Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-15T19:20:49Z No. of bitstreams: 1 amanda_n_b_fontes_ioc_bcm_0050_2011.pdf: 3773109 bytes, checksum: 8933f048c4d79d33efa1313c366344a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-15T19:20:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 amanda_n_b_fontes_ioc_bcm_0050_2011.pdf: 3773109 bytes, checksum: 8933f048c4d79d33efa1313c366344a8 (MD5) Previous issue date: 2011-05-26 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A hanseníase é uma doença infecto-contagiosa crônica, causada pelo Mycobacterium leprae. Após o sequenciamento do genoma deste patógeno, inúmeros esforços têm sido feitos na busca por sequências repetitivas com potencial para diferenciar isolados de M. leprae. Atualmente, VNTRs têm sido utilizados com o objetivo de compreender a diversidade genética deste patógeno em áreas com alta prevalência da doença. Além disso, SNPs também têm contribuído para elucidar aspectos referentes à disseminação da hanseníase pelo mundo. Neste estudo, a variabilidade genética de 292 isolados de M. leprae oriundos de amostras clínicas de pacientes hansenianos das regiões norte, nordeste e sudeste do país foi avaliada utilizando 16 VNTRs e três SNPs. O polimorfismo dos diferentes VNTRs foi determinado através de MLVA (Multiple-locus VNTR analysis) utilizando FLA (Fragment lenght analysis), enquanto que os SNPs foram analisados através de PCR-RFLP e/ou sequenciamento. O poder discriminatório dos 16 VNTRs foi de 0.999, sendo que as repetições de dinucleotídeos AT e o trinucleotídeo GAA21 apresentaram os maiores índices de discriminação alélica. Além da genotipagem de isolados de M. leprae de biópsias de pele, material de linfa fixado em lâmina de baciloscopia também foi utilizado como uma fonte alternativa para obtenção de DNA deste bacilo. Com relação à genotipagem por SNP, foi possível observar a predominância do genótipo 3, associado à população européia, em Rondônia, Rio de Janeiro e São Paulo. Já o genótipo 4, oriundo da África Ocidental, foi predominante em Pernambuco e Fortaleza. A presença dos diferentes genótipos e sua predominância em determinadas áreas corroboram com o processo de colonização do país que se reflete na atual composição étnica da população brasileira. Com base nos perfis obtidos através dos VNTRs e SNPs, foram identificados seis grupos geneticamente idênticos: quatro do Ceará, um de Rondônia e outro formado entre amostras de Minas Gerais e São Paulo. Nenhuma associação entre os pacientes enquadrados nos grupos da região norte e sudeste do país foi estabelecida. Todavia, foi possível observar que os grupos foram formados entre indivíduos oriundos de mesmo estado ou região geográfica. Com relação aos grupos formados entre as amostras do Ceará, associações entre o gênero masculino e o local de origem das amostras foram estabelecidas com base nos genótipos de M. leprae, sugerindo que estes seriam fatores de risco para a transmissão da hanseníase. Neste estudo, também foi possível avaliar amostras de pacientes com hanseníase recidiva para quatro VNTRs e os achados sugerem que estes pacientes foram re-infectados ou que houve mudança da população bacteriana durante a recidiva da doença. Os resultados comprovam que a genotipagem de M. leprae é uma ferramenta importante na elucidação de aspectos relativos à transmissão e disseminação da doença pelo mundo. / Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae. After sequencing the genome of this pathogen, numerous efforts have been made to identify repetitive sequences with potential to differentiate isolates of M. leprae. Currently, VNTRs have been used in order to understand the genetic diversity of this pathogen in areas with high prevalence of leprosy. Another form of genetic polymorphism, namely single nucleotide polymorphisms (SNPs), elucidated aspects related to the spread of leprosy in the world. In this study, the genetic variability of 292 M. leprae isolates from clinical leprosy patients from the north, northeast and southeast of the country, were analyzed for composition of 16 VNTRs and three SNPs. The genetic variability of different VNTRs was evaluated by MLVA (Multiple-locus VNTR analysis) using FLA (Fragment length analysis) while the SNPs were analyzed by RFLP-PCR and/or sequencing. The discriminatory power of 16 VNTRs was 0.999 and the AT dinucleotides and the GAA21 trinucleotide demonstrated the higher rates of allelic discrimination. In addition to the genotyping of isolates of M. leprae derived from skin biopsy samples, lymph fixed in ZN slides was also used as an alternative source to obtain DNA. By SNP typing, we observed the high prevalence of genotype 3, previously associated with Europeans, in the states of Rondônia, Rio de Janeiro and São Paulo. On the other hand, genotype 4, originating from Western Africa, was predominant in Pernambuco and Fortaleza. The presence of different genotypes and their prevalence in certain areas of Brazil is in accordance to the country’s history of colonization which reflects in the current ethnic composition of the population. Based on the VNTR and SNP profiles, six identical groups of two isolates each were identified: four from Ceará, one from Rondônia and another composed of samples from Minas Gerais and São Paulo. No association between patients from north and southeast of the country was established, however, most groups were composed by patients from the same state or geographic region. When performing an analysis of genotype similarity with patient data in groups from Ceará, we observed association of male gender and place of origin with M. leprae genotype grouping, suggesting these could be risk factors for transmission of leprosy. In this analysis, patients with leprosy relapse were also analyzed for four VNTRs and the results suggest the occurrence of re-infection or of bacterial population shift during disease relapse. The results of this study demonstrate that genotyping of M. leprae is an important tool to elucidate aspects of transmission and spread of disease in the world.

Leprosy is slowly progressive, chronic infectious disease, caused by the bacillus Mycobacterium leprae (M. leprae), with a potentially severe, mutilating and stigmatizing evolution. It represents a major public health problem in a lot of the countries around the world. Since 1982, the World Health Organization (WHO) recommended multidrug therapy (MDT) for the treatment of the disease with the combination of three drugs (rifampicin, clofazimine and dapsone) in multibacillary cases, and two, for the paucibacillary (rifampicin and dapsone). When more than one drug is used, the risks of adverse effects are increased. Retrospective papers reveal that adverse effects of drugs of MDT are one of the causes of irregularity or noncompliance with treatment, which make difficult the combat against the disease as a public heath problem. Furthermore, the occurrence of these events in an economically active age group may cause work absenteeism and be onerous. On other hand, spontaneous reports of adverse effects systems are at risk of subnotification, demanding the elaboration of specific forms of notification. Therefore, this paper aimed: 1) To verify the frequency and types of adverse effects to the drugs used on multidrug treatment (MDT) in two centers of reference in leprosy treatment, as well as the occurrence of serious adverse events leading to change in the treatment and its correlation with the presence of other diseases; 2) To identify clinical and epidemiological aspects of risk associated with the occurrence of adverse reactions and the instant of its appearance. 3) To analyze the risk of adverse effects interfere with treatment adherence, therapeutic response and the occurrence of leprosy reaction in patients followed in two referral centers treating leprosy. We designed a prospective study, after approval of the ethics committee, with monthly evaluation of the patients in two centers of leprosy treatment during the period of November 2011 and May 2014: in the ambulatory of (Des)Mancha-Sergipe Project, Universiy Hospital, Universidade Federal de Sergipe, and Reference Center of Leprosy, CEMAR (Centro de Especialidades Médicas de Aracaju). We applied a questionnaire to collect demographic, clinic, epidemiologic parameters such as sex, age, Body Mass Index (BMI), operational form of disease and adverse effects information in monthly evaluation, and analyzed their relationship to the therapeutic response, occurrence of leprosy reactions and treatment adherence. After the inclusion and exclusion criteria, we followed 119 of 245 patients that initiated the MDT between November 2011 and May 2013 in two centers. Adverse effects to MDT treatment were common, with a predominance of cutaneous related ones associated to clofazimina, such as ichthyosis/ xerosis (70.6%) and skin pigmentation (65.5%), followed by anemia related to dapsone (62.2 %). Although most adverse events to MDT were mild, severe adverse effects were detected, such as Drug Reaction with Eosinophilia and Systemic Symptoms (DRESS) in 3 patients, who required the suspension of MDT and replacement of dapsone for another drug, besides haemolytic anemia and drug hepatitis. Therapy was replaced in 13 patients, of whom 12 had at least 1 disease, which indicates probable use of other medications and suggests possible drug interaction as influence on adverse reactions, especially in the more severe. It was observed association of adverse effects to MDT with gender, age group, body mass index (BMI), operational classification and occurrence of leprosy reaction. The adverse effects did not impact on the adherence to treatment or therapeutic response. Thus, although retrospective papers show that adverse effects to drugs of MDT are important cause of irregularity or noncompliance with treatment, this present study was prospective, revealing that the active search for patients and specific adverse effect investigation forms can prevent leprosy treatment dropout. / A Hanseníase é uma doença infecciosa crônica, lentamente progressiva, causada pelo bacilo Mycobacterium leprae (M. leprae), de evolução potencialmente grave, mutilante e estigmatizante. Representa um grande problema de saúde pública em vários países do mundo. Desde 1982, a Organização Mundial de Saúde (OMS) preconizou a poliquimioterapia (PQT) para o tratamento da doença com a combinação de três drogas (rifampicina, clofazimina e dapsona) nos casos multibacilares, e de duas, para os paucibacilares (rifampicina e dapsona). Quando se utiliza mais de uma droga, existe o risco da soma de efeitos adversos. Estudos retrospectivos, transversais e de série de casos revelam que as reações adversas às drogas utilizadas na poliquimioterapia (PQT) constituem uma das causas de irregularidade ou abandono do tratamento, dificultando o combate da doença como problema de saúde pública. Além disso, a ocorrência desses eventos em faixa etária economicamente ativa pode levar ao absenteísmo ao trabalho e tornar-se onerosa. Por outro lado, os sistemas de relato espontâneo das reações adversas são prejudicados pela subnotificação, demandando a elaboração de formulários específicos de notificação. Diante disso, o presente estudo teve como objetivos: 1) Verificar a frequência e tipos de efeitos adversos às drogas usadas na poliquimioterapia (PQT), bem como a ocorrência de eventos adversos graves que levem à mudança no esquema terapêutico e sua correlação com a presença de comorbidades. 2) Identificar as variáveis de risco clínicas e epidemiológicas associadas à ocorrência das reações adversas e ao instante de seu aparecimento. 3) Analisar o risco das reações adversas interferirem na adesão ao tratamento, na resposta terapêutica e na ocorrência de reação hansênica em pacientes acompanhados em dois centros de referência do tratamento de hanseníase. Foi realizado estudo prospectivo, com avaliação mensal dos pacientes de dois centros de tratamento de hanseníase, o ambulatório do projeto (Des)Mancha-Sergipe do Hospital Universitário da Universidade Federal de Sergipe e no Centro de Referência em Hanseníase do CEMAR (Centro de Especialidades Médicas de Aracaju), no período de Novembro de 2011 a Maio de 2014. Dados demográficos, clínicos, epidemiológicos e laboratoriais foram coletados em avaliações mensais, para investigação de efeitos adversos e sua relação com forma clínica da doença, resposta terapêutica, ocorrência de reações hansênicas e aderência ao tratamento. Após os critérios de inclusão de exclusão, foram acompanhados 119 de 245 pacientes que iniciaram a PQT entre Novembro de 2011 e Maio de 2013 nos 2 centros. As reações adversas ao tratamento da PQT mostraram-se frequentes, com predomínio dos efeitos cutâneos relacionados à clofazimina, como ictiose/ xerose (70,6%) e pigmentação da pele (65,5%), seguidos pela anemia relacionada à dapsona (62,2%). Embora a maioria dos eventos adversos laboratoriais tenham sido leves, efeitos adversos graves foram detectados, a exemplo da síndrome de reação à droga com eosinofilia e sintomas sistêmicos (DRESS), observada em 3 pacientes, que requereu suspensão da PQT e substituição da Dapsona por outra droga, além de anemia hemolítica e hepatite medicamentosa. A terapêutica foi substituída em 13 pacientes, dos quais 12 tinham pelo menos 1 comorbidade, o que denota provável uso de outras medicações e sugere possível interação medicamentosa como influência nas reações adversas, especialmente nas mais graves. Observou-se associação de eventos adversos à PQT com o sexo feminino, faixa etária, Índice de Massa Corpórea (IMC), classificação operacional e ocorrência de reação hansênica. Não se observou repercussão dos eventos adversos na aderência ao tratamento ou na resposta terapêutica. Dessa forma, embora estudos retrospectivos apontem as reações adversas às drogas da PQT como importante causa de tratamento incompleto, o presente estudo foi prospectivo, revelando que a busca ativa dos pacientes e a utilização de formulário de investigação de eventos adversos podem prevenir o abandono terapêutico.

Pathogenic bacteria such as M.tuberculosis have evolved several mechanisms to aid their intracellular survival and subvert host defenses. One of the contributing factors is thought to be the production and secretion of large amount of cAMP, Mycobacterial genomes encode a large number of adenylyl cyclases distinct in their structure and regulatory mechanisms. The roles of these enzymes in the physiology and pathogenesis of virulent mycobacteria are only now being elucidated. The roles of phosphodiesterases (PDEs), which serve to lower cAMP levels through degradation are, however, relatively unexplored. The Rv0805 gene was previously shown to code for an active phosphodiesterase from Mycobacterium tuberculosis. Bioinformatics analysis revealed that orthologs of Rv0805 were found even in eukaryotes. Biochemical and structural characterization of Rv0805 revealed that it was a class III cAMP phosphodiesterase. Comparative genomics identified a close ortholog of Rv0805 in M. leprae (ML2210). The genome of M. leprae Encodes only 1,604 predicted proteins and possesses the highest number of pseudogenes, 1,116. The retention of a functional PDE, the ortholog of Rv0805, in the minimal genome of M. leprae is indicative of its importance in cellular physiology. Biochemical characterization of proteins from M. leprae and use of heterologous hosts will help understand this human pathogen better, since there are no tools currently available to genetically manipulate this bacterium. Sequence analysis of ML2210 revealed the presence of conserved motifs and residues known to be critical for catalysis and unique to class III phosphodiesterases. ML2210 shares 83% sequence identity with Rv0805 and 24% sequence identity with the phosphodiesterase from E. coli (cpdA). In vitro biochemical characterization of ML2210 using non-nucleotide colorigenic and cyclic nucleotide substrates revealed that it was an enzymatically active phosphodiesterase. Kinetic parameters of ML2210 with respect ot colorigenic substrates revealed that its catalytic properties were similar to that of Rv0805. However, with respect to hydrolysis of 3’, 5’-cAMP, ML2210 was catalytically more efficient than Rv0805, suggesting that in spite of being orthologs, these enzymes have evolved distinct specificities at their active site. A parallel of monoclonal antibodies raised to Rv0805 was also used understand the differences in the biochemical properties of Rv0805 and ML2210 better. It was observed that only one monoclonal antibody was able to recognize ML2210 by ELISA and not by Western blot analysis. These results revealed that conformational differences between ML2210 and Rv0805 exist. Over-expression of ML2210 in M. smegmatis resulted in a modest decrease in intracellular cAMP levels. Despite the absence of a predicted transmembrane region or a membrane-targeting signal, ML2210 localized to the cell envelop fraction upon over expression in M. smegmatis. Moreover, like Rv0805, over-expression of ML2210 also resulted in perturbation of the cell wall of M. smegmatis, arguing for additional cellular roles of this protein. Orthologs of Rv0805 or ML2210 are found only in slow growing mycobacteria suggesting that other cyclic nucleotide phosphodiesterases could regulate cAMP levels in fast growing mycobacteria like M. smegmatis. Since BLAST results did not retrieve an ortholog of Rv0805 or ML2210, COG1409 (COG database) containing Rv0805 was examined for the presence of other mycobacterial phosphodiesterases. Bioinformatics analysis identified Rv2795c as another PDE from M. tuberculosis. Sequence analysis of Rv2795c revealed the presence of all the motifs conserved in the class III PDEs but Rv2795c shared only 22% sequence identity with Rv0805 and 19% sequence identity with CpdA. Importantly, an ortholog of Rv2795c was identified in M. leprae. Interestingly. Rv2795c and its orthologs branched away from Rv0805, making it phylogenetically distinct and hence warranting further characterization. Recombinant, purified MSMEG_2647 (the Rv2795c ortholog from M. smegmatis) was able to hydrolyze cyclic nucleotides and other phosphodiester substrates in vitro. The Km for colorigenic substrates was higher when compared to the Km of ML2210 or Rv0805 for these substrates. However, the kinetic parameters of MSMEG_2647 for cyclic nucleotides were comparable to those of ML2210 or Rv0805. MSMEG_2647 was a metal dependent enzyme and among the panel of metals tested, Mn2+ supported the highest in vitro catalytic activity of MSMEG_2647. Zn2+ inhibited the catalytic activity of MSMEG_2647. In order to gain insight into the catalysis of MSMEG_2647, the end products of cAMP hydrolysis by MSMEG_2647 were analysed using reverse phase HPLC. The assay revealed that the end products of cyclic nucleotide hydrolysis by MSMEG_2647 were different when compared to the end products of hydrolysis of the same substrates by Rv0805 or ML2210. This suggests differences in the architecture of the active site residues of the mycobacterial MPEs. A mutational anlaysis of the active site residues in MSMEG_2647 was carried out to identify residues involved in substrate recognition and metal coordination. Although Rv0805 and MSMEG_2647 shared only a 22% sequence identity, MSMEG_2647 displayed strict conservation in the core MPE motifs. Mutation of the active residues N97 and H98 in Rv0805 had led to an abrogation of its catalytic activity. However, corresponding mutations of N76A and H77A in MSMEG_2647, did not lead to a loss in its catalytic activity. A third mutation known to be important for the catalytic activity of Rv0805 (D19) was incorporated. The corresponding residue at D19 position was mutated to an alanine. The catalytic activity of MSMEG_2647D19AN76AH77A mutant was abrogated, suggesting that while the core MPE motifs are conserved between mycobacterial PDEs, differences in the ensemble of the active site residues contributing to their catalytic activity exist. Thus, at least two biochemically diverse PDE clades are found in mycobacterial species. In order to decipher the function of MSMEG_2647, its expression was monitored during the growth of M. Smegmatis. The promoter of MSMEG_2647 displayed maximum activity during the logarithmic phase of M. smegmatis growth after which its activity declined as M. smegmatis entered the stationary phase. However in contrast to this, the transcript corresponding to msmeg_2647 mRNA was found at both logarithmic and stationary phases. The MSMEG_2647 protein was also detected at both logarithmic and stationary phases of M. smegmatis. These results suggest that additional factors may contribute to the stability of msmeg_2647 mRNA and protein levels. Localization studies of MSMEG_2647 revealed that MSMEG_2647 was present in the cytosol as well as in the cell envelope fractions. Interestingly, over-expression of MSMEG_2647 did not result in a significant increase in PDE activity in various subcellular fractions, suggesting tight regulation on the in vivo activity in various subcellular fractions, suggesting tight regulation on the in vivo activity of MSMEG_2647. In addition, over-expression of MSMEG_2647 in M. smegmatis led to only a modest decrease in cAMP levels in M. smegmatis. These results suggested additional roles of MSMEG_2647 in the biology of mycobacteria. Overexpression of MSMEG_2647 peturbed the integrity of cell wall as assessed by the use of lipophillic indicators of cell growth, crystal violet and malachite green, and a cell wall targeting antibiotic, isoniazid. Analyzing the gene neighborhood of MSMEG_2647 provided an insight into its putative function. It was observed that the stop codon of msmeg_2647 overlapped with the start codon of msmeg_2648 and stop codon of msmeg-2648 overlapped with the start codon of msmeg_2649. RT PCR was carried out at logarhtimic and stationary phases of M. smegmatis growth, which revealed that a polycistronic mRNA was being transcribed. These results confirmed that msmeg_2647, msmeg_2648 and msmeg_2649 were a part of an operon. Interestingly, these three genes as a gene cluster were confined to only those actinobacteria that produced mycolic acids. An operon often encodes products that form multiprotein complexes and operate in a common pathway. Since there were a part of an operon, a GST pull-down approach was employed to test if MSMEG_2647, MSMEG_2648 and MSMEG_2649 could physically interact. It was observed that MSMEG_2647 interacted with MSMEG_2648 and MSMEG_2649. MSMEG_2648 in turn interacted with MSMEG_2649. A role for MSMEG_2647 as a scaffold recruiting MSMEG_2648 and MSMEG_2649 is therefore proposed. In turn, a complex formation with these proteins may regulate the activity of MSMEG_2647. Attempts to generate a knock out of msmeg_2647 in M. smegmatis by homologous recombination were not successful suggesting either the gene was essential or a polar effect on msmeg_2648(an essential gene for the viability of M. smegmatis) may not allow msmeg_2647 to be deleted from the genome of M. smegmatis. In summary, this study has identified and characterized two new phosphodiesterases from mycobacteria, one from the pathogenic mycobacterium, M. leprae and the other, a PDE from M. smegmatis that is conserved in all species of mycobacteria. Several, key biochemical differences were observed using biochemical and biological approaches. It appears that the cellular roles of mycobacterial phsophodiesterases may extend beyond cAMP hydrolysis, with these proteins not only regulating cell wall properties but also acting as scaffolding proteins in the cell.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O diagnóstico da hanseníase neural pura baseia-se em dados clínicos e laboratoriais do paciente, incluindo a histopatologia de espécimes de biópsia de nervo e detecção de DNA de Mycobacterium leprae (M. leprae) pelo PCR. Como o exame histopatológico e a técnica PCR podem não ser suficientes para confirmar o diagnóstico, a imunomarcação de lipoarabinomanana (LAM) e/ou Glicolipídio fenólico 1 (PGL1) - componentes de parede celular de M. leprae foi utilizada na primeira etapa deste estudo, na tentativa de detectar qualquer presença vestigial do M. leprae em amostras de nervo sem bacilos. Além disso, sabe-se que a lesão do nervo na hanseníase pode diretamente ser induzida pelo M. leprae nos estágios iniciais da infecção, no entanto, os mecanismos imunomediados adicionam severidade ao comprometimento da função neural em períodos sintomáticos da doença. Este estudo investigou também a expressão imuno-histoquímica de marcadores envolvidos nos mecanismos de patogenicidade do dano ao nervo na hanseníase. Os imunomarcadores selecionados foram: quimiocinas CXCL10, CCL2, CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD68, HLA-DR, e metaloproteinases 2 e 9. O estudo foi desenvolvido em espécimes de biópsias congeladas de nervo coletados de pacientes com HNP (n=23 / 6 BAAR+ e 17 BAAR - PCR +) e pacientes diagnosticados com outras neuropatias (n=5) utilizados como controle. Todas as amostras foram criosseccionadas e submetidas à imunoperoxidase. Os resultados iniciais demonstraram que as 6 amostras de nervos BAAR+ são LAM+/PGL1+. Já entre as 17 amostras de nervos BAAR-, 8 são LAM+ e/ou PGL1+. Nas 17 amostras de nervos BAAR-PCR+, apenas 7 tiveram resultados LAM+ e/ou PGL1+. A detecção de imunorreatividade para LAM e PGL1 nas amostras de nervo do grupo HNP contribuiu para a maior eficiência diagnóstica na ausência recursos a diagnósticos moleculares. Os resultados da segunda parte deste estudo mostraram que foram encontradas imunoreatividade para CXCL10, CCL2, MMP2 e MMP9 nos nervos da hanseníase, mas não em amostras de nervos com outras neuropatias. Além disso, essa imunomarcação foi encontrada predominantemente em células de Schwann e em macrófagos da população celular inflamatória nos nervos HNP. Os outros marcadores de ativação imunológica foram encontrados em leucócitos (linfócitos T e macrófagos) do infiltrado inflamatório encontrados nos nervos. A expressão de todos os marcadores, exceto CXCL10, apresentou associação com a fibrose, no entanto, apenas a CCL2, independentemente dos outros imunomarcadores, estava associada a esse excessivo depósito de matriz extracelular. Nenhuma diferença na frequência da imunomarcação foi detectada entre os subgrupos BAAR+ e BAAR-, exceção feita apenas às células CD68+ e HLA-DR+, que apresentaram discreta diferença entre os grupos BAAR + e BAAR- com granuloma epitelioide. A expressão de MMP9 associada com fibrose é consistente com os resultados anteriores do grupo de pesquisa. Estes resultados indicam que as quimiocinas CCL2 e CXCL10 não são determinantes para o estabelecimento das lesões com ou sem bacilos nos em nervo em estágios avançados da doença, entretanto, a CCL2 está associada com o recrutamento de macrófagos e com o desenvolvimento da fibrose do nervo na lesão neural da hanseníase. / The diagnosis of pure neural leprosy (PNL) is based on clinical and laboratory data, including the histopathology of nerve biopsy specimens and detection of M. leprae DNA by polymerase chain reaction (PCR). Given that histopathological examination and PCR methods may not be sufficient to confirm diagnosis, immunolabeling of lipoarabinomanan (LAM) and/or phenolic glycolipid 1 (PGL1) M. leprae wall components were utilized in the first step of this investigation in an attempt to detect any vestigial presence of M. leprae in AFB- nerve samples. Furthermore, its well known that nerve damage in leprosy can be directly induced by Mycobacterium leprae in the early stages of infection; however, immunomediated mechanisms add gravity to the impairment of neural function in symptomatic periods of the disease. Therefore, this study also investigated the immunohistochemical expression of immunomarkers involved in the pathogenic mechanisms of leprosy nerve damage. These markers selected were CXCL10, CCL2 chemokines and CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD68, HLA-DR, metalloproteinases 2 and 9 in nerve biopsy specimens collected from leprosy (23) and nonleprosy patients (5) suffering peripheral neuropathy. Twenty-three PNL nerve samples (6 AFB+ and 17 AFB-PCR+) were cryosectioned and submitted to LAM and PGL1 immunohistochemical staining by immunoperoxidase; 5 nonleprosy nerve samples were used as controls. The 6 AFB-positive samples showed LAM/PGL1 immunoreactivity. Among the 17 AFB- samples, only 8 revealed LAM and/or PGL1 immunoreactivity. In 17 AFB-PCR+ patients, just 7 had LAM and/or PGL1-positive nerve results. In the PNL cases, the detection of immunolabeled LAM and PGL1 in the nerve samples would have contributed to enhanced diagnostic efficiency in the absence of molecular diagnostic facilities. The results of the second part of this study showed that CXCL10-, CCL2-, MMP2- and MMP9-immunoreactivities were found in the leprosy nerves but not in nonleprosy samples. Immunolabeling was predominantly found in recruited macrophages and Schwann cells composing the inflammatory cellular population in the leprosy-affected nerves. The immunohistochemical expression of all the markers, but CXCL10, was associated with fibrosis; however, only CCL2 was, independently from the other markers, associated with this excessive deposit of extracellular matrix. No difference in the frequency of the immunolabeling was detected between the AFB+ and AFB- leprosy subgroups of nerves, exception made to some statistical tendency to difference in regard to CD68+ and HLA-DR+ cells in the AFB- nerves exhibiting epithelioid granuloma. MMP9 expression associated with fibrosis is consistent with previous results of this research group. The findings conveys the idea that CCL2 and CXCL10 chemokines at least in advanced stages of leprosy nerve lesions are not determinant for the establishment of AFB+ or AFB- leprosy lesions, however, CCL2 is associated with macrophage recruitment and fibrosis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O diagnóstico da hanseníase neural pura baseia-se em dados clínicos e laboratoriais do paciente, incluindo a histopatologia de espécimes de biópsia de nervo e detecção de DNA de Mycobacterium leprae (M. leprae) pelo PCR. Como o exame histopatológico e a técnica PCR podem não ser suficientes para confirmar o diagnóstico, a imunomarcação de lipoarabinomanana (LAM) e/ou Glicolipídio fenólico 1 (PGL1) - componentes de parede celular de M. leprae foi utilizada na primeira etapa deste estudo, na tentativa de detectar qualquer presença vestigial do M. leprae em amostras de nervo sem bacilos. Além disso, sabe-se que a lesão do nervo na hanseníase pode diretamente ser induzida pelo M. leprae nos estágios iniciais da infecção, no entanto, os mecanismos imunomediados adicionam severidade ao comprometimento da função neural em períodos sintomáticos da doença. Este estudo investigou também a expressão imuno-histoquímica de marcadores envolvidos nos mecanismos de patogenicidade do dano ao nervo na hanseníase. Os imunomarcadores selecionados foram: quimiocinas CXCL10, CCL2, CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD68, HLA-DR, e metaloproteinases 2 e 9. O estudo foi desenvolvido em espécimes de biópsias congeladas de nervo coletados de pacientes com HNP (n=23 / 6 BAAR+ e 17 BAAR - PCR +) e pacientes diagnosticados com outras neuropatias (n=5) utilizados como controle. Todas as amostras foram criosseccionadas e submetidas à imunoperoxidase. Os resultados iniciais demonstraram que as 6 amostras de nervos BAAR+ são LAM+/PGL1+. Já entre as 17 amostras de nervos BAAR-, 8 são LAM+ e/ou PGL1+. Nas 17 amostras de nervos BAAR-PCR+, apenas 7 tiveram resultados LAM+ e/ou PGL1+. A detecção de imunorreatividade para LAM e PGL1 nas amostras de nervo do grupo HNP contribuiu para a maior eficiência diagnóstica na ausência recursos a diagnósticos moleculares. Os resultados da segunda parte deste estudo mostraram que foram encontradas imunoreatividade para CXCL10, CCL2, MMP2 e MMP9 nos nervos da hanseníase, mas não em amostras de nervos com outras neuropatias. Além disso, essa imunomarcação foi encontrada predominantemente em células de Schwann e em macrófagos da população celular inflamatória nos nervos HNP. Os outros marcadores de ativação imunológica foram encontrados em leucócitos (linfócitos T e macrófagos) do infiltrado inflamatório encontrados nos nervos. A expressão de todos os marcadores, exceto CXCL10, apresentou associação com a fibrose, no entanto, apenas a CCL2, independentemente dos outros imunomarcadores, estava associada a esse excessivo depósito de matriz extracelular. Nenhuma diferença na frequência da imunomarcação foi detectada entre os subgrupos BAAR+ e BAAR-, exceção feita apenas às células CD68+ e HLA-DR+, que apresentaram discreta diferença entre os grupos BAAR + e BAAR- com granuloma epitelioide. A expressão de MMP9 associada com fibrose é consistente com os resultados anteriores do grupo de pesquisa. Estes resultados indicam que as quimiocinas CCL2 e CXCL10 não são determinantes para o estabelecimento das lesões com ou sem bacilos nos em nervo em estágios avançados da doença, entretanto, a CCL2 está associada com o recrutamento de macrófagos e com o desenvolvimento da fibrose do nervo na lesão neural da hanseníase. / The diagnosis of pure neural leprosy (PNL) is based on clinical and laboratory data, including the histopathology of nerve biopsy specimens and detection of M. leprae DNA by polymerase chain reaction (PCR). Given that histopathological examination and PCR methods may not be sufficient to confirm diagnosis, immunolabeling of lipoarabinomanan (LAM) and/or phenolic glycolipid 1 (PGL1) M. leprae wall components were utilized in the first step of this investigation in an attempt to detect any vestigial presence of M. leprae in AFB- nerve samples. Furthermore, its well known that nerve damage in leprosy can be directly induced by Mycobacterium leprae in the early stages of infection; however, immunomediated mechanisms add gravity to the impairment of neural function in symptomatic periods of the disease. Therefore, this study also investigated the immunohistochemical expression of immunomarkers involved in the pathogenic mechanisms of leprosy nerve damage. These markers selected were CXCL10, CCL2 chemokines and CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD68, HLA-DR, metalloproteinases 2 and 9 in nerve biopsy specimens collected from leprosy (23) and nonleprosy patients (5) suffering peripheral neuropathy. Twenty-three PNL nerve samples (6 AFB+ and 17 AFB-PCR+) were cryosectioned and submitted to LAM and PGL1 immunohistochemical staining by immunoperoxidase; 5 nonleprosy nerve samples were used as controls. The 6 AFB-positive samples showed LAM/PGL1 immunoreactivity. Among the 17 AFB- samples, only 8 revealed LAM and/or PGL1 immunoreactivity. In 17 AFB-PCR+ patients, just 7 had LAM and/or PGL1-positive nerve results. In the PNL cases, the detection of immunolabeled LAM and PGL1 in the nerve samples would have contributed to enhanced diagnostic efficiency in the absence of molecular diagnostic facilities. The results of the second part of this study showed that CXCL10-, CCL2-, MMP2- and MMP9-immunoreactivities were found in the leprosy nerves but not in nonleprosy samples. Immunolabeling was predominantly found in recruited macrophages and Schwann cells composing the inflammatory cellular population in the leprosy-affected nerves. The immunohistochemical expression of all the markers, but CXCL10, was associated with fibrosis; however, only CCL2 was, independently from the other markers, associated with this excessive deposit of extracellular matrix. No difference in the frequency of the immunolabeling was detected between the AFB+ and AFB- leprosy subgroups of nerves, exception made to some statistical tendency to difference in regard to CD68+ and HLA-DR+ cells in the AFB- nerves exhibiting epithelioid granuloma. MMP9 expression associated with fibrosis is consistent with previous results of this research group. The findings conveys the idea that CCL2 and CXCL10 chemokines at least in advanced stages of leprosy nerve lesions are not determinant for the establishment of AFB+ or AFB- leprosy lesions, however, CCL2 is associated with macrophage recruitment and fibrosis.

La lèpre est une maladie tropicale négligée qui atteint près de 200 000 personnes chaque année et dont l’agent causal est Mycobacterium leprae. La susceptibilité génétique de l’hôte à la maladie est bien établie, et a permis de comprendre certains mécanismes de la physiopathologie de la maladie. Il existe par ailleurs une grande variabilité inter-individuelle des manifestions cliniquesde la maladie, qui s’étendent d’un pôle dit tuberculoïde à un pôle dit lépromateux. Nous avons cherché à identifier les facteurs de susceptibilité génétique à cette polarisation de la maladie. Nous avons tout d’abord décrit que le sexe et l’âge sont des facteurs non-génétiques associés à ce phénotype.Notre travail s’est ensuite appuyé sur les outils classiques de l’épidémiologie génétique, c’est à dire les études de liaison et d’association, pour identifier des variants génétiques qui influencent la polarisation de la lèpre. Nous avons utilisé une puce à ADN pangénomique avec plus de 500 000 marqueurs pour génotyper un échantillon de familles vietnamiennes comprenant 939 malades, dont 692 enfants. Nous avons identifié une liaison de la région 19p12 avec la polarisation de la lèpre. L’étude d’association n’a pas permis d’identifier de signal significatif à l’échelle du génome. Nous avons développé un nouveau test d’association pour des données familiales qui a permis d’améliorer les résultats sans atteindre la significativité. Notre travail sera prolongé par des études d’association dans deux populations cas-témoins du Vietnam et du Brésil. Nous chercherons à identifier les marqueurs causaux au sein de la région de liaison 19p12 d’une part, et à découvrir de nouveaux variants d’autre part. L’identification de marqueurs associés à la polarisation de la lèpre permettra de mieux prévoir l’évolution de la maladie et de proposer des traitements plus ciblés selon le risque génétique individuel. / Leprosy is a neglected tropical disease that affects nearly 200,000 people each year and caused byMycobacterium leprae. Genetic host susceptibility to the disease is well established, and helped to understand some of the mechanisms of the disease’s physiopathology. There is also a wide inter-individual variability of the clinical manifestations of the disease, which runs from a so-said tuberculoid to a so-said lepromatous pole. We sought to identify genetic susceptibility factors for this polarization of the disease. We initially described gender and age as non-genetic factors associated with this phenotype. We then based our analysis on the classical tools from thefield of genetic epidemiology, namely linkage and association studies, to identify genetic variants that influence leprosy polarization. We used a DNA-microarray with 500,000 markers spanning over the whole genome to genotype a sample of Vietnamese families including 939 patients, of which 692 were children. We have found a region linked to leprosy polarization on chromosome 19p12. The association study could not identify a significant signal across the genome. We developed a new test for association designed for familial data that improved the results without reaching significance. Our work will be pursued by association studies in two case-control populations from Vietnam and Brazil. We will try to identify the causal markers within the 19p12 linkage region on the one hand, and to discover new variants on theother hand. The identification of markers associated with leprosy polarization could help us to better predict the evolution of the disease, and to offer more targeted treatments to patients, based on their individual genetic risk.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carlarenatagraca_dissert.pdf: 933158 bytes, checksum: fdfd445f7f2238bec496e0064ddfd5bc (MD5) Previous issue date: 2011-07-26 / Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae (M. leprae), an obligate intracellular acid-fast bacillus, which affects the skin and peripheral nervous system. The diseases expression results from the interaction between the bacillus and the immune system; most infected subjects develop effective immune response against M. leprae, without disease; others exhibit a spectrum of clinical manifestations closely linked to the pattern of host immune response to pathogen. Among the host defense mechanisms are immunoregulatory cytokines with activities represented by specific populations of Th1 and Th2 lymphocytes and the production of reactive oxygen species (ROS), which are key elements for bacterial destruction intramacrofágica. In this context, several genomic regions have been implicated in susceptibility and severity in genetically controlled leprosy. The glutathione Stransferase are enzymes that eliminate reactive oxygen species, are the most studied genes: GSTM1 and GSTT1. The NINJURIN1 is a cell adhesion molecule that provides suitable substrates for repair of Schwann cells after peripheral nerve injury. The single nucleotide polymorphism NINJ1, encoded by the protein NINJURIN1, is the result of a transversion to adenine nucleotide polymorphic cytokine (AC), responsible in an amino acid exchange of asparagine for alanine at position 110 of the protein (asp110ala). Objectives. 1) Investigate if the presence of polymorphism in the GSTT1 and GSTM1 genes could affect the course of leprosy; 2) Investigate if the presence of polymorphism in the NINJ1 gene could be relevant for neural impairment. Material and Methods. A cohort of 218 leprosy patients (patients) and 244 subjects without leprosy (controls) was studied. The genomic DNA was obtained from peripheral blood, GSTT1 and GSTM1 polymorphism screening was performed using polymerase chain xi Abstract v reaction and NINJ1 gene analysis was performed using the technique of restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) using the enzyme Hae III. The genotype and allele frequency were measured by Chi-square and logistic regression models with or without correction for age and gender. Results. The frequency of the GSTT1/GSTM1 null genotypes was significantly higher in controls when compared to patients (P = 0.01). The GSTT1 genotype frequency was significantly increased in patients when compared to controls (P=0.01). The frequency of the NINJ1 asp110ala was significantly increased in patients with nerve impairment (p = 0.0198). Also, patients with the CC (ala/ala) allele had a higher risk of developing disability when compared the allele AA (asp/asp) (p = 0.0143). Conclusion. The results demonstrated: (1) there is an association of GSTT1 positive genotype for development of leprosy disease. The data found suggested that the absence of GSTs, with a consequent permanence of intracellular ROS, can contribute to M. leprae destruction and, therefore, reduce the disease risk; (2) polymorphism in NINJ1 gene offers less nerve protection in leprosy patients. This finding indicates that NINJURIN1 is an important adhesion molecule and can be a potential therapeutic tool in many diseases. / A hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo bacilo álcool-ácido resistente Mycobacterium leprae (M. leprae), patógeno intracelular obrigatório, que afeta a pele e o sistema nervoso periférico. A expressão dessa doença resulta da interação entre o bacilo e o sistema imunológico; a maioria das pessoas infectadas desenvolve resposta imune eficaz contra M. leprae, sem sintomas da doença; outras exibem um espectro de manifestações clínicas ligado ao padrão da resposta imunológica do hospedeiro ao patógeno. Entre os mecanismos de defesa do hospedeiro estão as citocinas com atividades imunorreguladoras específicas representadas pelas populações de linfócitos Th1 e Th2 e a produção de espécies reativas de oxigênios (ROS), que são elementos fundamentais para destruição bacilar intramacrofágica. Nesse contexto, inúmeras regiões genômicas têm sido implicadas na suscetibilidade e na severidade geneticamente controlada à hanseníase. Os Glutatião S-transferase são enzimas que eliminam as espécies reativas de oxigênio, os genes mais estudados são: GSTT1 e GSTM1. O NINJURIN1 é uma molécula de adesão celular que fornece substratos apropriados para reparação das células de Schwann após lesão no nervo periférico. O polimorfismo de nucleotídeo único NINJ1 codificado pela proteína NINJURIN1, é resultado de uma transversão polimórfica do nucleotídeo adenina para citocina (AC), responsável pela troca de um aminoácido asparagina para alanina na posição 110 da proteína (asp110ala). Objetivos. 1) avaliar os polimorfismos dos genes GSTT1 e GSTM1 na modulação da suscetibilidade genética à hanseníase e/ou à evolução dessa doença em seus pólos maligno ou benigno; 2) investigar a correlação entre o polimorfismo de nucleotídeo único NINJURIN1 e o grau de comprometimento do nervo periférico. Materiais e Métodos. A amostra foi composta de 218 pacientes xi Resumo com hanseníase (pacientes) e 244 indivíduos sem hanseníase (controles). O DNA genômico foi obtido de sangue periférico, a análise dos polimorfismos GSTT1 e GSTM1 foi realizada utilizando a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e a análise do gene NINJ1 foi realizada através da técnica de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (PCR-RFLP), utilizando a enzima HAE III. A frequência de genótipos e alelos foi analisada pelo teste do qui-quadrado e por modelos de regressão logística com ou sem correção para idade e sexo. Resultados. A frequência dos genótipos nulos GSTT1/GSTM1 foi significativamente maior nos controles que nos pacientes (P = 0,01). A frequência do genótipo GSTT1 foi significativamente maior nos pacientes em relação aos controles (P = 0,01). A frequência do polimorfismo NINJ1 asp110ala foi significativamente maior em pacientes com comprometimento do nervo (p = 0, 0198). Além disso, pacientes com o alelo CC (ala / ala) apresentaram risco maior de desenvolver lesão no nervo quando comparado ao alelo AA (asp / asp) (p = 0,0143). Conclusão. Os resultados demonstraram: (1) há associação do genótipo GSTT1 positivo para o desenvolvimento da hanseníase. Os achados sugerem que a ausência de GSTs, com consequente permanência de ROS intracelular, pode contribuir para a eliminação do M. leprae e, dessa forma, reduzir o risco da doença; (2) o polimorfismo no gene NINJ1 oferece menos proteção ao nervo na hanseníase. Esse achado indica que a NINJURIN1 é uma molécula de adesão importante e pode ser uma potencial ferramenta terapêutica em muitas doenças.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-04-29T22:29:48Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AlteracoesClinicasMetabolicas.pdf: 846962 bytes, checksum: 3fffa9e191cc7af367be9be69c9db093 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-04-30T12:58:40Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AlteracoesClinicasMetabolicas.pdf: 846962 bytes, checksum: 3fffa9e191cc7af367be9be69c9db093 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-30T12:58:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AlteracoesClinicasMetabolicas.pdf: 846962 bytes, checksum: 3fffa9e191cc7af367be9be69c9db093 (MD5) Previous issue date: 2009 / A hanseníase é doença infecto-contagiosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae. Caracteriza-se por acometimento dermatoneurológico, variando em espectro entre dois polos estáveis (tuberculoide e virchoviano), com formas intermediárias instáveis. Uma classificação operacional, para fins de tratamento, reúne os doentes em dois grupos: paucibacilares (PB) que correspondem a formas clínicas que possuem 1-5 lesões e baciloscopia negativa; multibacilares (MB) que correspondem a formas clínicas com mais de 5 lesões e com ou sem baciloscopia positiva. Apesar de curável, a hanseníase ainda representa relevante problema de saúde pública. Sua maior morbidade associa-se aos estados reacionais e ao acometimento neural que podem causar incapacidades físicas e deformidades permanentes, comprometendo significativamente a qualidade de vida dos pacientes. Consequências clínicas, no que diz respeito as alterações oftalmológicas, endócrinas e cardiovasculares podem advir da etiopatogenia do processo infeccioso e imunopatológico, assim como dos efeitos adversos medicamentosos, desse modo tais eventos necessitam de esclarecimento afim de que o planejamento em saúde possa minimizar tais agravos. Um pronto diagnóstico, possibilita um tratamento precoce e eficaz, evitando com isso alterações clínicas importantes e sequelas. Foi realizado um estudo descritivo do tipo série de casos com 68 pacientes com alta terapêutica da hanseníase maior ou igual a 2 anos e com tratamento dos estados reacionais, tendo como objetivo descrever os aspectos clínicos, epidemiológicos e laboratoriais em pacientes multibacilares após alta com enfoque no diagnóstico de hipertensão, diabetes, osteoporose e discutir possíveis relações com tratamento dos episódios reacionais hansênicos. Observamos que a maioria dos pacientes eram do sexo masculino, com faixa etária acima de 45 anos, procedente de Belém, baixa escolaridade e de baixa renda familiar, o tipo de hanseníase predominante foi a forma virchowiana, a reação reversa foi o estado reacional mais prevalente, o corticoide foi o medicamento mais utilizado para o tratamento nos estados reacionais, os pacientes que não usaram corticoide apresentaram maior percentagem de densitometria normal, as comorbidades diabetes, hipertensão e osteoporose foram mais frequente em pacientes que usaram corticoide e com idade acima de 45 anos. O grau 2 foi o grau de incapacidade mais prevalente. / Leprosy is an infectious disease caused by Mycobacterium leprae. It is characterized by dermato-neurological damage, ranging in spectrum between two stable poles (tuberculoid and lepromatous), with unstable intermediate forms. An operational classification with treatment purposes, join patients in two groups: the paucibacillary (PB), which represents clinical forms that have 1-5 injuries and smear-negative; the multibacillary (MB) corresponding to clinical forms of 5 or more lesions and with or without positive smear. Although to be treatable, leprosy still represents an important public health problem. Its major morbidity is associated with the reaction state and neural damage that can cause physical disabilities and permanent deformity, compromising significantly the patients quality of life. Clinical consequences with regard to ophthalmology, endocrine and cardiovascular diseases may come from the pathogenesis of both infection and immunopathological process, as by the adverse drug reactions, so such events must to be clarified in order that the health planning can minimize such injuries. An early diagnosis enables an early and effective treatment intending to avoid important clinical changes and sequelae. It was conducted a descriptive study of the kind of serial cases of 68 patients with high treatment of leprosy longer than or equal to 2 years and treatment of reactional states, aiming to describe the clinical, epidemiological and laboratory aspects in multibacillary patients after discharge with a focus on hypertension, diabetes, osteoporosis diagnosis and discuss about the possible relationships with the treatment of reactional leprosy episodes. We observed that most patients were male, aged over 45, comes from Belém, low education and low family income, the prevalent type of leprosy was the virchowian, the reverse reaction was the most prevalent state reaction , corticosteroids have been the most used drug for treatment in reactional states, patients who did not use corticosteroids had a greater percentage of normal densitometry, the co-morbidities: diabetes, hypertension and osteoporosis were more frequent in patients who used corticosteroids and age over 45 years . The level 2 was the most prevalent degree of disability.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-09-11T18:10:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_UsoTecnicaBiologia.pdf: 2281724 bytes, checksum: a45c8462c51f7b087c62763c6118d17b (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-09-13T14:16:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_UsoTecnicaBiologia.pdf: 2281724 bytes, checksum: a45c8462c51f7b087c62763c6118d17b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-13T14:16:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_UsoTecnicaBiologia.pdf: 2281724 bytes, checksum: a45c8462c51f7b087c62763c6118d17b (MD5) Previous issue date: 2016-06-28 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O propósito deste estudo foi aplicar a técnica da biologia molecular em amostra de secreção nasal de contatos intradomiciliares de portadores de hanseníase, em combinação com a avalição dermatoneurológica, na melhoria do diagnóstico precoce da hanseníase. O estudo foi realizado em unidades municipais de saúde de Belém-PA, no período de fevereiro de 2013 a abril de 2015. A amostra foi constituída de 154 contatos intradomiciliares e 58 casos índices de hanseníase, totalizando 212 sujeitos. A coleta de dados se deu por meio de ficha epidemiológica, avaliação dermatoneurológica e exame da cicatriz de BCG. Foi coletada uma amostra de secreção nasal de cada sujeito para a PCR. Nos casos índices, a PCR positiva prevaleceu na faixa etária de 40-59 anos (35,0%); na forma MB (80,0%); casos com 7 a 9 lesões de pele (35,0%) e com ausência de nervos espessados (40,0%). Todos os casos índices positivos para a PCR evidenciaram sinais e sintomas de hanseníase (34,5%) e a maioria não possuía cicatriz de BCG (65,0 %). Entre os contatos, a PCR positiva incidiu no sexo feminino (63,9 %); na faixa etária de 20 a 39 anos (44,4 %); renda familiar de um salário mínimo (47,2 %); ocupação de estudante (33,3 %) e no ensino médio completo (36,1 %). A maior evidência de positividade da PCR nos casos índices e contatos foi na forma multibacilar, respectivamente (37,2 % e 25,6 %). Comprova-se uma concordância altamente significante entre os sinais e sintomas clínicos com a PCR na secreção nasal dos contatos multibacilares, indicando que se estes vierem a adoecer há maior probabilidade de reproduzirem a mesma forma operacional dos casos índices. O maior percentual de PCR positiva foi nos contatos com ausência de cicatriz de BCG (25,8 %). A associação entre os sinais e sintomas e a PCR indica que os contatos com PCR positivo têm 07 vezes mais chance de apresentar sinais e sintomas de hanseníase. Ao estimar o risco potencial para o desenvolvimento da hanseníase nos contatos identificou-se 22 (14,3%) em risco intermediário e 06 (3,9 0%) no alto risco. Cento e quarenta e quatro (144) contatos referiram convívio diário com o caso índice (93,5 %) e destes 36 (25,0 %) foram positivos para a PCR. Verifica-se que com a evolução do tratamento dos casos índices há redução da positividade da PCR, em ambas as formas operacionais. Na correlação entre a PCR e o grau de incapacidade dos casos índices, o grau 1 foi mais prevalente (55,0 %). A detecção do DNA do M. leprae na secreção nasal de contatos intradomiciliares, por PCR, em associação com a avaliação dermatoneurológica eleva a efetividade do diagnóstico precoce na hanseníase, contribuindo com o controle da doença na comunidade. / The purpose of this study was to apply the technique of molecular biology in nasal secretion sample from household contacts of leprosy patients, in combination with dermatological and neurological assessments, improving the early diagnosis of leprosy. The study was conducted in health municipal units of Belém-PA, from February 2013 to April 2015. The sample consisted of 154 household contacts and 58 index cases of leprosy, totaling 212 subjects. Data collection was through epidemiological record, dermatologic and neurological evaluations and BCG scar examination. A nasal secretion sample from each subject for the PCR was collected. In index cases, positive PCR was in the age group of 40-59 years (35.0%), in multibacillary (MB) form (80,0%); cases with 7 to 9 skin lesions (35.0%) and with no enlarged nerves (40.0%). All positive index PCR cases show signs and symptoms of leprosy (34.5%) and most do not have BCG scar (65.0%). Among the contacts, positive PCR prevailed in females (63.9%); in the age group 20-39 years (44.4%); family income of a minimum wage (47.2%); student occupation (33.3%) and completed high school (36.1%). The strongest evidence of positive PCR in index cases and contacts was in multibacillary, respectively (37.2% and 25.6%). Proves to be a highly significant correlation between clinical signs and symptoms with PCR in nasal secretion of multibacillary contacts, indicating that if they get sick are more likely to reproduce the same operating way of index cases. The highest percentage of positive PCR was in contact with the absence of BCG scar (25.8%). The association between the signs, symptoms and PCR indicates that contacts with positive PCR have 07 times more likely to show signs and symptoms of leprosy. In estimating the potential risk for the development of leprosy in contacts, we identified 22 (14.3%) at intermediate risk and 06 (3.9% 0) at high risk. One hundred and forty-four (144) contacts said that they have daily contact with the index case (93.5%) and of these 36 (25.0%) were positive for PCR. The treatment of index cases led to a reduction of PCR positivity in both modes of operation. The correlation between PCR and the degree of disability of the index cases, grade 1 was more prevalent (55.0%). M. leprae DNA detection in the nasal secretion of household contacts for PCR, in association with dermatological and neurological assessments, raises the effectiveness of early diagnosis of leprosy, contributing to the control of the disease in the community.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2015-06-25T17:17:45Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_PerfilAnticorposAntipgl1.pdf: 3961735 bytes, checksum: cb870fcf4a6843b99ca34ae66c395bf5 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2015-06-29T13:22:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_PerfilAnticorposAntipgl1.pdf: 3961735 bytes, checksum: cb870fcf4a6843b99ca34ae66c395bf5 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-29T13:22:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_PerfilAnticorposAntipgl1.pdf: 3961735 bytes, checksum: cb870fcf4a6843b99ca34ae66c395bf5 (MD5) Previous issue date: 2012 / No Brasil, a hanseníase ainda persiste com elevados coeficientes de detecção, inclusive em menores de quinze anos, em especial nas Regiões Norte, Nordeste e Centro-Oeste. Os resultados de estudos soroepidemiológicos para hanseníase, utilizando teste sorológico anti- PGL-1, pelo método Elisa, realizados no Estado do Pará onde os municípios em sua maioria alcançam patamares de elevadas endemicidade, podem ser comprometidos pela ausência de definição local de parâmetro que limite os níveis séricos de anticorpos específicos, IgM, anti- PGL-1 entre positivos e negativos; assim como, as avaliações e o seguimento de casos de pacientes reacionais e suspeitos de recidiva, ou de doentes e infectados sem sinais clínicos.Autores defendem a posição de que o ponto de corte (PC), entre positivos e negativos, deve ser encontrado a partir de uma população de doadores não contato de hanseníase da própria área de estudo para possibilitar comparabilidade. O objetivo do estudo foi descrever o comportamento sorológico dos níveis de anticorpos anti-PGL-1, método ELISA, em indivíduos sadios de áreas endêmicas em hanseníase no Estado do Pará, sua correlação com níveis de endêmicidade e fatores demográficos, e identificar PC para o teste. Estudo analítico transversal, população composta por doadores de sangue dos hemocentros do Estado do Pará. Amostra de 1.001 doadores de sangue não contato intradomiciliar de portadores de hanseníase, residentes em áreas de elevada endemicidade do Estado do Pará. Seleção dos participantes através de entrevista e ficha epidemiológica com variáveis independentes, como sexo, idade e cicatriz de BCG que foram correlacionadas com os níveis sorológicos de anti- PGL-1 encontrados na população do estudo. Resultados mostraram que não houve significância estatística entre sexo, idade, presença de cicatriz de BCG e os níveis de anti- PGL-1, usando PC ≥ 0,2. A média dos níveis de anti-PGL-1 foi notadamente baixa para áreas de hiperêndemicidade e muito alta endemicidade. As taxas de soropositividade e soroprevalência também foram consideradas baixas. Foram encontrados diferentes pontos de corte com a média geral dos níveis de anti-PGL-1, com a média por hemocentro e por municípios. A soropositividade obtida com PC ≥ 0,13 dobrou em valores absolutos de 15 para 36 em todas as três variáveis analisadas, apesar de não ter produzido resultados com significância estatística. Sugere-se a realização de mais estudos soroepidemiológicos utilizando ponto de corte mais baixo, como o encontrado neste estudo (0.13), para avaliar a influencia do mesmo na sensibilidade do teste, na soropositividade em contatos e não contatos de portadores de hanseníase, na descoberta de infecção subclínica e seguimentos dos casos.