Les récepteurs aux hormones glycoprotéiques (rGpHs) rTSH, rFSH et rLH/CG appartiennent<p>à la classe A des GPCRs. Les récepteurs da la classe A des GPCRs sont caractérisés par la<p>similitude de séquence de leur domaine transmembranaire avec la rhodopsine. Outre ce<p>domaine dit « serpentin », qu’ils partagent avec tous les GPCRs, les rGpHs offrent la<p>particularité de présenter un grand domaine extracellulaire (ECD) responsable de la liaison et<p>de l’affinité de leurs ligands respectifs.<p>Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) sont les cibles de 50% des médicaments<p>actuellement sur le marché pharmaceutique. La compréhension de leur mode de<p>fonctionnement est donc essentielle au développement de nouvelles molécules capables de<p>cibler spécifiquement ces récepteurs. Ces dernières années, il est apparu clairement que les<p>GPCRs étaient présent à la surface cellulaire sous forme d’oligomères. Le but de ce travail<p>était d’explorer de manière approfondie, le mécanisme d’activation et de dimérisation du<p>rTSH en identifiant les résidus du domaine transmembranaire des récepteurs aux hormones<p>glycoprotéiques impliqués dans le processus d’activation et de dimérisation.<p>Au cours de ce travail de thèse, nous avons dans premier temps généré une banque de mutants<p>aléatoires du rTSH. Ces mutants ont ensuite été criblés par une approche HTRF pour mettre<p>en évidence des mutants dont l’activité constitutive est augmentée ou ayant perdu la capacité<p>de dimériser.<p>Nous avons ainsi déterminé de nouveaux résidus importants pour le mécanisme d’activation<p>du rTSH. Les résultats que nous avons obtenus permettent d’apporter des éléments de réponse<p>et une base de travail sur le mécanisme d’activation. Cependant une description détaillée de<p>l’activation reste toutefois indéterminée. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La libération d'hormones glucocorticoïdes (GC), en réponse au stress, est un mécanisme important du contrôle de la neurogenèse chez l'adulte. Une question non résolue est de savoir si ces hormones agissent directement sur les précurseurs neuronaux (NPCs) ou indirectement, en agissant sur d'autres types cellulaires, modifiant la libération de facteurs de croissance ou l'activité de réseaux neuronaux. Afin de répondre à cette question, nous avons développé un modèle murin dans lequel le gène du récepteur des GC (GR) est invalidé, de façon inductible, dans les précurseurs neuraux adultes. Nous avons montré qu'en présence ou en absence du GR, un traitement chronique avec des GC affecte de façon similaire la différentiation et la survie des neurones nés chez l'adulte. L'effet connu des GC sur la suppression de la neurogenèse adulte n'est donc pas du à une action directe de ces hormones sur les NPCs. L'absence du GR n'affecte pas non plus le comportement des souris mutantes lorsque les GC circulent à un niveau de base. En revanche, un traitement chronique avec des GC induit chez les animaux contrôles un phénotype anxieux (observé dans les tests de novelty-suppressed feeding, light/dark box, and elevated O-maze) alors que les animaux mutés sont préservé de ce changement comportemental. De façon similaire, un traitement chronique avec des GC facilite l'apprentissage des souris contrôles lors d'un test d'apprentissage par la peur. L'invalidation du gène GR dans les NPC bloque cet effet. L'apprentissage des souris. Ces résultats précisent le rôle du GR dans le contrôle de la neurogenèse dans l'hippocampe adulte et dans la modulation des comportements de type anxieux. / Stress hormones are known as one of the strongest and most ecologically relevant mediators of adult neurogenesis. A lingering question in adult neurogenesis is whether these hormones, known as glucocorticoids (CG), act directly on neural progenitor cells (NPCs), or indirectly through secreted factors or changes in network activity. To address these unknowns, we generated a transgenic mouse model whose GC receptors (GRs) could be inducibly inactivated specifically in NPCs. We investigated the effect of this cell-specific GR knockout model on hippocampal survival and differentiation and found them to be similarly affected by chronic GC treatment compared to controls. This implies that GC-suppressed neurogenesis and its impact on morphology is indirect, and GR in other cells may be mediating the effects. Furthermore, mice with GR inactivation in newborn neurons behaved similarly to controls in all tasks observed under basal levels of GC. When mice were chronically treated with GC, however, controls exhibited an anxious phenotype, whereas transgenic mice behaved like untreated control groups in all anxiety measures except latency to feed in NSF. Neither GC nor inactivation of GR in adult-born neurons altered depression-like behaviors in the forced swim test, nor percent freezing in contextual fear discrimination. Lastly, we found that GC increased the rate of learning in 1-trial contextual fear conditioning, an effect not mediated by reducing GR signaling in the neurogenic pool. These results highlight the functional contributions of adult neurogenesis as well as how their GRs mediate anxiety-relevant behaviors irrespective of suppressed neurogenesis.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Afin d'assurer un contrôle des dommages causés par la maladie hollandaise de l'orme, une meilleure compréhension de l'interaction hôte-pathogène s'avère nécessaire. Plus spécifiquement, cette étude vise à approfondir les connaissances du pathogène lui-même et des facteurs de virulence utilisés par celui-ci. Deux méthodes permettent d'identifier les gènes impliqués dans la pathogénie du champignon ascomycète Ophiostoma novo-ulmi : 1) la comparaison de souches présentant des niveaux de virulence très différents ou 2) la mutagenèse aléatoire. En milieu naturel il existe très peu de variation de la virulence entre les souches d'O. novo-ulmi; en conséquence, la première alternative n'était pas envisageable. C'est pourquoi nous avons développé une méthode efficace de transformation à partir d'une souche très virulente d'O. novo-ulmi (H327) afin de produire des transformants moins virulents et d'identifier l'un des gènes associés à cette perte de virulence. L'ajout d'enzyme de restriction a permis d'augmenter le taux de transformants mais n'a pas favorisé le taux d'insertions uniques du plasmide tel que mentionné dans d'autres travaux. Des séquences d'ADN génomique proches du site d'insertion du plasmide ont ensuite été isolées à partir des transformants présentant une croissance réduite. Le deuxième volet de ces travaux consiste à développer un test qui permettrait de déterminer rapidement la virulence des transformants et d'éviter l'utilisation de plants d'orme lors du criblage initial. Nous avons démontré l'utilité de mesurer les lésions sur pommes 'Golden Delicious' pour évaluer la virulence des transformants et de souches sauvages d'O. novo-ulmi. Enfin, la dernière partie de la thèse porte spécifiquement sur un transformant moins virulent, KP78, identifié précédemment lors des tests sur pommes et sur ormes. Parmi les six gènes situés dans la région de l'insertion, deux présentent une expression réduite dans le mycélium poussant sur milieu au bois d'orme. L'analyse de ségrégation de l'insertion dans une descendance issue d'un croisement entre KP78 et une souche de type sauvage a montré qu'une mutation non marquée serait responsable des caractères qui distinguent KP78 de la souche de référence H327.

La transcétolase (TK, EC 2.2.1.1) est une enzyme catalysant la formation de cétoses de configuration D-thréo à partir d’aldéhydes α-hydroxylés (2R), par formation stéréospécifique d’une liaison C-C. L’objectif de ces travaux est d’inverser l’énantiosélectivité de cette enzyme par ingénierie afin d’obtenir des cétoses L-érytho (recherchés pour leurs applications potentielles dans les domaines pharmaceutique et/ou nutritionnel) à partir d’aldéhydes α-hydroxylés (2S). Dans ce but, une TK thermostable (mTKgst) issue de la bactérie thermophile Geobacillus stearothermophillus a d’abord été identifiée et produite. L’étude de sa structure tridimensionnelle a permis d’identifier deux résidus du site actif ayant un rôle potentiel dans l’inversion de son énantiosélectivité : Leu382 et Asp470. Des banques demTKgst mutées ont alors été créées, selon deux stratégies : rationnelle et semi-rationnelle. La première a consisté à muter les deux résidus sélectionnés par mutagenèse par saturation de site, tandis que la seconde a consisté à modifier deux séquences de cinq résidus contigus à aux positions clés, selon la mutagenèse par cassette. Afin d’identifier les mTKgst mutées d’intérêt, un test de criblage à haut-débit a été mis au point, basé sur le suivi pH-métrique de la réaction en présence de rouge de phénol. A l’issue du criblage, le variant mTKgst-L382D/D470S a été mis en évidence. Son activité vis-à-vis d’un aldéhyde modèle de configuration (2S) a été augmentée d’un facteur 5 par rapport à l’enzyme sauvage et la perte de l’énantiosélectivité vis-à-vis desaldéhydes (2R) a été confirmée. / Transketolase (TK, EC 2.2.1.1) catalyzes the formation of D-threo ketoses from (2R)-α-hydroxyaldehydes by the stereospecific formation of a C-C bond. Our aim was to invert the enantioselectivity of TK by protein engineering in order to obtain L-erytho ketoses (sought after for their potential pharmaceutical and/or nutritional applications) from (2S)-α-hydroxyaldehydes. For that purpose, a thermostable TK from thermophilic bacterium Geobacillus stearothermophilus (mTKgst) has been identified and overexpressed. After the study of the 3D-structure of mTKgst, two residues located in its active site (Leu382 and Asp470) were selected as mutation targets for the inversion of the enzyme’s enantioselectivity. Both rational and semi-rational approaches were considered for the construction of the mutant mTKgst libraries. In the former, the two residues were modified by site-saturation mutagenesis. In the latter, short sequences of five amino acids, neighboring target ones, were modified using a cassette mutagenesis technique. A novel continuous pH-based assay has been developed for the high-throughput screening of the mTKgst libraries, using phenol red as pH indicator. The screening revealed mTKgst-L382D/D470S as the top mutant, showing a 5-fold activity improvement towards a model (2S)-hydroxyaldehyde and the loss of enantioselectivity towards the (2R)-aldehyde.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.