Sympathetic nerve activity increases in the heart during cardiac failure. Here, we hypothesized that β1 integrins play a protective role in chronic β-adrenergic receptor-stimulated cardiac myocyte apoptosis and heart failure. l-isoproterenol (iso; 400 μg/kg per hour) was infused in a group of wild-type (WT) and β1 integrin heterozygous knockout (hKO) mice. Left ventricular structural and functional remodeling was studied at 7 and 28 days of iso-infusion. Western blot analysis demonstrated reduced β1 integrin levels in the myocardium of hKO-sham. Iso-infusion increased heart weight:body weight ratios in both groups. However, the increase was significantly higher in WT-iso. M-mode echocardiography indicated increased left ventricular end-diastolic diameter, percentage of fractional shortening, and ejection fraction in the WT-iso group. The percentage of fractional shortening and ejection fraction were significantly lower in hKO-iso versus hKO-sham and WT-iso. Peak left ventricular developed pressure and left ventricular end-diastolic pressure measured using Langendorff-perfusion analyses were significantly higher in the WT-iso group (P<0.05 versus WT-sham and hKO-Iso). The number of TUNEL-positive myocytes was significantly higher in hKO-iso hearts 7 and 28 days after iso-infusion. The increase in myocyte cross-sectional area and fibrosis was higher in the WT-iso group. Matrix metalloproteinase-9 protein levels were significantly higher in WT-iso, whereas matrix metalloproteinase-2 levels were increased in hKO-iso hearts. Iso-infusion increased phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2 in both groups. The increase in c-Jun N-terminal kinase phosphorylation was significantly higher in hKO-iso (P<0.001 versus WT-iso). Thus, β1 integrins play a crucial role in β-adrenergic receptor-stimulated myocardial remodeling with effects on cardiac myocyte hypertrophy, apoptosis, and left ventricular function.

Bone Cancer Research Trust / The full text will be available at the end of the embargo: 6th October 2027

No / Vascular disrupting agents (VDA) offer a strategy to starve solid tumors of nutrients and oxygen concomitant with tumor shrinkage. Several VDAs have progressed into early clinical trials, but their therapeutic value seems to be compromised by systemic toxicity. In this report, we describe the design and characterization of a novel VDA, ICT2588, that is nontoxic until activated specifically in the tumor by membrane-type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP). HT1080 cancer cells expressing MT1-MMP were selectively chemosensitive to ICT2588, whereas MCF7 cells that did not express MT1-MMP were nonresponsive. Preferential hydrolysis of ICT2588 to its active metabolite (ICT2552) was observed in tumor homogenates of HT1080 relative to MCF7 homogenates, mouse plasma, and liver homogenate. ICT2588 activation was inhibited by the MMP inhibitor ilomastat. In HT1080 tumor-bearing mice, ICT2588 administration resulted in the formation of the active metabolite, diminution of tumor vasculature, and hemorrhagic necrosis of the tumor. The antitumor activity of ICT2588 was superior to its active metabolite, exhibiting reduced toxicity, improved therapeutic index, enhanced pharmacodynamic effect, and greater efficacy. Coadministration of ICT2588 with doxorubicin resulted in a significant antitumor response (22.6 d growth delay), which was superior to the administration of ICT2588 or doxorubicin as a single agent, including complete tumor regressions. Our findings support the clinical development of ICT2588, which achieves selective VDA targeting based on MT-MMP activation in the tumor microenvironment.

Les métalloproteases matricielles (MMPs) appartiennent à une famille d'endopéptidases dépendantes du zinc, présentent sous forme secrétée ou membranaire (MT-MMP) et qui jouent un rôle fondamental dans la signalisation cellulaire. L'activité des MMPs est régulée par leur inhibiteurs endogènes, les inhibiteurs tissulaires des MMPs (TIMPs). Le système MMP/TIMP régule les interactions cellule-cellule et cellule-matrice extra cellulaire et module la motilité cellulaire par clivage protéolytique des composants de la matrice extra cellulaire aussi bien lors de processus physiologiques que dans des situations pathologiques.Dans un premier temps, nous avons mis en évidence le rôle de TIMP-1 dans la modulation de la croissance neuritique et la morphologie neuronale, via l'inhibition de MMP-2 et non de MMP-9. souches de la muqueuse olfactive (OE-MSCs). Nous montrons dans cette étude que les gélatinases MMP-2 et MMP-9 ainsi que la MMP membranaire MT1-MMP, sont impliquées dans la migration des OE-MSCs. Nous montrons également que les gélatinases sont probablement impliquées dans les propriétés neurotrophiques des OE-MSCs et des cellules engainantes olfactives.L'ensemble de ces résultats apporte de nouveaux éléments fondamentaux, dans la compréhension du rôle du système MMP/TIMP dans les processus post-lésionnels qui ont lieu au sein du système nerveux central. / The matrix metalloproteinases (MMPs) belong to a growing family of Zn2+-dependent endopeptidases, secreted or membrane-bound (MT-MMP), which play a fundamental role in the cell signalling. The activity of the MMPs is regulated by their endogenous inhibitors, the tissue inhibitors of MMPs (TIMPs). The MMP / TIMP system regulates the cell-cell and cell-extracellular matrix interactions and modulates the cellular motility through the cleavage of protein components of the extracellular matrix, as well during physiological and pathological conditions.Our results suggest that TIMP-1 is implicated in the modulation of the neurite outgrowth and morphology of cortical neurons through the inhibition at least in part, of MMP-2 and not MMP-9. Afterward, we study of the system MMP / TIMP in the migration of the stem cells of olfactory ectomesenchymal stem cells (OE-MSCs). We show that gelatinases MMP-2 and MMP-9 as well as MT1-MMP, are involved in OE-MSCs migration. We also show that gelatinases are probably involved in neurotrophic properties of the OE-MSCs and olfactory ensheathing cells.Altogether, these results provide new evidences on the role of MMP/TIMP system in central nervous system post-lesional processes.

Les travaux réalisés portent sur la conception de ligands protéiques capables de cibler le site catalytique des métalloprotéases matricielles (MMPs) grâce à une méthode d’ingénierie développée au laboratoire qui repose sur le greffage de motifs fonctionnels. Le motif fonctionnel choisi correspond aux 4 résidus N-terminaux du TIMP-2, un inhibiteur naturel des MMPs. Des plates-formes protéiques possédant des motifs d’acides aminés dans une topologie similaire à celle du motif de référence dans le complexe TIMP-2/MMP-14 ont été identifiées par criblage systématique de la PDB à l’aide du logiciel STAMPS (Search for Three-dimensional Atom Motif in Protein Structure). Dix candidats ligands satisfaisant les contraintes topologiques, stériques et de similarité électrostatique avec le ligand naturel TIMP-2 ont été sélectionnés. Ces ligands ont été produits par synthèse chimique ou par voie recombinante puis leur capacité à inhiber une série de 6 MMPs a été évaluée. Les résultats indiquent que tous les ligands protéiques conçus in silico sont capables de lier les sites catalytiques des MMPs avec des constantes d’association allant de 450 nM à 590 mM, sans optimisation supplémentaire. La caractérisation structurale par diffraction X de 2 variants d’un de ces ligands protéiques a permis de montrer que les interactions établies par le motif 1-4 dans ces ligands étaient similaires à celles observées dans le complexe TIMP-2/MMP-14, avec cependant des différences dans la géométrie de certaines d’entre elles. Des études de simulation par dynamique moléculaire ont également permis de mettre en évidence de possibles différences dans la géométrie et la stabilité de certaines des interactions reproduites dans les 10 plates-formes, pouvant contribuer aux affinités modestes observées pour ces ligands. Cependant, les résultats obtenus montrent que la méthode de conception in silico utilisée est capable de fournir une série de ligands protéiques de 1ère génération ciblant de manière spécifique un site catalytique d’intérêt avec un bon rendement. Cette méthode pourrait constituer la 1ère étape d’une approche hybride de conception in silico de ligands combinée à des techniques de sélection expérimentales. / Artificial mini-proteins able to target catalytic sites of matrix metalloproteinases (MMPs) were designed using a functional motif grafting approach. The motif corresponded to the 4 N-terminal residues of TIMP-2, a broad-spectrum natural protein inhibitor of MMPs. Scaffolds able to reproduce the functional topology of this motif as described in the TIMP-2/MMP-14 complex were obtained by exhaustive screening of the Protein Data Bank (PDB) using the STAMPS software (Search for Three-dimensional Atom Motif in Protein Structure). Ten artificial protein binders satisfying all topologic, steric and electrostatic criteria applied for selection were produced for experimental evaluation. These binders targeted catalytic sites of MMPs with affinities ranging from 450 nM and 590 μM prior to optimization. The crystal structures of two artificial binders in complex with the catalytic domain of MMP-12 showed that the intermolecular interactions established by the functional motif in these artificial binders corresponded to those found in the TIMP-2/MMP-14 complex, albeit with some differences in their geometry. Molecular dynamics simulations of the 10 binders in complex with MMP-14 suggested that these scaffolds could allow reproducing in part the native intermolecular interactions, but some differences in geometry and stability could contribute to the lower affinity of the artificial protein binders as compared to the natural one. Nevertheless, these results show that the in silico design method used can provide sets of starting protein binders targeting a specific binding site with a good rate of success. This approach could constitute the first step of an efficient hybrid computational-experimental protein binder design approach.

Le développement d’une nouvelle sonde dite « activity-based probe » pour réaliser la détection de formes actives de protéases appartenant à la famille des protéases à zinc de la matrice (MMP) a été réalisé dans ce travail, en partant d’un inhibiteur phosphinique puissant des MMP dans lequel a été introduit un groupement photoactivable de type diazérine. Ce composé se révèle un inhibiteur puissant de plusieurs MMP avec des affinités nanomolaires. Ce composé incubé avec différentes MMP est par ailleurs capables de modifier de façon covalente un grand nombre de MMP au niveau de leur site actif, avec des rendements de modification variant de plus de 50% à 11%, selon la nature des MMP. En ayant choisi comme moyen de détection la radioactivité, nous démontrons qu’avec cette nouvelle sonde qu’il est possible de détecter des formes actives de MMP avec des sensibilités de l’ordre de la femtomole dans des systèmes modèles de protéomes complexes. Appliquée à l’analyse de lavages broncho alvéolaires de souris traitées par voie pulmonaire avec des nanoparticules pour induire une réponse inflammatoire, cette nouvelle sonde permet de mettre en évidence la présence de formes actives du domaine catalytique de la MMP-12, une métalloprotéase à zinc exprimée par les macrophages, mais pas dans les animaux contrôles. En revanche l’analyse de carotides humaines de patients souffrant d’athérosclérose ne nous pas conduit avec cette sonde à la détection de formes actives de MMP. Malgré ce résultat, il est à noter que la détection de forme active de MMP dans un fluide pathologique est une première dans ce domaine. Cette sonde étant validée pour sa capacité à détecter des formes actives de MMP, elle permettra dans l’avenir de tester d’autres fluides pathologiques d’origine humaine ou bien des extraits de tissu comme des tumeurs pour lesquels les MMP pourraient être des marqueurs de ces pathologies. / A new activity-based probe able to covalently modify the active site of proteases belonging to the matrix metalloprotease family (MMPs) has been developed in this thesis project. The probe was shown to behave as potent inhibitor of several MMPs, with nanomolar Ki values. This probe was also able to modify specifically only the free active site of MMPs, with particular high yields of cross-linking varying from 50 % to 11 %, depending of the MMPs tested. Using radioactivity as means of detection, this probe was able to detect active form of MMPs with a threshold of 1 femtomole. Applied to the study of bronchoalvelolar fluids (BAL) from mice exposed to nanoparticles by a lung aspiration protocol, this probe revealed the presence of the catalytic domain of MMP-12 under its active form, but not in control animals. When used to detect active form of MMPs from extracts obtained from human arteries of patient suffering from atherosclerosis, the probe was not able to detect such MMP active forms. Despite this negative result, the detection of active form of MMP in pathological fluid like BAL has never been reported before this work. Having validated this novel MMP activity-based probe, it will be possible to use it now for detecting MMPs from other pathological fluids or tissues extracts in which MMPs can be good markers of the pathology.

La cicatrisation de défauts osseux permet tout au plus une réparation de l'os et dans peu de cas, une régénération ad integrum. Le développement de biomatériaux issus de l'ingénierie tissulaire en vue d'une régénération osseuse est donc un enjeu majeur. Le but de cette étude a été d'évaluer si des peptides GXXPG issus de l'élastine sont capables de favoriser la différenciation ostéoblastique de cellules mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse humaine (CMMO) ainsi que la formation de la matrice osseuse et sa minéralisation. Pour y répondre, nous avons utilisés les lattis de collagène de type I (COL1). La contraction de lattis « flottants » (LF) stimule l'expression de marqueurs de l'ostéoblaste (Runx-2, BSP…) par les CMMO ainsi que la minéralisation de la matrice osseuse. Cette différenciation ostéoblastique est aussi associée à l'activation de la cascade MT1-MMP/MMP-2/MMP-13. Nous montrons ensuite que les peptides GXXPG stimulent de façon dose-dépendante l'expression de marqueurs ostéoblastiques comme Runx-2 via S-Gal. Sur « coating » de COL1, ils stimulent la différenciation ostéoblastique des CMMO, la formation de la matrice osseuse et sa minéralisation. Enfin, dans des conditions « inflammatoires » créées par l'ajout de plasminogène (Plg) exogène, ces peptides conservent une activité ostéogénique sous contraintes mécaniques ou non. Plg seul induit également la différenciation ostéoblastique. Bien que les peptides GXXPG stimulent la production d'enzymes à activité collagénolytique (MT1-MMP, MMP-1), la lyse des LF n'est pas significative. En conclusion, les peptides GXXPG apparaissent comme des biomolécules pharmacologiques prometteuses pour la régénération osseuse. / Bone healing leads in only a few cases to an ad integrum regeneration, but most often to an incomplete tissue repair. Thus, the development of new biomaterials from tissue engineering in order to promote bone regeneration is a major goal. The purpose of our study was to evaluate if GXXPG peptides, derived from elastin, are able to favor human bone marrow mesenchymal cells (HBMC) to mature osteoblasts and bone matrix formation and mineralization.To this end, we used type I collagen (COL1) lattices. Floating lattice (LF) contraction stimulates osteoblasts markers expression (Runx-2, BSP…) by HMBC and bone matrix mineralization. Osteoblast differentiation is also associated to MT1-MMP/MMP-2/MMP-13 proteolytic cascade activation. We then showed that GXXPG peptides stimulate osteoblast markers like Runx-2 in a dose-dependent manner, an effect which involves S-Gal receptor. On a type I collagen coating model, these peptides also promote CMMO differentiation into osteoblast, bone matrix formation and mineralization. Finally, under “inflammatory” conditions, which can be catalyzed by plasminogen (Plg) supplementation, these peptides keep their ability to induce osteogenic responses in HBMC, even under mechanical stress. Plg alone is also able to promote osteoblast differentiation. Although GXXPG peptides stimulate collagenolytic enzymes (MT1-MMP, MMP-1) production, collagen degradation in LF is not significant. To conclude, GXXPG peptides appear as promising pharmacological biomolecules in bone regeneration.

Dentale Implantate sind heutzutage ein fester Bestandteil der modernen Zahnheilkunde. Durch die steigende Anzahl gesetzter Implantate steigt auch die absolute Zahl an Misserfolgen. Der Hauptgrund für den Verlust von Implantaten ist die Periimplantitis. Sie stellt eine Entzündung des Weich- und Hartgewebes um dentale Implantate dar, welche im ultimativen Stadium den Verlust der Integrität des Implantats zur Folge hat. Das Ziel dieser Arbeit soll es sein, einen Überblick über die Genexpression des entzündeten periimplantären Gewebe zu erlangen um so die Periimplantitis auf mikrobiologischer Ebene zu charakterisieren. Um das zu erreichen wurde umgebendes Gewebe von Implantaten mit Periimplantitis und von Implantaten ohne Periimplantitis von menschlichen Patienten gewonnen. Für die Ermittlung der Ergebnisse wurde die Microarray-Technik angewandt (Affymetrix Gene- Chip R Human Gene 1.0 ST Array) und um diese Ergebnisse zu validieren wurde die qPCR-Technik verwendet (real-time-PCR). Die Ergebnisse zeigen, dass klassische Entzündungsmarker wie IL-1, -8 und -6 sind in ihrer Expression stark erhöht. Die erhöhte Expression von CD24 zusammen mit weiteren Cluster of Differentiation und das Expressionsmuster der Interleukine zeigen, dass das unspezifische Immunsystem eine Hauptrolle bei der Entzündung um Implantate spielt. Makrophagen und Monozyten sind sehr wahrscheinlich die am stärksten vertretene Spezies von Abwehrzellen im von Periimplantitis betroffenen Gewebe. Marker für den Abbau von Gewebe, die MMPs-1, -12 und -13 sind in ihrer Expression erhöht, ihre Inhibitoren, die TIMPs sind in ihrer Expression erniedrigt. MMP-12 ist die Makrophagen spezifische Elastase und somit ein weiterer Indikator für die tragende Rolle von Makrophagen bei der Periimplantitis. Kollagen-3 ist das einzige Kollagen, welches den Ergebnissen dieser Arbeit zufolge in seiner Expression erhöht ist. Kollagen-3 findet sich neben Haut- und Muskelzellen in der Wand von Blutgefäßen. Transkriptions- und Wachstumsfaktoren wie RUNX2, SOX2 und FGF18 sind den Ergebnissen dieser Arbeit nach im entzündeten periimplantären Gewebe in ihrer Expression erniedrigt. Fazit: Anhand der Ergebnisse dieser Arbeit lässt sich die Periimplantitis als ein gut durchblutetes, granulationsgewebe-ähnliches-Gewebe mit einer herabgesetzten Kompetenz zur Regeneration charakterisieren. Das unspezifische Immunsystem ist Hauptakteur bei der Periimplantitis und die hauptsächlich anwesenden Immunzellen sind Makrophagen und Monocyten. Die Gewebehomöostase ist in Richtung Gewebeabbau verschoben.

Matrix metalloproteinases (MMPs) network with other biological molecules to maintain the extracellular matrix (ECM) in normal physiology and perform different roles. Understanding and assigning specific role to each of 24 members of these endoproteinases is impeded because of lack of specific and efficient detection methods in biological samples. Moreover, MMP-based anti-cancer drug development has also been challenged because, currently, there is no robust methodology to distinguish the inactive pro-enzymes, active enzymes or those complexed with endogenous inhibitors in biological specimens. The objective of this project is to develop a chemical proteomics strategy based on Matrix assisted laser desorption ionization tandem mass spectrometry (MALDI-MS/MS) to help identify and discriminate the various MMP forms. Firstly, a triazine dye-based ligand immobilized on chromatography beads was utilized to assess whether it binds to recombinant human MMPs (rhMMPs). The results highlighted that the ligand interacts with latent forms of MMPs in agreement with the literature. Secondly, the potential of the ligand was assessed using MALDI-MS/MS based methodology in in vitro cancer models. Cell line culture supernatants were used in amounts to emulate the availability of tumour biopsies in clinical settings. The MS/MS spectral peaks specific to MMPs (MMP-2 and MMP- 14), and two endogenous inhibitors TIMP-1 and TIMP-2 were found in affinity chromatography eluates of cell culture supernatants with higher Mascot scores for the latter. While western blot detected MMP-2 in cell extracts, MALDI-MS/MS did not detect MMPs because of amounts below the limit of detection (LOD) of the instrument. Although the ligand was found to be interacting with MMPs and detergent-free salt elution buffers improved MALDI analysis, recovery of MMPs from biological samples was sub-optimal. The dye ligand was observed to bind other enzymes and despite various strategies to reduce non-specific binding of proteins or enable selective elution did not improve MMP enrichment. Further work using methodology described in this study is required after scaling up the MMP amounts in biological specimen and to resolve the issue of non-specific binding of proteins to the ligand by understanding its structure.

Les cancers broncho-pulmonaires à petites cellules (CBPPC), tumeurs endocrines représentant 20% des cancers pulmonaires, sont fortement associés au tabagisme. Ils sont très agressifs en raison de leur progression rapide et de la présence de métastases souvent présentes au moment du diagnostic. Moins de 10% des patients sont opérables et la plupart des échantillons de tumeurs sont recueillis par endoscopie bronchique ou par médiastinoscopie. Dans ce travail de thèse, nous avons montré que l’expression du TFPI-2, un gène suppresseur de tumeur, était diminué dans 65% des cas de CBPPC. Afin d’étudier l’impact du TFPI-2 sur la progression tumorale, nous avons préalablement développé un modèle orthotopique murin de CBPPC qui mime le développement de ce type de cancer pulmonaire. Des cellules NCI-H209, n’exprimant pas le TFPI-2, ont été préalablement transfectées pour exprimer la luciférase et la croissance tumorale a été suivie par imagerie de bioluminescence. L’expression du TFPI-2 a ensuite été restaurée dans ces cellules et nous avons montré que la croissance tumorale était alors réduite. Cet effet peut s’expliquer par une diminution de la prolifération des cellules exprimant le TFPI-2, associée à un arrêt du cycle cellulaire en phase G1/S dû à l’expression de p15 et de p27 et à une induction de l’apoptose. Nous avons aussi démontré que lorsque le TFPI-2 est surexprimé, les transcrits et les protéines MMP-1 et -3 sont diminuées, tout comme la phosphorylation des protéines de la voie des MAP Kinases impliquées dans l’induction des transcrits de ces MMP. Cette corrélation entre l’expression du TFPI-2 et la diminution de celle de la MMP-1 a été retrouvée dans 35% des échantillons de CBPPC humains. Ces résultats suggèrent que l’inactivation du TFPI-2 dans les CBPPC peut favoriser le développement de ce cancer. Enfin, nous avons également démontré, pour la première fois que le TFPI-2 peut aussi inhiber la kallicréine 12, une protéase à sérine potentiellement anti-angiogénique. L’ensemble de ces données suggèrent que le TFPI-2 peut être un potentiel biomédicament capable de limiter la progression des carcinomes pulmonaires à petites cellules. / Small Cell Lung Cancer (SCLC) is the most common neuroendocrine tumour of the lung (15% of cases) and is strongly associated with smoking. It is characterised by tumours that grow rapidly with early metastases. Less than 10% of patients with SCLC have a resectable tumour, thus surgical specimens are scarce and most tumour samples come from small biopsies obtained during bronchial endoscopy or mediastinoscopy. In this study, low levels of TFPI-2 expression were found in 65% of patients with SCLC. To study the impact of TFPI-2 in tumour progression, we first developed a clinically relevant animal model that resembles various stages of human SCLC. NCI-H209 cells, not expressing TFPI-2, were genetically modified to express firefly luciferase and the growth of the tumour was sensitively followed by bioluminescence imaging. TFPI-2 was then overexpressed in these cells and we showed that TFPI-2 inhibited lung tumour growth. Such inhibition could be explained in vitro by a decrease in tumour cell proliferation, blockade of G1/S phase cell cycle transition due to p15 and p27 expression, and an increase in apoptosis shown in NCI-H209 cells expressing TFPI-2. We also demonstrated that TFPI-2 upregulation in NCI-H209 cells decreased MMP expression, particularly by downregulating MMP-1 and MMP-3. Moreover, TFPI-2 inhibited phosphorylation of the MAPK signalling pathway proteins involved in the induction of MMP transcripts, among which MMP-1 was predominant in SCLC tissues and was inversely expressed with TFPI-2 in 35% of cases. These results suggest that downregulation of TFPI-2 expression could favour the development of SCLC. Finally, we also demonstrated for the first time that TFPI-2 could inhibit the kallikrein 12, an anti-angiogenic serine proteinase. Altogether, these results suggest that TFPI-2 could be a new potent therapeutic agent to control SCLC tumour progression in SCLC.