La lectine de Helix pomatia (HPA), extraite de la glande à albumine de l'escargot de Bourgogne et spécifique du résidu GalNAc, appartient à une nouvelle famille de lectine dite de type H. Elle est utilisée depuis plus de vingt ans comme marqueur d'adénocarcinomes (notamment du sein, du colon, du poumon) à fort pouvoir métastatique et donc faible pronostic vital. Son utilisation comme outil de routine en oncologie est, cependant, fortement limitée par son impossibilité à la produire sous forme recombinante. Afin de contourner ces difficultés, des protéines homologues ont été recherchées chez d'autres invertébrés. Deux lectines de type H ont été identifiées chez l'amibe Dictyostelium discoideum (discoidines) et une chez le corail Sinularia lochmodes (SLL-2). Les discoidines sont composées de deux domaines distincts, un domaine C-terminal, spécifique des résidus galactosylés et homologue à HPA et un domaine N-terminal, dit domaine discoidine, de fonction inconnue. Ces travaux de thèse portent, dans un premier temps, sur la poursuite de la caractérisation structurale de la discoidine 1 puis sur la production du domaine N-terminal de la discoidine 2 afin de confirmer la fonction lectine supposée. Dans un second temps, des expériences de microscopie confocale ont montrés que les discoidines ne possédaient pas la capacité d'HPA dans la discrimination des cellules métastatiques par rapport aux non métastatiques. La construction, par mutagenèse, d'une protéine chimérique entre la discoidine 2, très facilement produite dans E. coli, et HPA a alors été entreprise, le but étant de lui apporter la même spécificité qu'HPA. Enfin, la protéine SSL-2 a été clonée et de nombreux essais d'expression sous forme soluble et de purification ont été réalisés en vue de sa caractérisation biochimique et structurale pour sa possibilité d'utilisation comme marqueurs en histopathologie

La mésentéricine Y105 est une bactériocine de sous-classe IIa produite par Leuconostoc mesenteroides Y105. Pour comprendre le mécanisme de l'activité anti-Listeria de ce peptide et plus généralement des bactériocines de classe IIa, l'étude des relations existant entre la structure et la fonction de ce peptide a été envisagée. Dans ce but, une collection de mésentéricines Y105 modifiées au niveau d'un résidu a été produite. Afin d'obtenir ces dérivés de bactériocine, une méthode de mutagenèse aléatoire par PCR a été mise en place pour générer des séquences d'ADN, codant la bactériocine mature, modifiées sur un seul codon. Dans un deuxième temps, une méthode de production hétérologue de ces peptides mutés a été développée en utilisant d'une part un vecteur portant les gènes de structure des bactériocines, et d'autre part, un vecteur permettant l'expression de l'immunité et du transport de ces peptides. Un outil de production universelle de peptide a été élaboré. L'étude de l'impact des mutations sur l'activité antagoniste, la structure secondaire (analysée par dichroïsme circulaire en présence de trifluoroéthanol ou de micelles de lysophosphatidylcholine), la structure tridimensionnelle (prédite) et l'interaction de la mésentéricine Y105 avec des environnements mimant les membranes cibles (méthode d'extinction de la fluorescence intrinsèque du tryptophane) a été réalisée. Enfin, une analyse par résonance magnétique nucléaire (RMN) a été effectuée sur la bactériocine sauvage pour déterminer sa structure tridimensionnelle. De l'ensemble de ces données, un modèle d'action est proposé pour la mésentéricine Y105, ce modèle peut être étendu aux bactériocines de structure proche.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'azote est l'un des éléments les plus essentiels dans le monde pour les êtres vivants, car il est essentiel pour la production des éléments de base de la cellule, les acides aminés, les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires. L’atmosphère est composé de 78% d'azote gazeux, une source d'azote inutilisable par la plupart des organismes à l'exception de ceux qui possèdent l’enzyme nitrogénase, tels que les bactéries diazotrophique. Ces micro-organismes sont capables de convertir l'azote atmosphérique en ammoniac (NH3), qui est l'une des sources d'azote les plus préférables. Cette réaction exigeant l’ATP, appelée fixation de l'azote, est catalysée par une enzyme, nitrogénase, qui est l'enzyme la plus importante dans le cycle de l'azote. Certaines protéines sont des régulateurs potentiels de la synthèse de la nitrogénase et de son activité; AmtB, DraT, DraG, les protéines PII, etc.. Dans cette thèse, j'ai effectué diverses expériences afin de mieux comprendre leurs rôles détailés dans Rhodobacter capsulatus. La protéine membranaire AmtB, très répandue chez les archaea, les bactéries et les eucaryotes, est un membre de la famille MEP / Amt / Rh. Les protéines AmtB sont des transporteurs d'ammonium, importateurs d'ammonium externe, et ont également été suggéré d’agir comme des senseurs d'ammonium. Il a été montré que l’AmtB de Rhodobacter capsulatus fonctionne comme un capteur pour détecter la présence d'ammonium externe pour réguler la nitrogénase. La nitrogénase est constituée de deux métalloprotéines nommées MoFe-protéine et Fe-protéine. L'addition d'ammoniaque à une culture R. capsulatus conduit à une série de réactions qui mènent à la désactivation de la nitrogénase, appelé "nitrogénase switch-off". Une réaction critique dans ce processus est l’ajout d’un groupe ADP-ribose à la Fe-protéine par DraT. L'entrée de l'ammoniac dans la cellule à travers le pore AmtB est contrôlée par la séquestration de GlnK. GlnK est une protéine PII et les protéines PII sont des protéines centrales dans la régulation du métabolisme de l'azote. Non seulement la séquestration de GlnK par AmtB est importante dans la régulation nitrogénase, mais la liaison de l'ammonium par AmtB ou de son transport partiel est également nécessaire. Les complexes AmtB-GlnK sont supposés de lier DraG, l’enzyme responsable pour enlever l'ADP-ribose ajouté à la nitrogénase par DraT, ainsi formant un complexe ternaire. Dans cette thèse certains détails du mécanisme de transduction du signal et de transport d'ammonium ont été examinés par la génération et la caractérisation d’un mutant dirigé, RCZC, (D335A). La capacité de ce mutant, ainsi que des mutants construits précédemment, RCIA1 (D338A), RCIA2 (G344C), RCIA3 (H193E) et RCIA4 (W237A), d’effectuer le « switch-off » de la nitrogénase a été mesurée par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats ont révélé que tous les résidus d'acides aminés ci-dessus ont un rôle essentiel dans la régulation de la nitrogénase. L’immunobuvardage a également été effectués afin de vérifier la présence de la Fe-protéine l'ADP-ribosylée. D335, D388 et W237 semblent être cruciales pour l’ADP-ribosylation, puisque les mutants RCZC, RCIA1 et RCIA4 n'a pas montré de l’ADP-ribosylation de la Fe-protéine. En outre, même si une légère ADP-ribosylation a été observée pour RCIA2 (G344C), nous le considérons comme un résidu d'acide aminé important dans la régulation de la nitrogénase. D’un autre coté, le mutant RCIA3 (H193E) a montré une ADP-ribosylation de la Fe-protéine après un choc d'ammonium, par conséquent, il ne semble pas jouer un rôle important dans l’ADP-ribosylation. Par ailleurs R. capsulatus possède une deuxième Amt appelé AmtY, qui, contrairement à AmtB, ne semble pas avoir des rôles spécifiques. Afin de découvrir ses fonctionnalités, AmtY a été surexprimée dans une souche d’E. coli manquant l’AmtB (GT1001 pRSG1) (réalisée précédemment par d'autres membres du laboratoire) et la formation des complexes AmtY-GlnK en réponse à l'addition d’ammoniac a été examinée. Il a été montré que même si AmtY est en mesure de transporter l'ammoniac lorsqu'il est exprimé dans E. coli, elle ne peut pass’ associer à GlnK en réponse à NH4 +. / Nitrogen is one of the most vital elements in the world for living creatures since it is essential for the production of the basic building blocks of the cell; amino acids, nucleic acids and other cellular constituents. The atmosphere is 78% nitrogen gas (N2), a source of nitrogen unusable by most organisms except for those possessing the enzyme nitrogenase, such as diazotrophic bacteria species. These microorganisms are capable of converting atmospheric nitrogen to ammonia (NH3), which is one of the most preferable nitrogen sources. This ATP demanding reaction, called nitrogen fixation, is catalysed by the nitrogenase enzyme, which is the most important enzyme in the nitrogen cycle. Some proteins are potential regulators of nitrogenase synthesis and activity; AmtB, DraT, DraG, PII proteins and etc. In this thesis I performed various experiments in order to better understand their roles in Rhodobacter capsulatus, in more detail. The membrane protein AmtB, which is widespread among archaea, bacteria and eukaryotes, is a member of the MEP/Amt/Rh family. The AmtB proteins are ammonium transporters, taking up external ammonium, and have also been suggested to sense the presence of ammonium. It has been shown that in Rhodobacter capsulatus AmtB functions as a sensor for the presence of external ammonium in order to regulate nitrogenase. Nitrogenase consists of two metalloprotein components named MoFe-protein and Fe-protein. The addition of ammonium to R. capsulatus culture medium leads to a series of reactions which result in the deactivation of nitrogenase, called “nitrogenase switch-off”. A critical reaction in this process is one in which DraT adds an ADP-ribose group to the Fe-protein of nitrogenase. The entrance of ammonia through the AmtB pore is regulated by GlnK sequestration. GlnK is a PII protein and PII proteins are one of the central proteins in the regulation of nitrogen metabolism. Not only is GlnK-AmtB sequestration important in nitrogenase regulation, but binding of ammonium by AmtB or its partial transport is also necessary. AmtB-GlnK complexes are thought to bind DraG, which is responsible for removing the ADP-ribose that DraT adds to nitrogenase, to form a ternary complex. In this thesis details of the signal transduction mechanism and ammonium transport were examined by generating and characterizing RCZC, a (D335A) site- directed mutant of AmtB. The ability of this mutant, as well as previously constructed mutants RCIA1 (D338A), RCIA2 (G344C), RCIA3 (H193E) and RCIA4 (W237A), to “switch-off” nitrogenase activity was measured by gas chromatography. The results revealed that all the above amino acid residues have critical roles in nitrogenase regulation. Immunoblotting was also carried out to check the presence of ADP-ribosylated Fe-protein. D335, D388 and W237 seem to be crucial for NifH ADP-ribosylation, since their mutants (RCZC, RCIA1 and RCIA4 respectively) didn't show ADP-ribosylation on Fe-protein. In addition, although a slight ADP-ribosylation was observed for RCIA2 (G344C) we still consider it as an important amino acid residue in this matter whereas the remaining mutant RCIA3 (H193E) showed Fe-protein ADP-ribossylation after an ammonium shock, therefore it doesn't seem to be important in NifH ADP-ribosylation. In addition R. capsulatus possesses a second Amt called AmtY, which in contrast to AmtB, doesn't appear to have any specific roles. In order to find out its functionality, AmtY was overexpressed in an E. coli strain lacking AmtB (GT1001 pRSG1) (which was carried out previously by other lab members) and AmtY-GlnK complex formation in response to ammonium addition was examined. It was shown that even though AmtY is able to take up ammonia when expressed in E. coli it fails to associate with GlnK in response to NH4+.

La surexpression de pompes d’efflux par les cellules cancéreuses permet l’élimination d’agents cytotoxiques, induisant alors une résistance à la chimiothérapie. Trois transporteurs ABC sont principalement impliqués dans cette résistance : ABCB1 (aussi appelé P-gp), ABCC1 (ou MRP1) et ABCG2 (ou BCRP, MXR, ABCP). Du fait de leur implication dans le phénotype de « MultiDrug Resistance », il est essentiel de mieux comprendre le fonctionnement de ces transporteurs. Une étude par mutagenèse dirigée a montré que les boucles intracellulaires, ICL0 et ICL1 sont impliquées dans le transport des substrats. Deux résidus sont particulièrement intéressants : W379 qui agirait comme un filtre des substrats ; et H457 qui participerait à la reconnaissance ou à la fixation des substrats. Par ailleurs, il est important de moduler cette chimiorésistance. Dans ce contexte nous avons développé une nouvelle classe d’inhibiteurs d’ABCB1 et ABCG2 non compétitifs basés sur un motif dipeptidique. Les composés les plus efficaces, CT1347 pour ABCB1 et CT1364 pour ABCG2, s’avèrent, d’une part peu ou pas cytotoxiques à fortes concentrations, abolissent d’autre part la résistance induite par ABCB1 ou ABCG2 et se comportent comme des inhibiteurs non compétitifs du Hoechst 33342 et de la daunorubicine. De plus, CT1364 inhibe l’activité ATPasique d’ABCG2 et induit une diminution rapide de l’expression de la protéine. Enfin, les 1ers tests in vivo de ce composé montrent que l’association avec l’irinotécan ralentit la croissance des xénogreffes de petite taille chez des souris / Resistance to chemotherapy is partly due to efflux pumps expressed in the plasma membrane which prevent the accumulation of anticancer drugs in the tumour cells. Three human ATP-binding Cassette (ABC) transporters are particularly involved in this phenotype: P-gp/ABCB1, MRP1/ABCC1, and the last discovered BCRP/ABCG2. Because of their involvement in chemoresistance, it is critical to understand the mechanism by which those ABC transporters recognize and transport drugs. The mutagenesis study of the intracellular loops, ICL0 and 1 shows that these loops are involved in this mechanism. Two amino acids were particularly remarkable: W379 which act as a substrate filter and H457 which can be involved in substrate recognition and binding. In order to restore the cancer cell sensitivity to chemotherapeutic drugs, we have developed a new class of peptide inhibitors, specific to one transporter. A structure-activity relationship study has been performed and made it possible to develop a second generation of molecules. The most efficient compound inhibiting ABCB1 (CT1347) or ABCG2 (CT1364) have none or limitated cytotoxic effects. These compounds restore the activity of chemotherapeutic drugs and act as non competitive inhibitors. Moreover, CT1364 inhibits the ATP hydrolysis activity and lead to a rapid reduction of ABCG2 expression. Initial in vivo tests that have been carried out with CT1364 associated with irinotecan allow to observe a growth reduction of small mice xenografts

Les molybdoenzymes (MoEs) à bisPGD sont des métalloprotéines dont le site actif est constitué d'un cofacteur à molybdène (Mo) mononucléaire. Elles sont impliquées dans les cycles biogéochimiques de l'azote, du carbone et du soufre et catalysent essentiellement des réactions d'oxydoréduction à 2 e-/2 H+ envers une grande variété de substrats. En dépit de la connaissance de la structure cristallographique de nombreuses MoEs, leur fonctionnement reste encore largement incompris. Ces enzymes présentent un intérêt biotechnologique car certains de leurs substrats sont des composés toxiques notoires, tels que les oxydes de sélénium ou d'arsenic. L'objectif de ma thèse a été d'identifier quels facteurs structuraux gouvernent la réactivité d'une MoE à bisPGD, la nitrate réductase A d'E. coli. Le premier axe de mes travaux de thèse a consisté à étudier l'activité de l'enzyme envers différents substrats et examiner le rôle du ligand protéique du Mo dans sa réactivité, en combinant des approches de mutagenèse dirigée, de biochimie et de spectroscopie RPE. J'ai montré que le ligand protéique du Mo est impliqué dans une étape clé du cycle catalytique. Le second axe a consisté à identifier les relations existantes entre la structure atomique du site actif et ses signatures spectrales. Pour augmenter la résolution et permettre d'identifier les transitions structurales mises en jeu lors de l'interconversion entre les différentes formes spectrales, j'ai utilisé la spectroscopie RPE impulsionnelle, qui permet de détecter les noyaux magnétiques (1H et 14N, …). Mes résultats constituent un pré-requis nécessaire pour l'étude structurale à haute résolution du site actif de la nitrate réductase. / Molybdenum (Mo) is a rare transition metal that is indispensable to most living organisms. In particular, it makes part of the active site of metalloenzymes involved in the biogeochemical cycles of carbon, nitrogen and sulphur. In this context, prokaryotic molybdoenzymes (MoEs) with the bisPGD cofactor at their active site essentially catalyze oxidoreduction reactions with 2 e-/2 H+ towards a wide range of substrates. Given that some MoEs can activate substrates that are well-known pollutants, understanding the mechanism of these enzymes accounts for a major prerequisite for future enzymatic engineering strategies aimed at optimizing enzyme reactivity towards bioremediation processes. To identify the molecular determinants of the reactivity of MoEs, we have explored the importance of the Mo proteic ligand aspartate in the respiratory Nitrate Reductase from E. coli. We have combined biochemistry and EPR spectroscopy to analyze the impact of the Mo-ligand substitution on both the enzymatic and the structural properties of the molybdenum cofactor. Our results show that the nature of the proteic ligand plays a critical role in the reactivity of the active site. A second part of my thesis work consisted in establishing the link between spectroscopic data on the MoV centre and its atomic structure. To get a high level of resolution and to identify which kind of structural modification is responsible for the spectroscopic differences between every Mo(V) signature, pulsed EPR spectroscop is most promising. Our results constitute a pre-requisite for structural studies of every species of the MoV center of the NRA.

Les lipases, protéines ubiquitaires, sont les enzymes les plus étudiées et les plus utilisées dans l’industrie. Elles catalysent un très grand nombre de réactions, d’hydrolyse et de synthèse, conduisant à une grande diversité de molécules, acides, esters, amides…. Les domaines d’applications sont nombreux : les bio-énergies, les arômes, bio-lubrifiants, bio-plastifiants, émulsifiants, produits phytosanitaires et détergents, cosmétiques, synthons pour la chimie fine, produits pharmaceutiques… Aujourd’hui, grâce aux outils génétiques, il est possible de modifier leur activité, spécificité et thermostabilité pour les adapter idéalement aux contraintes industrielles. Dans ce travail de doctorat, nous nous sommes intéressés à quatre lipases d’intérêt industriel. Les 3 premières appartiennent à la famille des lipases de Candida rugosa (Lip1, Lip3 et Lip4). Bien que très homologues, leurs spécificités sont très différentes. Elles se distinguent de toutes les autres lipases par un site actif composé d’un long tunnel avec la triade catalytique à l’entrée de celui-ci. Cela en fait une enzyme particulièrement intéressante pour la conversion et la purification d’acides gras à longue chaîne. La quatrième est une nouvelle lipase identifiée chez la levure oléagineuse, Yarrowia lipolytica. Elle est très active sur les acides gras à longue chaîne, active à pH acide et présentant une grande énantiosélectivité sur des molécules d’intérêt pharmaceutique, les esters d’acide 2- halogéno-aryl acide acétique. Dans un premier temps, un nouveau système d’expression, une souche spécifique de Yarrowia lipolytica, a été étudié pour l’expression de variants construits par mutagenèse dirigée. Cette souche JMY1212 permet une intégration ciblée dans le génome de Y. lipoytica. Nous avons démontré qu’il s’agissait du premier système d’expression permettant de comparer statistiquement l’activité de variants directement à partir du surnageant de culture. Trois des lipases de Candida rugosa ont été clonées avec succès dans cette souche et leurs activités et spécificités vis-à-vis de la longueur de chaines des acides gras ont été étudiées. Lip1 et Lip3 présentent une spécificité pour les acides gras à longueur de chaine moyenne (C8-C10) alors que Lip4 préfère les C18:1. De, plus, pour la première fois, la purification, à partir d’un mélange d’esters éthyliques issu d’huile de poissons, d’acides gras poly-insaturés (PUFAs); acides cis-5, 8, 11, 14, 17-eicosapentaenoic (EPA) et cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoic (DHA), molécules bonnes pour la santé, a été réalisée avec les trois lipases séparées de C. rugosa. Quelle que soit l’enzyme, le rendement de récupération du DHA est supérieur à 93 % (97, 100 et 93 % pour Lip1, Lip3 et Lip4 respectivement. Une pureté maximale en DHA de ~60 % a été obtenue avec Lip3 et Lip4, à partir d’un mélange initial d’esters éthyliques contenant 25% de DHA. Une différence remarquable entre ces trois enzymes est que Lip4 est capable de mieux hydrolyser l’ester d’EPA (60% contre 14 et 16% pour Lip1 et Lip3). Lip4 est même capable d’hydrolyser le DHA (7% contre 3 et 0 % pour Lip1 et Lip3). La deuxième partie de ce travail a été consacrée à l’amélioration de l’énantiosélectivité des deux enzymes étudiées vis-à-vis de synthons d’intérêt dans l’industrie pharmaceutique, les esters de 2-bromo aryl acide acétique. La construction raisonnée d’un double variant de la lipase Lip2 de Y. lipolytica, D97AV232F, a permis d’obtenir une enzyme totalement énantiosélective (E >200). Celle-ci reconnaît l’énantiomère R alors que la lipase sauvage avait une faible préférence pour l’énantiomère S (E=5). Par ailleurs, cette exceptionnelle augmentation de l’énantiosélectivité s’accompagne d’une amélioration de l’activité de l’enzyme qui est ainsi multipliée par 4,5. Sur ce même mélange d’énantiomères, les 3 lipases de C. rugosa se sont avérées remarquables. Malgré leur grande homologie, leur spécificité est différente. Lip1 et Lip3 sont totalement S spécifiques (E>200), alors que Lip4 est R spécifique (E=15). Le docking moléculaire des énantiomères S et R dans le site actif des lipases Lip1 et Lip4 a permis de mieux comprendre ces différences de spécificité et de proposer des cibles de mutagenèse dirigée. L’encombrement et la nature de l’acide aminé présent en position 296 sont cruciaux pour la discrimination de l’enzyme / Lipases, ubiquitous proteins, are the most studied enzymes and the most used in industry. They catalyse a great number of reactions, hydrolysis and synthesis, leading to a great diversity of molecules, acids, esters, amides. There are numerous fields of applications: bio-energies, flavours, bio-lubricants, bio-plasticizers, emulsifiers, detergents, cosmetics, synthons for fine chemistry, and pharmaceutical products. Nowadays, thanks to genetic tools, it is possible to modify their activity, specificity and thermostability to ideally adapt enzymes for the industrial constraints. In this work, we were interested in four lipases of industrial interest. The third ones belong to the lipase family of Candida rugosa (Lip1, Lip3 and Lip4). Although they present high homology, their specificities are very different. They are distinct from the other lipases by the active site composed of a long tunnel with the catalytic triad at the entry of the tunnel. It leads to enzymes particularly interesting for the conversion and the purification of long chain fatty-acids. The fourth one is a new lipase identified from oleaginous yeast, Yarrowia lipolytica. It is one of the most active lipase on long chain fatty-acids; it is very active and stable at acid pH and presents a high enantioselectivity on molecules of pharmaceutical interest, the esters of 2- halogeno-aryl acetic acid. In this work, we first tested a new expression system, a specific strain of Y. lipolytica, for expression of variants obtained by site-directed mutagenesis. This strain JMY1212 enables integration to be targeted to a special locus of the Y. lipoytica genome. We demonstrated that it is the first expression system in which it is possible to compare statistically variant activities directly from the supernatant of the culture. Secondly, three lipases of C. rugosa were cloned successfully in this strain and their activities and specificities with respect to fatty acid chain lengths were studied. Lip1 and Lip3 have specificity for the fattyacids of medium chain (C8-C10) whereas Lip4 prefers C18: 1. Moreover, for the first time, purification, from a mixture of ethyl esters issued from fish oil, polyunsaturated fatty acids (PUFAs); cis-5, 8, 11, 14, 17- eicosapentaenoic acid (EPA) and cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoic acid (DHA), molecules with health benefits, was realised with the three C. rugosa lipases, separately. Whatever the enzyme the recovery of DHA is superior to 90 % (97, 100 and 93 % for Lip1, Lip3 and Lip4 respectively. The maximal DHA purity ~60 % was obtained with Lip3 and Lip4, with an initial ethyl ester mixture containing 25% DHA. A remarkable difference between these enzymes lies in the fact that Lip4 is able to better hydrolyse the EPA esters (60% against 13% and 16% respectively for Lip1 and Lip3). Lip4 is also able to hydrolyse DHA (7% against 3 and 0 % for Lip1 and Lip3 respectively). The third part of this work was devoted to the improvement of the enantioselectivity of the two enzymes studied with respect to the resolution of a racemic mixture of pharmaceutical industry, the R, S esters of 2-bromo aryl acetic acid. The rational construction of a double variant of Lip2 lipase from Y. lipolytica, D97A V232F was realized to obtain a total enantioselective enzyme (E > 200). This variant recognizes the enantiomer R whereas wild-type lipase had a weak preference for the enantiomer S (E=5). In addition, this exceptional increase in the enantioselectivity is accompanied by a 4.5 fold improvement of the activity. With the same mixture of enantiomers, the 3 lipases of C. rugosa proved to be remarkable from the point of view of enantioselectivity. In spite of their high homology, their specificity is different. Lip1 and Lip3 are completely specific for the S enantiomer, whereas Lip4 is R specific (E=15). The molecular docking of the S and R enantiomers in the active site of Lip1 and Lip4 lipases enables the observed differences in specificity to be better understood and targets for site-directed mutagenesis to be proposed. We demonstrated that the nature of the amino acid present in position 296 is crucial for the discrimination of these enzymes

Les systèmes bioélectroniques tels que les biopiles enzymatiques nécessitant souvent l'utilisation des assemblages moléculaires complexes comprenant le cofacteur de l'enzyme, des agents de couplage et des médiateurs électrochimiques. Afin de les simplifier, nous avons remplacé ces différents partenaires par 13 analogues simples à synthétiser après identification par criblage in silico. Le noyau aromatique est couplé à un noyau aromatique et puis un médiateur électrochimique est couplé à celui-ci. Les produits sont des poudres de couleurs variées (rose, rouge). Le rendement de la première étape est de 83% avec une pureté d'environ 92%. Le rendement de la seconde étape est compris entre 45% et 65% avec une pureté de 97%. Ces analogues ont été caractérisés chimiquement (RMN, spectrométrie de masse) et électrochimiquement (voltammétrie cyclique et spectroélectrochimie). Les activités de deux enzymes, la formiate déshydrogénase (FDH) et l'alcool déshydrogénase de foie de cheval (HLADH), et d'un catalyseur organométallique, le [Cp*Rh(bpy)(H2O)]2+, ont été évaluées avec ces analogues. De faibles activités ont été observées en présence de l'HLADH avec 4 analogues et en présence de la FDH avec un seul analogue. Au contraire aux enzymes, la réduction d'un médiateur a pu été confirmée en présence du catalyseur [Cp*Rh(bpy)(H2O)]2+ par voltammétrie cyclique. La FDH native n'est pas adaptée à fonctionner avec ces nouveaux substrats solubles dans un LI, le [MMIm][Me2PO4]. Une FDH tolérante (N187S/T321S) au [MMIm][Me2PO4] précédemment obtenue par évolution dirigée a été donc étudiée en isolant les simples mutants N187S et T321S. Le double mutant N187S/T321S et le simple mutant N187S sont 4 fois plus actifs en solution aqueuse et en présence de LI. Des analyses par spectroscopie de fluorescence ont montré que la simple mutation N187S favorise la stabilité du dimère de FDH en modifiant le pKa de l'acide aminé E163. Celui-ci est impliqué dans la thermostabilité et la tolérance des FDHs aux LIs / Bioelectrical systems, such as enzymatic biofuel cells, often require a molecular construction complex comprising the enzyme cofactor, intermediary molecules and electrochemical mediators. In order to simplify them, we have replaced these different partners by 13 analogs that are simple to synthesize after identification by screening in silico. The nicotinamide ring is coupled to an aromatic moiety and an electrochemical mediator is then coupled to it as well, resulting in various colored powders (pink, red). The first step' s yield is around 83% with a purity of approximately 92%. The second step's yield is comprised between 45% and 65% with a purity of 97%. The analogs were characterized chemically (NMR, mass spectrometry) and electrochemically (cyclic voltammetry, spectroelectrochemistry). The activities of two enzymes, the formate dehydrogenase (FDH) and the horse liver alcohol dehydrogenase (HLADH), and an organometallic catalyst, [Cp*Rh(bpy)H2O]2+, were evaluated with these analogs. Weak activities were observed for 4 analogs using the HLADH and 1 analog using the FDH. Unlike the enzymes, the reduction of a conjugated mediator was confirmed with the catalyst [Cp*Rh(bpy)H2O]2+ using cyclic voltammetry. The wild type FDH is not adapted to function with these new substrates, which can be solubilized in an IL such as [MMIm][Me2PO4]. An FDH (N187S/T321S) shown to be tolerant to [MMIm][Me2PO4], and obtained previously by directed evolution, was studied by isolating the two single mutants, N187S and T321S. The double mutant N187S/T321S and the mutant N187S are 4 times more active in aqueous solution and in [MMIm][Me2PO4]. Fluorescence spectroscopy analyses showed that the single mutation N187S favorises FDH dimer stability by modifying the pKa of the amino acid E163. The latter is involved in FDH thermal stability and tolerance in ILs

Ce travail cherche à apporter un éclairage sur les relations séquence-structure-fonction des alpha1,3/4-fucosyltransférases, avec un accent particulier sur les core alpha1,3-fucosyltransférases des plantes. La fucosylation de type Core alpha1,3 est une caractéristique des oligosaccharides N-liés des plantes et invertébrés, avec une fonction biologique qui n'est pas encore élucidée. L'activité Core alpha1,3-fucosyltransférase est responsable d'allergies alimentaires, au pollen, et aux insectes chez l'homme. Dans le cadre de ce travail sont présentés des résultats de caractérisation biochimique (effet de cations divalents sur l'activité, Km de substrat donneur), des expériences de troncation des différents domaines (ex: suppression du domaine C-terminal spécifique aux core alpha1,3-fucosyltransférases des plantes), et de mutagenèse dirigée, en utilisant comme protéine modèle, la core 1,3-fucosyltransferase A (FucTA) d'Arabidopsis thaliana qui a été exprimée sous forme recombinante chez Pichia pastoris. Ces expériences ont été dictées sur la base de nos résultats d'analyses bioinformatiques des séquences de alpha1,3/4-fucosyltransférases et de la modélisation par homologie du domaine de liaison au nucléotide-sucre de l'enzyme FucTA. La mutagenèse des résidus clé identifiés par cette approche a permis de confirmer l'importance de certains acides aminés dans le mécanisme catalytique. Enfin la protéine FucTA étant elle-même glycosylée quand elle est produite chez P. pastoris, nous avons étudié l'impact de cette glycosylation sur la production et l'activité de la protéine, par des expériences de mutagenèse, de Western blotting et de spectrométrie de masse.

Le virus de la rougeole est un virus à ARN négatif, membre de la famille des Paramyxoviridae. Le complexe de réplication viral comprend trois protéines principales : la polymérase à ARN ARN-dépendante (L), la nucléoprotéine (N) et la phosphoprotéine (P). Cette thèse présente une étude structurale, par des méthodes biochimiques et biophysiques, de la phosphoprotéine et de la nucléoprotéine produites dans la bactérie Escherichia coli. J'ai étudié les déterminants de la polymérisation de N et identifié un variant intéressant pour l'étude de N par cristallographie aux rayons X. J'ai aussi mis au point la purification d'un complexe de N et P, prélude à son étude structurale. Par ailleurs, j'ai montré que la partie N-terminale de P est intrinsèquement désordonnée. J'ai pu étendre ce résultat aux protéines P de nombreux virus apparentés par une étude bio-informatique. J'ai ensuite démontré l'importance du désordre structural au sein du complexe réplicatif des Paramyxoviridae #à la fois par son abondance et d'un point de vue fonctionnel#. Au-delà de leur intérêt pratique immédiat, ces résultats indiquent que la machinerie réplicative de ces virus pourrait constituer un système modèle pour l'étude du désordre structural dans les protéines. De plus, ils soulèvent de nombreuses questions et sont donc un prélude à une refonte de notre vision du complexe réplicatif de ces virus dont l'étude revêt une importance majeure en santé humaine.