Made available in DSpace on 2015-11-18T13:20:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 debora_mattos_ioc_mest_2014.pdf: 25027935 bytes, checksum: 36794f8df745a06c2879690ef1660179 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A susceptibilidade de Rhodnius prolixus ao T. rangeli depende da cepa do parasita e das interações moleculares no intestino e na hemocele do vetor. T. rangeli pode modular a resposta imune do vetor, preparando o hospedeiro à invasão e a sobrevivência dos parasitas na hemocele, superando assim as adversidades encontradas nos diferentes órgãos do inseto. Neste trabalho, são discutidos os mecanismos destas interações, destacando também o papel da microbiota intestinal e outros mecanismos importantes para o desenvolvimento do parasita. Inicialmente nossas investigações foram realizadas para comparar aspectos da imunidade celular e humoral de ninfas de 4º e 5º estádio de R. prolixus em resposta a uma infecção oral com a cepa Macias de T. rangeli. Na infecção oral em 4º estádio (acompanhamento em longo prazo), não foi observada diferença na mortalidade e muda ao comparar com os insetos controle não infectados. Constatou-se um número aumentado de flagelados no intestino das ninfas de 5º estádio durante o curso da infecção. Também, não houve alteração significativa na contagem de microagregados hemocitários (nódulos) em infecções de 4º estádio, enquanto em ninfas infectadas em 5º estádio houve um aumento no número de nódulos. Por outro lado, não houve diferença no número de hemócitos em ambas as infecções Demonstramos nos dois tipos de infecção oral com T. rangeli em R. prolixus, em comparação com os insetos controle não infectados, que o intestino médio atenuou a atividade de fenoloxidase, aumentou as atividades antibacterianas testadas in vitro contra Serratia marcescens, e alterou a expressão relativa de genes que codificam para defensinas (DefA, DefB, DefC), prolixicina e lisozimas (LisAe LisB). Isto sugere a influência destas atividades sobre a contagem de unidades formadoras de colônias, encontradas diminuídas no trato digestivo do inseto. Em uma segunda etapa do estudo, foram comparadas as respostas de defesa em ninfas de 5º estádio de R. prolixus inoculadas com T. rangeli, cepas Macias e H14. A cepa Macias de T. rangeli não aumentou a mortalidade desses insetos, apresentou capacidade de sobreviver e se multiplicar na hemolinfa, aumentou o número de hemócitos, e induziu alta atividade de fenoloxidase. Em contraste, estes mesmos parâmetros medidos em insetos inoculados com a cepa H14 de T. rangeli foram diferentes daqueles encontrados com inoculação de insetos usando a cepa Macias. Conclui-se que R. prolixus responde de forma distinta frente a vias de infecção oral ou por inoculação com T. rangeli, sugerindo que a capacidade infectiva deste protozoário, pode ser alterada por modulação do sistema imune do vetor

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:20:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 antonio_goncalves_ioc_dout_2013.pdf: 2946820 bytes, checksum: 18a0b77b3b95468e0be2f5a0005d91c4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus da dengue compreende quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV1-4) e até o momento não existe nenhuma vacina disponível comercialmente contra este patógeno. Alguns autores apontam a proteína NS1 de DENV como um antígeno protetor. Entretanto, ainda não se sabe ao certo o seu papel na replicação viral, bem como na indução de proteção ou patogênese. Nosso grupo vem trabalhando com as vacinas de DNA contra a dengue, testando-os em modelos murinos. Camundongos imunizados com uma vacina de DNA (pcTPANS1), que contém o gene NS1 de dengue 2 (DENV2), mostraram altos níveis de anticorpos anti-NS1 e quase 100 % de proteção quando desafiados com DENV2 (4 LD50). Este projeto tem por objetivo o mapeamento da resposta imune protetora gerada pela vacina pcTPANS1. Os resultados revelaram que 50 % dos animais que receberam o soro de outros camundongos, previamente imunizados com o plasmídeo pcTPANS1, sobreviveram à infecção após o desafio com DENV2 (4 LD50). Entretanto quando utilizamos um segundo estoque viral com 40 LD50, todos os animais apresentaram altas taxas de mortalidade e fortes sinais clínicos da infecção, com exceção do grupo de camundongos imunizados com a vacina pcTPANS1. Posteriormente analisamos o papel da resposta imune celular na proteção. O ensaio de depleção in vivo mostrou que todos os animais vacinados e depletados de células CD4+ morreram após o desafio com DENV2, enquanto que 60 % dos animais depletados de CD8+ sobreviveram à infecção. Os ensaios de transferência adotiva de células T mostraram proteção somente no grupo de camundongos que receberam concomitantemente soro e linfócitos TCD4+ provenientes de animais imunizados com a vacina pcTPANS1 As células obtidas do baço de animais vacinados com o plasmídeo pcTPANS1 foram capazes de secretar IFN-\F067 após estímulo com o peptídeo 265AGPWHLGKL273, contido na proteína NS1 de DENV2 e descrito na literatura como específico para células TCD8+\F02E\F020Também avaliamos in vivo uma possível atividade citotóxica específica para este peptídeo. Nossos resultados mostraram que os camundongos imunizados com a vacina pcTPANS1 promoveram a lise das células alvo pulsadas anteriormente com o peptídeo. Além disso, quando células alvos foram administradas 72 horas após o desafio com DENV2, houve um aumento significativo do percentual de lise. Em outro ensaio para avaliação de citotoxicidade in vivo, os animais foram imunizados com pcTPANS1 e submetidos ao tratamento para depleção de células CD4+ ou CD8+ Nossos resultados demonstraram que a atividade citotóxica específica para o peptídeo 265AGPWHLGKL273 é atribuída principalmente à população de células TCD8+, pois quando analisamos os resultados obtidos com animais imunizados e depletados de células TCD8- o percentual de lise foi reduzido para 37,9 %, corroborando os dados da literatura que descreve este peptídeo como específico para células TCD8+. Além disso, avaliamos a indução de possíveis danos gerados com a vacina pcTPANS1, tanto por análises histopatológicas do fígado quanto por dosagens dos níveis séricos de enzimas hepáticas, sem a detecção de qualquer alteração nos animais imunizados. De um modo geral, o conjunto de resultados obtidos nesse trabalho sugere que a proteção mediada pela vacina pcTPANS1 no nosso modelo experimental está relacionada principalmente com a resposta de células TCD4+ em associação com anticorpos anti-NS1, embora a vacina ative também uma resposta de células TCD8+ citotóxica / Dengue virus comprises four antigenically distinct serotypes (DENV1 - 4) . Nowada ys, there is no commercially available vaccine against this pathogen. Some authors point out the NS1 protein fr om DENV as a protective antigen, h owever, its role in viral replication, as well as in the induction of protection or pathogenesis, remains still unclear. Our group has been working with DNA vaccines a gainst dengue testing them in murine models. Mice immunized with one DNA vaccine (pcTPANS1), which contains the NS1 gene from dengue 2 (DENV2), showed high levels of anti - NS1 antibodies and almost 100 % protection when challenged with DENV2 (4 LD 50 ). This project aims to map the protective immune response generated by the pcTPANS1. Results showed that 50 % of animals that received serum from other mice, previously immunized with the pcTPANS1, survived infection after challenge with DENV2 (4 LD 50 ). However when we used a second viral stock with 40 LD 50 , all animals showed high mortality rates and strong clinical signs of infection, except the mouse group immunized with the pcTPANS1 vaccine. Subsequently, we analyzed the role of the cellular immune response in protection. The in vivo depletion assay showed that all vaccinated and depleted from CD4 + cells died after challenge with DENV2, whereas 60 % of CD8 + depleted animals survived infection. The assays o f T cell adoptive transfer showed protection only in the mouse group receiving concomitantly serum and CD4 + T lymphocytes recovered from animals immunized with the pcTPANS1 vaccine . Splenocytes obtained from pcTPANS1 vaccinated animals were able to secrete IFN   after stimulation with the peptide 265 AGPWHLGKL 273 , present in NS1 protein from DENV2 and described as specific for CD8 + T cells  We also analyzed in vivo a possible cytotoxic activity specific for this peptide. Our results showed that mice immuniz ed with the pcTPANS1 vaccine promoted the lysis of target cells previously pulsed with the peptide. Besides, when target cells were given 72 hours after challenge with DENV2, there was a significant increase in the lysis percentage. In another assay for th e assessment of in vivo cytotoxicity, animals were immunized with pcTPANS1 and subjected to treatment for depletion of CD4 + or CD8 + cells. Our results showed that the cytotoxic activity specific for the peptide 265 AGPWHLGKL 273 is attributed mainly to the population of CD8 + T cells, because when we analyzed results obtained from animals immunized and depleted of CD8 Tcells, the lysis percentage was reduced to 37.9 %, corroborating data from literature which describes this peptide as specific for CD8 + T c ells. Moreover, we evaluated the induction of possible damages generated by the pcTPANS1 vaccine, either by histopathological analysis in the liver or by quantification of serum levels of hepatic enzymes, without detection of any alteration in immunized an imals. In general, results obtained in this work suggest that protection mediated by the pcTPANS1 vaccine in our experimental model is related mainly to the CD4 + T cells response in association with anti - NS1 antibodies, although the vaccine also activate s a CD8 + T cells cytotoxic response.

Submitted by Angelo Silva (asilva@icict.fiocruz.br) on 2016-07-20T14:04:17Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71865.pdf: 48467768 bytes, checksum: dcb3b08cfc32a71a87cfc37712819a0b (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-07-21T15:21:07Z (GMT) No. of bitstreams: 2 71865.pdf: 48467768 bytes, checksum: dcb3b08cfc32a71a87cfc37712819a0b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-21T15:21:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 71865.pdf: 48467768 bytes, checksum: dcb3b08cfc32a71a87cfc37712819a0b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As doenças tropicais não ocorrem de forma isolada devido a sua prevalência e distribuição. A malária e parasitoses intestinais são infecções endêmicas em várias regiões do planeta, incluindo a região amazônica. Evidência experimental mostra que infecções parasitárias concomitantes podem induzir modificações na resposta imune específica a antígenos de cada patógeno e nas manifestações clínicas causadas por essas infecções. Atualmente no Brasil são escassas informações sobre a prevalência de coinfecções malária-parasitoses intestinais em humanos, ou dados descrevendo alterações na resposta imune a estes patógenos quando elas se encontram associadas. Este fato nos levou a estudar tanto a prevalência quanto as alterações nas variáveis clínicas e imunológicas associadas à coinfecção malária-parasitoses intestinais em indivíduos moradores de assentamentos na Amazônia legal, localizados no Estado de Rondônia, Brasil. A partir do diagnóstico coproparasitológico e parasitológico e molecular de Plasmodium, os indivíduos participantes do estudo foram agrupados em quatro grupos: Infectados somente por Plasmodium (M), indivíduos coinfectados Plasmodium-parasitoses intestinais (CI), infectados unicamente com parasitoses intestinais (IP) e indivíduos sem infecções por Plasmodium e/ou parasitoses intestinais (UN). Observamos uma frequência importante de indivíduos coinfectados com malária-parasitoses intestinais (18%). Também foi visto que os protozoários são o principal grupo de parasitoses intestinais infectando esta população. O protozoário observado com maior frequência foi Giardia intestinalis enquanto Strongyloides stercoralis foi o helminto mais frequente Não observamos alterações de variáveis hematológicas nos indivíduos coinfectados comparados com os indivíduos com malária. Em relação à avaliação dos níveis de citocinas, não observamos diferenças entre os indivíduos dos grupos CI e M. Os indivíduos infectados com Plasmodium apresentaram altos níveis de IL-6, TNF-\03B1, IL-10 e CRP, junto com baixos níveis de IL-17ª. Em contraste, foram observados altos níveis de IL-17ª em indivíduos do grupo IP. Posteriormente foi avaliada a alteração da resposta humoral a proteínas plasmodiais em resposta à coinfecção. Não observamos alterações da produção de anticorpos contra as proteínas PvAMA-1 e PvMSP-119 associada à coinfecção, porém, o grupo PI apresentou menor frequência de resposta e menores índices de reatividade de IgG para as duas proteínas. Contudo, não foram observadas alterações na frequência de respondedores e índices de reatividade nas subclasses de IgG contra as duas proteínas recombinantes nos indivíduos do grupo CI. Em conjunto, estes resultados mostram que as infecções por parasitos intestinais são frequentes na população estudada, além de existir uma grande riqueza de algumas espécies de protozoários. Entretanto, apesar da prevalência destas infecções na população, elas parecem não influenciar as variáveis hematológicas, níveis de citocinas e anticorpos contra antígenos de P. vivax nos indivíduos coinfectados / Abstract: Tropical diseases do not occur isolated due to their prevalence and distribution. Malaria and intestinal parasites are endemic infections in several regions of the planet including amazonic regions. Experimental evidence has shown that concomitant parasitic infections could induce changes in both immune response to pathogen antigens and clinical manifestations caused by them. Nowadays there are few studies of prevalence of malaria-intestinal parasite coinfections in human populations, or data describing alterations caused in immune response to these pathogens when both infections coexist simultaneously. This lack of information led us to study the prevalence and changes of hematologic and immunological variables associated to coinfections in a population from a settlement located in the Amazon region in Brazil. Here we show in two articles the results of the investigation conducted in the described population. From stool samples diagnosis and parasitological and molecular diagnosis of Plasmodium, the studied individuals were grouped in: Individuals single-infected with Plasmodium (M), Plasmodium-intestinal parasites coinfected individuals (CI), Individuals single-infected with intestinal parasites (IP) and individuals without Plasmodium and/or intestinal parasite infections (UN). In the first paper a high frequency of coinfected individuals was observed (18%) We also observed that protozoans were the main intestinal parasite group infecting the studied population. Among protozoans the most prevalent species was Giardia intestinalis and the most prevalence helminth species was Strongyloides stercoralis. There were no changes in hematologic variables or cytokines comparing individuals from M and CI groups. Individuals infected with Plasmodium (groups M and CI) presented increased levels of de IL-6, TNF-\03B1, IL-10 and CRP, and low levels of LI-17A. On the other hand, individuals from IP group had increased levels of IL-17A. In the second paper we did not find changes in the antibody levels directed to PvAMA-1 and PvMSP-119 associated to coinfections. Nevertheless, the group of individuals with intestinal parasites presented a reduced frequency of responders and lower reactivity indexes of IgG subclasses frequencies and reactivity indexes among the groups studied. Together these results show that in the studied population there exists an important prevalence and intestinal parasites, mainly of protozoans. However, in spite of the important values of intestinal parasites prevalences in the population; hematological variables, cytokines and antibody production directed to P. vivax antigens are not affected in coinfected individuals

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um Pestivirus, pertencente à família Flaviviridae, o qual é dividido em dois genótipos ou espécies (BVDV-1 e BVDV-2), e em pelo menos 20 subgenótipos de BVDV-1 (1a-1t) e três de BVDV-2 (2a-2c). O BVDV também pode ser classificado em biótipos [citopático(cp) e não-citopático (ncp)]. As perdas reprodutivas podem ser a consequência econômica mais importante da infecção. A infecção persistente (PI) pode ocorrer quando há uma infecção entre os 42 e 125 dias de gestação, e se o feto sobreviver, o bezerro será imunotolerante ao vírus e como resultado pode desenvolver doença das mucosas (DM). O objetivo desse estudo é descrever um surto de infecção por BVDV-1d em bezerros de corte que apresentaram lesões de DM atípica, abordando aspectos clínicos, epidemiológicos, virológicos e patológicos. O surto ocorreu em uma propriedade rural de bovinos de corte Angus localizada em Glorinha, Rio Grande do Sul, Brasil. Em um intervalo de 15 dias, 11 de 164 bezerros apresentaram sinais clínicos de anorexia, sialorreia acentuada, perda de peso e andar rígido com claudicação, progredindo para decúbito e morte em um curso clínico de sete dias. Todos esses 11 bezerros apresentavam em mucosa oral e nasal, região interdigital de membros torácicos e pélvicos extensas áreas de ulceração. Três bezerros foram necropsiados: úlceras orais e nasais foram observadas, frequentemente envolvendo gengiva, palato duro, palato mole e plano nasal; ulcerações lineares multifocais na língua, esôfago e rúmen; e também ulcerações multifocais arredondadas no abomaso. Além disso, o bezerro #2 exibiu na pele de regiões ventrais do corpo espessamento difuso com formação crostosa acentuada, ocasionalmente áreas de ulceração. Microscopicamente, as lesões ulcerativas em mucosas e pele consistiam em necrose superficial, com numerosas células apoptóticas, células epiteliais vacuolizadas e hiperqueratose paraqueratótica difusa acentuada. O exame imuno-histoquímico (IHQ) da pele dos três bezerros evidenciou acentuada imunomarcação no citoplasma de células epiteliais, enquanto na mucosa oral evidenciou moderada a acentuada imunomarcação. Todos os 11 bezerros mortos foram positivos no RT-PCR para detecção do Pestivirus, assim como outros 11 bezerros vivos (de 387 animais restantes no rebanho). Após quatro semanas, os exames de RT-PCR e IHQ dos 11 bezerros vivos foram repetidos com resultados positivos, comprovando o status de animais PI. O sequenciamento de partes do genoma determinou que todos animais haviam sido infectados por um BVDV- 1 do subgenótipo “d”. BVDV cp foi isolado das amostras de 8 bezerros mortos; enquanto apenas BVDV ncp foi isolado de amostras dos 11 bezerros vivos. Os achados patológicos, moleculares e virológicos permitiram concluir que esse foi um surto de DM atípico em bezerros causado por BVDV-1d com lesões restritas ao trato alimentar superior e pele. Como as características epidemiológicas e clínicas de doenças vesiculares podem ser muito similares ao observado, recomenda-se que os testes diagnósticos específicos para BVDV (histopatologia, IHQ e RT-PCR) sejam empregados rotineiramente na necropsia em surtos com lesões atípicas similares em bovinos. / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is a Pestivirus, belonging to the Flaviviridae family, also divided in two genotypes or species (BVDV-1 and BVDV-2), and in at least 20 subgenotypes of BVDV-1 (1a-1t) and three of BVDV-2 (2a-2c). BVDV can also be classified into biotypes (cytopathic and noncytopathic). Reproductive losses may be the most economically important consequence of the infection. Persistent infection (PI) may occur when there is an infection between 42 and 125 days of gestation, and if the fetus survives, the calf will be immunotolerant to the virus and a possible outcome is mucosal disease (DM). The aim of this study is to describe an outbreak of BVDV-1d infection in calves of a beef herd cattle that presented atypical DM lesions, with a clinical, epidemiological, virological and pathological approach. The outbreak occurred in a beef Angus cattle farm located in Glorinha, Rio Grande do Sul state, Brazil. Within 15 days, 11 of 164 calves presented clinical signs of anorexia, severe sialorrhoea, weight loss and stiff gait with lameness, progressing to recumbency, and death in a clinical course of seven days. All these 11 calves presented in oral and nasal mucosa, interdigital region of thoracic and pelvic limbs extensive areas of ulceration. Three calves were necropsied: oral and nasal ulcers were observed, often involving gingiva, hard palate, soft palate and nasal planum; multifocal linear ulcerations in tongue, esophagus and rumen; and also rounded multifocal ulcerations in the abomasum. In addition, calf #2 showed diffuse thickening of the skin with severe crust formation, occasionally ulceration, in ventral body regions. Microscopically, ulcerative lesions observed in mucosas and cutaneous lesions consisted of superficial necrosis, with numerous apoptotic cells, vacuolation of epithelial cells and severe diffuse parakeratotic hyperkeratosis. Immunohistochemistry (IHC) of skin of the three calves showed severe immunostaining in the cytoplasm of epithelial cells, while oral mucosa showed moderate to severe immunostaining. All 11 dead calves were positive in RT-PCR for detection of Pestivirus along with other 11 live calves (from 387 remaining animals from herd). After four week, RT-PCR and IHC of these 11 live animals were repeated with positive results, which prove the PI status of these animals. All animals were infected by BVDV-1 of subgenotype ”d” according to parts of the genome of the virus that were sequenced.. Cytopathic BVDV was isolated from samples of 8 dead calves; only non-cytophatic BVDV were isolated from samples of 11 live animals. Pathological, molecular and virological findings allowed us to conclude that this was an outbreak of atypical DM in calves caused by BVDV-1d with lesions restricted to the upper alimentary system and skin. Since epidemiological and clinical features of vesicular diseases may be very similar to what was observed, it is recommended that BVDV diagnostic tests (histopathology, IHC and RT-PCR) should be routinely included in the necropsy workup in outbreaks with similar atypical lesions in cattle.

Após o nascimento, os recém-nascidos são expostos a vários tipos de micro-organismos, que podem determinar um processo infeccioso devido a sua imaturidade imunológica. Dentro deste processo, a amamentação tem um papel importante pela transferência passiva de imunoglobulina A (IgA). A cavidade oral é a principal porta de entrada destes agentes, especialmente os estreptococos, sendo que alguns colonizam inicialmente como Streptococcus gordonii (SGO), S. sanguinis (SSA) e S. mitis (SMI) e outros podem causar doenças, como S. mutans (SM), por ser o principal agente etiológico da cárie dentária. Pouco se sabe sobre a especificidade de IgA do colostro contra antígenos importantes destes estreptococos, o que pode ajudar na investigação dos mecanismos de estimulação antigênica e desenvolvimento da resposta imune de mucosa. Para tanto, foi avaliado no presente estudo, a especificidade e os níveis de IgA três antígenos de virulência de SM: glucan binding protein B (gbpB), glicosiltransferase (GTF) e antígeno I/II (Ag I/II) envolvidos na capacidade destas bactérias de aderir e acumular no biofilme. Além disso, as glicosiltransferases: 153 kDa de SGO e 170 kDa de SSA e IgA1- protease de SMI (220 kDa) em amostras de colostro humano. Um total de 77 amostras de colostro foram analisadas quanto aos níveis de immunoglobulian A, M e G por ELISA. A complexidade da IgA contra as bactérias foram analisadas por Western blot. Os resultados mostraram que a concentração média de IgA foi de 2850,2 (±2567,2) mg/100 mL sendo estatisticamente maior (p<0.05) dos níveis de IgM e de IgG (respectivamente 321,8±90,3 e 88,3± 51,5 mg/100 mL). A maioria das amostras tiveram níveis detectáveis de anticorpos IgA para extratos de antígenos de bactérias e seus antígenos de virulência, apresentando um elevado número de bandas reativas. Não houve diferença estatisticamente significante no número médio de IgA reativas a Ags entre os antígenos (p>0.4). A detecção de gbpB foi significativamente menor do que os outros antígenos de SM (p<0.05). Assim, o leite materno das primeiras horas após o nascimento apresentou níveis significativos de IgA contra importantes antígenos de virulência dos estreptococos orais estudados, que pode sugerir que a amamentação antes da erupção dos dentes pode interferir no processo de instalação e acumulação destes microorganismos na cavidade oral. / After birth, newborn babies are exposed to several types of microorganisms that can determine an infectious process due to their immunological immaturity. In this case, the feeding plays an important role by passive transfering of immunoglobulin A (IgA). The oral cavity is the main gateway of these agents, especially streptococci, some initially colonize as Streptococcus gordonii (SGO), S. sanguinis (SSA) and S. mitis (SMI) and others can cause diseases such as S. mutans (SM), as the main agent of tooth decay. Little is known about the specific IgA against major antigens of these streptococci which can help in the investigation of antigenic stimulation mechanisms and development of mucosal immune response. Therefore, we evaluated in this study, the specificity and levels of IgA from colostrum against three SM virulence antigens: glucan binding protein B (gbpB), glycosyltransferase (GTF) and antigen I/II (Ag I/II) involved in capacity these bacteria to adhere to and accumulate in the biofilm. Also, the glycosyltransferases: 153 kDa-SGO and 170 kDa-SSA and IgA1- protease of SMI (220 kDa). This study involved 77 samples of colostrum that were analyzed for levels of immunoglobulian A, M and G by Elisa. The specificity of IgA against extracts of SM and initials colonizators (SSA, SMI, SGO) were analyzed by the western blot. The mean concentration of IgA was 2850.2 (± 2567.2) mg/100ml followed by IgM and IgG (respectively 321.8 ± 90.3 and 88.3 ± 51.5), statistically different (p<0.05). Results showed that the majority of samples had detectable levels of IgA antibodies to extracts of bacteria antigens and theirs virulence antigens. To SM, the GbpB was significantly lower detected than others antigens of SM (p<0.05). High complexities of response to Ags were identified in the samples. There were no significant differences in the mean number of IgA-reactive Ags between the antigens (p>0.4). So, the breast milk from first hours after birth presented significant levels of IgA specific against important virulence of antigens those oral streptococci, which can disrupt the installation and accumulation process of these microorganisms in the oral cavity.

Após o nascimento, os recém-nascidos são expostos a vários tipos de micro-organismos, que podem determinar um processo infeccioso devido a sua imaturidade imunológica. Dentro deste processo, a amamentação tem um papel importante pela transferência passiva de imunoglobulina A (IgA). A cavidade oral é a principal porta de entrada destes agentes, especialmente os estreptococos, sendo que alguns colonizam inicialmente como Streptococcus gordonii (SGO), S. sanguinis (SSA) e S. mitis (SMI) e outros podem causar doenças, como S. mutans (SM), por ser o principal agente etiológico da cárie dentária. Pouco se sabe sobre a especificidade de IgA do colostro contra antígenos importantes destes estreptococos, o que pode ajudar na investigação dos mecanismos de estimulação antigênica e desenvolvimento da resposta imune de mucosa. Para tanto, foi avaliado no presente estudo, a especificidade e os níveis de IgA três antígenos de virulência de SM: glucan binding protein B (gbpB), glicosiltransferase (GTF) e antígeno I/II (Ag I/II) envolvidos na capacidade destas bactérias de aderir e acumular no biofilme. Além disso, as glicosiltransferases: 153 kDa de SGO e 170 kDa de SSA e IgA1- protease de SMI (220 kDa) em amostras de colostro humano. Um total de 77 amostras de colostro foram analisadas quanto aos níveis de immunoglobulian A, M e G por ELISA. A complexidade da IgA contra as bactérias foram analisadas por Western blot. Os resultados mostraram que a concentração média de IgA foi de 2850,2 (±2567,2) mg/100 mL sendo estatisticamente maior (p<0.05) dos níveis de IgM e de IgG (respectivamente 321,8±90,3 e 88,3± 51,5 mg/100 mL). A maioria das amostras tiveram níveis detectáveis de anticorpos IgA para extratos de antígenos de bactérias e seus antígenos de virulência, apresentando um elevado número de bandas reativas. Não houve diferença estatisticamente significante no número médio de IgA reativas a Ags entre os antígenos (p>0.4). A detecção de gbpB foi significativamente menor do que os outros antígenos de SM (p<0.05). Assim, o leite materno das primeiras horas após o nascimento apresentou níveis significativos de IgA contra importantes antígenos de virulência dos estreptococos orais estudados, que pode sugerir que a amamentação antes da erupção dos dentes pode interferir no processo de instalação e acumulação destes microorganismos na cavidade oral. / After birth, newborn babies are exposed to several types of microorganisms that can determine an infectious process due to their immunological immaturity. In this case, the feeding plays an important role by passive transfering of immunoglobulin A (IgA). The oral cavity is the main gateway of these agents, especially streptococci, some initially colonize as Streptococcus gordonii (SGO), S. sanguinis (SSA) and S. mitis (SMI) and others can cause diseases such as S. mutans (SM), as the main agent of tooth decay. Little is known about the specific IgA against major antigens of these streptococci which can help in the investigation of antigenic stimulation mechanisms and development of mucosal immune response. Therefore, we evaluated in this study, the specificity and levels of IgA from colostrum against three SM virulence antigens: glucan binding protein B (gbpB), glycosyltransferase (GTF) and antigen I/II (Ag I/II) involved in capacity these bacteria to adhere to and accumulate in the biofilm. Also, the glycosyltransferases: 153 kDa-SGO and 170 kDa-SSA and IgA1- protease of SMI (220 kDa). This study involved 77 samples of colostrum that were analyzed for levels of immunoglobulian A, M and G by Elisa. The specificity of IgA against extracts of SM and initials colonizators (SSA, SMI, SGO) were analyzed by the western blot. The mean concentration of IgA was 2850.2 (± 2567.2) mg/100ml followed by IgM and IgG (respectively 321.8 ± 90.3 and 88.3 ± 51.5), statistically different (p<0.05). Results showed that the majority of samples had detectable levels of IgA antibodies to extracts of bacteria antigens and theirs virulence antigens. To SM, the GbpB was significantly lower detected than others antigens of SM (p<0.05). High complexities of response to Ags were identified in the samples. There were no significant differences in the mean number of IgA-reactive Ags between the antigens (p>0.4). So, the breast milk from first hours after birth presented significant levels of IgA specific against important virulence of antigens those oral streptococci, which can disrupt the installation and accumulation process of these microorganisms in the oral cavity.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2012-08-21T16:31:44Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Renato Abdala.pdf: 2009448 bytes, checksum: 415669cc9e6a0622d6f58202d33f6488 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-21T16:31:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Renato Abdala.pdf: 2009448 bytes, checksum: 415669cc9e6a0622d6f58202d33f6488 (MD5) / CPqRR/FIOCRUZ: Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico INCT-DT: Instituto Nacional de Ciência e tecnologia de Doenças Tropicais / Neste estudo foram avaliadas as principais alterações hematológicas e imunofenotípicas em pacientes portadores da fase crônica da esquistossomose (INF), subcategorizados por cargas parasitárias distintas, apresentando menos de 100 ovos por grama de fezes (<100) e mais de 100 ovos por grama de fezes (>100) e indivíduos negativos para ovos residentes (CA) ou não (CT) em áreas endêmicas para a doença. Amostras de fezes e sangue periférico foram coletadas para realização de exame parasitológico pelo método de Kato-Katz e hemograma, respectivamente. Logo após, foi realizado a avaliação do perfil imunofenotípico ex vivo dos leucócitos circulantes e a produção de citocinas em culturas de células mononucleares do sangue periférico, após estimulação antigênica in vitro por 12 horas na ausência ou presença de antígenos solúveis do ovo (SEA), do verme adulto (SWAP) e proteínas recombinantes (Sm22.6 e Sm29) do Schistosoma mansoni. Os resultados mostraram aumento no número absoluto de eosinófilos nos grupos INF e >100. Em relação ao perfil imunofenotípico, foi observado aumento da expressão dos receptores do Tipo Toll-2, CD80, CD86 e CD54 em monócitos dos grupos CA, INF, e >100 em relação ao grupo CT. Foi observado também aumento do receptor CD18 em linfócitos T CD4+ dos grupos CA e <100 em relação ao grupo CT, diminuição do CD18 no grupo >100 em relação ao grupo <100 e aumento da expressão do CD18 no grupo <100 em relação ao grupo CA. Em linfócitos T CD8+ foi observado aumento na expressão do receptor do tipo Toll-2 nos grupos INF, <100 e >100 em relação ao grupo CT, aumento do CD18 nos grupos <100 e CA em relação ao grupo CT e diminuição do CD18 no grupo >100 em relação ao grupo <100. Em linfócitos B, foi observado aumento da expressão do receptor CD80 e CD86 no grupo <100 em relação ao CT e aumento na expressão do CD86 no grupo CA em relação ao grupo CT. A análise após estimulação antigênica revelou, em monócitos, aumento da síntese de TGF-nos grupos INF e >100 estimulados com Sm22.6 e SEA em relação ao CA, redução na síntese de IL-10 e IL-12 no grupo INF em relação ao grupo CA estimulado com Sm22.6 e redução na síntese de IL-1nos grupos CAINF, <100 e >100estimulados com Sm22.6 e SEA em relação ao meio. Houve também, redução de expressão de IL-5 no grupo <100 em relação ao CA estimulado com Sm22.6, aumento na síntese de IFN- nos grupo INF e >100 estimulados com SEA em relação ao meio e aumento na síntese de F-e IL-10 nos grupo INF e >100 estimulados com Sm22.6 e SEAem relação ao grupo CA em linfócitos T CD4+. Além disso, houve aumento da síntese de IL-12 e TNF-no grupo INF em relação ao CA estimulado com SEA, redução de IL-8 no grupo >100 em relação ao grupo <100 estimulados com SEA, SWAP e Sm22.6 e redução de síntese de IL-5 no grupo INF estimulado com SWAP em relação ao CA em linfócitos T CD8+. Após a realização desse trabalho, pode-se concluir que indivíduos portadores da fase crônica e residentes em área endêmica para a doença apresentam forte expressão de moléculas co-estimuladoras, de adesão e de ativação celular em monócitos, linfócitos B, linfócitos T CD4+ e CD8+ do sangue periférico, sugerindo que estes indivíduos possuam intensa atividade das células envolvidas na resposta imune contra a infecção pelo S. mansoni. Além disso, de uma maneira geral, os indivíduos infectados apresentaram, após estimulação antigênica com antígenos recombinantes, redução na síntese de citocinas pró inflamatórias e aumento da síntese de citocinas reguladoras tanto para monócitos quanto para linfócitos. Isto mostra uma enorme capacidade que esses antígenos possuem em induzir uma modulação da resposta imune relacionada à resistência a infecção e a uma menor gravidade da doença. A categorização da população estudada, segundo intensidades de infecção distintas, definiu a contribuição dessa variável para os mecanismos de resistência e susceptibilidade durante a infecção esquistossomótica. / In this study, hematological and immunological features were determined in patients with chronic phase of schistosomiasis (INF), subcategorized by distinct parasitic loads in those with less than 100 eggs per gram of feces (<100) or more than 100 eggs per gram of feces (> 100). Non infected patients resident (CA) or not (CT) in endemic areas for the disease were evaluated as control groups. Stool samples and peripheral blood were collected to perform parasitological exams and hemogram, respectively. Afterwards, it was performed the immunophenotypic profile of circulating leukocytes and cytokine pattern in peripheral blood mononuclear cells cultures after antigenic stimulation in vitro at 12 hours in the absence or presence of soluble egg antigens (SEA), soluble worm antigen preparation (SWAP) and recombinant proteins of Schistosoma mansoni (Sm22.6 and Sm29 ). The results showed an increase in the absolute number of eosinophils in INF and >100 groups. It was also observed an increase in expression of TLR2, CD80, CD86 and CD54 on monocytes from CA, INF, and >100 groups as compared to CT group. It was still observed an increase in the CD18 receptor expression in T CD4+ lymphocytes from CA and <100 groups as compared to CT group. Decreased CD18 expression on >100 as compared to <100 group as well as increased expression of CD18 in <100 group as compared to CA group were also detected. Analyses of T CD8+ lymphocytes demonstrated an increase in the TLR2 expression from INF, <100 and >100 groups as compared to the CT group. Increased CD18 expression in <100 and CA groups as compared to CT group as well as decreased in CD18 expression from >100 as compared to <100 group were still revealed. In B lymphocytes, there was an increase in the both CD80 and CD86 expressions on <100 group as compared to CT group, and an increase in the CD86 expression from CA group as compared to CT group. The analysis after antigenic stimulation revealed in monocytes increased TGF- synthesis from INF and >100 groups stimulated with SEA and Sm22.6 as compared to CA group, and decreased IL-10, IL-12 synthesis from INF group as compared to CA group, and decreased IL-1 syntheses from CA, INF, <100 and >100 groups estimualated with SEA and Sm22.6 as compared to absence of stimulation. There was also reduction in positivity for IL-5 from <100 group stimulated with Sm22.6 as compared to CA group and increase in the IFN- from INF and >100 groups stimulated with SEA as compared to absence of stimulation  increase in F- and IL-10 synthesis from INF and >100 groups stimulated with SEA and Sm22.6 as compared to absence of stimulation by T CD4+ lymphocytes besides of increased IL-12 and TNF- from INF group stimulated with SEA as compared to CA group decreased IL-8 syntheses from >100 group stimulated with SEA, SWAP and Sm22.6 as compared to <100 group and decreased IL-5 syntheses from INF group stimulated with SWAP as compared to CA group by T CD8+ lymphocytes. In conclusion, the individuals with chronic phase of schistosomiasis and residents in endemic areas for the disease have strong expression of co-stimulatory, adhesion and cell activation molecules in circulating monocytes, B cells and CD4+ and CD8+ T lymphocytes, suggesting that these individuals have intense cellular activity that might be involved in immune response against S. mansoni infection. Overall, infected individuals presented, after antigenic stimulation in vitro with recombinant specific antigens, reduced syntheses of pro-inflammatory cytokines apart of increased regulatory cytokine synthesis from both monocytes and lymphocytes revealing a great ability of these antigens to induce a modulation of immune response related to the resistance to infection as well as a lower disease severity. The subcategorization of the study population according to distinct intensity of infection better define the contribution of this parameter to resistance or susceptibility during Schistosoma mansoni infection.

Made available in DSpace on 2016-03-01T13:50:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 fernanda_carvalho_ioc_mest_2013.pdf: 2915749 bytes, checksum: ee384ee737351ba7f424834b3c624fbc (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os indivíduos com hanseníase multibacilar (MB) apresentam uma baixa capacidade de produzir IFN-\03B3 em resposta ao Mycobacterium leprae, agente etiológico da doença, e consequentemente, apresentam uma alta carga bacilar constituindo as principais fontes de disseminação e transmissão do bacilo. Por outro lado, contatos intradomiciliares destes doentes constituem o grupo de indivíduos com maior risco de adoecimento. O presente estudo tem como objetivo geral compreender os mecanismos de modulação negativa da resposta imune celular M. leprae específica em indivíduos sadios com alta exposição ao bacilo e em indivíduos com hanseníase MB, até hoje pouco esclarecidos. Para isto, avaliamos as frequências de linfócitos T CD4+ e CD8+ virgens, de memória central e de memória efetora recém-ativados em resposta ao M. leprae ou conjuntos de peptídeos nonâmeros (restritos a MHC de classe I, P.C.I) e pentadecâmeros (restritos a MHC de classe II, P.C.II) específicos do M. leprae em células mononucleares de sangue periférico (CMS) dos contatos domiciliares no início (T0) e ao longo do tratamento do caso índice (T1). Em paralelo, os níveis de 16 citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento secretados por CMS destes contatos estimuladas in vitro, em T0 e T1, com os antígenos mencionados. Nove contatos foram avaliados, dos quais sete foram vacinados com BCG em T0 Na maioria dos contatos, independente da vacinação ou não com BCG, observou-se um aumento da frequência de linfócitos T CD4+ de memória efetora a pelo menos um dos antígenos utilizados em T1. Detectou-se, também, um aumento consistente de células T CD8+ de memória efetora respondedoras a P.C.I. Observou-se variações nas frequências de linfócitos T CD4+ e/ou CD8+ produtores de IFN-\03B3 ou IL-10 M. leprae específicas no sangue periférico dos contatos. Entretanto, com o tamanho atual da amostragem populacional não foi possível observar diferenças estatisticamente significativas entre tempos avaliados. A vacinação com BCG gerou um perfil de resposta imune Th1 com aumento da secreção de IFN-\03B3 em seis dos sete contatos vacinados. Observamos, ainda, um aumento significativo da produção de G-CSF, GM-CSF, MCP-1, IL-6 e MIP-1\03B2 em resposta ao M. leprae ou a, pelo menos, um dos conjuntos de peptídeos M. leprae-específicos em T1. A partir dos dados obtidos, foi possível observar que o tratamento do caso índice e consequente eliminação da fonte de M. leprae vivo no ambiente juntamente com a vacinação com BCG contribuiram para o aumento de resposta imune celular M. leprae-específica dos contatos de pacientes multibacilares Numa última etapa do trabalho, padronizamos um protocolo para isolamento de células provenientes de lesões de pele de pacientes MB. Nossos dados iniciais sugerem uma abundância de células T CD8+ nestas lesões, concordando com observações anteriores. Uma análise detalhada do fenótipo funcional das células presentes na lesão lepromatosa poderá contribuir na definição das populações celulares envolvidas na modulação negativa da resposta imune protetora contra o M. leprae. Além disso, a caracterização funcional particularmente das células T CD8+ específicas para P.C.I seria de grande relevância para o entendimento da resposta imune protetora na hanseníase, com potencial aplicação no desenvolvimento de vacinas mais eficazes para o controle da doença / I ndividual s with multibacillary leprosy (MB) have a low capacity to produce IFN - γ in response to Mycobacterium leprae , etiologic al agent of leprosy , and consequently, have a high bacterial load, being the main sources of dissemination and transmission of the bacillus. Household contacts (HC) of these patients constitute the group of i ndividuals at highest risk for leprosy. The aim of the present study is to understand the mechanisms of cellular immune response downregulation by M. leprae in healthy individuals with high exposure to M. leprae and patients with MB leprosy, a phenomenon t hat remains poorly understood until today. In this work we evaluated the frequencies of recently activated naive , central memory and effector memory CD4 + and CD8 + T cells, in response to M. leprae and a pool of M. leprae - specific peptide nonamers ( MHC clas s I - restricted, P.C. I) and pentadeca mers ( MHC class II - restricted, P.C.II) in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of HC at the beginning (T0) and during the treatment of the index case (T1). We also compared the levels of 16 cytokines, chemokines and growth factors secreted by PBMC of these contacts stimulated in vitro with the same antigens at T0 and T1. Nine contacts were evaluated, which seven were vaccinated with BCG at T0. Most of the HC , independently of BCG vaccination, showed increased fre quency of CD4 + effector memory to at least one of the antigens used in T1. A consistent increase of CD8 + effector memory responsive to P . C . I was also detected. It was observed varia tions in the frequencies of CD4 + and / or CD8 + T cells producing IFN - γ or IL - 10 M. leprae - specific by PBMC from HC . However, with the current size of the sample population was not observed statistically significant differences between the time points studied. The BCG vaccine generated a Th1 immune response profile with increased s ecretion of IFN - γ in six out of seven vaccinated contacts. We also have observed a significant increase in the production of inflammatory mediators , such as G - CSF, GM - CSF, MCP - 1, IL - 6 and MIP - 1 β in response to M. leprae or at least one of the M. leprae - specific peptide po ols at T1. It was observed in the our data that index case treatment and consequent elimination of the live M. leprae source from the environment, together with BCG vaccination contributed to the increase in M. leprae - specific cellular immune response in H C of MB patients. In the final step of this work, we standardized a protocol for isolation of cells from biopsies of skin lesions of MB patients. I n agreement with previous observations , our i nitial data suggest an abundance of CD8 + T cells. A detailed ana lysis of the functional phenotype of the cells present in lepromatous lesions may contribute to the definition of cell populations involved in negative modulation of the immune response against M. leprae . The functional characterization, particularly of CD 8 + T cells specific to P.C.I, would be of great relevance to understand the protective immune response in leprosy, with potential application in the development of more effective vaccines to control the disease

Made available in DSpace on 2016-03-10T13:18:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 fernanda_cortes_ioc_dout_2014.pdf: 5719125 bytes, checksum: 6db914d863efd13cbfcacc7296b02027 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A pandemia do HIV-1 é a infecção emergente mais importante das últimas décadas. O desenvolvimento de uma vacina é colocado como a melhor estratégia para o controle da pandemia. No entanto, entre os candidatos vacinais que evoluíram para testes clínicos de eficácia, apenas um mostrou resultados positivos, mas com uma modesta eficácia (31,2%). Além da busca por uma vacina eficiente contra a infecção pelo HIV-1, o desenvolvimento de estratégias para se atingir a cura também é essencial. Considerando esses dois objetivos principais, diversos fatores são colocados como obstáculos, sendo a enorme diversidade genética do HIV-1 e a falta de correlatos de proteção contra a doença ou a infecção, os pontos centrais e nos quais focamos nossa atenção. No primeiro trabalho, foi avaliada a resposta de células T frente a peptídeos derivados de sequências consensos e sequências de isolados virais mais próximos ao consenso (CVI) dos três subtipos prevalentes no Brasil, B, C e F1 e do grupo M. O estudo incluiu 32 indivíduos infectados com o HIV-1, subtipo B (n = 13), subtipo C (n = 11) e subtipo F1 (n = 8). As respostas específicas frente a Gag e Nef foram avalidas usando o ensaio de ELISpot IFN-\03B3. Peptídeos baseados nas sequências CVI apresentaram capacidade de redução da distância genética e de detecção da resposta de células T similar ao observado para as sequências consenso Em geral, o nível de reatividade cruzada entre os subtipos B e F1 foi maior do que entre os subtipos B e C ou entre os subtipos C e F1. Esses resultados sugerem que o obstáculo imposto pela diversidade genética no desenho de vacinas é dependente dos subtipos envolvidos. No segundo trabalho foi avaliada a resposta de células T de indivíduos controladores da replicação viral frente aos peptídeos consenso, derivados do primeiro estudo. Além disso, foi feita uma avaliação de fatores genéticos e imunológicos nesse grupo de controladores. O estudo incluiu três grupos de controladores: 1) Controladores de Elite (EC, n=7) com carga viral (CV) <80 cópias/mL em todos os pontos; 2) Controladores de Elite com Blips (EEC, n=5) com CV>80 cópias/mL em apenas 30% dos pontos e 3) Controladores Virêmicos (VC, n=7) com CV <5.000 cópias/mL e >80 cópias/mL em mais de 30% dos pontos. Indivíduos infectados pelo HIV-1 não tratados (NC) ou em tratamento antirretroviral (HAART) e indivíduos não infectados pelo HIV-1 foram analisados como controles. A coorte de controladores foi enriquecida em alelos protetores HLA-B, B*27 e B*57, mas não foi observada diferenças significativas entre os três grupos de controladores. O DNA viral circular (2-LTR) foi detectado nos EEC (3/5) e nos VC (6/7), mas não nos EC Uma frequência maior de células T CD8+ ativadas foi observada em EEC e VC quando comparada a indivíduos não infectados. Os EC demonstraram uma resposta de células T de menor magnitude frente a Gag/Nef e uma proporção de anticorpos IgG anti-HIV significativamente menor (P < 0,05) que os grupos de EEC, VC e NC. Esses resultados demonstram que EEC e VC são capazes de montar uma resposta imune específica mais forte frente a estímulos do HIV-1, mas paralelamente, apresentam maiores níveis de ativação imune, translocação microbiana e maior reservatório viral, quando comparados aos EC. Esses resultados destacam a heterogeneidade dos indivíduos capazes de controlar a replicação viral e reforçam a necessidade de uma classificação mais precisa de indivíduos infectados pelo HIV-1 com diferentes níveis de controle / The HIV - 1 pandemic bas been the most relevant infections that has emerged in the last decades. V accine developmen t has been considered as the best strategy to control th is pandemi c, h owever, the candidate vaccines that have evolved to the stage of efficacy clinical trials , only one presented positive results and even that with very modest efficacy (31,2%). As such, s trategies to find a cure is essential though has been hindered by several obstacles such as t he enormous genetic diversity of HIV - 1 and lack of correlates of protection against disease or infection . These two obstacles were investigated in the present stu dy by evaluating the T cell response against peptides based on consensus and closest viral isolate sequences (CVI) from the three prevalent subtypes in Brazil, B, C and F1 and from group M consensus. The study included 32 subjects infected with HIV - 1 subty pe B (n = 13), C (n = 11), and F1 (n = 8). Gag and Nef - specific T cell responses were evaluated by IFN - γ - ELISpot assay. Peptides based on CVI sequences were similar to consensus in both reducing genetic distance and detecting T cell responses . Overall, the level of cross - subtype response between su btypes B and F1 was higher than between subtype C and B or C and F1. Our results suggest that the barrier of genetic diversity in HIV - 1 group M for vaccine design may be dependent on the subtypes involved. The second study evaluated the T cell response fr om controllers against peptides derivate d from the first study. In addition , we performed an evaluation of the genetics and immunologic patterns in this cohort of controllers. The study included three controller groups: 1) Elite Controllers (EC, n = 7) wit h VL <80 copies/mL in all determinations; 2) Ebbing Elite Controllers (EEC, n = 5) with transient viremia (blips); and 3) Viremic Controllers (VC, n = 7) with plasma viremia <5,000 copies/mL. HIV - 1 infected subjects u ntreated non - controllers (NC), patients under suppressive HAART and HIV - 1 negative healthy individuals were also analyzed as controls. This cohort was enriched by the protective HLA - B alleles B*27 and B*57, but no significant differences were observed among distinct groups of controllers. 2 - LTR circles were detected in EEC (3/5) and VC (6/7) , but not in EC. A higher frequency of activated CD8 + T cells was observed in EEC and VC than in HIV negative subjects. EC displayed a weaker Gag/Nef IFN - γ T cell response and a significantly lower proportion (p < 0.05) of anti - HIV IgG antibodies than EEC, VC and NC groups. These data showed that EEC and VC are able to mount a stronger HIV - specific immune response, but experience increases in the level of immune activation, microbial translocation and size of the HIV - 1 DNA reservoir compared to EC. These results highlight the heterogeneity of the HIV controllers and reinforce the needs for a precise classification of patients with different levels of viral suppression.

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:47:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 amanda_cavalcanti_ioc_dout_2014.pdf: 8125448 bytes, checksum: a21804f13675939416a209e2c1250af8 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Leishmaniose Visceral causada pela Leishmania infantum é uma doença zoonótica no Novo Mundo em que o cão é o principal hospedeiro doméstico. O conhecimento prévio dos mecanismos imunopatogênicos associados à infecção por L. infantum é necessário para o desenvolvimento de vacinas e outras estratégias de controle. O objetivo geral desta tese foi correlacionar a expressão clínica, a carga parasitária, a resposta imunológica do hospedeiro e a diversidade genética dos parasitos em cães naturalmente infectados por L. infantum. O presente estudo é uma avaliação transversal de noventa e dois cães naturalmente infectados por L. infantum provenientes do estado do Mato Grosso. A infecção dos animais incluídos no estudo foi confirmada por sorologia, cultura e /ou PCR. O diagnóstico etiológico foi realizado por PCR-RFLP para o gene hsp70 e por eletroforese de enzimas nos parasitos isolados. Foram ainda analisados os sinais clínicos, a resposta imune pela expressão gênica de citocinas, a carga parasitária por qPCR, as alterações histológicas no baço e fígado e a as populações e genótipos de L. infantum circulantes por meio da análise do polimorfismo de microssatélites. Foram definidos grupos de acordo com a carga parasitária esplênica e hepática. Os animais com alta carga parasitária apresentaram altos títulos de anticorpos específicos anti-Leishmania e mais sinais clínicos da doença A carga parasitária no baço foi maior do que no fígado e houve correlação com o rompimento da arquitetura esplênica, caracterizado principalmente pela desorganização da polpa branca. No fígado, a carga parasitária foi correlacionada positivamente à ocorrência de granulomas, à degeneração dos hepatócitos bem como à intensidade do infiltrado inflamatório. Mostramos que a maior carga parasitária promoveu menor expressão gênica de IL-12, IFN\03B3, TNF, IL-6, TGF\03B2 e IL-10 no baço e maior expressão de CCL2, CXCL8 e MAP4K4 no fígado. A análise genética dos parasitos é indicativa de que há infecção policlonal e tropismo tissular de alguns clones, mais evidente na análise das amostras pareadas (tecidos e isolados do tecido). Foi observada baixa variabilidade genética em que a maioria (96%, 49/51) das amostras foi caracterizada como pertencente a POP2, dentre as populações circulantes no Brasil previamente descritas pelo nosso grupo. Não houve associação entre a variabilidade genética dos parasitos e os parâmetros clínicos, parasitológicos ou imunológicos. Apesar disso, os dados gerados pelos ensaios in vitro com as cepas de diferentes populações sugerem que há sim diferenças na infectividade entre cepas com genótipos de microssatélites distintos. Foi reunida uma série de dados que, em conjunto, mostram que na região estudada a Leishmanise Canina é causada por população geneticamente homogênea não tendo sido observada nenhuma correlação entre genótipos específicos e o fenótipo da infecção canina / Visceral leishmaniasis is a zoonotic disease in the New World and the domestic dog is the main host of Leishmania infantum . Prior knowledge of the immunopathogenic mechanisms associated with infection by L. infantum is required for the development of vaccines and other control strategies. The overall aim of this thesis was to compare the clinical expression, parasite load, the host immune response and genetic diversity of parasites in dogs naturally infected with L. infantum . This study is a cross - sect ional assessment of ninety - two dogs naturally infected by L. infantum . Infection was confirmed by serology, parasite culture and / or PCR. The etiology was assessed by hsp70 PCR - RFLP and MLEE . We further analyzed clinical signs , immune response by cytokine gene expression, molecular parasite load by qPCR, histological changes in sple nic and hepatic compartments and also L. infantum populations and genotypes through microsatellite analysis. Groups according to the spleen and liver parasite load were defined. Animals with high parasite load had high titers of anti - Leishmania antibodies and more clinical signs. The paras ite load in the spleen was higher than in liver and correlated with disruption of splenic architecture, mainly characterized by white pulp diso rganization. Liver parasite load was correlated with the occurrence of granulomas, degeneration and intensity of the inflammatory infiltrate. We show that the higher parasite load promoted lower gene expression o f IL - 12, IFNγ, TNF, IL - 6, IL - 10 and TGFβ in the spleen and increased expression of CCL2, CXCL8 MAP4K4 in the liver. Genetic analysis of parasites is indicative of polyclonal infection and tissue tropism of some clones, more evident in the analysis of paire d samples ( strain isolated and tissue). We also found l ow genetic variability , in which the majority (96%, 49/51) of the samples was characterized as belonging to POP2, among tree populations previously described by our group. There was no association betw een the genetic variability of the parasites and the clinical, parasitological and immunological parameters. Nevertheless, the data generated by in vitro assays with strains from different populations suggest that there are differences in infectivity betwe en strains with distinct m icrosatellite genotypes. Taken together, these results show that in the region studied Canine Leishmaniasis is caused by genetically homogeneous population without any correlation between specific genotypes and the phenotype of ca nine infection .