Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Leptosphaeria maculans est un Dothideomycète phytopathogène capable d’alterner des modes de vie saprophyte, hemibiotrophe endophyte et nécrotrophe durant son cycle infectieux sur le colza. Afin de comprendre cette plasticité infectieuse, une mutagenèse aléatoire à grande échelle par ATMT a permis de générer une collection de 5000 transformants. L’objectif principal de cette thèse était d’exploiter cette collection en prenant avantage de la disponibilité d’outils de génomique, pour, d’une part, comprendre les mécanismes d’intégration de l’ADN-T dans le génome, et d’autre part, identifier des déterminants du pouvoir pathogène ciblés par l’ADN-T dans des mutants affectés dans leur capacité infectieuse. Une analyse systématique de 318 pieds d’insertion a été réalisée dans le but de d’évaluer les caractéristiques de l’insertion de l’ADN-T. Ce dernier est fréquemment inséré dans les régions actives riches en gènes, et favorise des gènes impliqués dans des processus biologiques indicatifs d’une conidie germante. Un biais marqué des insertions en faveur des régions régulatrices est observé ainsi qu’une corrélation entre la densité des insertions et le skew CG près du site d’initiation de la transcription. Ces observations sont cohérentes avec le modèle de ciblage intranucléaire de l’ADN-T. Enfin, l’existence de micro-homologies entre le site de pré-insertion et la bordure gauche de l’ADN-T indique une intégration par voie de recombinaison homologue (HR) et/ou microhomologue (MMEJ). Une approche multicritère a été utilisée pour caractériser cette collection. Un test d’inoculation a permis d’identifier 166 mutants altérés dans leur pouvoir pathogène. La validation génétique de la co-ségrégation entre le phénotype altéré et la présence de l’ADN-T indique que 44% des mutants montrant un déterminisme monogénique de l’altération sont effectivement étiquetés. Parmi les mutants altérés, 35 ont été analysé pour : (i) le phénotype de croissance en conditions usuelles de culture et en réponse aux stress oxydatif, UV et nutritif, (ii) le lien entre altération de la germination et pouvoir pathogène. Les gènes affectés par l’intégration de l’ADN-T, ont été identifié et analysé dans la souche sauvage à l’aide de données de transcriptomique. Ces cribles ont permis de décomposer le phénotype d’altération in planta en plusieurs phénotypes in vitro. Le plus fréquemment, les mutants ne sont pas altérés dans leur in vitro croissance, mais la plupart sont sensibles aux ROS. Les analyses d’expression au cours de l’infection indiquent que les gènes codant pour des effecteurs et ceux impliqués dans la détoxification des ROS, ont des dynamiques d’expression inverses et bi-phasiques, en lien avec le style de vie hemibiotrophe de L. maculans. Les 42 gènes ciblés par l’ADN-T dans ces mutants ont été identifiés et leur fonction putative disséquée par bioinformatique et transcriptomique. Au final, nous avons identifié six mutants d’intérêt pour une caractérisation fonctionnelle. Deux de ceux-ci deux ont atteint un niveau de caractérisation suffisant pour l’émission d’une hypothèse de travail. Dans le mutant µ1165, l’ADN-T cible un gène codant pour une protéine ribosomale S17 (LmRPS17), dont la régulation dépendrait de la voie de signalisation du complex TORC1. Nos résultats préliminaires suggèrent, d’une part, que TORC1 est une cible potentielle de LmRPS17 et, d’autre part, que la phase biotrophe de l’infection chez L. maculans est probablement régulée par TORC1 via l’enzyme de détoxication des ROS SOD2. Dans le mutant µ444, l’ADN-T cible un gène codant pour un élément rétroviral putatif LmHYP1, largement conservé parmi les ascomycètes. Nos résultats suggèrent que LmHYP1 interviendrait dans la régulation de gènes impliqués dans le pouvoir pathogène, via la production de petits ARN interférents issus hypothétiquement du clivage de son ARN messager par la machinerie de défense anti-rétrovirale. La validation de ces deux hypothèses est en cours au laboratoire. / The Dothideomycete phytopathogen Leptosphaeria maculans is capable to alternate saprophytic, hemibiotrophic, endophytic and necrotrophic life styles during a single infectious cycle on its host plant, Brassica napus. However, little is known about the determinants of such plasticity. As part of a large-scale insertional mutagenesis project aiming at the discovery of pathogenicity factors a collection 5000 transformants has been generated by ATMT. The main objective of my PhD was to take advantage of “omics” to extract biological value from L. maculans mutants collection for a better understanding of T-DNA integration features and further identification of pathogenesis determinants in this fungus. A systematic analysis of 318 T-DNA tags was performed in a large collection of transformants in order to evaluate the features of T-DNA integration in its particular TE-rich compartmentalized genome. The T-DNA integration was mainly targeted to gene-rich, transcriptionally active regions, and favored biological processes that are consistent with the physiological status of a germinating conidia. In addition, T-DNA integration was strongly biased towards regulatory regions, and mainly promoters. Consistently with the T-DNA intranuclear targeting model, the density of T-DNA insertion correlated with CG skew near the transcription initiation site. The existence of microhomologies between promoter sequences and the T-DNA LB flanking sequence was also consistent with T-DNA integration to host DNA mediated by homologous recombination and/or the microhomology-mediated end joining pathways. Based on this data, a multi-criteria approach was used to draw the more possible information from this collection by identifying all 166 mutants reliably affected in pathogenicity, and expanding the genetic analysis. Considering single-gene segregation of the pathogenicity phenotype, our data indicate a 44% ratio of actual tagging. In parallel, for a subset of 35 isolates of the collection, we (i) described growth patterns in regular culture conditions or in response to oxidative, UV or starvation stresses, (ii) evaluated the link between altered germination and pathogenicity, (iii) identified and annotated the genes putatively affected by the T-DNA integration, and (iv) analyzed kinetics of expression of these genes in the WT isolate using available microarrays. Our results showed that pathogenicity alteration phenotype could be broken down into a pattern of phenotypes in vitro including growth, germination defect and susceptibilities to oxidative burst, starvation and UV stresses. Our results showed that most of these mutants were not altered in axenic growth but showed enhanced sensitivity to reactive oxygen species (ROS). Furthermore, our results showed that effectors and ROS scavengers have inverted dynamics during plant infection, consistently with the biphasic hemibiotrophic growth of L. maculans. Also, 42 genes targeted by the T-DNA in these mutants were recovered and dissected. This catalogue allowed us to identify a series of promising mutants for further functional studies. Based on this screening, six mutants were subjected to further analyses but only two reached sufficient advance for hypothesis building. In mutant µ1165, the T-DNA targeted a ribosomal protein S17 (LmRPS17), a downstream component of target of rapamycin complex 1 (TORC1) pathway. Our preliminary results suggested that TORC1 is a potential a target of LmRPS17. Also, biotrophic growth is probably tuned by TORC1 via Super oxide dismutase 2 (SOD2). In mutant µ444, the T-DNA targeted a retroviral-like element LmHyp1 widely conserved among ascomycetes. Our results suggest that LmHyp1 probably acts as a regulatory element during plant infection as its cleavage by the antiretroviral defences is hypothesized to generate siRNAs that silences distant genes. Work on these mutants is in progress.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Chez Cupriavidus metallidurans CH34, le complexe CnrYXH contribue à réguler l'expression des gènes de régulation et de résistance au cobalt et au nickel en fonction de la concentration environnementale de ces cations. La fixation de cobalt ou de nickel sur le domaine périplasmique senseur de CnrX induit des modifications conformationnelles à l'origine de la transduction du signal transmembranaire. Cela conduit à rendre le facteur sigma CnrH disponible pour sa liaison à l'ARN polymérase (ARNP) dans le cytoplasme. Le complexe CnrH:ARNP se fixe alors spécifiquement sur les promoteurs des gènes cnrY et cnrC pour initier la transcription des gènes de régulation (cnrYXH) et de résistance (cnrCBAT). Dans le but de déterminer la nature de ce signal, mon projet de thèse visait à cartographier les interactions protéine:protéine au sein du complexe CnrYXH dans les trois compartiments concernés : le périplasme, la membrane plasmique et le cytoplasme. La documentation des déterminants d'interaction entre CnrX, CnrY et CnrH a permis d'élaborer un modèle structural et fonctionnel pour le complexe CnrYXH et ses homologues soulevant des hypothèses nouvelles sur le fonctionnement du système Cnr. / The CnrYXH complex contributes to regulate the expression of the regulatory genes and resistance genes involved in cobalt and nickel resistance in Cupriavidus metallidurans CH34. The binding of nickel or cobalt to CnrX in the periplasm induces conformational modifications that could trigger transmembrane signal transduction. As a result, CnrH is made available in cytoplasm for binding to RNA polymerase. The CnrH:RNA polymerase complex binds specifically the cnr promoters and initiates transcription of both the regulatory genes (cnrYXH) and resistance genes (cnrCBAT). In order to delineate the mechanism of signal transduction through the membrane, I studied the interactions between the three partners in the different cellular compartments: periplasm, plasmic membrane and cytoplasm. The identification of the interaction determinants between CnrX, CnrY and CnrH allowed us to propose a structural and functional model for the CnrYXH complex and its homologues. This model brings up new hypothesis on the function of Cnr system.

Chez les eucaryotes, le complexe kinase TORC1 (Target Of Rapamycin Complex 1) joue un rôle central dans le contrôle de la croissance cellulaire. Il intègre de nombreux signaux et agit en modulant l’état de phosphorylation de différents effecteurs, principalement des protéines impliquées dans des processus anaboliques ou cataboliques. Parmi ces signaux, on distingue notamment les acides aminés. Ces derniers agissent sur TORC1 via l’action de protéines de la famille des GTPases Rag, elles-mêmes régulées par des facteurs GEF et GAP. Des études récentes sur des cellules mammifères ont mis en évidence l’existence de senseurs d'acides aminés, capables de moduler l'activité des facteurs GEF et GAP. Chez la levure, ces senseurs restent toutefois inconnus. Chez la levure, TORC1 contrôle la fonction de plusieurs protéines y compris des transporteurs d'acides aminés de la membrane plasmique, comme la perméase générale des acides aminés, Gap1. C’est via sa branche de signalisation Tap2-PP2A/Npr1 que TORC1 contrôle l'ubiquitylation et le trafic intracellulaire de ces transporteurs, et ceci, en modulant l’activité d’adaptateurs de type α-arrestine de l'ubiquitine-ligase Rsp5.Dans ce travail, nous avons combiné des approches de génétique et de biochimie chez la levure afin d’étudier la régulation de TORC1 et son rôle dans l'endocytose en réponse au substrat de Gap1, la perméase générale des acide aminés, et de Can1, la perméase spécifique de l'arginine.Dans la première et la deuxième partie de ce travail, je décris ma contribution à l'étude qui visait à élucider le mécanisme d'ubiquitylation de Gap1 et de Can1 induite par le transport de leurs substrats. Le modèle déduit de ce travail propose que cette régulation négative n'est pas due à l'accumulation intracellulaire des acides aminés transportés, mais à un changement conformationnel des perméases, couplé à la réaction de transport et qui fait apparaitre un état ouvert vers l'intérieur, entraînant ainsi le remodelage de la queue cytoplasmique N-terminale et en conséquence l’exposition d'un site de liaison caché pour des adaptateurs de Rsp5 de type α-arrestine. Dans le cas de Can1, l'α-arrestine principale impliquée est Art1 et doit être stimulée via TORC1. Cependant, les α-arrestines Bul1/2, impliquées dans la régulation négative de Gap1, sont capables de promouvoir son ubiquitylation induite par le transport de substrat, qu'elles aient ou non été stimulées via TORC1. Nous fournissons également des preuves que d'autres perméases d'acides aminés spécifiques (Mup1, Lyp1) sont régulées par leurs propres substrats d'une manière similaire à Can1.Dans la dernière partie de ce travail, nous avons étudié le mécanisme par lequel le transport des acides aminés chez la levure stimule l'activité de TORC1 via les GTPases Rag, Gtr1 et Gtr2. En analysant en Western Blot l’état de phosphorylation de Npr1 et Sch9, deux kinases effectrices de TORC1, nous avons révélé que le signal général qui déclenche l'activation Gtr-dépendante de TORC1 est le flux de H+ couplé au transport des acides aminés généré par des symporteurs H+/acide-aminés. Dans ce contexte, nous avons identifié la pompe à H+ de la membrane plasmique, Pma1, comme étant un régulateur essentiel de l'activité de TORC1. L'activité de transport de Pma1 étant elle-même stimulée par une augmentation des protons cytosoliques, nous suggérons que Pma1 module TORC1 par un effet de signalisation.Collectivement, nos résultats fournissent de nouvelles perspectives sur le rôle central de TORC1 dans le contrôle des transporteurs de nutriments chez la levure. / The Target of Rapamycin Complex 1 (TORC1) plays a pivotal role in controlling cell growth in probably all eukaryotic organisms. It operates by integrating upstream signals like growth factors and nutrients to modulate by phosphorylation multiple downstream effectors, mostly proteins involved in anabolic or catabolic processes. Among the various signals that impinge on TORC1, nitrogen sources, in particular amino acids are primordial input signals modulating TORC1 activity through the conserved Rag family of GTPases. Recent studies in mammals have shed the light on the existence of various sensor systems of internal amino acids that modulate the activity of the GEF and GAP factors acting on the Rag GTPases. Yet, in yeast the amino acid sensing events acting upstream of the Rag GTPase (named Gtr1 and Gtr2) regulators remain poorly known. Yeast TORC1 controls the function of many proteins including several plasma membrane amino acid transporters, e.g. Gap1, the general amino acid permease. It does so via the Tap2-PP2A/Npr1-signaling branch that controls the ubiquitylation and intracellular trafficking of these proteins through regulation of α-arrestin-type adaptors of the ubiquitin-ligase Rsp5. In this work, we combined yeast genetics and biochemical assays to study TORC1 regulation by amino acids and to illustrate the role of TORC1 in substrate-transport mediated endocytosis of Gap1 and of the arginine specific permease, Can1. In the first and second part of this work, I describe my contribution to the study that aimed at elucidating the mechanism of substrate-transport-mediated ubiquitylation and endocytosis of Gap1 and Can1. The model deduced from this work states that this down-regulation is not due to intracellular accumulation of the transported amino acids, but to substrate-transport-induced conformational transition of the transporters to an inward-facing state, resulting in remodeling of their N-terminal cytoplasmic tail and subsequent exposure of a hidden binding site for α-arrestin-like adaptors of Rsp5. In the case of Can1, the main α-arrestin involved is Art1 and needs be stimulated via TORC1. The Bul1/2 α-arrestins involved in Gap1 down-regulation, however, are able to promote its substrate-transport-elicited ubiquitylation regardless of whether they have been stimulated via TORC1 or not. We also provide evidence that other specific amino acid permeases (Mup1, Lyp1) are regulated by their own substrates in a manner similar to Can1. In the last part of this work, we investigated how amino acid uptake by yeast cells triggers Rag/Gtr-dependent activation of TORC1. By assaying the phosphorylation on western blot of two TORC1-downstream effectors, the Npr1 and Sch9 kinases, we showed that uptake by Gap1 of ß-alanine, which cannot be used as a nitrogen source, unexpectedly stimulates TORC1 activity. Further analysis of this response allowed us to show that the general signal triggering Gtr-dependent activation of TORC1 in response to amino acid uptake is the influx of H+ coupled to transport via H+/amino-acid symporters. Furthermore, we identified Pma1, the H+-ATPase establishing the H+ gradient at the plasma membrane, as a central player of this control of TORC1 activity. As the transport activity of Pma1 itself is known to be stimulated by an increase of cytosolic protons, we suggest that Pma1 modulates TORC1 via signaling. Altogether, our results provide new insights on the central role of TORC1 in control of nutrient permeases in yeast. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La détection de molécules odorantes représente un enjeu important dans divers domaines tels que l’industrie alimentaire, le diagnostic médical et la sécurité du territoire, par exemple. En effet, les odorants, présents par milliers dans notre environnement, véhiculent de nombreuses informations, via leur nature chimique ou leur concentration. Notre système olfactif est capable de discriminer des milliers de molécules différentes via des mécanismes biochimiques impliquant l’association de nombreux partenaires protéiques et un codage combinatoire de l’information. Ces biomolécules, qui englobent notamment les récepteurs olfactifs et les protéines de liaison aux odorants (OBP), constituent une source intéressante d’éléments de détection pour la conception de biocapteurs. Les OBP sont de petites protéines solubles présentent dans le mucus nasal à des concentrations de l’ordre du millimolaire. Leur poche de liaison hydrophobe leur confère la capacité de lier de façon réversible les molécules odorantes. Leur robustesse et leur manipulation aisée en font de bonnes candidates pour l’élaboration de biocapteurs. Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés à la détection de molécules odorantes en associant des OBP comme biorécepteur et l’électrochimie comme méthode de transduction. Par une méthode de mutagenèse dirigée, nous avons montré qu’en modifiant un seul des acides aminés dans la poche de liaison de deux OBP de rat (rOBP2 et rOBP3), il était possible de moduler leurs affinités envers les odorants. En parallèle, nous avons décrit la détection qualitative et quantitative de molécules volatiles à partir d’OBP. Nous avons montré que rOBP3 lie la 2-méthyl-1,4-naphtoquinone (MNQ), une sonde électrochimique. La quantité de MNQ déplacée de la poche de liaison de rOBP3 par la 3-isobutyl-2-méthoxypyrazine (IBMP), un odorant modèle, a été mesurée par voltammétrie cyclique à vagues carrées. Nous avons déterminé les constantes de dissociation des complexes rOBP3 / MNQ et rOBP3 / IBMP. Les valeurs mesurées par électrochimie ont été confirmées par compétition avec une sonde fluorescente et par titration calorimétrique isotherme. En combinant cette nouvelle méthode analytique à des variants de rOBP3 qui présentent des profils de liaison différents et complémentaires, nous avons détecté sélectivement chacun des constituants d’un mélange ternaire d’odorants. Ces travaux, qui allient ingénierie des OBP et électrochimie, offrent des perspectives intéressantes dans le domaine des nez électroniques. / The detection of odorant molecules has become an important challenge in different research area, such as the food industry, medical diagnostics and homeland security. Indeed, the thousands of odorants in our environment provide information on their chemical nature or their concentration. Human olfactory system is capable of discriminating thousands of different molecules thanks to biochemical mechanisms involving multiple protein receptor partners and a combinatorial coding. These biomolecules that include olfactory receptors and odorant-binding proteins (OBP) represent an interesting source of detectors for the design of biosensors. OBPs are small soluble proteins present in nasal mucus at millimolar concentrations. Their hydrophobic binding pocket gives them the ability to reversibly bind odorant molecules. OBPs are robust and easy to produce and are thus good candidates for the design of biosensors. In this work, we focused on the detection of odorant molecules associating OBPs as a bioreceptor and electrochemistry as a transduction method. Using site-directed mutagenesis, we have shown that by substituting a single amino acid in the binding pocket of two rat OBPs (rOBP2 and rOBP3), it is possible to modulate their binding affinities towards odorants. In parallel, we described a qualitative and quantitative method for the detection of volatile molecules using OBPs. We have shown that rOBP3 binds 2-methyl-1,4-naphtoquinone (MNQ), an electrochemical probe. The amount of MNQ displaced from the binding pocket of rOBP3 by the model odorant 3-isobutyl-2-methoxypyrazine (IBMP), was measured using square-wave voltammetry. We determined the dissociation constants of the rOBP3 / MNQ and rOBP3 / IBMP complexes. These values measured by electrochemistry were confirmed by a competitive fluorescent assay and isothermal titration calorimetry. By combining this new analytical method to rOBP3 variants with different and complementary binding profiles, we were able to selectively detect each of the components of a ternary mixture of odorants. This work, that combines the engineering of OBPs and electrochemistry, offers us interesting perspectives in the field of electronic noses.

Chez certains pathogènes, les flavohémoglobines (flavoHbs) jouent un rôle important dans le système de défense des microorganismes en leur conférant une résistance contre le stress nitrosant généré par les cellules du système immunitaire. Dans la mesure où ces protéines sont absentes chez l’homme, plusieurs études ont été réalisées en vue de comprendre le fonctionnement des flavoHbs au niveau moléculaire en les considérant comme des cibles attractives potentielles pour des inhibiteurs sélectifs. L’inactivation de ces enzymes chez les pathogènes entraîne une perte de virulence. Des composés chimiques (dérivés azolés) ont été identifiés comme étant capables d’inhiber leur activité enzymatique et d’affecter les facteurs de virulence bactérienne. Si ces composés sont très utilisés dans le traitement d’infections fongiques cutanées invasives, leur activité antibactérienne potentielle n’est pas encore exploitée.Typiquement, les flavoHbs sont composées de trois domaines : un domaine à hème de type globine, un domaine de site de fixation d’une flavine et un domaine de fixation du substrat de l’enzyme, le NADH. Les structures cristallographiques des flavoHbs montrent que ce sont des protéines capables d'adopter des conformations différentes selon la nature et la présence de ligand de l’hème mais aussi selon l’organisme d’origine. Ces différentes conformations se traduisent par une mobilité d’un seul des trois domaines sans modification majeure des deux autres domaines. Nous avons entrepris, dans ce travail, l’étude de la flavoHb d’une bactérie pathogène, Staphyloccocus aureus (pathogenic bacteria), peu étudiée dans la littérature et sa comparaison avec celle issue de Ralstonia eutropha (bactérie non pathogène), mieux caractérisée, afin de tenter d’apporter des informations nouvelles voire plus spécifiques de leur fonctionnement chez les pathogènes.Le travail présenté dans ce manuscrit décrit tout d’abord la caractérisation fonctionnelle et biochimique de la flavoHb de S.aureus, et approfondi celle de R. eutropha. Du fait de l’absence de structure cristallographique de la flavoHb de S. aureus, nous avons construit un modèle structural théorique en se basant sur l’homologie de séquence forte entre la séquence d’acide aminée de S. aureus et celle de Saccharomyces cerevisiae dont la structure 3D a été récemment déterminée. Dans l’hypothèse où le mécanisme enzymatique des flavoHbs implique une transition entre différentes conformations, les flavoHbs de R. eutropha et S. aureus ont été modifiées génétiquement au niveau du résidu phénylalanine suggéré par l’analyse structurale comme pouvant jouer un rôle dans la transition entre les différentes conformations. Les conséquences de la mutation de Phe396 en Ser ou Ala ont été analysées au regard des activités catalytiques et des propriétés biochimiques de l’enzyme mais aussi des propriétés des transferts d’électrons intramoléculaires entre les groupements prosthétiques (hème et flavine) par différentes techniques spectroscopiques. Ce travail a permis de montrer que l’effet de la substitution du résidu Phe sur les propriétés enzymatiques diffère selon la flavoHb considérée et révèle dans certains cas un site de fixation de substrat autre que le substrat natif. L’effet d’inhibiteurs (dérivés azolés) mais aussi des quinones et de composés aromatiques nitrés sur le fonctionnement des protéines natives et modifiées génétiquement ont été également étudiés dans ce travail, ces derniers composés pouvant agir en tant que "substrats subversifs" pour les flavoHbs, transformant leurs fonctions de protection en fonctions cytotoxiques.L’ensemble de ce travail a montré que, malgré des structures et des séquences protéiques très voisines, les flavoHbs issues de bactéries différentes sont susceptibles de se comporter différemment vis-à-vis de l’introduction d’une même mutation, de l’effet d’un même inhibiteur et peuvent le cas échéant présenter aussi des cycles catalytiques sensiblement différents. / For some pathogens, flavohemoglobins (FlavoHbs) play an important role in the defense of microorganisms by conferring them a resistance against nitrosative stress generated by the immune system cells. Since these protein are absent in human, several studies have been conducted in order to understand the functioning of these proteins at the molecular level, considering them as potential attractive targets for selective inhibitors. Their inactivation results a loss of virulence. Chemical compounds such as azole derivatives have been identified as being capable of inhibiting their enzymatic function and thereby affecting the bacterial virulence factors. If these compounds are widely used in the treatment of invasive fungal skin infections, their potential antibacterial activity is not yet operated.Typically, flavoHbs are composed of three domains: an N-terminal globin domain which harbors a single heme b and a C-terminal ferredoxin reductase-like FAD- and NAD-binding module. The crystallographic structures of flavoHbs show that these proteins are able to adopt different conformations depending on the nature and the presence of heme ligand but also depending on different organisms they are coming from. The different conformations are characterized by a rigid body motion of one of the three domains. We have undertaken in this work, the study of the Staphyloccocus aureus flavoHb, poorly studied in the literature, and compared it to the Ralstonia eutropha flavoHb (non pathogenic bacteria) to provide new and more specific information on behaviors of these proteins derived from pathogens.This PhD work describes first the functional and biochemical characterization of the S. aureus flavoHb. Due to the lack of its crystallographic structure, a theoretical structural model was designed based on the strong sequence homology between the amino acid sequence of S. aureus and Saccharomyces cerevisiae for which the 3D structure was recently determined. We hypothesized that the relative movement of protein domains could be a way to regulate its enzymatic activity by controlling the substrate accessibility. The Phe396 residue (nomenclature according to R. eutropha), suggested by the structural data to play an important role in the enzyme functioning, but also in the equilibrium between different conformations, was substituted by the Ala or Serine amino acids. The effects of the punctual mutations were investigated with respect to the enzyme functioning and biochemical properties. The mutations effect on the internal electron transfer between flavoHbs cofactors (heme and FAD) was also studied by spectroscopic techniques. This work showed that the impact of Phe substitution on the enzymatic properties is different, depending the considered flavoHb and revealed an additional binding site for other substrate than the native one. The effects of azole derivative inhibitors and also quinones and nitroaromatic compounds have been studied on native and genetically modified enzymes functioning. The latter compounds may act as the ‘subversive substrates’ for flavoHb, converting its protective functions into the cytotoxic ones.Taken as a whole, this work showed that, although the protein structures and sequences are similar, the flavoHbs from different bacteria may behave differently towards an identical mutation, an identical inhibitor and could display different catalytic cycles.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2004-2005 / Les cancers cutanés sont associés à la formation des dimères cyclobutyliques de pyrimidine (DCP) générés par les ultraviolets (UV) du soleil. Nos résultats indiquent que les transversions T-->G retrouvées suite aux UVA sont dues aux DCP formés majoritairement sur les TT. Nous avons également démontré que, contrairement au dogme établi, les protéines réparant les mésappariements n'influencent pas la réparation des DCP. p53 a indéniablement une influence sur la réparation des DCP. Cependant, la lignée SW480, contenant un gène p53 double-muté, est fonctionnelle en réparation par excision de nucléotides des DCP. Normalement, un stress est nécessaire à l'activation des effecteurs de p53. Cependant, la protéine p53 double-mutée des SW480 active constitutivement p21, un effecteur de p53. L'activation des protéines réparant les DCP par p53 se fait probablement de la même façon que p21. L'éclaircissement de ces mécanismes a amené une meilleure compréhension de l'induction des cancers.