanisms of action, and the cardioprotective activity of Alda-1, this study was designed using two different approaches: in vivo, with male Wistar rats submitted to acute and chronic treatments; and, in vitro, in mice fibroblasts and cybrids with ND5 (gene that encodes the mitochondrial Complex I subunit) mitochondrial gene heteroplasmy. The expression profiling of genes related to beta oxidation pathways, Bax, Bcl-2, C1QBP, ALDH2 and miR34a microRNA (ALDH2 expression regulator), and the lipoper... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Estudos citogenéticos e moleculares realizados em 116 exemplares de lagartos do gênero Enyalius, provenientes de 58 localidades do Brasil, revelam grande variação cariotípica (2n=36 a 2n=46) e significativa diversidade de espécies. Segundo a última grande revisão, o gênero Enyalius estaria composto por seis espécies, duas delas politípicas: E. bilineatus, E. brasiliensis (E. b. boulengeri e E. b. brasiliensis), E. catenatus (E. c. catenatus, E. c. bibroni e E. c. pictus), E. iheringii, E. leechii e E. perditus. A partir de reconstruções filogenéticas utilizando seqüências combinadas de regiões parciais dos genes mitocondriais cyt b, ND4 e16S e do gene nuclear c-mos, com os métodos de máxima parcimônia, máxima verossimilhança e inferência bayesiana, é proposta uma hipótese filogenética para o gênero. Dois grandes clados são observados: clado 1 composto pelas espécies E. brasiliensis, E. iheringii e E. perditus e o clado 2 formado por E. bibroni, E. bilineatus, E. catenatus, E. leechii, E. pictus e três novas espécies. Delimitando geograficamente a ocorrência desses 2 clados está o Rio Doce: ao sul deste está o clado 1 e ao norte, o clado 2. Os rios Jequitinhonha e o Rio São Francisco também delimitam a ocorrência das espécies E. pictus e E. catenatus, respectivamente. De acordo com essa filogenia molecular, associada a dados morfológicos, o gênero Enyalius está composto de, pelo menos, 11 espécies, considerando as subespécies de E. catenatus como espécies válidas e as populações de Mucugê (BA), Serra da Jibóia (BA) e Ibateguara e São José da Laje (AL) como três espécies novas. Resultados cariotípicos inéditos são apresentados para duas espécies deste gênero: E. pictus (2n=36, 12M+24m) e a espécie nova de Mucugê (BA), com o surpreendente número diplóide 2n=46, 22M+24m. Este cariótipo é muito distinto da maioria das espécies de Enyalius, sendo composto por 22 macrocromossomos acrocêntricos e 24 microcromossomos. / Cytogenetic and molecular studies were performed in 116 lizard of the genus Enyalius, from 58 localities of Brasil. A large karyotype variability with diploid number ranging from 2n=36 to 2n=46 and a conspicuous diversity of species were detected. Based on the last major revision on the genus, six species, two of the them with subspecies, were recognized: E. bilineatus, E. brasiliensis (E. b. boulengeri and E. b. brasiliensis), E. catenatus (E. c. catenatus, E. c. bibroni and E. c. pictus), E. iheringii, E. leechii and E. perditus. Here, a molecular phylogeny was reconstructed for the genus using mitochondrial (cytochrome b, ND4 and 16S) and nuclear (c-mos) DNA sequences. Maximum parsimony and maximum likelihood criteria, as well as Bayesian analyses, were carried out on separate and combined sequences. According to this hypothesis, the species of Enyalius are grouped into two major clades: clade 1 assembling E. brasiliensis, E. iheringii and E. perditus, and clade 2 that includes E. bibroni, E. bilineatus, E. catenatus, E. leechii, E. pictus and three new species. The geographical distribution of these two clades coincides with the limits of Rio Doce at south (clade 1) and north (clade 2). The Jequitinhonha and São francisco rivers also delimit the occurrence of E. pictus and E. catenatus respectively. Based on our phylogenetic hypothesis and morphological data, we propose that the genus Enyalius is actually comprised of, at least, 11 species. Chromosomal results for two species are here described for the first time: E. pictus (2n=36, 12M+24m) and a new species from Mucugê (BA) that present a surprising diploid number 2n=46, 22M+24m. This karyotype with 2n=46 formed by 22 acrocentric macrochromosomes is very distinct from those found in most species of the genus.

As deficiências da proteína trifuncional mitocondrial (MTP) e da desidrogenase de acil-CoA de cadeia longa hidroxilada (LCHAD) são defeitos hereditários da β-oxidação de ácidos graxos. Pacientes afetados por essas deficiências apresentam acúmulo de 3-hidroxiácidos de cadeia longa, como os ácidos 3-hidroxidodecanóico (3HDA), 3-hidroxitetradecanóico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico (3HPA) em tecidos e líquidos biológicos. A apresentação clínica é caracterizada por encefalopatia com coma, letargia, convulsão, retardo mental e hipotonia, além de disfunção hepática, cardiomiopatia, fraqueza muscular e retinopatia. Considerando que a fisiopatologia dos sintomas neurológicos dessas doenças ainda não está bem estabelecida e que tem sido levantada a hipótese de que os ácidos graxos acumulados nessas doenças possam exercer efeitos tóxicos, o presente trabalho se propôs a investigar os efeitos in vitro dos ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA sobre parâmetros de estresse oxidativo e da homeostase mitocondrial em cérebro de ratos de 30 dias de vida. Inicialmente, observamos que o 3HDA, 3HTA e 3HPA induziram um aumento na peroxidação lipídica evidenciado por um aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Os ácidos 3HTA e 3HPA também causaram dano oxidativo proteico, visto que aumentaram o conteúdo de carbonilas e diminuíram o conteúdo de grupamentos sulfidrila. Além disso, 3HTA e 3HPA diminuíram os níveis de glutationa reduzida (GSH), o principal antioxidante não-enzimático presente no cérebro, sem no entanto, alterar a produção de nitratos e nitritos. O ácido 3HTA apresentou o efeito mais pronunciado nos parâmetros testados e a adição dos antioxidantes e sequestradores de radicais livres trolox e deferoxamina (DFO) foram capazes de prevenir parcialmente o dano oxidativo lipídico, ao passo que DFO preveniu totalmente a redução dos níveis de GSH. Além disso, os ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA aumentaram o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuíram os valores do índice de controle respiratório. 3HTA e 3HPA também diminuíram o potencial de membrana e o conteúdo de equivalentes reduzidos de NAD(P)H na matriz mitocondrial, sugerindo um efeito desacoplador da fosforilação oxidativa. Além disso, o 3HTA diminuiu o estado 3 da respiração e a razão ADP/O quando utilizado glutamato/malato como substrato, mas não quando utilizado piruvato/malato ou sucinato como substratos, sugerindo que o transporte de glutamato e/ou sua oxidação possam estar sendo inibidos pela presença deste ácido. Nossos resultados sugerem que os ácidos graxos acumulados na deficiências da LCHAD e MTP induzem estresse oxidativo e comprometem a homeostase mitocondrial, mecanismos que potencialmente podem estar envolvidos no dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados por essas deficiências. / Mitochondrial trifunctional protein (MTP) and isolated long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiencies are inborn errors of metabolism of fatty acid oxidation. Affected patients present blood and tissue accumulation of the 3-hydroxy fatty acids, such as 3-hydroxydodecanoic (3HDA), 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids. Clinical presentation is characterized by a encephalopathic crises with coma, lethargy, seizures, mental retardation and hypotonia, besides hepatic disfunction, cardiomiopathy and muscle weakness and retinopathy. Considering that the pathophisiology of the neurological damage found in LCHAD/MTP-deficient patients is not yet clear, and it has been proposed that accumulating fatty acids could present toxic effects, the aim of the present work was to investigate the in vitro effects of 3HDA, 3HTA and 3HPA on oxidative stress parameters and on mitochondrial homeostasis in 30-day-old rat brain. It was first verified that 3HDA, 3HTA and 3HPA significantly induced lipid peroxidation, as determined by increased thiobarbituric acid-reactive substances levels. In addition, carbonyl formation was significantly increased by 3HTA and 3HPA, whereas sulfhydryl content was decreased, which indicates that these fatty acids elicit protein oxidative damage. 3HTA and 3HPA also diminished the reduced glutathione (GSH) levels, the main brain non-enzymatic antioxidant defense, without affecting nitrate and nitrite production. Finally, we observed that 3HTA elicited the most pronounced effects on the tested parameters and the addition of antioxidants and free radical scavengers trolox and deferoxamine (DFO) were able to partially prevent lipid oxidative damage, whereas DFO fully prevented the reduction on GSH levels induced by this fatty acid. We also found that 3HDA, 3HTA and 3HPA markedly increased state 4 respiration and diminished the respiratory control ratio. 3HTA and 3HPA also diminished the mitochondrial membrane potential and the matrix NAD(P)H levels, suggesting an uncoupler effect of oxidative fosforilation . In addition, 3HTA decreased state 3 of respiration and ADP/O ratio, when used glutamate/malate as substrates, but not when piruvate/malate or succinate were used as substrates, suggesting that glutamate transport and/or oxidation could be inhibited by this fatty acid. Taken together, these results suggest that the fatty acids accumulating in LCHAD/MTP induce oxidative stress and impair mitochondrial homeostasis, mechanisms that potentially may be involved on the neurological damage found in affected patientes.

Estudos citogenéticos e moleculares realizados em 116 exemplares de lagartos do gênero Enyalius, provenientes de 58 localidades do Brasil, revelam grande variação cariotípica (2n=36 a 2n=46) e significativa diversidade de espécies. Segundo a última grande revisão, o gênero Enyalius estaria composto por seis espécies, duas delas politípicas: E. bilineatus, E. brasiliensis (E. b. boulengeri e E. b. brasiliensis), E. catenatus (E. c. catenatus, E. c. bibroni e E. c. pictus), E. iheringii, E. leechii e E. perditus. A partir de reconstruções filogenéticas utilizando seqüências combinadas de regiões parciais dos genes mitocondriais cyt b, ND4 e16S e do gene nuclear c-mos, com os métodos de máxima parcimônia, máxima verossimilhança e inferência bayesiana, é proposta uma hipótese filogenética para o gênero. Dois grandes clados são observados: clado 1 composto pelas espécies E. brasiliensis, E. iheringii e E. perditus e o clado 2 formado por E. bibroni, E. bilineatus, E. catenatus, E. leechii, E. pictus e três novas espécies. Delimitando geograficamente a ocorrência desses 2 clados está o Rio Doce: ao sul deste está o clado 1 e ao norte, o clado 2. Os rios Jequitinhonha e o Rio São Francisco também delimitam a ocorrência das espécies E. pictus e E. catenatus, respectivamente. De acordo com essa filogenia molecular, associada a dados morfológicos, o gênero Enyalius está composto de, pelo menos, 11 espécies, considerando as subespécies de E. catenatus como espécies válidas e as populações de Mucugê (BA), Serra da Jibóia (BA) e Ibateguara e São José da Laje (AL) como três espécies novas. Resultados cariotípicos inéditos são apresentados para duas espécies deste gênero: E. pictus (2n=36, 12M+24m) e a espécie nova de Mucugê (BA), com o surpreendente número diplóide 2n=46, 22M+24m. Este cariótipo é muito distinto da maioria das espécies de Enyalius, sendo composto por 22 macrocromossomos acrocêntricos e 24 microcromossomos. / Cytogenetic and molecular studies were performed in 116 lizard of the genus Enyalius, from 58 localities of Brasil. A large karyotype variability with diploid number ranging from 2n=36 to 2n=46 and a conspicuous diversity of species were detected. Based on the last major revision on the genus, six species, two of the them with subspecies, were recognized: E. bilineatus, E. brasiliensis (E. b. boulengeri and E. b. brasiliensis), E. catenatus (E. c. catenatus, E. c. bibroni and E. c. pictus), E. iheringii, E. leechii and E. perditus. Here, a molecular phylogeny was reconstructed for the genus using mitochondrial (cytochrome b, ND4 and 16S) and nuclear (c-mos) DNA sequences. Maximum parsimony and maximum likelihood criteria, as well as Bayesian analyses, were carried out on separate and combined sequences. According to this hypothesis, the species of Enyalius are grouped into two major clades: clade 1 assembling E. brasiliensis, E. iheringii and E. perditus, and clade 2 that includes E. bibroni, E. bilineatus, E. catenatus, E. leechii, E. pictus and three new species. The geographical distribution of these two clades coincides with the limits of Rio Doce at south (clade 1) and north (clade 2). The Jequitinhonha and São francisco rivers also delimit the occurrence of E. pictus and E. catenatus respectively. Based on our phylogenetic hypothesis and morphological data, we propose that the genus Enyalius is actually comprised of, at least, 11 species. Chromosomal results for two species are here described for the first time: E. pictus (2n=36, 12M+24m) and a new species from Mucugê (BA) that present a surprising diploid number 2n=46, 22M+24m. This karyotype with 2n=46 formed by 22 acrocentric macrochromosomes is very distinct from those found in most species of the genus.

Está bem definido que fatores genéticos têm um papel importante no desenvolvimento do diabetes mellitus (DM) tipo 2 e de suas complicações crônicas. Sendo assim, grandes esforços têm sido feitos para identificar os genes associados com estas doenças. A proteína desacopladora 2 (UCP2) é expressa em diversos tecidos e atua na proteção contra o estresse oxidativo e na regulação da secreção de insulina pelas células-beta pancreáticas e do metabolismo dos ácidos graxos, mecanismos associados com o DM tipo 2, bem como com suas complicações crônicas. Dessa forma, o gene UCP2 é um gene candidato ao desenvolvimento destas doenças. Recentemente, nós relatamos que o haplótipo -866A / 55Val / Ins, constituído pelos polimorfismos - 866G/A, Ala55Val e Ins/Del no gene UCP2, foi associado com risco aumentado para retinopatia diabética (RD) proliferativa, a forma mais severa de RD, em pacientes com DM tipo 1 e 2. No presente estudo, nós avaliamos os efeitos deste haplótipo, bem como dos polimorfismos que o constituem, na expressão do gene UCP2 na retina humana. Nós também avaliamos a expressão do gene MnSOD2, o qual codifica uma enzima antioxidante, de acordo com os diferentes haplótipos e polimorfismos estudados no gene UCP2. Este estudo transversal incluiu 188 doadores cadavéricos de córneas, todos nãodiabéticos. Em um subgrupo de 91 amostras de retina diferenciadas de acordo com a presença do haplótipo mutado (-866A / 55Val / Ins) e dos alelos de risco dos três polimorfismos estudados, as concentrações dos RNAm da UCP2 e MnSOD2 foram avaliadas pela técnica de PCR em tempo real. Portadores do haplótipo mutado (homozigotos + heterozigotos) apresentaram uma menor expressão do RNAm da UCP2 do que portadores do haplótipo de referência (8,4 ± 7,6 vs. 18,8 ± 23,7 unidades arbitrárias; p = 0,046). De acordo com este resultado, os níveis do RNAm da UCP2 também foram menores em portadores dos alelos de risco -866A e 55Val quando comparados aos portadores dos outros genótipos destes polimorfismos (p = 0,010 e p = 0,003, respectivamente). A expressão do gene UCP2 não diferiu significativamente entre portadores do alelo de risco Ins e portadores do genótipo Del/Del (p = 0,556). Indivíduos portadores do haplótipo heterozigoto (-866A 55Val Ins / -866G 55Ala Del), bem como heterozigotos para os três polimorfismos estudados, apresentaram uma expressão gênica aumentada de MnSOD2 (p < 0,050). Nossos resultados indicam que a presença do haplótipo mutado -866A / 55Val / Ins está associada com expressão gênica diminuída de UCP2 na retina humana. Possivelmente, os níveis de expressão gênica da MnSOD2 na retina podem influenciar o efeito da UCP2 na patogênese da RD proliferativa. Entretanto, estudos funcionais adicionais serão necessários para confirmar se mudanças na expressão do gene UCP2 também ocasionam mudanças nos níveis de proteína. / It is well established that genetic factors play an important role in the development of type 2 diabetes mellitus (DM) and its chronic complications. Therefore, grate efforts have been made to identify genes associated with these diseases. Uncoupling protein 2 (UCP2) is expressed in several tissues, and acts in the protection against oxidative stress and in the regulation of both insulin secretion by pancreatic beta-cells and fatty acid metabolism, mechanisms associated with type 2 DM pathogenesis as wells as with its chronic complications. So, UCP2 gene is a candidate gene to the development of these diseases. Recently, we reported that the -866A / 55Val / Ins haplotype (constituted by the -866G/A, Ala55Val and Ins/Del polymorphisms in the UCP2 gene) was associated with increased risk for proliferative diabetic retinopathy (DR), which is the most severe form of DR, in both type 1 and type 2 DM patients. In the present study, we evaluated the effects of this haplotype as well as the polymorphisms which constitute it on UCP2 gene expression in human retina. We also evaluated MnSOD2 gene expression, which codifies an antioxidant enzyme, accordingly to different haplotypes and studied polymorphisms in the UCP2 gene. This cross-sectional study included 188 cadaveric cornea donors, all nondiabetic. In a subset of 91 retinal samples differentiated according to the presence of the mutated haplotype (-866A / 55Val / Ins) and risk alleles of the three studied polymorphisms, UCP2 and MnSOD2 mRNA concentrations were measured by real-time PCR technique. Mutated haplotype carriers (homozygous + heterozygous) presented a lower UCP2 mRNA expression than reference haplotype carriers (8.4 ± 7.6 vs. 18.8 ± 23.7 arbitrary units; P = 0.046). Accordingly, UCP2 mRNA levels were also lower in -866A and 55Val allele carriers when compared with carriers of other genotypes of these polymorphisms (P = 0.010 and P = 0.003, respectively). UCP2 gene expression did not differ between Ins allele carriers and Del/Del carries (P = 0.556). Subjects carrying the heterozygous haplotype (-866A 55Val Ins / -866G 55Ala Del) as well as heterozygous for the three studied polymorphisms showed increased MnSOD2 gene expression (P < 0.050). Our results indicate that the presence of the -866A / 55Val / Ins haplotype is associated with decreased UCP2 mRNA expression in human retina. Possibly, MnSOD2 expression levels in retina might influence the UCP2 effect on the pathogenesis of proliferative DR. However, further functional studies will be necessary to confirm if changes on UCP2 gene expression also generate changes on protein levels.

As deficiências da proteína trifuncional mitocondrial (MTP) e da desidrogenase de acil-CoA de cadeia longa hidroxilada (LCHAD) são defeitos hereditários da β-oxidação de ácidos graxos. Pacientes afetados por essas deficiências apresentam acúmulo de 3-hidroxiácidos de cadeia longa, como os ácidos 3-hidroxidodecanóico (3HDA), 3-hidroxitetradecanóico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico (3HPA) em tecidos e líquidos biológicos. A apresentação clínica é caracterizada por encefalopatia com coma, letargia, convulsão, retardo mental e hipotonia, além de disfunção hepática, cardiomiopatia, fraqueza muscular e retinopatia. Considerando que a fisiopatologia dos sintomas neurológicos dessas doenças ainda não está bem estabelecida e que tem sido levantada a hipótese de que os ácidos graxos acumulados nessas doenças possam exercer efeitos tóxicos, o presente trabalho se propôs a investigar os efeitos in vitro dos ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA sobre parâmetros de estresse oxidativo e da homeostase mitocondrial em cérebro de ratos de 30 dias de vida. Inicialmente, observamos que o 3HDA, 3HTA e 3HPA induziram um aumento na peroxidação lipídica evidenciado por um aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Os ácidos 3HTA e 3HPA também causaram dano oxidativo proteico, visto que aumentaram o conteúdo de carbonilas e diminuíram o conteúdo de grupamentos sulfidrila. Além disso, 3HTA e 3HPA diminuíram os níveis de glutationa reduzida (GSH), o principal antioxidante não-enzimático presente no cérebro, sem no entanto, alterar a produção de nitratos e nitritos. O ácido 3HTA apresentou o efeito mais pronunciado nos parâmetros testados e a adição dos antioxidantes e sequestradores de radicais livres trolox e deferoxamina (DFO) foram capazes de prevenir parcialmente o dano oxidativo lipídico, ao passo que DFO preveniu totalmente a redução dos níveis de GSH. Além disso, os ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA aumentaram o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuíram os valores do índice de controle respiratório. 3HTA e 3HPA também diminuíram o potencial de membrana e o conteúdo de equivalentes reduzidos de NAD(P)H na matriz mitocondrial, sugerindo um efeito desacoplador da fosforilação oxidativa. Além disso, o 3HTA diminuiu o estado 3 da respiração e a razão ADP/O quando utilizado glutamato/malato como substrato, mas não quando utilizado piruvato/malato ou sucinato como substratos, sugerindo que o transporte de glutamato e/ou sua oxidação possam estar sendo inibidos pela presença deste ácido. Nossos resultados sugerem que os ácidos graxos acumulados na deficiências da LCHAD e MTP induzem estresse oxidativo e comprometem a homeostase mitocondrial, mecanismos que potencialmente podem estar envolvidos no dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados por essas deficiências. / Mitochondrial trifunctional protein (MTP) and isolated long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiencies are inborn errors of metabolism of fatty acid oxidation. Affected patients present blood and tissue accumulation of the 3-hydroxy fatty acids, such as 3-hydroxydodecanoic (3HDA), 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids. Clinical presentation is characterized by a encephalopathic crises with coma, lethargy, seizures, mental retardation and hypotonia, besides hepatic disfunction, cardiomiopathy and muscle weakness and retinopathy. Considering that the pathophisiology of the neurological damage found in LCHAD/MTP-deficient patients is not yet clear, and it has been proposed that accumulating fatty acids could present toxic effects, the aim of the present work was to investigate the in vitro effects of 3HDA, 3HTA and 3HPA on oxidative stress parameters and on mitochondrial homeostasis in 30-day-old rat brain. It was first verified that 3HDA, 3HTA and 3HPA significantly induced lipid peroxidation, as determined by increased thiobarbituric acid-reactive substances levels. In addition, carbonyl formation was significantly increased by 3HTA and 3HPA, whereas sulfhydryl content was decreased, which indicates that these fatty acids elicit protein oxidative damage. 3HTA and 3HPA also diminished the reduced glutathione (GSH) levels, the main brain non-enzymatic antioxidant defense, without affecting nitrate and nitrite production. Finally, we observed that 3HTA elicited the most pronounced effects on the tested parameters and the addition of antioxidants and free radical scavengers trolox and deferoxamine (DFO) were able to partially prevent lipid oxidative damage, whereas DFO fully prevented the reduction on GSH levels induced by this fatty acid. We also found that 3HDA, 3HTA and 3HPA markedly increased state 4 respiration and diminished the respiratory control ratio. 3HTA and 3HPA also diminished the mitochondrial membrane potential and the matrix NAD(P)H levels, suggesting an uncoupler effect of oxidative fosforilation . In addition, 3HTA decreased state 3 of respiration and ADP/O ratio, when used glutamate/malate as substrates, but not when piruvate/malate or succinate were used as substrates, suggesting that glutamate transport and/or oxidation could be inhibited by this fatty acid. Taken together, these results suggest that the fatty acids accumulating in LCHAD/MTP induce oxidative stress and impair mitochondrial homeostasis, mechanisms that potentially may be involved on the neurological damage found in affected patientes.

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No. of bitstreams: 1 silvajunior_fc_me_sjrp.pdf: 4129284 bytes, checksum: 6fbd44eda2ee6b9b62753d8e00cd09a5 (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Heteroptera é uma Subordem da Ordem Hemiptera, que possui cerca de 40 mil espécies distribuídas em oitenta famílias, dentre elas está a família Pentatomidae que se destaca por ser uma das maiores famílias com cerca de 4.100 espécies, representando, aproximadamente, 11% do total de espécies de Heteroptera. As espécies de Pentatomidae Chinavia impicticornis, Edessa meditabunda, E. collaris e Thyanta perditor foram estudadas nesse trabalho devido ao sua importância econômica, tendo em vista que são espécies fitófagas que causam grandes perdas em diversas culturas. Os machos das espécies foram coletados na região de São José do Rio Preto, os testículos foram fixados e posteriormente processados para analise em microscopia eletrônica de transmissão, os blocos obtidos foram trimados, cortados, contrastados e analisados com microscópio eletrônico de transmissão Leo – Zeiss, do Centro de Microscopia e Microanálise (IBILCE-UNESP, São José do Rio Preto, SP) e com o microscópio eletrônico de transmissão Jeol JEM - 100 CXII da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP-USP). As eletromicrografias das espécies estudadas apresentaram características ultraestruturais semelhantes às encontradas para diversos indivíduos de diferentes ordens, dentre essas características estão a formação do acrossomo, a partir de uma grande vesícula secretada pelo complexo de Golgi e que se localiza na região apical/lateral do núcleo. O núcleo, também, sofre transformações semelhantes às relatadas para grande parte dos insetos passando de um estado grande e esférico com a cromatina dispersa para um estado pequeno e fusiforme e com a cromatina extremamente condensada. Outra estrutura observada foi o adjunto do centríolo que se mostrou uma estrutura eletrondensa na região basal do núcleo. Também foi observada a migração das mitocôndrias para um polo celular e sua posterior fusão formando o complexo mitocondrial ou “Nebenkern”, que, posteriormente, se divide formando os dois derivados mitocondriais simétricos, com a presença de estruturas paracristalinas em seu interior. O padrão de microtúbulos encontrado no axonema, para todas as espécies, foi de 9+9+2, típico de insetos, sendo formado entre os derivados mitocondriais e acompanhado por estes ao longo de quase toda sua extensão. Morfologicamente, os derivados mitocondriais são diferentes entre C. impicticornis, E. meditabunda, E. collaris e T. perditor onde foi possível notar que os derivados de C. impicticornis se apresentaram grandes e arredondados, E. meditabunda pequenos e arredondados, E. collaris alongados e com extremidades arredondadas e T. perditor pequenos com uma extremidade arredondada e a outra angular podendo estas diferenças morfológicas serem características interessantes para futuros estudos filogenéticos ou sistemáticos para o grupo. Portanto, podemos concluir que a maioria das características analisadas é semelhante entre os insetos, com exceção da morfologia dos derivados mitocondriais que são diferentes, até mesmo, entre as espécies da família Pentatomidae. / Heteroptera is a suborder of the Hemiptera order, which has approximately 40,000 species distributed in eighty families, among them is the Pentatomidae family that stands out for being one of the largest families with approximately 4,100, representing approximately 11% of the total species of Heteroptera. The species of Pentatomidae Chinavia impicticornis, Edessa meditabunda, E. collaris and Thyanta perditor were studied in this work because of their economic importance, given that they are phytophagous species that cause great losses in several crops. Males of the species were collected in the region of São José do Rio Preto, the testes were fixed and then processed for analysis by transmission electron microscopy, the obtained blocks were trimmed, cut, contrasted and analyzed with transmission electron microscope Leo - Zeiss, of the Centro de Microscopia e Microanálise (IBILCE-UNESP, São José do Rio Preto, SP) and the transmission electron microscope Jeol JEM - 100 CXII of Faculdade de Medicina of Ribeirão Preto (FMRP-USP). The species have similar ultrastructural characteristics to those found in many individuals of different orders, among these features is the acrosome formation from a large vesicle secreted by Golgi apparatus and located in the apical/lateral area of the nucleus. The nucleus also undergoes changes similar to those reported for most insects, passing of a great and spherical state with chromatin dispersed to a small and fusiform state and highly condensed chromatin. Another structure was observed the centriolar adjunct that showed electrodense structure in the basal region of the nucleus. We also observe the migration of mitochondria for the cell and its subsequent fusion was observed forming the mitochondrial complex or “Nebenkern”, which later splits to form two symmetrical mitochondrial derivatives, with the presence of paracrystalline structures inside. The pattern of microtubules found on the axonema, for all species was 9+9+2, typical of insects, being formed between the mitochondrial derivatives and accompanied by such over almost its entire length. Morphologically, the mitochondrial derivatives are different between C. impicticornis, E. meditabunda, E. collaris and T. perditor where it was possible to note that C. impicticornis derivatives showed large and rounded, E. meditabunda small and rounded, E. collaris elongated and rounded ends and T. perditor smaller with one rounded end and the other angled being able these morphological differences are interesting features for future phylogenetic or systematic studies for the group. Therefore, we can conclude that the analyzed characteristics are most similar among the insects, with the exception of the morphology of the mitochondrial derivatives which are different even among the species of the Pentatomidae family.

As deficiências da proteína trifuncional mitocondrial (MTP) e da desidrogenase de acil-CoA de cadeia longa hidroxilada (LCHAD) são defeitos hereditários da β-oxidação de ácidos graxos. Pacientes afetados por essas deficiências apresentam acúmulo de 3-hidroxiácidos de cadeia longa, como os ácidos 3-hidroxidodecanóico (3HDA), 3-hidroxitetradecanóico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico (3HPA) em tecidos e líquidos biológicos. A apresentação clínica é caracterizada por encefalopatia com coma, letargia, convulsão, retardo mental e hipotonia, além de disfunção hepática, cardiomiopatia, fraqueza muscular e retinopatia. Considerando que a fisiopatologia dos sintomas neurológicos dessas doenças ainda não está bem estabelecida e que tem sido levantada a hipótese de que os ácidos graxos acumulados nessas doenças possam exercer efeitos tóxicos, o presente trabalho se propôs a investigar os efeitos in vitro dos ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA sobre parâmetros de estresse oxidativo e da homeostase mitocondrial em cérebro de ratos de 30 dias de vida. Inicialmente, observamos que o 3HDA, 3HTA e 3HPA induziram um aumento na peroxidação lipídica evidenciado por um aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Os ácidos 3HTA e 3HPA também causaram dano oxidativo proteico, visto que aumentaram o conteúdo de carbonilas e diminuíram o conteúdo de grupamentos sulfidrila. Além disso, 3HTA e 3HPA diminuíram os níveis de glutationa reduzida (GSH), o principal antioxidante não-enzimático presente no cérebro, sem no entanto, alterar a produção de nitratos e nitritos. O ácido 3HTA apresentou o efeito mais pronunciado nos parâmetros testados e a adição dos antioxidantes e sequestradores de radicais livres trolox e deferoxamina (DFO) foram capazes de prevenir parcialmente o dano oxidativo lipídico, ao passo que DFO preveniu totalmente a redução dos níveis de GSH. Além disso, os ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA aumentaram o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuíram os valores do índice de controle respiratório. 3HTA e 3HPA também diminuíram o potencial de membrana e o conteúdo de equivalentes reduzidos de NAD(P)H na matriz mitocondrial, sugerindo um efeito desacoplador da fosforilação oxidativa. Além disso, o 3HTA diminuiu o estado 3 da respiração e a razão ADP/O quando utilizado glutamato/malato como substrato, mas não quando utilizado piruvato/malato ou sucinato como substratos, sugerindo que o transporte de glutamato e/ou sua oxidação possam estar sendo inibidos pela presença deste ácido. Nossos resultados sugerem que os ácidos graxos acumulados na deficiências da LCHAD e MTP induzem estresse oxidativo e comprometem a homeostase mitocondrial, mecanismos que potencialmente podem estar envolvidos no dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados por essas deficiências. / Mitochondrial trifunctional protein (MTP) and isolated long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiencies are inborn errors of metabolism of fatty acid oxidation. Affected patients present blood and tissue accumulation of the 3-hydroxy fatty acids, such as 3-hydroxydodecanoic (3HDA), 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids. Clinical presentation is characterized by a encephalopathic crises with coma, lethargy, seizures, mental retardation and hypotonia, besides hepatic disfunction, cardiomiopathy and muscle weakness and retinopathy. Considering that the pathophisiology of the neurological damage found in LCHAD/MTP-deficient patients is not yet clear, and it has been proposed that accumulating fatty acids could present toxic effects, the aim of the present work was to investigate the in vitro effects of 3HDA, 3HTA and 3HPA on oxidative stress parameters and on mitochondrial homeostasis in 30-day-old rat brain. It was first verified that 3HDA, 3HTA and 3HPA significantly induced lipid peroxidation, as determined by increased thiobarbituric acid-reactive substances levels. In addition, carbonyl formation was significantly increased by 3HTA and 3HPA, whereas sulfhydryl content was decreased, which indicates that these fatty acids elicit protein oxidative damage. 3HTA and 3HPA also diminished the reduced glutathione (GSH) levels, the main brain non-enzymatic antioxidant defense, without affecting nitrate and nitrite production. Finally, we observed that 3HTA elicited the most pronounced effects on the tested parameters and the addition of antioxidants and free radical scavengers trolox and deferoxamine (DFO) were able to partially prevent lipid oxidative damage, whereas DFO fully prevented the reduction on GSH levels induced by this fatty acid. We also found that 3HDA, 3HTA and 3HPA markedly increased state 4 respiration and diminished the respiratory control ratio. 3HTA and 3HPA also diminished the mitochondrial membrane potential and the matrix NAD(P)H levels, suggesting an uncoupler effect of oxidative fosforilation . In addition, 3HTA decreased state 3 of respiration and ADP/O ratio, when used glutamate/malate as substrates, but not when piruvate/malate or succinate were used as substrates, suggesting that glutamate transport and/or oxidation could be inhibited by this fatty acid. Taken together, these results suggest that the fatty acids accumulating in LCHAD/MTP induce oxidative stress and impair mitochondrial homeostasis, mechanisms that potentially may be involved on the neurological damage found in affected patientes.