Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Nous nous sommes intéressés à évaluer l'influence du changement climatique sur les patrons nets de réponse des plantes aux agents pathogènes. Dans ce travail, nous avons étudié les effets de l’augmentation de la température (20°, 25° et 28°C) sur le phénotype précoces (symptômes de maladie) et sur la fitness en fin de cycle de différentes accessions et mutants de nodulation de la plante légumineuse modèle Medicago truncatula, inoculées par des souches d’agent pathogène racinaire Verticillium adaptées à des différentes températures. Le comportement des variétés de Luzerne cultivée (Medicago sativa) dans ces conditions a été également analysé. Le travail a été divisé en 3 parties. La première partie nous a permis d’identifier parmi 12 souches de Verticillium spp., une souche froide (VA1) et une souche tempérée (V31.2), avec une température optimale de 20°C et 25°C respectivement pour la croissance, la sporulation et l'agressivité sur M. truncatula. Par contre, notre collection des souches ne renfermant pas de souches adaptées à des températures plus élevées. Nous avons obtenu par mutagénèse UV de la souche V31.2 une troisième souche (AS38) chaude qui est agressive à 28°C. Dans la deuxième partie nous avons observé les symptômes de maladie pour sept accessions naturelles de M. truncatula, inoculées par ces trois souches d’agent pathogène, à trois températures 20°, 25° et 28°C et en présence de la souche Sinorhizobium meliloti RCR2011. De faibles symptômes ont été relevés pour deux accessions A17 et DZA315.16 inoculées par VA1 à 20°C. Nous avons observé une sensibilité maximale pour trois accessions (F83005.5, DZA315.16 et L321) inoculées par V31.2 à 25°C, et pour quatre accessions (F83005.5, DZA315.16, L321 et L198) inoculées par AS38 à 28°C. Les résultats des symptômes de maladie ont été confirmés par une quantification moléculaire de l’ADN fongique (qPCR) et par ré-isolement à partir des tissus aériens de la plante. L’effet de VA1 et V31.2 sur trois caractères de fitness (nombre et poids de gousse par plante, ainsi que biomasse aérienne) de M. truncatula a été étudié. L’effet de VA1 s’observe uniquement à 20°C sur l'accession A17. Par contre, V31.2 a montré un impact sur les trois caractères de fitness qui diminuent chez les accessions sensibles, ainsi que sur le nombre de gousse pour l’accession résistante L198. Dans la troisième partie nous avons analysé de la même façon pour quatre mutants de nodulation dans le fond génétique A17. Les mutants ont montré un niveau de résistance à la souche VA1 plus élevé qu’A17, quelle que soit la température étudiée. Vis à vis de la souche V31.2, à 20°C les mutants skl et hcl ont montré le même taux de symptômes qu’A17 tandis que les mutants nfp et sunn ont de taux de symptômes supérieur à celui d'A17. Ces mutants ont tous une sensibilité plus élevé à 25°C. Les résultats des symptômes de maladie ont été confirmés par le test de ré-isolement. Pour ces mutants nous montrons pour la première fois, que seul le mutant sunn (hypernodulant) à la même productivité qu’A17, quelle que soit la condition (contrôle ou inoculées) et la souche (VA1 ou V31.2) étudiée ; alors que le mutant skl (hypernodulant également) a une productivité plus faible. Les deux autres mutants déficients dans la nodulation nfp et hcl ont montré une productivité plus faible qu’A17 quelle que soit la souche et la température étudiée. Enfin une bonne similitude a été trouvée entre la réponse phénotypique précoce (symptômes de maladie) de M. truncatula et de M. sativa inoculées par Verticillium spp. Dans cette thèse, on n’est pas trouvé la corrélation positive entre la capacité de la nodulation et la protection contre la maladie, mais la symbiose augmente la fitness pour certaines de ces plantes. Les résultats suggèrent aussi que l'augmentation de la température pourrait contribuer à faire apparaître une souche adaptée à 28°C (AS38) qui est plus agressive et plus virulente que V31.2 sur M. truncatula. / We were interested to evaluate the influence of climate change on net patterns of plants responses to pathogens. In this work, we studied the effects of temperature increase (20 °, 25 ° and 28 ° C) on early phenotype (symptoms of disease) and on fitness at the end of growth cycle on different accessions and nodulation mutants of the legume model plant Medicago truncatula, inoculated by the root pathogen Verticillium adapted to different temperatures. The behavior of cultivated varieties of alfalfa (Medicago sativa) in these conditions was also analyzed. The work is divided into 3 parts. In the first part, we identified among 12 strains of Verticillium spp., a cold strain (VA1) and a temperate strain (V31.2) with an optimum temperature of growth, sporulation and aggressiveness to M. truncatula of 20°C and 25°C respectively. Since our strain collection doesn’t contain strains adapted to higher temperatures, we have obtained by UV mutagenesis of strain V31.2 a third strain (AS38), considered as a ‘hot’ strain, which is aggressive at 28°C. In the second part, we observed the symptoms of disease on seven natural accessions of M. truncatula, inoculated by the three strains of the pathogen at three temperatures 20°C, 25°C and 28°C in the presence of Sinorhizobium meliloti RCR2011. Mild symptoms were observed for two accessions A17 and DZA315.16 inoculated with VA1 at 20°C. We observed a maximal sensitivity for three accessions (F83005.5, DZA315.16 and L321) inoculated with V31.2 at 25 ° C, and for four accessions (F83005.5, DZA315.16, L321 and L198) inoculated with AS38 at 28 ° C. The results of phenotypic disease symptoms were confirmed by molecular quantification of fungal DNA (qPCR), and re-isolation of the fungus from aerial plant tissues. The effect of strains VA1 and V31.2 on three fitness traits (number and weight of pods per plant and aerial biomass) was studied. The effect negative of VA1 was observed only at 20°C on the A17 accession. In contrast, V31.2 showed an impact on the three fitness traits, which decrease in susceptible accessions, as well as on pod number of the resistant accession L198. In the third part, a similar analysis was made for four nodulation mutants in A17 genetic background. Nodulation mutants showed a higher level of resistance to VA1 than A17, at different studied temperatures. Towards strain V31.2 at 20°C the mutants skl and hcl showed the same symptom scores as A17 whereas nfp and sunn mutants had more susceptible. Mutants showed a higher sensitivity at 25°C to V31.2 fungal strain. The results of phenotypic disease symptoms were confirmed by re-isolation experiments. For the nodulation mutants we showed, for the first time, that only the sunn mutant (hypernodulant) has the same productivity as A17, regardless of the condition (inoculated or control) and the studied strain (VA1 or V31.2); while the skl mutant (hypernodulant also) has a lower productivity. The other two mutants defective in nodulation (nfp and hcl) showed lower productivity than A17 regardless of the strain (VA1 or V31.2) and the temperature studied. Finally, a strong similarity was found between the early phenotypic response symptoms disease in M. truncatula and M. sativa inoculated by Verticillium spp. In this thesis, we didn’t find a positive correlation between the ability of nodulation and protection against the disease, however the symbiosis increases the fitness of some of these plants. The results also suggest that increasing temperatures could favour appearance a strain adapted to 28°C (AS38), which is more aggressive and more virulent than V31.2 on M. truncatula.

Sous contraintes industrielles, les micro-organismes sont soumis à différents stress technologiques, liés à leur culture en réacteur de grande taille, altérant leur viabilité et les performances des procédés. Les fluctuations des paramètres physico-chimiques (température, pH, …) sont responsables de cette baisse d’efficacité de la fermentation. Afin de contribuer à l’intensification des performances des procédés de production de bio-éthanol, ce projet de thèse propose d’améliorer la robustesse d’une souche industrielle de Saccharomyces cerevisiae productrice d’alcool vis-à-vis d’un stress environnemental : la température. La stratégie générale de ce projet réside dans l’obtention d’un mutant plus tolérant que la souche sauvage au stress appliqué par abaissement de son taux de décès. Un pilote original de culture en continu a été mis en place, couplant mutagénèse aux UV, générant des modifications génétiques et pression de sélection par des variations de température, permettant la sélection des variants les plus robustes. Un modèle phénoménologique a été développé afin de simuler les cinétiques microbiennes selon le mode de conduite du pilote et d’optimiser les conditions de fonctionnement nécessaires à l’obtention des futurs variants. Ce modèle cinétique fait intervenir l’influence de la température sur les cinétiques de croissance, de décès cellulaire et de production d’éthanol chez Saccharomyces cerevisiae. Ces cinétiques ont été quantifiées expérimentalement en fonction de la température et des traitements de mutagénèse par UV. Grâce aux conditions obtenues par simulation, des cultures en mode continu ont été réalisées et des variants obtenus ont été caractérisés, en condition de production intensive d’éthanol, sur la base de leurs performances en termes de croissance, de décès et de capacités fermentaires. Cette stratégie a permis de sélectionner un variant possédant une meilleure robustesse vis-à-vis de la température, caractérisé par un taux de décès plus faible que celui de la souche sauvage. Néanmoins ce variant ne se caractérise pas par de meilleures performances fermentaires / Under industrial constraints, microorganisms are exposed to various stresses, due to their cultivation in large scale bioreactor, altering their viability and the performances of bioprocesses. Fluctuations in physico-chemical parameters (temperature, pH, ...) are responsible for this reduction in fermentation efficiency. This Ph.D project intends to improve the robustness of an industrial ethanol producer Saccharomyces cerevisiae strain under heat stress, in order to improve its industrial production of bio-ethanol under temperature fluctuating environment. The strategy of this project is to obtain a mutant more tolerant than the wild type strain to heat stress, possessing a lower death rate. An original continuous culture reactor has been designed, coupling UV mutagenesis (generating genetic modifications) and selection pressure (temperature) to select the most robust variant. A phenomenological model was proposed to simulate microbial kinetics based on the monitoring strategy of the chemostat and to optimize the operating conditions necessary for the generation of variants. This dynamic model involves the impact of the temperature on the kinetics of growth, cell death and ethanol production in Saccharomyces cerevisiae. These kinetics were experimentally quantified as a function of the temperature and the UV treatment. Continuous cultures were carried out under the simulated conditions and some variants were characterized in very high ethanol performance fermentations in terms of growth, death and production performances. This strategy allowed us to select a variant possessing a better thermal robustness characterized by a lower death rate than the wild type strain under heat stress. However, the reduction of the death rate did not translate into better ethanol production performances

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La dihydrofolate réductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle à la prolifération cellulaire. Elle réduit le dihydrofolate en tétrahydrofolate, un co-facteur impliqué dans la biosynthèse des purines et du thymidylate. La DHFRh est une cible de choix pour des agents de chimiothérapie comme le méthotrexate (MTX), inhibant spécifiquement l’enzyme ce qui mène à un arrêt de la prolifération et ultimement à la mort cellulaire. Le MTX est utilisé pour le traitement de plusieurs maladies prolifératives, incluant le cancer. La grande utilisation du MTX dans le milieu clinique a mené au développement de mécanismes de résistance, qui réduisent l’efficacité de traitement. La présente étude se penche sur l’un des mécanismes de résistance, soit des mutations dans la DHFRh qui réduisent son affinité pour le MTX, dans le but de mieux comprendre les éléments moléculaires requis pour la reconnaissance de l’inhibiteur au site actif de l’enzyme. En parallèle, nous visons à identifier des variantes plus résistantes au MTX pour leur utilisation en tant que marqueurs de sélection en culture cellulaire pour des systèmes particuliers, tel que la culture de cellules hématopoïétiques souches (CHS), qui offrent des possibilités intéressantes dans le domaine de la thérapie cellulaire. Pour étudier le rôle des différentes régions du site actif, et pour vérifier la présence d’une corrélation entre des mutations à ces régions et une augmentation de la résistance au MTX, une stratégie combinatoire a été dévelopée pour la création de plusieurs banques de variantes à des résidus du site actif à proximité du MTX lié. Les banques ont été sélectionnées in vivo dans un système bactérien en utilisant des milieux de croissance contenant des hautes concentrations de MTX. La banque DHFRh 31/34/35 généra un nombre considérable de variantes combinatoires de la DHFRh hautement résistantes au MTX. Les variantes les plus intéressantes ont été testées pour leur potentiel en tant que marqueur de sélection dans plusieurs lignées cellulaires, dont les cellules hématopoïétiques transduites. Une protection complète contre les effets cytotoxiques du MTX a été observée chez ces cellules suite à leur infection avec les variantes combinatoires. Pour mieux comprendre les causes moléculaires reliées à la résistance au MTX, des études de structure tridimensionnelle de variantes liées au MTX ont été entreprises. La résolution de la structure de la double variante F31R/Q35E lié au MTX a révélé que le phénotype de résistance était attribuable à d’importantes différences entre le site actif de la double variante et de l’enzyme native, possiblement dû à un phénomème dynamique. Une compréhension plus générale de la reconnaissance et la résistance aux antifolates a été réalisée en comparant des séquences et des structures de variantes de la DHFR résistants aux antifolates et provenant de différentes espèces. En somme, ces travaux apportent de nouveaux éléments pour la comprehension des intéractions importantes entre une enzyme et un ligand, pouvant aider au développement de nouveaux antifolates plus efficaces pour le traitement de diverses maladies. De plus, ces travaux ont généré de nouveaux gènes de résistance pouvant être utilisés en tant que marqueurs de sélection en biologie cellulaire. / Human dihydrofolate reductase (hDHFR) is an enzyme that is essential to cell proliferation. It reduces dihydrofolate to tetrahydrofolate, an important cofactor involved in purine and thymidylate biosynthesis. hDHFR is a choice target for chemotherapeutic drugs like methotrexate (MTX), which specifically inhibits the enzyme, stopping cell proliferation and leading to cellular death. MTX is used for the treatment of many proliferative diseases, including cancers. Widespread use of MTX has lead to the development of resistance mechanisms appear which impair treatment efficiency. The present work focuses on a mechanism of resistance, namely mutations in hDHFR that reduce its affinity for MTX, to better understand the underlying mechanisms of inhibitor recognition at the active site of the enzyme. In parallel, we aim at identifying the most MTX-resistant variants to offer novel selectable markers for particular cell culture systems, such as hematopoietic cell culture, which offer important perspectives for cellular therapy. To study the role of different regions of the hDHFR active site, and to verify if a correlation exists between mutations in these regions and increased resistance to MTX, a combinatorial strategy was developed enabling the creation of several hDHFR variant libraries at active site residues located in proximity to bound MTX. The libraries were selected in vivo in a bacterial system using culture media containing high concentration of the inhibitor. One library in particular, hDHFR 31/34/35, yielded a considerable number of highly MTX-resistant combinatorial hDHFR variants. The most interesting candidates were tested for their potential as selectable markers in various cell lines, including transduced hematopoietic cells. Complete protection from MTX-cytotoxicity was obtained for these cells following infection with the combinatorial variants. To better understand the molecular causes of MTX resistance, resolution of the crystal structures of variant proteins in presence of MTX was attempted. Resolution of the F31R/Q35E double variant revealed that the resistance phenotype was related to important differences in the active site relative to WT, possibly attributable to a dynamic motion effect. A more general comprehension of antifolate recognition and resistance was achieved by sequence and structural comparison of antifolate-resistant DHFR variants from different species. Overall, our work contributes to the better understanding of enzyme-inhibitor interactions, which could provide new insights into the development of more efficient clinical therapies. In addition, this work has yielded novel drug-resistance genes useful as selectable markers for cellular biology.

Les maladies métaboliques, comme le diabète, la dyslipidémie ou l'obésité, constituent un problème majeur de santé publique dans les pays développés. Ces maladies très répandues restent encore difficiles à traiter malgré une recherche active. Les stratégies thérapeutiques contre ces maladies incluent le développement de nouvelles molécules ciblant les récepteurs aux acides gras, étant donné leur rôle essentiel dans l'homéostasie du métabolisme. C'est dans ce contexte que s'inscrit ce travail portant sur deux récepteurs couplés aux protéines G, les récepteurs aux acides gras à courte chaîne 2 et 3 ou free fatty acid receptors 2 (FFA2) et 3 (FFA3). Nous avons tout d'abord cherché à déterminer le profil d'expression des deux récepteurs. Ensuite, nous avons établi des lignées cellulaires stable exprimant FFA2 ou FFA3 afin d'étudier la pharmacologie d'agonistes synthétiques et endogènes de ces récepteurs. Après avoir identifié les voies de signalisation engendrées par l'activation des récepteurs, nous avons démontré que les agonistes synthétiques étaient des activateurs allostériques, c'est-à-dire qu'ils se liaient aux récepteurs sur un site distinct de celui des ligands endogènes. Pour identifier les résidus d'acides aminés nécessaires à la reconnaissance des ligands, nous avons généré une gamme de mutants ponctuels de ces récepteurs par mutagénèse dirigée. En analysant l'effet des mutations dans des tests fonctionnels, nous avons pu déterminer avec précision où se liaient les ligands et ainsi pu dessiner par informatique des modèles structuraux des récepteurs qui pourront être utilisés pour le drug design de futures molécules agonistes de ces récepteurs.

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Les maladies métaboliques, comme le diabète, la dyslipidémie ou l’obésité, constituent un problème majeur de santé publique dans les pays développés. Ces maladies très répandues restent encore difficiles à traiter malgré une recherche active. Les stratégies thérapeutiques contre ces maladies incluent le développement de nouvelles molécules ciblant les récepteurs aux acides gras, étant donné leur rôle essentiel dans l’homéostasie du métabolisme. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce travail portant sur deux récepteurs couplés aux protéines G, les récepteurs aux acides gras à courte chaîne 2 et 3 ou free fatty acid receptors 2 (FFA2) et 3 (FFA3). Nous avons tout d'abord cherché à déterminer le profil d'expression des deux récepteurs. Ensuite, nous avons établi des lignées cellulaires stable exprimant FFA2 ou FFA3 afin d’étudier la pharmacologie d’agonistes synthétiques et endogènes de ces récepteurs. Après avoir identifié les voies de signalisation engendrées par l’activation des récepteurs, nous avons démontré que les agonistes synthétiques étaient des activateurs allostériques, c’est-à-dire qu’ils se liaient aux récepteurs sur un site distinct de celui des ligands endogènes. Pour identifier les résidus d’acides aminés nécessaires à la reconnaissance des ligands, nous avons généré une gamme de mutants ponctuels de ces récepteurs par mutagénèse dirigée. En analysant l’effet des mutations dans des tests fonctionnels, nous avons pu déterminer avec précision où se liaient les ligands et ainsi pu dessiner par informatique des modèles structuraux des récepteurs qui pourront être utilisés pour le drug design de futures molécules agonistes de ces récepteurs. / Metabolic diseases, such as diabetes, dyslipidemia or obesity, are more and more weighing on public health expenses in developed countries. Despite active research, these widespread diseases remain difficult to handle. Promising new therapeutic strategies against metabolic diseases include the development of drugs targeting the free fatty acid receptors, as key players in metabolism homeostasis. In this context, the current PhD thesis focuses on the study of two G protein-coupled receptors, namely the short-chain free fatty acid receptors 2 (FFA2) and 3 (FFA3). First, we investigated the expression of the two receptors of interest in a variety of cell types. Then, in order to study the pharmacology and the binding mode of endogenous and synthetic agonists on FFA2 and FFA3, we established stable cell lines expressing each receptor. Once we identified the signaling pathways engendered in response to receptor activation, we showed that synthetic agonists were allosteric activators of the receptors, in the sense that they bind to the receptors at a distinct site from short-chain fatty acids, i.e. the endogenous agonists. To identify the aminoacid residues that were involved in ligand binding, we generated a variety of point mutated receptors by site-directed mutagenesis. By analyzing the effects of the mutations in functional tests, we determined precisely the aminoacid residues that were essential for ligand binding. From these results, we designed in silico structural models which may aid future drug design efforts for the discovery of new FFA2 and FFA3 agonists.

Ces travaux de thèse s'articulent autour de deux projets : les études structure-fonction de l'aminopeptidase A, d'une part, et celles du récepteur de l'apéline, d'autre part. I/ L'aminopeptidase A (APA, EC 3.4.11.7) est une aminopeptidase monozinc membranaire qui, dans le cerveau, produit l'angiotensine (Ang) III à partir de l'Ang II. L'Ang III est l'un des principaux peptides effecteurs du système rénine-angiotensine cérébral qui exerce un effet stimulateur tonique sur le contrôle central de la pression artérielle chez le rat hypertendu. Ainsi le blocage de l'APA par un inhibiteur spécifique et sélectif, l'EC33 ou sa prodrogue, le RB150, normalise la pression artérielle dans deux modèles expérimentaux d'hypertension artérielle (HTA). L'APA constitue une cible thérapeutique potentielle pour le traitement de l'HTA qui justifie le développement de nouveaux inhibiteurs de cette enzyme plus puissants et plus sélectifs que l'EC33 et avec un profil pharmacodynamique et pharmacocinétique amélioré par rapport au RB150. Pour cela, nous avons construit un modèle tridimensionnel (3D) de l'APA sur la base de la structure cristallographique de l'APA humaine récemment publiée. Nous avons ensuite validé ce modèle par des études structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagénèse dirigée en démontrant l'implication, d'un résidu du sous-site S1 dans la spécificité de substrat acide de l'APA et de deux résidus formant le sous-site S2' interagissant avec le résidu P2' acide d'inhibiteurs tripeptidiques précédemment développés dans le laboratoire.II/ L'apéline est le ligand naturel du récepteur orphelin humain APJ (ApélineR), un récepteur à sept domaines transmembranaires couplé aux protéines G. L'apéline et son récepteur sont impliqués dans le maintien de l'équilibre hydrique et des fonctions cardiovasculaires. L'ApélineR constitue une cible thérapeutique potentielle dans le traitement de l'insuffisance cardiaque et des rétentions hydriques. Etant donné que la demi-vie de l'apéline dans la circulation sanguine est de l'ordre de la minute, l'objectif est de développer des analogues de l'apéline métaboliquement stables. Pour développer de tels composés, nous avons entrepris de comprendre comment l'apéline se lie à son récepteur et comment elle l'active. Dans ce but, nous avons construit un modèle 3D de l'ApélineR basé sur la structure cristallographique du récepteur aux chimiokines, CXCR4. Nous avons validé ce modèle par des études structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagénèse dirigée. Nous avons identifié à la surface du récepteur, les résidus acides des boucles extracellulaires qui interagissent avec les résidus basiques de l'apéline. Nous avons ensuite développé des analogues de l'apéline-17 (K17F) métaboliquement stables par deux stratégies différentes. Premièrement, nous avons substitué chacun des résidus de l'apéline par son énantiomère de la série D ou par un acide aminé synthétique. Deuxièmement, nous avons ajouté une chaîne fluoroalkyle à l'extrémité N-terminale de l'apéline. Ces deux stratégies ont permis d'obtenir plusieurs composés dont les plus actifs sont le P92 et le LIT01-196 qui conservent des propriétés pharmacologiques identiques à celles de K17F et qui présentent une demi-vie plasmatique largement supérieure à celle du peptide endogène. Ces deux analogues se sont révélés particulièrement actifs in vivo avec une capacité à diminuer la pression artérielle et à réduire la sécrétion de vasopressine dans le sang conduisant à une augmentation de la diurèse aqueuse. Les modèles 3D validés de l'APA et de l'ApélineR seront utilisés pour des campagnes de criblage in silico de chimiothèques virtuelles afin de découvrir de nouveaux inhibiteurs de l'APA et des agonistes de l'ApélineR qui pourraient conduire à terme à de nouveaux candidats-médicaments. Ces composés pourraient être utiles pour le traitement de l'HTA et de l'insuffisance cardiaque. / The doctoral work was divided in two parts, one on the structure-function studies of aminopeptidase A, and the second one, on those of the apelin receptor. I/ Aminopeptidase A (APA) is a membrane bound monozinc aminopeptidase which generates, in the brain, angiotensin (Ang) III from Ang II. Ang III is one of the main effector peptides of the brain renin-angiotensin system, which exerts a tonic stimulatory action on the control of blood pressure in hypertensive rats. Thus, the blockade of brain APA by a specific and selective inhibitor, EC33 or its prodrug, RB150, normalizes blood pressure in two animal models of arterial hypertension (HTA). APA constitutes a potential therapeutic target for the treatment of HTA that justifies the development of more potent and selective APA inhibitors than EC33, with enhanced pharmacodynamic and pharmacokinetic profiles when compared to RB150. With this aim, we built a three dimensional (3D) model of APA based on the recently published crystal structure of human APA. We validated this model by structure-function studies combining molecular modeling and site-directed mutagenesis demonstrating the crucial role of one residue in the S1 subsite responsible for substrate specificity of APA for N-terminal acidic amino-acid residues and two other residues constituting the S2' subsite of APA involved in the binding of the P2' acidic residue of tripeptidic inhibitors, previously developed in the laboratory. II/ Apelin is the endogenous ligand of the human orphan receptor named APJ (ApelinR), a G protein-coupled receptor. Apelin and ApelinR are involved in the control of body fluid homeostasis and cardiovascular functions. ApelinR constitutes a potential therapeutic target for the treatment of heart failure and water retentions. Given that apelin half-life in the blood circulation is in the minute range, we aimed to develop potent metabolically stable apelin analogs.. In this context, it is necessary to understand how apelin binds to ApelinR and how it is activated. To do so, we build a 3D model of ApelinR based on the crystal structure of the chemokine receptor, CXCR4. We validated this model by structure-function studies by molecular modeling and site-directed mutagenesis. We showed that apelin interacts with the receptor through interactions between the basic residues of the peptide and the acidic residues of the ApelinR, located in the extracellular loops. ,We then developed metabolically stable apelin-17 (K17F) analogs following two different strategies. First, we substituted each residue of K17F by its D-isomer or a synthetic amino-acid. Secondly, we added a fluoroalkyl chain at the N-terminal part of K17F. These two strategies allowed to significantly improve plasma half-life of the modified peptides for several hours without modifying their pharmacological properties as compared to K17F. Two apelin metabolically stable analogs, P92 and LIT01-196, were found to have significantly higher in vivo activity than K17F with a strong capacity to decrease blood pressure and to inhibit vasopressin release in the blood stream inducing an increased aqueous diuresis. These new validated 3D models will be now used to perform in silico screening of virtual chemical libraries to discover new APA inhibitors and ApelinR agonists that could ultimately lead to new drug candidates. These compounds could be useful for the treatment of HTA and heart failure.