It has been suggested that moderate exercise contributes to protection against the development of chronic diseases by anti-inflammatory mechanisms that include elevations of anti-inflammatory cytokines and also reduction of the expression of Toll- Like Receptors (TLRs). However, prolonged strenuous exercise has been shown to reduce the function of some immune cells, decrease virus protection and consequently may account for the reason athletes appear more vulnerable to catching Upper Respiratory Tract Infections (URTI). Although it has been proven that some exercise is better than no exercise, it is not clear yet what is the right amount of exercise to elicit beneficial immune responses and to help prevent the development of diseases. Therefore, the general aim of the studies in this thesis was to evaluate the impact of different types of exercise on monocyte TLR expression in participants with different fitness levels. It was found that different acute exercise protocols elicit different changes in TLR2 and TLR4 expression, where an acute bout of strenuous exercise reduced TLR4 expression for a few hours after the completion of the exercise (Chapter 5); however, short two bouts of exhaustive exercise separated by 2 hours did not change TLR4 expression (Chapter 6). In addition, changes in TLR4 expression were related to sex and the physical activity level of the participants (Chapter 4), and should therefore be considered separately when analysing TLR4 expression. Furthermore, high-intensity intermittent training improves participants' aerobic capacity and modifies the monocyte subpopulation concentration in the blood, with no changes in TLR4 expression. Further research needs to be done in this area to achieve a conclusive finding about changes in TLR4 expression and monocyte subsets after different training protocols, and possible relationships to cytokine production.

Les macrophages sont une cible cellulaire du VIH-1, et jouent un rôle important dans la pathogenèse virale. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée au rôle des macrophages dans la pathogenèse du VIH-1, mais aussi au cours de la co-infection avec Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agent étiologique de la tuberculose. J'ai tout d'abord participé à une étude mettant en évidence que l'infection par le VIH-1 reprogramme la migration des macrophages, favorisant notamment le mode migratoire protéolytique. Cet effet est médié par l'interaction de la protéine virale Nef avec les protéines de l'hôte Hck et WASP, ce qui conduit à une modification de l'organisation et de la fonction des podosomes, structures impliquées dans la dégradation de la matrice extracellulaire et la migration dépendante des protéases. La meilleure capacité à migrer des macrophages infectés par le VIH-1 in vitro se traduit in vivo par une augmentation du recrutement des macrophages dans différents tissus de souris transgéniques qui expriment la protéine Nef. Ces travaux ont ainsi révélé un nouveau mécanisme par lequel le VIH-1 dissémine dans les tissus, via l'action de Nef dans les macrophages. L'association fréquente du VIH-1 avec Mtb complique le problème de santé publique posé par l'infection virale. En effet, Mtb aggrave la pathogenèse du VIH-1 chez les patients co-infectés. L'étude des mécanismes impliqués et le rôle des macrophages dans ce phénomène constituent les objectifs principaux de ma thèse. J'ai révélé que les macrophages infectés par Mtb génèrent un microenvironnement qui active les macrophages voisins vers un programme de polarisation anti-inflammatoire dit M(IL-10). J'ai mis en évidence que ces macrophages M(IL-10) sont particulièrement efficaces pour la production de VIH-1. J'ai démontré que le microenvironnement associé à la tuberculose entraîne la formation de nanotubes entre les macrophages, grâce à l'activation de la signalisation cellulaire médiée par l'axe IL-10/STAT3. Ces nanotubes, qui favorisent le transfert du virus d'un macrophage à un autre, sont à l'origine de la spectaculaire production de VIH-1 par les macrophages. Nous avons également constaté que ces cellules M(IL-10) s'accumulent dans la circulation sanguine des patients co-infectés ainsi que dans les poumons de primates non-humains co-infectés. Dans l'ensemble, mes travaux identifient les nanotubes comme des acteurs clés dans l'aggravation de la pathogenèse du VIH-1 lors de la co-infection avec Mtb. Ainsi, les nanotubes et la voie de signalisation IL-10/STAT3 pourraient représenter des cibles pour développer de nouvelles thérapies de lutte contre la comorbidité VIH/Mtb. Les résultats obtenus lors de ma thèse contribuent à une meilleure compréhension du rôle des macrophages dans la pathogenèse et la dissémination du VIH-1 dans un contexte de mono-infection, ou lors d'une co-infection avec Mtb. / Macrophages are both crucial host effector cells for HIV-1 and important leukocytes involved in viral pathogenesis. For my doctoral thesis, I was interested in further characterizing the role of macrophages in HIV-1 pathogenesis, and during co-infection with Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the etiological agent for tuberculosis (TB). I first participated in a study that provided evidence that HIV-1 infection reprograms the migration of macrophages, particularly by triggering the protease-dependent migration mode. This effect was mediated by the interaction of the viral protein Nef with the host proteins Hck and WASP, which leads to modification in the organization and proteolytic activity of podosomes, important structures for protease-dependent migration. The higher migration capacity of HIV-1-infected macrophages translated in vivo by an increase in the recruitment of macrophages in several tissues of Nef-transgenic mice. This work revealed a novel mechanistic understanding of how HIV-1 infection drives macrophages into tissues, contributing to viral dissemination and possibly creating a hidden cellular reservoir of virus. Worsening this public health issue posed by the HIV-1 epidemic is the frequent association of the virus with Mtb. Indeed, Mtb aggravates HIV-1 pathogenesis in co-infected individuals. Yet, the mechanisms involved in this process are still poorly understood, including the contribution of macrophages. To investigate how Mtb exacerbates the HIV-1 infection in human macrophages was the main focus of my thesis. First, I revealed that Mtb-infected macrophages generate a microenvironment that drives bystander macrophages towards phenotypic and functional features of the so-called M(IL-10) anti-inflammatory program. I found that these M(IL-10) macrophages are highly efficient for HIV-1 production. I demonstrated that the TB-associated microenvironment induces the formation of macrophage-to-macrophage connecting tunneling nanotubes (TNTs) through the IL- 10/STAT3 axis, a phenomenon that is responsible for the dramatic increase of HIV-1 production in M(IL-10) macrophages. Moreover, I provided evidence that M(IL-10) cells are expanded in the peripheral blood of co-infected patients and accumulate in the lungs of co-infected non-human primates. Altogether, this central part of my PhD thesis sheds light to TNTs as key players in the aggravation of HIV-1 pathogenesis in human macrophages during co-infection with Mtb. Thus, this cellular mechanism (together with the IL- 10/STAT3 axis) could represent an unexpected target to develop novel therapeutics against AIDS/TB co-morbidity. Collectively, the results obtained during my thesis contribute to a better understanding of the role of macrophages during HIV-1 pathogenesis and their ability to disseminate the virus in a mono-infection context, or during co-infection with Mtb.

Orientador: José Maurício Sforcin / Resumo: A própolis é um produto resinoso, elaborado pelas abelhas a partir de diferentes partes das plantas, e se destaca por suas inúmeras propriedades biológicas, e pela possibilidade de aplicação na indústria farmacêutica. Recentemente, nosso grupo tem estudado sua ação sobre monócitos – células do sistema fagocítico mononuclear que exercem importante função na resposta imune. Neste projeto, visamos investigar a possível ação moduladora da própolis na apresentação de antígenos por monócitos humanos, utilizando um antígeno infeccioso (subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli - EtxB), um antígeno tumoral (MAGE-1), o ácido retinóico (AR) e lipopolissacarídeo (LPS), simultaneamente ou não a própolis, avaliando o possível efeito citotóxico dos tratamentos, a expressão de receptores celulares (TLR-2, TLR-4, HLA-DR, CD40, CD80) e a produção de citocinas (TNF-α, IL-6, IL-10 e IL-12). A modulação da autofagia foi avaliada através da expressão de genes que codificam as proteínas Beclin-1 e LC3-II, utilizando a rapamicina simultaneamente ou não a própolis. A própolis não alterou a viabilidade dos monócitos humanos e exerceu efeito citoprotetor nas células incubadas com os estímulos. A própolis manteve a expressão basal dos receptores de superfície celular; porém, em associação com MAGE-1 e LPS, diminuiu a expressão de CD40 estimulada pelos antígenos isoladamente. Em associação com AR, a própolis manteve a ação do antígeno sobre os receptores. Já a associação da própolis co... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

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La synthèse des protéines de choc thermique (HSPs) est un moyen de défense développé par la cellule pour faire face aux diverses agressions auxquelles elle peut être soumise. En tant que chaperons, les HSPs participent aux mouvements intracellulaires des protéines, préviennent l'agrégation des protéines altérées, éliminent les protéines anormales et contribuent à la conformation correcte des peptides nouvellement synthétisées. Mon équipe d’accueil s’intéresse aux rôles des HSPs dans des processus cellulaires tels que l’apoptose et la différenciation cellulaire. Le but de mon travail de thèse consiste à étudier le rôle des protéines de choc thermique HSP90 et HSP70 au cours de la différenciation des monocytes en macrophages. J’ai dans un premier temps étudié l’implication de HSP90 dans la différenciation macrophagique. c-IAP1 est un membre de la famille des protéines inhibitrices de l’apoptose impliqué dans la régulation de l’apoptose, dans le cycle cellulaire et dans la signalisation cellulaire. Nous avons précédemment montré que c-IAP1 migre du noyau vers le cytoplasme au cours de la différenciation cellulaire. Nous démontrons dans ce travail que c-IAP1 est une protéine cliente de la protéine de choc thermique HSP90β. Dans trois différents modèles de différenciation, ces protéines interagissent et migrent ensemble du noyau vers le cytoplasme au cours de la différenciation cellulaire. L’inhibition de HSP90 ou la déplétion spécifique de l’isoforme β par des siRNA conduisent à sa dégradation par le protéasome. La fonction de chaperon moléculaire de HSP90 envers c-IAP1 est spécifique de l’isoforme β car la déplétion de l’isoforme α n’a pas d’effets sur c-IAP1. De plus l’inhibition de HSP90 ou la déplétion de HSP90β bloquent la différenciation cellulaire tout comme la déplétion de c-IAP1 par siRNA. La deuxième partie de montre travail a consisté à étudier le rôle de HSP70 dans la différenciation macrophagique. Nous montrons que cette protéine est fortement induite après stimulation des cellules par le facteur de croissance M-CSF et que son inhibition bloque la différenciation des monocytes en macrophage. HSP70 interagit avec la protéine Spi-1/Pu.1, facteur de transcription clé de la différenciation macrophagique. L’expression de Spi-1/Pu.1 augmente également au cours de la différenciation macrophagique et ce de manière similaire à celle de HSP70. Ceci suggère l’implication des facteurs de transcription responsables de l’induction des HSPs, les Heat Shock Factor (HSF). L’étude du promoteur de Spi-1/Pu.1 a révélé la présence d’une séquence ressemblant fortement aux éléments de réponse classiques sur lesquels se fixe HSF1. HSF1 est capable de se fixer sur le promoteur de Spi-1/Pu.1 et l’inhibition de HSF1 bloque l’expression de Spi-1/Pu.1. HSF1 participe donc au contrôle de l’expression de Spi-1/Pu.1 lors de la différenciation macrophagique. HSP90 et HSP70 sont donc essentielles à la différenciation macrophagique. Comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans les voies de différenciation se révèle extrêmement important puisque des altérations des mécanismes de l’hématopoïèse sont retrouvées dans plusieurs types de leucémies (leucémies aiguës myéloblastiques et leucémies myélo-monocytaires chroniques). Connaître le rôle des HSPs dans la différenciation cellulaire permettrait donc de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies. / Heat shock proteins (HSPs) are molecular chaperones whose expression is increased after many different stresses. They have a protective function helping the cell to cope with lethal conditions. These proteins play an essential role as molecular chaperones by assisting the correct folding of nascent and stress-accumulated misfolded proteins and by preventing their aggregation. My team is interested in understanding the roles of HSPs in two physiological related processes: apoptosis and cell differentiation. The aim of my work is to study the functions of HSP90 and HSP70 in macrophagic differentiation. I first studied the role of HSP90 in macrophagic differentiation. We previously reported that cellular inhibitor of apoptosis protein-1 (c-IAP1), migrated from the nucleus to the surface of the Golgi apparatus in cells undergoing differentiation. c-IAP1 is a member of the inhibitor of apoptosis protein (IAP) family which has demonstrated functions in cell death, cell signaling and mitosis. Here, we show that c-IAP1 is a client protein of the stress protein HSP90β. In three distinct cellular models, the two proteins interact and migrate from the nucleus to the cytoplasm during the differentiation process through a leptomycin B-sensitive pathway. Inhibition of HSP90 proteins by small chemical molecules and specific depletion of HSP90isoform by siRNA both leads to c-IAP1 degradation by the proteasomal machinery. This chaperone function of HSP90 towards c-IAP1 is specific of its β isoform as specific depletion of HSP90α isoform does not affect c-IAP1 content. Chemical inhibition of HSP90 or siRNA-mediated depletion of HSP90both inhibit cell differentiation, which can be reproduced by siRNA-mediated depletion of c-IAP1. Altogether, these results suggest that HSP90prevents auto-ubiquitination and degradation of its client protein c-IAP1, whose depletion would be sufficient to inhibit cell differentiation. The second part of my work consisted in the study of the role of HSP70 in macrophagic differentiation. We used two models of differentiation: human peripheral monocytes exposed to M-CSF and THP1 cells induced to differentiate by TPA. We found that in both models, HSP70 expression was induced during differentiation. Interestingly, the expression of Spi-1/Pu.1, a transcription factor essential for monocytes to differentiate, was similarly induced. Upon differentiation, both proteins co-localized in the nucleus and associated. Inhibition or down regulation of HSP70 induced Spi-1/Pu.1 degradation and blocks the differentiation process, indicating that the necessity of Spi-1/Pu.1 to be chaperoned by HSP70 during differentiation. Since Spi-1/Pu.1 promoter has a HSE-like, we studied whether transcription factors responsible for HSPs induction, HSF, could be involved. We show that although HSF2 do not seem involved, HSF1 binds to Spi-1/Pu.1 promoter and its inhibition blocks Spi-1/Pu.1 expression and monocytes differentiation. So HSP90 and HSP70 are essentials for macrophagic differentiation. Understanding monocyte differentiation regulation is important since defects of the differentiation process can lead to the development of leukemias (acute myeloid leukemia, chronic myelomonocytic leukemia). A better understanding of the roles of HSPs may provide new therapeutic strategies for the treatment of these pathologies.

Les caspases sont des protéases à cystéine, très étudiées dans la mort cellulaire par apoptose et impliquées dans de nombreux autres processus de survie tels que la prolifération, l’inflammation et la différenciation. Au cours de la différenciation des monocytes en macrophages induite par le M-CSF, les caspases sont activées au sein d’un complexe multiprotéique composé de FADD, de RIP1, de FLIP et de la caspase-8. Ce complexe se forme indépendamment des récepteurs de mort et en réponse à des vagues d’activation de PI3K/Akt successives d’amplitudes et de durées croissantes prenant naissance au niveau du récepteur au M-CSF. La caspase-8, activée dans ce complexe, active par clivage les caspases effectrices, qui clivent à leur tour des protéines dont la Nucléophosmine. La Nucléophosmine, aussi appelée NPM, B23, NO38 ou Numatrine est une protéine chaperonne nucléolaire effectuant la navette entre noyau et cytoplasme. Cette protéine est impliquée dans de nombreux processus dont la ribogenèse, la duplication du centrosome ou la régulation de la transcription. Au cours de ma thèse, j’ai décrit le clivage de NPM au cours de la différenciation macrophagique. NPM est clivée une première fois par les caspases sur le site NGKD213 puis pas la cathepsine B. La surexpression du fragment de clivage généré par les caspases inhibe la phagocytose de bactéries ainsi que la migration cellulaire, sans affecter la phagocytose des corps apoptotiques suggérant que le clivage de NPM par les caspase participe au maintien au repos des macrophages. La protéolyse de NPM est arrêtée lorsque les macrophages sont activés par des ligands des TLR comme les LPS. La forme native s’accumule et inhibe la synthèse de cytokines in vitro et in vivo. NPM est recrutée sur le promoteur de MCP-1 en présence de LPS suggérant une fonction transcriptionnelle de NPM. / Caspases are cystein proteases whose function in apoptosis has been largely explored. Caspases play a role in various other cellular processes, such as proliferation, inflammation or differentiation. During M-CSF-driven macrophagic differentiation, caspases are activated in a multimolecular complex, including FADD, RIP1, FLIP and caspase-8. This complex is death receptor independent and is linked to M-CSFR by successive PI3K/Akt waves of increasing amplitude and duration. Caspase-8 is activated in this complex, activates downstream effector caspases, which in turn cleaves cellular targets such as Nucleophosmin. Nucleophsomin (also called NPM, B23, NO38 or Numatrin) is a nucleolar chaperon protein that shuttles between nucleus and cytoplasm. This protein is involved in various cellular processes such as ribogenesis, centrosome duplication or transcription regulation. During my PhD, I described NPM cleavages during macrophagic differentiation. NPM is first cleaved by caspases at NGKD213 site and then by cathepsin B. Caspases-generated fragment overexpression inhibits bacteria phagoctosis and migration without affecting apoptotic bodies engulfment, suggesting that caspase-mediated NPM cleavage maintains macrophages at steady-state. NPM proteolysis is abrogated upon macrophage activation by TLR ligands such as LPS. Full-length NPM accumulates and inhibits cytokine synthesis in vitro and in vivo. NPM is recruited on MCP-1 promoter, suggesting a transcriptionnal function for NPM.

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Pancreatic cancer (PC) remains one of the most challenging solid tumors to treat with a high unmet medical need as patients poorly respond to standard-of-care-therapies. Prominent desmoplastic reaction involving cancer-associated fibroblasts (CAFs) and the immune cells in the tumor microenvironment (TME) and their cross-talk play a significant role in tumor immune escape and progression. To identify the key cellular mechanisms induce an immunosuppressive tumor microenvironment, we established 3D co-culture model with pancreatic cancer cells, CAFs, monocyte as well as T cells. Using this model, we analysed the influence of tumor cells and fibroblasts on monocytes and their immune suppressive phenotype. Phenotypic characterization of the monocytes after 3D co-culture with tumor/fibroblast spheroids was performed by analysing the expression of defined cell surface markers and soluble factors. Functionality of these monocytes and their ability to influence T cell phenotype and proliferation was investigated. 3D co-culture of monocytes with pancreatic cancer cells and fibroblasts induced the production of immunosuppressive cytokines which are known to promote polarization of M2 like macrophages and myeloid derived suppressive cells (MDSCs). These co-culture spheroid polarized monocyte derived macrophages (MDMs) were poorly differentiated and had an M2 phenotype. The immunosuppressive function of these co-culture spheroids polarized MDMs was demonstrated by their ability to inhibit autologous CD4+ and CD8+ T cell activation and proliferation in vitro, which we could partially reverse by 3D co-culture spheroid treatment with therapeutic molecules that are able to re-activate spheroid polarized MDMs or block immune suppressive factors such as Arginase-I. In conclusion, we generated a physiologically relevant 3D co-culture model, which can be used as a promising tool to study complex cell-cell interactions between different cell types within the tumor microenvironment and to support drug screening and development. In future, research focused on better understanding of resistance mechanisms to existing cancer immunotherapies will help to develop new therapeutic strategies in order to combat cancer. / Bei Bauchspeicheldrüsenkrebs handelt es sich um eine maligne Tumorerkrankung, deren Behandlung Ärzte noch immer vor große Herausforderungen stellen und die zur dritthäufigsten krebsbedingten Todesursache der westlichen Welt zählt. Desmoplastische Reaktionen im Tumorgewebe sind hierbei ein besonderes Merkmal dieser Erkrankung. Dabei spielen tumor-assoziierte Fibroblasten sowie unterschiedliche Zellen des Immunsystems und deren Interaktionen eine essentielle Rolle hinsichtlich Tumorwachstum und der Herunterregulation des Immunsystems. Um zelluläre Mechanismen, die ein immunsuppressives Tumormilieu induzieren, zu identifizieren, entwickelten wir ein 3D Ko-Kultur Modell mit Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, tumor-assoziierten Fibroblasten sowie Monozyten und T-Zellen. Mit Hilfe dieses Modells konnten wir den Einfluss von Tumorzellen und Fibroblasten auf den Phänotyp und das Verhalten von Monozyten untersuchen. Dazu wurden Monozyten in einer 3D Tumorzell/Fibroblasten Ko-Kultur kultiviert und differenziert, um anschließend die Expression definierter Zelloberflächenmarker und löslicher Faktoren zu analysieren. Des Weiteren wurde das Verhalten dieser 3D Ko-Kultur differenzierten myeloiden Zellpopulation sowie ihre Fähigkeit den Phänotyp von T Zellen und deren Proliferation zu beeinflussen untersucht. Die 3D Ko-Kultur der Monozyten zusammen mit den Tumorzellen und den Fibroblasten führten zur Produktion immunsuppressiver Zytokine und Chemokine, wodurch die Differenzierung der Monozyten in M2-ähnliche Makrophagen induziert wurde. Diese durch die 3D Tumorzell/Fibroblasten Sphäroide polarisierten aus Monozyten herangereiften M2-ähnlichen Makrophagen besaßen außerdem immunsuppressive funktionelle Eigenschaften, indem sie in der Lage waren, die Aktivierung und Proliferation von autologen CD4+ und CD8+ T Zellen in vitro zu inhibieren. Die Suppression sowohl der CD4+ als auch der CD8+ T Zellen konnte durch die Behandlung therapeutischer Moleküle, die die Re-Aktivierung der immunsuppressiven 3D Sphäroid polarisierten Makrophagen stimulierten oder suppressive Faktoren wie Arginase-I blockierten, wieder aufgehoben und die T Zell Proliferation teilweise wiederhergestellt werden. Unser etabliertes 3D Ko-Kultur System repräsentiert ein vielversprechendes physiologisch relevantes Modell, welches genutzt werden kann, um Zell-Zell Interaktion und Kommunikation im Tumormilieu zu untersuchen und dadurch die Wirkung von Medikamenten zu verbessern. Ein gezieltes besseres Verständnis von Tumorresistenz Mechanismen gegen bereits bestehende Immun Therapien fördert die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze zur Bekämpfung von Krebs.

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