Made available in DSpace on 2016-04-07T13:23:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 andre_dias_ioc_dout_2015.pdf: 3243109 bytes, checksum: d7bd8cfe053e4a7e858a6c96fc09cceb (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Mycobacterium leprae, agente etiológico da hanseníase, expressa em abundância uma proteína catiônica semelhante às histonas, denominada Hlp, presente tanto no envelope como no nucleóide bacteriano. O reconhecimento do DNA bacteriano, rico em motivos CpG não metilados, pelo receptor TLR-9 representa uma importante via para a ativação da resposta imune inata, a qual pode levar à eliminação do agente infeccioso ou mediar manifestações patológicas. Foi mostrado ainda que complexos DNA-histona são mais potentes agonistas de TLR-9 que DNA sozinho. Assim, o presente trabalho teve como objetivo investigar o envolvimento do receptor TLR-9 na ativação da resposta imune do hospedeiro durante o curso da infecção pelo M. leprae. Inicialmente foi analisada a participação do TLR-9 na ativação da resposta imune inata em células epiteliais alveolares da linhagem A549 após estímulo com M. leprae. M. leprae foi capaz de induzir aumento das quimiocinas IL-8 e MCP-1 e a transcrição gênica do peptídeo antimicrobiano H\F062D-2 nas células epiteliais. O aumento da expressão de CD80 na superfície celular também foi observada após estímulo com o bacilo. O complexo CpG-Hlp micobacteriano solúvel também induziu aumento na produção de IL-8 nas células A549. Foi observado que o aumento de IL-8 induzido pelo M. leprae ocorre de forma dependente da translocação nuclear do NF-\F06BB e que o antagonista sintético de TLR-9 afetou a secreção de IL-8 induzida pelo M. leprae. A adição de CpG ao M. smegmatis selvagem, mas não mutante para o gene hlp, aumentou a produção de IL-8 pelas células epiteliais Em conjunto, esses dados sugerem que as células epiteliais respiratórias podem reconhecer M. leprae via TLR-9 e, assim, participar da resposta imune inata no sítio inicial da infecção. Uma vez que o aparecimento do eritema nodoso hansênico (ENH) está associado a liberação massiva de antígenos micobacterianos, foi investigado o envolvimento do TLR-9 na patogênese do ENH. Neste sentido, foi verificado o aumento da expressão de TLR-9, tanto em lesões de pele como em células mononucleares periféricas de pacientes reacionais, quando comparados com pacientes não reacionais. Posteriormente foram quantificados os níveis de ligantes de TLR-9 na circulação dos pacientes. Além de DNA de M. leprae, altos níveis de Hlp foram detectados no soro de pacientes reacionais. Como o TLR-9 também reconhece DNA endógeno, os níveis circulantes do complexo DNA-histona humano foram quantificados e observou-se um aumento destes complexos no soro de pacientes reacionais. Demonstramos que PBMCs de pacientes reacionais secretam níveis aumentados das citocinas TNF-\F061, IL-6 e IL-1\F062 em resposta ao complexo CpG-Hlp em comparação a pacientes não reacionais e indivíduos sadios. Finalmente, o antagonista sintético de TLR-9 inibiu a secreção das citocinas pelas PBMCs em resposta ao lisado de M. leprae. Em conjunto, esses resultados sugerem um importante envolvimento do receptor TLR-9 no processo inflamatório desencadeado no ENH abrindo perspectivas para novas abordagens imunoprofiláticas e terapêuticas / Mycobacterium leprae , etiological agent of leprosy, expresses in abundance a cationic protein similar to histones, called histone - like protein ( Hlp ) , present in the envelope as well as in bacterial nucleoid. The r ecognitio n of bacterial DNA rich in unmethylated CpG motifs by TLR - 9 is an important pathway for activation of the innate immune response, which can lead to the elimination of the infectious agent or mediate pathological manifestations. Moreover, studies showed tha t DNA - histone complexes are mor e potent agonists of TLR - 9 than DNA alone . This study aimed to investigate th e involvement of TLR - 9 in the activation of the host immune response d urin g the course of M. leprae infection. Initially, we analyzed the participat ion of TLR - 9 activation on the innate immune response in A549 alveolar epithelial cells after stimulation with M. leprae . It was shown that M. leprae was able to induce the chemokines I L - 8 and MCP - 1 , and gene transcription of antimicrobial peptide H  D - 2 in epithelial cells. T he increase of CD80 expression on the cell surface was also observed after stimulation with bacillus. Soluble mycobacterial CpG - Hlp complex also induced an increase in IL - 8 in A549 cells. It was observed that the increase of IL - 8 , induc ed by M. leprae , occurs dependently nuclear translocation of NF -  B and synthetic TLR - 9 antagonist affected IL - 8 secretion induced by M. leprae . T he addition of CpG to wild type M. smegmatis , but not to the mutant gene hlp , increased IL - 8 production by epit helial cells. A s a whole , t he se results suggest that respiratory epithelial cells can recognize M. leprae via TLR - 9 and thus participate in the innate immune response in the initial infection site. Since the appearance of erythema nodosum leprosum (ENL) is associated with the massive release of mycobacterial antigens , it was investigated the involvement of TLR - 9 in the pathogenesis of ENL. In this sense, we observed an increase in expression of TLR - 9, both in skin lesions and peripher al mononuclear cells of ENL patients, when compa red with non reactional patients. Subsequently, we measured the levels of TLR - 9 ligands in the circulation of patients. In addition to M. leprae DNA , high levels of Hlp were detected i n the seru m of ENL patients . As TLR - 9 also recog nize s endogenous DNA, circulating levels of the human DNA - histone complex were quantified , and we also observed an increase of these complexes in the serum of ENL patients. Furthermor e, PBMCs from ENL pa tients secreted elevated levels of TNF -  , IL - 6 and IL - 1  cytokines in response to CpG - Hlp complex , when compared to nonreactional patients and healthy individuals. F inally, synthetic antagonist of TLR - 9 inhibited the secretion of cytokines by P BMCs in respo nse to M. leprae lysates . The results described in t he second part of the study suggest a major involvement of TLR - 9 receptor in the inflammatory process triggered in ENL , opening up prospects for new immunoprophylactic and therapeutic approaches.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2037.pdf: 7513733 bytes, checksum: ae85e56e3e497054d13c4189f0a93d84 (MD5) Previous issue date: 2006-12-21 / The freshwater fish louse Dolops carvalhoi is an ectoparasite of pacu, Piaractus mesopotamicus capable of causing substantial damage to its hosts. The aim of this study was to investigate some aspects of the host-parasite interaction between these two species. For this purpose the physiological and morphological responses and the participation of the non-adaptive immune system of pacu to the experimental infestation with D. carvalhoi were analyzed. Three different experimental protocols were designed in order to find out the effects of the parasites on their hosts, the host responses that may interfere with parasite establishment and the influence of chronic exposure of hosts with juvenile D. carvalhoi to a second acute stressor of confinement. The results showed that even low level of adult parasite infestation is capable to induce a stress response in the hosts. No changes were observed regarding the plasma osmoregulatory parameters, while an increased number of gill chloride cells and enhanced N+/K+-ATPase activity suggested that gill adaptive adjustments may be responsible for the maintenance of hydromineral homeostasis in P. mesopotamicus during the stressful situation imposed by parasites. The infestation also induced changes in the frequency of circulating blood defense cells and in the epidermis morphology of the hosts. These responses were considered to be adaptive and they points out to the activation and participation of the non-specific immune system during the time course of infestation. Hosts which have experienced a previous D. carvalhoi infestation displayed a lower infestation density and different patterns of physiological, morphological and immunological responses when they were submitted to a re-infestation. Macrophages were activated in both infested and previously infested fish. The increased density of mucous cells in the epidermis of previously infested fish suggests the participation of mucus in the defense mechanisms and possibly in the parasite detachment. Chronic infestation with juvenile parasites did not induce a stress response in the hosts. On the other hand, they were capable of modulating the stress response of fish to a second acute stressor. In conclusion, infestation with D. carvalhoi induced physiological and morphological responses in P. mesopotamicus, which were considered to be adaptive, and activated the non-adaptive immune mechanisms of the hosts in order to cope with the stress and damages imposed by parasites. / O piolho-de-peixe branquiúro Dolops carvalhoi é um ectoparasito normalmente encontrado infestando pacus, Piaractus mesopotamicus, sendo capaz de causar-lhes danos substanciais. O objetivo do presente estudo foi investigar alguns aspectos da relação parasito-hospedeiro entre estas duas espécies. Para tal propósito, as respostas fisiológicas e morfológicas e a participação do sistema imune não-adaptativo de pacus experimentalmente infestados com D. carvalhoi foram analisadas. Três protocolos experimentais diferentes foram desenhados com o intuito de se investigar os efeitos dos parasitos sobre seus hospedeiros, as respostas dos hospedeiros que possam interferir no estabelecimento dos parasitos e a influência da exposição crônica dos hospedeiros às formas jovens de D. carvalhoi sobre as respostas ao estresse agudo de confinamento. Os resultados mostraram que mesmo baixos níveis de infestação com parasitos adultos são capazes de induzir uma resposta ao estresse nos hospedeiros. Nenhuma alteração foi verificada com relação aos parâmetros plasmáticos osmorregulatórios, enquanto que um aumento no número de células cloreto nas brânquias e na atividade específica da enzima Na+/K+-ATPase sugeriram que ajustes branquiais adaptativos podem ter sido responsáveis pela manutenção do equilíbrio hidroeletrolítico em P. mesopotamicus durante a situação de estresse imposta pelos parasitos. A infestação induziu também mudanças na freqüência de células sanguíneas de defesa circulantes e na morfologia da epiderme dos hospedeiros. Estas respostas foram consideradas adaptativas e elas apontam para a participação do sistema imune não-adaptativo durante o período de infestação. Hospedeiros que experimentaram uma infestação prévia com D. carvalhoi apresentaram uma menor densidade de infestação e diferentes padrões de respostas fisiológicas, morfológicas e imunológicas quando foram submetidos a uma reinfestação. Os macrófagos foram ativados tanto em animais infestados quanto em previamente infestados. O aumento na densidade de células mucosas na epiderme de peixes previamente infestados sugere a participação do muco nos mecanismos de defesa e, possivelmente, na rejeição dos parasitos por parte dos hospedeiros. Infestações crônicas com as formas jovens dos parasitos não induziram respostas ao estresse nos hospedeiros. Por outro lado, elas foram capazes de modular as respostas ao estresse em peixes submetidos a um estressor agudo. Em conclusão, a infestação com D. carvalhoi induziu respostas fisiológicas e morfológicas em P. mesopotamcius, que foram consideradas adaptativas, e ativou os mecanismos de imunidade inata dos hospedeiros, permitindo que estes sobrevivessem ao estresse e outros danos impostos pelos parasitos.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:28:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseLVFS.pdf: 1728899 bytes, checksum: bc471c12c5b9a5facb5d37eff4d56da4 (MD5) Previous issue date: 2006-05-26 / Financiadora de Estudos e Projetos / The ions Ca2+, Mg2+ and the water pH influence the morphological and morphometric characters and also in the ionic regulation of fish. The objective of this study was describe the morphological and morphometric development pattern of Rhamdia quelen embryo and larvae; and to identify and determine the distribution of mucous and chloride cells in order to evaluate the effect of water pH and hardness in different Ca2+ and Mg2+ concentration. After fertilization the eggs were maintained at water pH 7.0 and 8.0 with three different Ca2+: Mg2+ concentrations (mg L-1): hardness 20 mg L-1 CaCO3 (5.0 Ca2+: 2.08 Mg2+, control) and hardness 70 mg L-1 CaCO3 (20 Ca2+:5.59 Mg2+ and 23 Ca2+: 2.08 Mg2+) at 24±1oC. The eggs (24 h post fertilization- hpf) and larvae (each 6 hours) 6 to 48 and 216 h post hatchery (hph) were collected to analyze the hatching rate, survival and larvae growth, morphological and morphometrics characters associates the vision (eye), feeding (development and functionality digestive tract) and swimming abilities (fins), the distribution of mucus and chloride cells, Na+/K+-ATPase activity enzyme, and whole body ionic content in embryo and larvae homogenate. The fertilization, hatching rate, post-hatch survival, weight and length (48 and 216h) were higher in pH 8,0 and did not show significance difference related with Ca2+: Mg2+ concentrations. These suggest that the pH 8.0 is indicated to Rhamdia quelen larvae culture. The increase of water hardness to 70 mg L-1 CaCO3, mainly 20 mg L-1 Ca2+ and 5,59 mg L-1 Mg2+ concentrations is recommended to both pH device improve the total body area larvae. The increase of hardness with 23 mg L-1 Ca2+, is not adequate for Rhamdia quelen larvae, as this Ca2+ concentration occurs an ionic unbalance Na+ and Cl- in both pHs. However, the morphology did not change by pH and Ca2+: Mg2+ concentrations used. The developmental stage between 6-216 hph was considered as critic period, device the development of osmorregulatory structures (gills, intestine and kidney) and the necessary changes to begin the exogenous feeding (open mouth, digestive tract, urogenital hole). Therefore, it is important information to researches and/or fisheries to improve the techniques and handlings for Rhamdia quelen early stages larvae culture to optimize the environmental conditions. The mucous cell density show a relation with water Ca2+ concentration, and it is suggest that beyond the possible adaptive responses, apparently the mucous cells number in silver catfish larvae (Rhamdia quelen) are influenced by hardness (Ca2+ increases) and water pH in the early phases. The larvae cultivated in pH 7.0 show high mucous cell and chloride cell number than in pH 8.0. The water hardness 70 mg L-1 CaCO3 (independently Ca2+ and Mg2+ concentration) changed the chloride cell density in the first hours post hatchery (6-12 h), and the number of these cells was lower in both pHs. Then, these results suggest that the mucous and chloride cell number can be modulated by ionic environmental condition in the early develpment of silver catfish larvae after hatchery. The thesis was organized in chapters, a general introduction and the objectives, and it was followed by chapter 1 about morphology and morphometry of embryo and larvae, chapter 2 about the distribution of mucous cells and chapter 3 about the distribution the chloride cells of silver catfish (Rhamdia quelen) embryo and it was with an integrated synthesis of study, the general conclusions and finish considerations. / Os íons Ca2+, Mg2+ e o pH da água de cultivo podem influenciar nas características morfológicas e morfométricas assim como na regulação iônica em peixes. Os objetivos deste estudo foram descrever o padrão morfológico e morfométrico básico do desenvolvimento de embriões e larvas de jundiá, Rhamdia quelen; identificar e avaliar a distribuição das células mucosas e de cloreto e verificar o possível efeito do pH e da dureza da água em diferentes concentrações de Ca2+ e Mg2+ sobre essas variáveis. Após a fertilização os ovos foram mantidos em água com pH 7,0 e 8,0 com 3 diferentes concentrações de Ca2+: Mg2+ na água (mg L-1): dureza 20 mg L-1 CaCO3 (5,0 Ca2+: 2,08 Mg2, controle) e dureza 70 mg L-1 CaCO3 (20 Ca2+:5,59 Mg2+ e 23 Ca2+: 2,08 Mg2+) a 24±1oC. Os ovos (24 horas após fertilização) e larvas (a cada 6 horas) de 6 a 48 e 216 h após eclosão foram coletados tanto para observação quanto para avaliação da percentagem de eclosão, sobrevivência e crescimento das larvas; dos caracteres morfológicos e morfométricos associados à visão (presença do olho), alimentação (desenvolvimento e funcionalidade do trato digestivo) e habilidade natatória (presença das nadadeiras) e também para identificação das células mucosas e de cloreto, atividade específica da enzima Na+/K+-ATPase e composição iônica corporal do homogeneizado de embriões e larvas. A percentagem de fertilização, eclosão, sobrevivência após eclosão, sobrevivência final, peso e comprimento (em 48 e 216h) foram maiores em pH 8,0 e não houve diferença significativa em relação às concentrações de Ca2+: Mg2+, sugerindo ser esse pH o indicado para o cultivo de larvas de Rhamdia quelen. O aumento da dureza da água para 70 mg L-1 CaCO3, principalmente nas concentrações de 20mg L-1 de Ca2+ e 5,59 mg L-1 de Mg2+ é recomendado por favorecer o aumento da área corporal total das larvas em ambos pHs. O aumento da dureza com a concentração de Ca2+ igual a 23 mg L-1 na água em ambos os pHs não parece ser o mais adequado para o cultivo das larvas de Rhamdia quelen, principalmente porque sugere um desequilíbrio ionoregulatório entre Na+ e Cl- nos pHs avaliados. Entretanto, a morfologia em função da seqüência de eventos temporais do desenvolvimento, não foi alterada pelos pHs 7,0 e 8,0 e nem pelas concentrações de Ca2+ :Mg2+ na água utilizada. O estágio de desenvolvimento entre 6-216 h após eclosão foi considerado como período crítico, devido ao desenvolvimento das estruturas relacionadas à osmorregulação (brânquias, intestino e rins) e as modificações necessárias à alimentação exógena (abertura da boca, trato digestivo e poro urogenital). Portanto, estas informações são importantes para pesquisadores e/ou produtores na determinação de técnicas de manejo nas fases iniciais de vida de Rhamdia quelen, contribuindo para o estudo biológico desta espécie em ambiente de cultivo. A densidade de célula mucosa apresentou uma relação com o Ca2+ na água, sugerindo que, além de uma possível resposta adaptativa, aparentemente existe uma influência osmorregulatória entre as células mucosas das larvas de jundiá (Rhamdia quelen) e a dureza da água principalmente em função do Ca2+, influenciada pelo pH da água nas fases larvais avaliadas. Ás larvas cultivadas em pH 7,0 sugerem maior número de células mucosas e de cloreto do que em pH 8,0. A dureza da água de 70 mg L-1 CaCO3 (independente das concentrações de Ca2+ e Mg2+) influenciou na densidade total de células de cloreto nas primeiras fases após eclosão (6- 12h), ocorrendo uma diminuição no número destas células em ambos os pHs. Portanto, há evidências de que o número de células mucosas e de cloreto é modulado nas larvas de jundiá de acordo com a concentração iônica do ambiente de cultivo nas primeiras fases após a eclosão. Esta tese foi organizada em forma de capítulos, contendo inicialmente uma introdução e objetivos do trabalho seguido pelo capítulo 1, referente à morfologia e morfometria de embriões e larvas, capítulo 2 referente à distribuição de células mucosas e o capítulo 3 a distribuição de células de cloreto em embriões e larvas de Jundiá (Rhamdia quelen). Para uma síntese geral integrada do trabalho esta tese foi finalizada com uma tese foi finalizada com conclusões gerais e considerações finais.

Bacillus subtilis é uma bactéria gram positiva de solo, não patogênica, não colonizadora de tecidos, naturalmente transformável e formadora de esporos utilizada como modelo de estudo de bactérias gram-positivas. Essas características acarretam em vantagens para a produção de proteases de interesse industrial e para utilização como veículo de antígenos vacinais, porém a falta de vetores induzíveis torna sua utilização como ferramenta biológica pouco explorada. No presente trabalho descrevemos a construção de diferentes vetores capazes de expressar os antígenos subunidade B da toxina termo-lábil (LTB) e subunidade estrutural da fímbria CFA/I (CFAB) de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) e avaliamos seu potencial vacinal. Foi avaliada a imunogenicidade de linhagens capazes de expressar LTB sob o controle de diferentes promotores: PgsiB (induzido em condições de estresse), PlepA (promotor constitutivo) e Pspac (induzido pela adição de IPTG) e em diferentes locais da célula (ancorada à parede celular ou secretada para o meio externo). Avaliamos ainda a imunogenicidade de linhagens capazes de co-expressar LTB e a listeriolisina O (LLO) de Listeria monocytogenes. O antígeno CFAB foi produzido no citoplasma ou ancorado à parede celular de B. subtilis em condições de estresse e as linhagens bacterianas administradas sozinhas ou conjuntamente com a toxina termo-lábil (LT) como adjuvante de mucosa. Camundongos imunizados com células ou esporos de B. subtilis recombinantes desencadearam respostas de anticorpos sistêmicos e secretados específicos para os antígenos (LTB e CFAB), não alterados pela adição do adjuvante. A expressão de LLO causou a supressão da resposta de anticorpos específicos para o antígeno LTB. Os resultados obtidos demonstram a viabilidade do uso de B. subtilis como veículo vacinal. / Bacillus subtilis is a gram positive, generally regarded as safe and spore forming soil bacteria used as a model for genetic and phisiological studies. This safety status allow its use as host for production of industrial protases and its application as vaccine vehicles, however the lack of epissomal inducible expression systems disable the exploration of this organism as a biotechnologic tool. In this work we describe the construction of epissomal vectors able to express the B subunit of the heat-labile toxin (LTB) and the structural subunit of the CFA/I fimbrae (CFAB) from the enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). We evaluate strains able to express LTB under the control of three promoters: PgsiB (stress inducible), PlepA (constitutive) e Pspac (IPTG inducible) and allowing the expression of LTB secreted or anchored to the cell wall We also evaluate the immunogenicity of strains able to co-express LTB and the listeriolysin O (LLO) from Listeria monocytogenes. CFAB was expressed in the cytoplasm or anchored to the cell wall and administred alone or with the mucosal adjuvant LT. Mice immunized both with cells or spores elicited secreted and systemic specific antibodies responses, which were not altered by the addition of the adjuvant LT. LLO expression suppressed the antibodies responses against LTB. The data shows the ability of B. subtilis to be used as vaccine vehicle.

O objetivo deste trabalho foi a construção de linhagens geneticamente modificadas de B. subtilis capazes de expressar porções de intimina, principal componente envolvido na capacidade de colonização de linhagens enteropatogênicas de Escherichia coli (EPEC), como estratégia vacinal de administração oral contra diarréias infecciosas. As vacinas desenvolvidas empregaram cinco regiões da intimina de EPEC e linhagens de B. subtilis capazes de expressar e acumular proteínas recombinantes no citoplasma. Além disso, avaliamos o uso de esporos e células vegetativas como veículos vacinais para a entrega de antígenos recombinantes a partir de sistema de expressão epissomal. A eficácia do modelo vacinal foi demonstrada pela: (i) produção de anticorpos sistêmicos (IgG) e secretados (sIgA) contra intimina, (ii) capacidade de neutralização das intiminas expressas por diferentes linhagens de EPEC pelos anticorpos específicos gerados nos animais imunizados; e (iii) proteção a desafio com linhagens de EPEC a partir de modelo experimental que emprega camundongos recém-nascidos. Os resultados representam uma etapa importante na validação de uma nova estratégia vacinal para o controle de patógenos entéricos. Além disto, propomos a utilização de um modelo animal como uma nova ferramenta para se avaliar o potencial protetor de vacinas contra EPEC. / The objective of this work was the construction of genetically modified strains of B. subtilis able to express portions of intimin, the main component involved in colonization by enteropathogenic Escherichia coli strains (EPEC) as a strategy of oral vaccination against infectious diarrhea. The vaccines employed five regions of EPEC intimin and B. subtilis strains expressing recombinant proteins in the cytoplasm. Furthermore, we evaluated the use of spores and vegetative cells as vaccine vehicles for the delivery of recombinant antigens based on an epissomal expression system. The efficacy of the vaccines was demonstrated by: (i) production of systemic (IgG) and mucosal (sIgA) antibody responses to intimin, (ii) neutralizing of intimin expressed by different strains of EPEC by the antibodies generated in immunized animals, and (iii) protection to lethal challenges carried out with EPEC strains using an experimental model based in newborn mice. The results represent an important step in the validation of a new vaccine strategy for the control of enteric pathogens. Moreover, we propose the use of an animal model as a new tool to evaluate the protective potential of vaccines against EPEC.

Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2018-02-15T16:51:53Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Tamara Nascimento Ferreira.pdf: 2375661 bytes, checksum: 1a03fafd92daf583c5befdc68482ada8 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-15T16:51:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Tamara Nascimento Ferreira.pdf: 2375661 bytes, checksum: 1a03fafd92daf583c5befdc68482ada8 (MD5) Previous issue date: 2015-02-25 / A tolerância oral é definida como uma supressão a respostas imunológicas específicas após imunização com um antígeno que foi previamente administrado por via oral. Esse método tem sido estudado, nas últimas décadas, como uma ferramenta na redução de respostas imunes humorais e celulares envolvidas em doenças autoimunes e alergias e parece ser uma alternativa para reduzir ou retardar a rejeição de transplantes. Neste estudo investigamos o potencial das toxinas dermonecróticas recombinantes do veneno da aranha marrom Loxosceles intermedia em induzir estado de tolerância de mucosas em modelo animal, avaliando os mecanismos celulares envolvidos e a resposta imune do animal tolerante frente a estímulos imunológicos específicos e inespecíficos. As toxinas recombinantes utilizadas para indução da tolerância oral foram a LiRecDT1 (com atividade dermonecrótica) e sua forma mutada, LiRecDT1H12A, (com atividade dermonecrótica residual). Para indução de tolerância oral foi utilizado protocolo com baixas doses de antígeno, onde foram tolerizados camundongos adultos Swiss, tratados oralmente com as toxinas recombinantes durante 21 dias, num total de 90g por animal. Para investigar possíveis mecanismos envolvidos na tolerância oral, foi avaliada a expressão fator de transcrição Foxp3 e da citocina TGF-β. Após o protocolo de tolerização os linfonodos mesentéricos foram processados para ensaio de western blotting e a expressão do fator de transcrição Foxp3 e da citocina TGF-β foram avaliados. Os grupos tolerizados com ambas as toxinas mostraram um aumento na expressão dos dois componentes, demonstrando que um dos mecanismos de tolerância oral no nosso modelo pode envolver aumento na população de linfócitos T regulatórios. Esse resultado pode ser reforçado pela dimimuição de edema de pata em camundongos naive que receberam, via intravenosa, esplenócitos de animais tolerizados com a toxina LiRecDT1 H12A (transferência adotiva). Além disso, pudemos observar que a tolerância induzida pela toxina LiRecDT1 H12A se estendeu a antígenos não relacionados (tolerância cruzada) com diminuição na produção de anticorpos IgG específicos e edema de pata em animais desafiados com veneno da vespa Polybia paulista. A tolerância oral induzida pela toxina LiRecDT1 H12A também permitiu aparente redução da resposta imunológica do animal tolerante frente ao enxerto alogênico de camundongos C57BL/6. Considerando os resultados obtidos é possível concluir que a tolerância oral induzida pelas toxinas LiRecDT1 e LiRecDT1 H12A pode envolver aumento na população de linfóticos T regulatórios cuja produção de citocinas anti-inflamatórias, pelo menos na tolerância induzida pela toxina LiRecDT1 H12A, pode reduzir a resposta imune a antígenos específicos e inespecíficos na tolerância cruzada e na redução de rejeição a transplantes. / Oral tolerance refers to physiologic induction of immunosuppression that occurs in mucosal induced by oral administration of an antigen. This method has been used to induce reduction of humoral and cellular responses involved in autoimmune diseases, allergies and may be an alternative to reduce transplant rejection. We investigated potential of dermonecrotic recombinant toxins of brown spider Loxosceles intermedia specie to induce a state of mucosal tolerance in a animal model. We did this by assessing the cellular mechanisms involved and the immune response of tolerant animals against specific and nonspecific immune stimulation. Dermonecrotic toxin LiRecDT1 and its mutated form, LiRecDT1 H12A (with residual dermonecrotic activity), has been used. Mice were treated with recombinant toxins, orally, for 21 days, with a total of 90g per animal. After oral tolerance protocol, mesenteric lymph nodes were processed for western blotting and the expression of nuclear transcription factor Foxp3 and cytokine Tgf-β were analyzed. LiRecDT1 and LiRecDT1 H12A tolerant groups showed an increase in expression of both proteins, which could be related to a increase in regulatory T-cells population. Adoptive transfer of splenocytes to naive mice from LiRecDT1 H12A tolerated group induced paw edema reduction, with supports this theory (adoptive transfer). Our results also demonstrated a bystander tolerance when LiRecDT1 H12A tolerated mice showed a decrease in IgG production and paw edema induction by Polybia paulista wasp venom. LiRecDT1 H12A tolerance also showed an apparent reduction in skin allograft rejection using C57BL/6 mice as donor and tolerated Swiss mice as receptor. Considering the results we concluded that oral tolerance induced by LiRecDT1 and LiRecDT1 H12A toxins could be involve increase in Tregs and non-inflammatory cytokines, and LiRecDT1 H12A tolerance can reduce specific and non specific immunology responses and allografts transplants rejection.

Made available in DSpace on 2016-02-26T13:44:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 luciana_santos_ioc_mest_2014.pdf: 1955821 bytes, checksum: 69f7294e0170b52f61568c172e15d50f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / A reação reversa (RR) é um quadro súbito com lesões cutâneas e neurais agudas que interrompem o curso crônico da hanseníase. A RR pode ocorrer em qualquer momento da evolução clínica da doença, inclusive após cura bacteriológica, afetando tanto pacientes multibacilares como paucibacilares. É largamente aceito que mecanismos imunológicos estão envolvidos neste processo, entretanto, o papel da resposta imune adaptativa específica ao M. leprae na patogênese da RR ainda não está esclarecido, já que ocorre em pacientes hiporrespondedores. No presente estudo caracterizamos as subpopulações de linfócitos T sanguíneos ex vivo envolvidas na RR assim como suas atividades funcionais in vitro. Para tanto, analisamos pacientes multibacilares com a forma clínica Borderline Lepromatosa (BL) que desenvolveram pela primeira vez a RR. Pacientes BL não reacionais e controles sadios de área endêmica para a hanseníase também foram incluídos no estudo. As análises fenotípica e funcionais ex vivo e in vitro foram realizadas por meio de citometria de fluxo multiparamétrica. Para os ensaios in vitro, as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) dos pacientes foram cultivadas e estimuladas com M. leprae (ML, 20\F06Dg/mL) e enterotoxina B de Staphyilococcus aureus (SEB, 1\F06Dg/mL) por 6 horas Para detectar a resposta proliferativa, as células foram incubadas com carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (CFSE) e estimuladas com ML e SEB por 5 dias. A análise dos genes que codificam os fatores de transcrição críticos para a diferenciação de linfócitos T foi realizada por reação da polimerase em cadeia quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Os resultados obtidos em nosso estudo sugerem que na abertura da RR, stat4 e t-bet são preferencialmente expressos in vivo. Observamos ainda diminuição ex vivo na frequência de linfócitos TNAÏVE no grupo RR e a prevalência nesses pacientes de células TEF e de memória previamente ativadas. As mesmas observações e conclusões podem ser aplicadas no que concerne à resposta proliferativa, vez que linfócitos T CD4+ e CD8+ do grupo RR proliferam in vitro espontaneamente e em resposta ao M. leprae. As células produtoras de IFN-\F067 foram observadas em todas as subpopulações de linfócitos T do grupo RR, incluindo TNAÏVE. No grupo RR também observamos frequências aumentadas de células TEF, TCM e TEM CD4+ e CD8+ produtoras de TNF\F02E\F020Além disso, nas mesmas condições, observamos frequência significativa de células TEF produtoras de IL-10. Em conjunto, os dados aqui apresentados e discutidos sugerem ativação Th1 in vivo como fator preponderante na patogênese da RR em pacientes BL / R eversal reaction (RR) is a sudden acute cutaneous and neural manifestation with lesions, that interrupt the chronic course of lepros y. RR can occur at any time during the clinical course of the disease, even after bacteriological cure, affecting both multibacillary and paucibacillary patients. It is widely accepted that immune mechanisms are involved in this process; however, the role of specific adaptive immune response to M. leprae in the RR pathogenesis is not clear, since it occurs in hyporesponsive patients. In the present study , we characterize ex vivo blood T lymphocytes subsets involved in RR , as well as their in vitro functiona l activities. For such purpose , we analyzed BL patients which developed RR. Non reactional BL patients and healthy individuals from endemic leprosy area were also included in the study. Phenotypic and functional ex vivo and in vitro analyzes were performed by multiparametric flow cytometry. For in vitro assays, peripheral blood mononuclear cells ( PBMC ) were cultured and stimulated with M. leprae (ML, 20  g/mL) and Staphylococcus aureus entertoxin B ( SEB , 1  g/mL) for 6 hours. To detect the proliferative response, PBMC incubated with carboxyfluorescein succinimidyl ester ( CFSE ) were stimulated with ML or SEB for 5 days. The analysis of the transcription factors i nvolved in T cell differentiation was performed by quantitative r eal - t ime polymerase chain reaction (qRT - PCR ) . The results obtained from our study suggest that, at RR onset, stat4 and t - bet are preferentially expressed in vivo . Among RR patients, we still observed an ex vivo decrease in the frequency of T NAIVE lymphocytes, as well as the prevalence of T EF and previously activated memory cells. The same remarks ad conclusions may be applied to the proliferative response, as T CD4+ and C D 8+ lymphocytes proliferate in vitro , both spontaneously and in response to M. leprae . IFN -  producing cells were observed in all T lymphocytes subsets in RR, including T NAIVE . Among RR patients, we also noted an increased frequency of TNF producing T EF , T CM and T EM CD4+ and CD8+ cells. Moreover, under the same conditi ons, we observed a significant frequency of IL - 10 producing T EF cells. Taken together, the data submitted and discussed herein suggest in vivo Th1 activation as a predominant factor in the pathogenesis of RR among BL patients

O objetivo deste trabalho foi a construção de linhagens geneticamente modificadas de B. subtilis capazes de expressar porções de intimina, principal componente envolvido na capacidade de colonização de linhagens enteropatogênicas de Escherichia coli (EPEC), como estratégia vacinal de administração oral contra diarréias infecciosas. As vacinas desenvolvidas empregaram cinco regiões da intimina de EPEC e linhagens de B. subtilis capazes de expressar e acumular proteínas recombinantes no citoplasma. Além disso, avaliamos o uso de esporos e células vegetativas como veículos vacinais para a entrega de antígenos recombinantes a partir de sistema de expressão epissomal. A eficácia do modelo vacinal foi demonstrada pela: (i) produção de anticorpos sistêmicos (IgG) e secretados (sIgA) contra intimina, (ii) capacidade de neutralização das intiminas expressas por diferentes linhagens de EPEC pelos anticorpos específicos gerados nos animais imunizados; e (iii) proteção a desafio com linhagens de EPEC a partir de modelo experimental que emprega camundongos recém-nascidos. Os resultados representam uma etapa importante na validação de uma nova estratégia vacinal para o controle de patógenos entéricos. Além disto, propomos a utilização de um modelo animal como uma nova ferramenta para se avaliar o potencial protetor de vacinas contra EPEC. / The objective of this work was the construction of genetically modified strains of B. subtilis able to express portions of intimin, the main component involved in colonization by enteropathogenic Escherichia coli strains (EPEC) as a strategy of oral vaccination against infectious diarrhea. The vaccines employed five regions of EPEC intimin and B. subtilis strains expressing recombinant proteins in the cytoplasm. Furthermore, we evaluated the use of spores and vegetative cells as vaccine vehicles for the delivery of recombinant antigens based on an epissomal expression system. The efficacy of the vaccines was demonstrated by: (i) production of systemic (IgG) and mucosal (sIgA) antibody responses to intimin, (ii) neutralizing of intimin expressed by different strains of EPEC by the antibodies generated in immunized animals, and (iii) protection to lethal challenges carried out with EPEC strains using an experimental model based in newborn mice. The results represent an important step in the validation of a new vaccine strategy for the control of enteric pathogens. Moreover, we propose the use of an animal model as a new tool to evaluate the protective potential of vaccines against EPEC.

Bacillus subtilis é uma bactéria gram positiva de solo, não patogênica, não colonizadora de tecidos, naturalmente transformável e formadora de esporos utilizada como modelo de estudo de bactérias gram-positivas. Essas características acarretam em vantagens para a produção de proteases de interesse industrial e para utilização como veículo de antígenos vacinais, porém a falta de vetores induzíveis torna sua utilização como ferramenta biológica pouco explorada. No presente trabalho descrevemos a construção de diferentes vetores capazes de expressar os antígenos subunidade B da toxina termo-lábil (LTB) e subunidade estrutural da fímbria CFA/I (CFAB) de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) e avaliamos seu potencial vacinal. Foi avaliada a imunogenicidade de linhagens capazes de expressar LTB sob o controle de diferentes promotores: PgsiB (induzido em condições de estresse), PlepA (promotor constitutivo) e Pspac (induzido pela adição de IPTG) e em diferentes locais da célula (ancorada à parede celular ou secretada para o meio externo). Avaliamos ainda a imunogenicidade de linhagens capazes de co-expressar LTB e a listeriolisina O (LLO) de Listeria monocytogenes. O antígeno CFAB foi produzido no citoplasma ou ancorado à parede celular de B. subtilis em condições de estresse e as linhagens bacterianas administradas sozinhas ou conjuntamente com a toxina termo-lábil (LT) como adjuvante de mucosa. Camundongos imunizados com células ou esporos de B. subtilis recombinantes desencadearam respostas de anticorpos sistêmicos e secretados específicos para os antígenos (LTB e CFAB), não alterados pela adição do adjuvante. A expressão de LLO causou a supressão da resposta de anticorpos específicos para o antígeno LTB. Os resultados obtidos demonstram a viabilidade do uso de B. subtilis como veículo vacinal. / Bacillus subtilis is a gram positive, generally regarded as safe and spore forming soil bacteria used as a model for genetic and phisiological studies. This safety status allow its use as host for production of industrial protases and its application as vaccine vehicles, however the lack of epissomal inducible expression systems disable the exploration of this organism as a biotechnologic tool. In this work we describe the construction of epissomal vectors able to express the B subunit of the heat-labile toxin (LTB) and the structural subunit of the CFA/I fimbrae (CFAB) from the enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). We evaluate strains able to express LTB under the control of three promoters: PgsiB (stress inducible), PlepA (constitutive) e Pspac (IPTG inducible) and allowing the expression of LTB secreted or anchored to the cell wall We also evaluate the immunogenicity of strains able to co-express LTB and the listeriolysin O (LLO) from Listeria monocytogenes. CFAB was expressed in the cytoplasm or anchored to the cell wall and administred alone or with the mucosal adjuvant LT. Mice immunized both with cells or spores elicited secreted and systemic specific antibodies responses, which were not altered by the addition of the adjuvant LT. LLO expression suppressed the antibodies responses against LTB. The data shows the ability of B. subtilis to be used as vaccine vehicle.

Orientador: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T10:43:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ruberti_Maristela_D.pdf: 10774061 bytes, checksum: 7afe7ee8aa8c7f97c1f80e66f0cd8bfa (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Trabalhos anteriores de nosso laboratório mostraram que camundongos transgênicos DO11.10, cuja maioria dos linfócitos T expressam TCR específico para ovalbumina (OVA) no contexto de...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Previous work from our laboratory showed that DO11.10 transgenic mice, in which the most of T lymphocytes express TCR specific for ovalbumin (OVA) in the context of...Note: The complete abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular