Os micoplasmas são os menores microrganismos capazes de autoreplicação conhecidos na natureza, responsáveis por uma série de doenças no homem e nos animais, infectando ainda plantas e insetos. Constituem um grande grupo de bactérias, ordenadas em diferentes gêneros na classe Mollicutes, cuja principal característica em comum, além do genoma reduzido, é a ausência de parede celular. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsável pela Pleuropneumonia Contagiosa Bovina, foi o primeiro microrganismo desta classe de bactérias a ser identificado. Esta é uma doença bastante grave, com altas taxas de morbidade e mortalidade. A variedade Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC é responsável principalmente por casos de Pleuropneumonia Contagiosa Caprina, mastite no gado bovino, e ainda artrite em ovinos e caprinos em menor extensão. M. capricolum é um patógeno caprino, responsável principalmente por casos de artrite com grande importância econômica na medicina veterinária. M. pulmonis é um patógeno de roedores, considerado como o melhor modelo experimental para o estudo das micoplasmoses respiratórias. M. genitalium, o menor microrganismo conhecido capaz de se autoreplicar, é um patógeno humano responsável por casos de uretrite não gonocócica, cujo seqüenciamento completo do cromossomo tornou-se um marco na era da genômica. O estudo funcional do genoma destes micoplasmas, para a compreensão de sua biologia e patogenicidade, requer o desenvolvimento de ferramentas genéticas eficientes. No presente trabalho, análises in silico das seqüências na região das prováveis origens de replicação cromossômica (oriC) destes micoplasmas demonstraram a existência de possíveis DnaA boxes localizados em torno do gene dnaA. Estas regiões oriC foram caracterizadas funcionalmente após sua clonagem em vetores artificiais e a transformação dos micoplasmas com os plasmídeos recombinantes resultantes. O plasmídeo pMPO1, contendo a região oriC de M. pulmonis, sofreu integração no cromossomo do micoplasma por recombinação homóloga após poucas passagens in vitro. A redução desta oriC para o fragmento contendo somente os DnaA boxes localizados nas estremidades 5´ou 3´do gene dnaA não foi capaz de produzir plasmídeos replicativos em M. pulmonis, exceto quando estes dois fragmentos foram clonados no mesmo vetor, espaçados pelo determinante de resistência à tetraciclina tetM. Um fragmento interno do gene da hemolisina A (hlyA) de M. pulmonis foi clonado nestes plasmídeos oriC, e os vetores resultantes foram utilizados para transformar o micoplasma. A integração destes vetores por um crossing-over com o gene hlyA, causando a sua dirupção, foi documentada. Deste modo, estes plasmídeos oriC podem vir a se tornar ferramentas genéticas valiosas para o estudo do papel de genes específicos, notadamente aqueles potencialmente envolvidos na patogênese. / Mycoplasmas are the smallest microorganisms capable of self replication known to date, responsible for many diseases in man and animals, infecting also plants and insects. They constitute a large group of bacteria, classified in different genera in the class Mollicutes, which main common characteristic, besides the small genome, is the absence of a cell wall. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsible for the Bovine Contagious Pleuropneumonia, was the first microorganism of this class of bacteria to be identified. That is a quite severe disease, with high morbidity and mortality rates. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC is responsible mainly for cases of Caprine Contagious Pleuropneumonia, mastitis in cattle, and also arthritis in goats and sheep in less extension. M. capricolum is a pathogen of goats, responsible mainly by cases of arthritis with large economic impact in veterinary medicine. M. pulmonis is a rodent pathogen, considered to be the best experimental model for studying respiratory mycoplasmoses. M. genitalium, the smallest microorganism capable of self replication, is an human pathogen responsible for cases of non gonococcal urethritis, which complete chromosome sequencing has become a benchmark in the era of genomics. Functional studies of these mycoplasma genomes, for comprehension of their biology and pathogenicity, requires the development of efficient genetic tools. In the present work, in silico analysis of sequences of the putative origin of chromosome replication (oriC) region of these mycoplasmas demonstrates the existence of putative DnaA boxes located around the dnaA gene. These oriC regions were functionally characterized after cloning into artificial vectors and transformation of mycoplasmas with the resulting recombinant plasmids. The plasmid pMPO1, which contains the M. pulmonis oriC region, has integrated into the mycoplasma chromosome by homologous recombination after a few in vitro passages. Reduction of this oriC to the fragment containing only the DnaA boxes located upstream or downstream the dnaA gene could not produce plasmids able to replicate in M. pulmonis, except when these two fragments were cloned in the same vector, spaced by tetracycline resistance gene tetM. An internal fragment of the M. pulmonis hemolysine A gene (hlyA) was cloned into these oriC plasmids, and the resulting vectors were used to transform the mycoplasma. Integration of these disruption vectors by one crossing-over with the hlyA gene could be documented. Therefore, these oriC plasmids may become valuable genetic tools for studying the role of specific genes of mycoplasmas, specially those potentially involved in pathogenesis.

Orientador: Márcia Guimarães da Silva / Resumo: Introdução: A infecção da cavidade amniótica e inflamação são associadas com o parto pré-termo espontâneo. Em geral, essas infecções são polibacterianas e causadas principalmente pela ascensão bacteriana do trato genital inferior. Dessa forma, a invasão microbiana da cavidade amniótica e o risco do parto pré-termo estão frequentemente relacionados à colonização vaginal por diferentes espécies bacterianas, incluindo aquelas de difícil cultivo, como micoplasmas genitais. Ureaplasma urealyticum e Mycoplasma hominis são as principais bactérias isoladas no líquido amniótico de gestações complicadas por parto pré-termo com membranas íntegras ou na presença de rotura prematura de membranas pré-termo. Além dos micoplasmas genitais, Gardnerella vaginalis merece destaque por ser a principal bactéria do core patológico da vaginose bacteriana e por estar associada ao risco de parto pré-termo. Dessa forma, considerando que a infecção da cavidade amniótica é de natureza polibacteriana, mimetizar esse cenário em membranas fetais in vitro se torna ferramenta importante para melhor entendimento dos mecanismos envolvidos no parto pré-termo. Objetivo: Avaliar a modulação da resposta imune induzida pela interação entre micoplasmas genitais e G. vaginalis nas membranas corioamnióticas in vitro. Material e Métodos: Para a estimulação da cultura in vitro, foram coletadas 8 membranas corioamnióticas de gestantes que tiveram a resolução da gestação por cesárea eletiva de termo (≥ 37 semanas de gestaç... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Introduction: The intraamniotic infection and inflammation are associated with spontaneous preterm birth (PTB). In general, such infections are polybacterial and caused mainly by ascending bacteria from the lower genital tract. Thus, the microbial invasion of the amniotic cavity (MIAC) and risk of preterm birth is often cervicovaginal colonizers such as genital mycoplasmas, in which Mycoplasma hominis (MH) and Ureaplasma urealyticum (UU) are the most commonly isolated bacteria in the amniotic fluid in both PTB with intact membranes and in preterm premature rupture of membranes (pPROM). In addition, Gardnerella vaginalis, the main microorganism of the pathological core of bacterial vaginosis is also closely associated with the risk of preterm birth. Thus, considering that the infection of the amniotic cavity is polybacterial, mimic this scenario in fetal membranes in vitro becomes an important tool for a better understanding of the mechanisms that trigger preterm delivery. Objective: To evaluate the modulation of the immune response induced by the interaction between genital mycoplasmas and G. vaginalis in chorioamniotic membranes in vitro. Material and methods: For the in vitro culture stimulation, 8 chorioamniotic membranes of pregnant women in term elective cesarean section (≥ 37 weeks gestation) were collected, in the absence of labor and/or premature rupture of membranes. Chorioamniotic membrane cultures were stimulated with 106 or 103UFC of heat inactivated bacterial sus... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-01-20Bitstream added on 2014-06-13T19:30:25Z : No. of bitstreams: 1 metzger_b_me_botfmvz.pdf: 819148 bytes, checksum: 26a92a8f8879a45e826beca01ff7b6a5 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O trabalho teve como objetivo investigar a ocorrência de Hepatozoon spp., piroplasmas e hemoplasmas em felídeos neotropicais nascidos em vida livre. Amostras sanguíneas foram colhidas de 11 Leopardus pardalis, 10 Leopardus tigrinus, oito Puma yagouaroundi, um Leopardus wiedii e um Puma concolor, provenientes dos Estados do Pará, Maranhão, Piauí, Ceará e Minas Gerais. Esfregaços sangüíneos foram realizados para observação dos hemoparasitas e a extração de DNA foi feita para utilização em técnicas moleculares. Hepatozoon spp. e piroplasmas foram diagnosticados pela Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) e hemoplasmas felinos foram pesquisados pela PCR- RFLP e “Nested”-PCR. A caracterização molecular dos isolados obtidos foi feita após o sequenciamento e a análise filogenética. A ocorrência de pelo menos um hemoparasita diagnosticado pela técnica do esfregaço sanguíneo foi de 6,45% (2/31) e pela PCR foi de 45,16% (14/31), sendo observadas, 16,12% (5/31), 3,22% (1/31) e 38,70% (12/31) de infecções por Hepatozoon sp., Cytauxzoon felis e hemoplasmas (das espécies Mycoplasma haemofelis e/ou Candidatus Mycoplasma haemominutum), respectivamente. Foram encontradas infecções únicas e mistas nos felídeos. O diagnóstico positivo foi maior nos adultos (92,85%) (p=0,007) e na espécie L. pardalis (57,14% - 8/14). A detecção de C. felis em exemplar juvenil de P. concolor, recém capturado na natureza, indica sua presença na população de felídeos neotropicais de vida livre no Brasil. A caracterização molecular de Hepatozoon sp. em felídeos neotropicais e os relatos das infecções por este hemoparasita em L. tigrinus e por M. haemofelis e Candidatus M. haemominutum em P. yagouaroundi são inéditos no mundo. / The aim of this study was to investigate the occurrence of Hepatozoon spp., piroplasms and hemoplasms in wild caught neotropical felids. Blood samples were drawn from 11 Leopardus pardalis, 10 Leopardus tigrinus, eight Puma yagouaroundi, one Leopardus wiedii and one Puma concolor coming from the States of Para, Maranhão, Piauí, Ceará and Minas Gerais. Blood smears were evaluated for parasites and DNA was extracted for molecular techniques. Hepatozoon spp. and piroplasms were diagnosed by Polymerase Chain Reaction (PCR) and feline hemoplasms were examined by both RFLP-PCR and Nested- PCR. Molecular characterization of the isolates obtained was performed after sequencing and phylogenetic analyses. The occurrence of at least one hemoparasite diagnosed by blood smear technique was 6.45% (2/31) and by PCR was 45.16% (14/31). Infections of Hepatozoon sp., Cytauxzoon felis and feline hemoplasms (from species Mycoplasma haemofelis and/or Candidatus Mycoplasma haemominutum) were observed, respectively, in 16.12% (5/31), 3.22% (1/31) and 38.70% (12/31) from the total of animals studied. Infections and co-infections were found among felids. The positive diagnosis were higher in adults (92.85%) (p= 0,007) and in L. pardalis (57.14% - 8/14). The detection of C. felis in a juvenile, recently wild caught P. concolor, indicates the presence of this piroplasm in the wild felid population of Brazil. The molecular characterization of Hepatozoon sp. in neotropical felids and the report of this hemoparasite infection in L. tigrinus as well as the report of M. haemofelis and Candidatus M. haemominutum in P. yagouaroundi are novelties in the world.

Submitted by Nathália Mayumi Noda Nicolau (nathaliamnicolau@gmail.com) on 2017-09-13T13:25:01Z No. of bitstreams: 1 Tese completa corrigida 13.09.17.pdf: 3318366 bytes, checksum: f767ed1c0946c7bf469c1036a88b2a8a (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-09-15T13:29:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 nicolau_nmn_dr_bot.pdf: 3318366 bytes, checksum: f767ed1c0946c7bf469c1036a88b2a8a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-15T13:29:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nicolau_nmn_dr_bot.pdf: 3318366 bytes, checksum: f767ed1c0946c7bf469c1036a88b2a8a (MD5) Previous issue date: 2017-08-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Introdução: A infecção da cavidade amniótica e inflamação são associadas com o parto pré-termo espontâneo. Em geral, essas infecções são polibacterianas e causadas principalmente pela ascensão bacteriana do trato genital inferior. Dessa forma, a invasão microbiana da cavidade amniótica e o risco do parto pré-termo estão frequentemente relacionados à colonização vaginal por diferentes espécies bacterianas, incluindo aquelas de difícil cultivo, como micoplasmas genitais. Ureaplasma urealyticum e Mycoplasma hominis são as principais bactérias isoladas no líquido amniótico de gestações complicadas por parto pré-termo com membranas íntegras ou na presença de rotura prematura de membranas pré-termo. Além dos micoplasmas genitais, Gardnerella vaginalis merece destaque por ser a principal bactéria do core patológico da vaginose bacteriana e por estar associada ao risco de parto pré-termo. Dessa forma, considerando que a infecção da cavidade amniótica é de natureza polibacteriana, mimetizar esse cenário em membranas fetais in vitro se torna ferramenta importante para melhor entendimento dos mecanismos envolvidos no parto pré-termo. Objetivo: Avaliar a modulação da resposta imune induzida pela interação entre micoplasmas genitais e G. vaginalis nas membranas corioamnióticas in vitro. Material e Métodos: Para a estimulação da cultura in vitro, foram coletadas 8 membranas corioamnióticas de gestantes que tiveram a resolução da gestação por cesárea eletiva de termo (≥ 37 semanas de gestação), na ausência de trabalho de parto e/ou rotura prematura de membranas. As culturas das membranas corioamnióticas foram estimuladas com 106 ou 103 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) de suspensão bacteriana, inativada pelo calor, diluída em meio de cultura de tecidos com U. urealyticum, M. hominis e G. vaginalis isolados ou em combinação. Amostras de membranas corioamnióticas, apenas com o meio de cultura, sem estímulo bacteriano foram usadas como controle negativo. Como controle positivo foi utilizado o lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli. Os sobrenadantes obtidos das culturas de membranas corioamnióticas, após 24 horas de estimulação bacteriana, foram avaliados pela tecnologia Luminex® xMAPTM utilizando um painel para as seguintes citocinas e receptores: IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, GM-CSF, sIL-1R1, sIL-1R2, sIL-6R, sTNF-R1, sTNF-R2. Além disso, pela técnica de ELISA foi avaliado o receptor solúvel sgp130, e por imunohistoquímica, a imunomarcação dos receptores de membrana mIL-6R e gp130 nas células coriônicas e no epitélio amniótico. A análise estatística para os dados de citocinas e receptores solúveis foi feita utilizando modelos de feitos mistos lineares usando a biblioteca Ime4 da linguagem de programação R. Os dados de imunohistoquímica foram avaliadas usando a análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey, em que, o valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significante. O software empregados nessas análises foi o GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Resultados: A estimulação das membranas por micoplasmas genitais não aumentou a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-8, TNF-α, GM-CSF), exceto a estimulação com U. urealyticum que aumentou os níveis de IL-8. No entanto, a estimulação com U. urealyticum e M. hominis aumentaram significativamente os níveis de IL-10 e IL-13. A estimulação das membranas corioamnióticas por G. vaginalis isoladamente ou em combinação com micoplasmas genitais resultou em aumento de citocinas pró e anti-inflamatórias (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, GM-CSF). Quanto a produção de IL-6, todos os grupos aumentaram significativamente com relação ao controle não estimulado, com exceção ao estímulo com M. hominis isolado. Já os níveis de sIL-6R aumentaram significativamente somente com estímulo por U. urealyticum isolado ou em combinação com M. hominis. Além disso, o receptor solúvel sgp130 se apresentou em níveis elevados em todos os tratamentos, com exceção do tratamento com G. vaginalis isolada ou na combinação das três espécies bacterianas em cargas iguais. A análise imunohistoquímica mostrou maior imunorreatividade do receptor de membrana mIL-6R apenas nas células do âmnio na presença de LPS e G. vaginalis em comparação com o controle (p <0,0001), mas não para os grupos de M. hominis, U. urealitycum e estimulações polibacterianas. Além disso, o gp130 aumentou estatisticamente nas células do âmnio e cório estimuladas com LPS, G. vaginalis e todos os tratamento polibacterianos. Conclusões: Membranas corioamnióticas in vitro produzem perfil distinto de citocinas e receptores pró e anti-inflamatórios em resposta à estimulação por micoplasmas genitais e G. vaginalis isolados ou em combinação. G. vaginalis estimula resposta pró-inflamatória nas membranas fetais in vitro, que após 24 horas é regulada pela atividade anti-inflamatória da IL-6 através da via de sinalização clássica. Micoplasmas genitais induzem controle da resposta inflamatória pela produção de IL-13, IL-10 e sTNF-R2 favorecendo sua sobrevivência na cavidade amniótica. Além disso, o aumento de IL-6 por si só pode não ser indicativo de qualquer função, uma vez que a sua atividade é controlada por diferentes receptores de membrana e solúveis, sendo que sua produção pelas membranas fetais não deve ser mediador funcional das vias indutoras de trabalho de parto. A tentativa de correlacionar o risco de desfecho gestacional adverso baseado exclusivamente nos níveis de IL-6 em fluidos biológicos, sem considerar os receptores de IL-6, podem ser ineficazes. / Introduction: The intraamniotic infection and inflammation are associated with spontaneous preterm birth (PTB). In general, such infections are polybacterial and caused mainly by ascending bacteria from the lower genital tract. Thus, the microbial invasion of the amniotic cavity (MIAC) and risk of preterm birth is often cervicovaginal colonizers such as genital mycoplasmas, in which Mycoplasma hominis (MH) and Ureaplasma urealyticum (UU) are the most commonly isolated bacteria in the amniotic fluid in both PTB with intact membranes and in preterm premature rupture of membranes (pPROM). In addition, Gardnerella vaginalis, the main microorganism of the pathological core of bacterial vaginosis is also closely associated with the risk of preterm birth. Thus, considering that the infection of the amniotic cavity is polybacterial, mimic this scenario in fetal membranes in vitro becomes an important tool for a better understanding of the mechanisms that trigger preterm delivery. Objective: To evaluate the modulation of the immune response induced by the interaction between genital mycoplasmas and G. vaginalis in chorioamniotic membranes in vitro. Material and methods: For the in vitro culture stimulation, 8 chorioamniotic membranes of pregnant women in term elective cesarean section (≥ 37 weeks gestation) were collected, in the absence of labor and/or premature rupture of membranes. Chorioamniotic membrane cultures were stimulated with 106 or 103UFC of heat inactivated bacterial suspension diluted in tissue culture medium with U. Urealyticum, M. hominis and G. vaginalis alone or in combination. Unstimulated samples were used as control in which was included only culture media without bacteria, and as positive control was used Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli. The supernatants obtained from the chorioamnionic membrane cultures after 24 hours were evaluated by Luminex xMAP technology using a panel for the following cytokines and receptors: IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, GM-CSF, sIL-1R1, sIL-1R2, sIL-6R, sTNF-R1, sTNF-R2. In addition, the soluble receptor sgp130 was evaluated by the ELISA technique, and by immunohistochemistry we identified membrane receptors, mIL-6R and gp130, in the amnion and chorion cells. Statistical analysis for cytokine and soluble receptors data were performed using linear mixed-effects models using the lme4 library of the R statistical language. Immunohistochemistry data were evaluated using one-way (ANOVA) followed by Tukey's test, in which the value of p <0.05 was considered statistically significant and the software used was GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Results: The stimulation of genital mycoplasmas did not increase the proinflammatory cytokines (IL-1β, IL-8, TNF-α, GM-CSF), except U. urealyticum that increased IL-8 levels. However, U. urealyticum and M. hominis significantly increased IL-10 and IL-13 levels. G. vaginalis alone or in combination with genital mycoplasmas showed an increased pro- and anti-inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, GM-CSF). Considering the IL-6 production, all groups increased significantly compared to the control, except M. hominis isolated. Moreover, sIL-6R levels increased significantly only in the presence of U. urealyticum alone or in combination with M. hominis. In addition, the soluble sgp130 receptor was elevated in all treatments, except for the treatment with G. vaginalis alone or in combination of the three bacteria in equal loads. Immunohistochemistry analysis showed greater intensity of mIL-6R only in amnion cells in the presence of LPS and G. vaginalis compared to control (p <0.0001) but not for M. hominis, U. urealitycum and polybacterial treatments. In addition, gp130 increased statistically in amnion cells stimulated with LPS, GV and all polybacterial treatments. Conclusions: Chorioamniotic membranes in vitro produce a distinct cytokine and pro- and anti-inflammatory profile in response to stimulation by genital mycoplasmas and G. vaginalis alone or in combination. G. vaginalis sustain a proinflammatory response in the fetal membranes in vitro, in which after 24 hours is regulated by the anti-inflammatory activity of IL-6 through the classical signaling pathway. While genital mycoplasmas induce a control of the inflammatory response, by the production of anti-inflammatory cytokines (IL-13, IL-10, sTNF-R2), favoring their survival in the amniotic cavity. Furthermore, the increase of IL-6 alone may not be indicative of any function, since its activity is controlled by different membrane and soluble receptors, since its production by fetal membranes could not be a functional mediator of the labor-inducing pathways. In summary, the attempt to correlate the risk of adverse gestational outcome based exclusively on IL-6 levels in biological fluids without considering IL-6 receptors may be ineffective. / CNPq: 140857/2013-3

Os micoplasmas são os menores microrganismos capazes de autoreplicação conhecidos na natureza, responsáveis por uma série de doenças no homem e nos animais, infectando ainda plantas e insetos. Constituem um grande grupo de bactérias, ordenadas em diferentes gêneros na classe Mollicutes, cuja principal característica em comum, além do genoma reduzido, é a ausência de parede celular. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsável pela Pleuropneumonia Contagiosa Bovina, foi o primeiro microrganismo desta classe de bactérias a ser identificado. Esta é uma doença bastante grave, com altas taxas de morbidade e mortalidade. A variedade Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC é responsável principalmente por casos de Pleuropneumonia Contagiosa Caprina, mastite no gado bovino, e ainda artrite em ovinos e caprinos em menor extensão. M. capricolum é um patógeno caprino, responsável principalmente por casos de artrite com grande importância econômica na medicina veterinária. M. pulmonis é um patógeno de roedores, considerado como o melhor modelo experimental para o estudo das micoplasmoses respiratórias. M. genitalium, o menor microrganismo conhecido capaz de se autoreplicar, é um patógeno humano responsável por casos de uretrite não gonocócica, cujo seqüenciamento completo do cromossomo tornou-se um marco na era da genômica. O estudo funcional do genoma destes micoplasmas, para a compreensão de sua biologia e patogenicidade, requer o desenvolvimento de ferramentas genéticas eficientes. No presente trabalho, análises in silico das seqüências na região das prováveis origens de replicação cromossômica (oriC) destes micoplasmas demonstraram a existência de possíveis DnaA boxes localizados em torno do gene dnaA. Estas regiões oriC foram caracterizadas funcionalmente após sua clonagem em vetores artificiais e a transformação dos micoplasmas com os plasmídeos recombinantes resultantes. O plasmídeo pMPO1, contendo a região oriC de M. pulmonis, sofreu integração no cromossomo do micoplasma por recombinação homóloga após poucas passagens in vitro. A redução desta oriC para o fragmento contendo somente os DnaA boxes localizados nas estremidades 5´ou 3´do gene dnaA não foi capaz de produzir plasmídeos replicativos em M. pulmonis, exceto quando estes dois fragmentos foram clonados no mesmo vetor, espaçados pelo determinante de resistência à tetraciclina tetM. Um fragmento interno do gene da hemolisina A (hlyA) de M. pulmonis foi clonado nestes plasmídeos oriC, e os vetores resultantes foram utilizados para transformar o micoplasma. A integração destes vetores por um crossing-over com o gene hlyA, causando a sua dirupção, foi documentada. Deste modo, estes plasmídeos oriC podem vir a se tornar ferramentas genéticas valiosas para o estudo do papel de genes específicos, notadamente aqueles potencialmente envolvidos na patogênese. / Mycoplasmas are the smallest microorganisms capable of self replication known to date, responsible for many diseases in man and animals, infecting also plants and insects. They constitute a large group of bacteria, classified in different genera in the class Mollicutes, which main common characteristic, besides the small genome, is the absence of a cell wall. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsible for the Bovine Contagious Pleuropneumonia, was the first microorganism of this class of bacteria to be identified. That is a quite severe disease, with high morbidity and mortality rates. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC is responsible mainly for cases of Caprine Contagious Pleuropneumonia, mastitis in cattle, and also arthritis in goats and sheep in less extension. M. capricolum is a pathogen of goats, responsible mainly by cases of arthritis with large economic impact in veterinary medicine. M. pulmonis is a rodent pathogen, considered to be the best experimental model for studying respiratory mycoplasmoses. M. genitalium, the smallest microorganism capable of self replication, is an human pathogen responsible for cases of non gonococcal urethritis, which complete chromosome sequencing has become a benchmark in the era of genomics. Functional studies of these mycoplasma genomes, for comprehension of their biology and pathogenicity, requires the development of efficient genetic tools. In the present work, in silico analysis of sequences of the putative origin of chromosome replication (oriC) region of these mycoplasmas demonstrates the existence of putative DnaA boxes located around the dnaA gene. These oriC regions were functionally characterized after cloning into artificial vectors and transformation of mycoplasmas with the resulting recombinant plasmids. The plasmid pMPO1, which contains the M. pulmonis oriC region, has integrated into the mycoplasma chromosome by homologous recombination after a few in vitro passages. Reduction of this oriC to the fragment containing only the DnaA boxes located upstream or downstream the dnaA gene could not produce plasmids able to replicate in M. pulmonis, except when these two fragments were cloned in the same vector, spaced by tetracycline resistance gene tetM. An internal fragment of the M. pulmonis hemolysine A gene (hlyA) was cloned into these oriC plasmids, and the resulting vectors were used to transform the mycoplasma. Integration of these disruption vectors by one crossing-over with the hlyA gene could be documented. Therefore, these oriC plasmids may become valuable genetic tools for studying the role of specific genes of mycoplasmas, specially those potentially involved in pathogenesis.

Com o objetivo de avaliar a magnitude da infecção por micoplasmas hemotrópicos nos felinos anêmicos, amostras sangüíneas de 270 felinos anêmicos (Ht&le;29%) e 53 felinos saudáveis foram submetidas à exames hematológicos, bioquímicos séricos (proteína total, albumina, fosfatase alcalina, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase, gamaglutamil transferase, bilirrubinas, uréia e creatinina), avaliação citológica do esfregaço sangüíneo e testes moleculares para a detecção de material genético de Mycoplasma spp. Foram encontradas 25 amostras positivas no grupo dos felinos anêmicos, pela técnica de Nested-PCR utilizando-se primers que amplificam fragmentos do gene 16S rRNA dos hemoplasmas. Dentre as amostras positivas, 23 foram caracterizadas por meio de seqüenciamento como Mycoplasma haemofelis e as duas restantes como \"Candidatus Mycoplasma turicensis\" e Mycoplasma haemocanis, respectivamente. As seqüências de nucleotídeos encontradas nesse estudo estão disponíveis no GenBank, sob os números de acesso EU442616 a EU442640, sendo os números EU442629 e EU442623, referentes ao \"Candidatus M. turicensis\" e M. haemocanis, respectivamente. Nos felinos infectados por M. haemofelis a anemia foi mais intensa quando comparados aos animais anêmicos negativos para qualquer uma das espécies de micoplasmas. Quanto à bioquímica sérica, as concentrações das bilirrubinas e a atividade sérica da ALT foram maiores nos felinos infectados. Adicionalmente, com o intuito de avaliar o papel desempenhado pelos retrovírus no desenvolvimento ou agravamento da anemia causada por micoplasmas hemotrópicos, todos os felinos foram avaliados quanto à infecção pelo vírus da imunodeficiência felina (FIV) e da leucemia felina (FeLV), por meio de testes imunoenzimáticos (ELISA) para a detecção de ambos os vírus, de imunofluorescência indireta para detecção do antígeno do FeLV e de técnicas moleculares de detecção do DNA viral do FIV. Dentre os felinos saudáveis não foi observada nenhuma amostra positiva para os micoplasmas hemotrópicos e/ou retrovírus. A associação entre M. haemofelis e FIV (p=0,009) e entre o M. haemofelis e FeLV (p=0,015) , foi evidenciada. O felino infectado por \"Candidatus M. turicensis\" apresentou discreta diminuição do hematócrito e ausência de sinais de regeneração medular e o felino positivo para M. haemocanis apresentou anemia mais profunda com sinais de regeneração. No primeiro a infecção por nenhum dos retrovírus foi identificada, enquanto que o segundo apresentou co-infecção por FIV e FeLV. As informações obtidas das alterações hematológicas e bioquímicas correlacionadas à infecção pelo M. haemofelis evidenciaram o potencial patogênico dessa espécie de micoplasma hemotrópico. A disfunção imunológica resultante da infecção pelos retrovírus pode predispor à infecção por M. haemofelis, não se excluindo a possibilidade de infecção por outros hemoplasmas. / The present study aimed to evaluate the magnitude of the hemotrophic mycoplasmas infections in anemic cats. Samples from 270 anemic cats (PCV&le;29%) and 53 healthy cats were submitted to hematological analysis (CBC, cytologic evaluation of blood smear), serum biochemistry (total protein, albumin, alkaline phosphatase, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, gama glutamil transferase, bilirubins, urea and creatinin), and molecular assays for hemoplasma DNA detection in blood samples. Among the anemic cats, 25 samples were positive by Nested-PCR for the gender Mycoplasma using primers targeting the 16S rRNA. For species identification, sequencing of the products revealed that 23 cats were infected with Mycoplasma haemofelis, one with \"Candidatus M. turicensis\" and another with M. haemocanis. The GenBank accession numbers of the nucleotide sequences derived in this study are from EU442616 to EU442640 (EU442629 and EU442623 refer to \"Candidatus M. turicensis\" and M. haemocanis, respectively). M. haemofelis-infected cats presented significantly more severe anemia and higher bilirubins concentration and ALT serum activity. Additionally, with purpose to evaluate the role play by the retrovirus in the development or aggravation of the anemia caused by hemotrophic mycoplasmas, all cats were tested for FeLV p27 antigenemia by enzyme-linked immunosorbent assay and by indirect immunofluorescence, and anti-FIV antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay and viral DNA by Nested-PCR. None of the healthy cats presented infection with hemotrophic mycoplasmas and/or retroviruses. The association between M. haemofelis and retroviruses (FIV, p=0,009 and FeLV, p=0,015) in anemic cats was evidenced. In the \"Candidatus M. turicensis\"-infected cat, slightly decreased hematocrit with no signs of regeneration were observed; and in the M. haemocanis-infected cat anemia was severe and regenerative. In the first, retroviruses infections were not detected, whereas the second was infected with FIV and FeLV. The hematological and biochemistry abnormalities correlated to the M. haemofelis infection had evidenced the pathogenic potential of this hemoplasma species. In conclusion, immunological dysfunction resulting from retrovirus infection may predispose to M. haemofelis infection, without excluding the possibility of infection with other hemoplasma.

Com o objetivo de avaliar a magnitude da infecção por micoplasmas hemotrópicos nos felinos anêmicos, amostras sangüíneas de 270 felinos anêmicos (Ht&le;29%) e 53 felinos saudáveis foram submetidas à exames hematológicos, bioquímicos séricos (proteína total, albumina, fosfatase alcalina, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase, gamaglutamil transferase, bilirrubinas, uréia e creatinina), avaliação citológica do esfregaço sangüíneo e testes moleculares para a detecção de material genético de Mycoplasma spp. Foram encontradas 25 amostras positivas no grupo dos felinos anêmicos, pela técnica de Nested-PCR utilizando-se primers que amplificam fragmentos do gene 16S rRNA dos hemoplasmas. Dentre as amostras positivas, 23 foram caracterizadas por meio de seqüenciamento como Mycoplasma haemofelis e as duas restantes como \"Candidatus Mycoplasma turicensis\" e Mycoplasma haemocanis, respectivamente. As seqüências de nucleotídeos encontradas nesse estudo estão disponíveis no GenBank, sob os números de acesso EU442616 a EU442640, sendo os números EU442629 e EU442623, referentes ao \"Candidatus M. turicensis\" e M. haemocanis, respectivamente. Nos felinos infectados por M. haemofelis a anemia foi mais intensa quando comparados aos animais anêmicos negativos para qualquer uma das espécies de micoplasmas. Quanto à bioquímica sérica, as concentrações das bilirrubinas e a atividade sérica da ALT foram maiores nos felinos infectados. Adicionalmente, com o intuito de avaliar o papel desempenhado pelos retrovírus no desenvolvimento ou agravamento da anemia causada por micoplasmas hemotrópicos, todos os felinos foram avaliados quanto à infecção pelo vírus da imunodeficiência felina (FIV) e da leucemia felina (FeLV), por meio de testes imunoenzimáticos (ELISA) para a detecção de ambos os vírus, de imunofluorescência indireta para detecção do antígeno do FeLV e de técnicas moleculares de detecção do DNA viral do FIV. Dentre os felinos saudáveis não foi observada nenhuma amostra positiva para os micoplasmas hemotrópicos e/ou retrovírus. A associação entre M. haemofelis e FIV (p=0,009) e entre o M. haemofelis e FeLV (p=0,015) , foi evidenciada. O felino infectado por \"Candidatus M. turicensis\" apresentou discreta diminuição do hematócrito e ausência de sinais de regeneração medular e o felino positivo para M. haemocanis apresentou anemia mais profunda com sinais de regeneração. No primeiro a infecção por nenhum dos retrovírus foi identificada, enquanto que o segundo apresentou co-infecção por FIV e FeLV. As informações obtidas das alterações hematológicas e bioquímicas correlacionadas à infecção pelo M. haemofelis evidenciaram o potencial patogênico dessa espécie de micoplasma hemotrópico. A disfunção imunológica resultante da infecção pelos retrovírus pode predispor à infecção por M. haemofelis, não se excluindo a possibilidade de infecção por outros hemoplasmas. / The present study aimed to evaluate the magnitude of the hemotrophic mycoplasmas infections in anemic cats. Samples from 270 anemic cats (PCV&le;29%) and 53 healthy cats were submitted to hematological analysis (CBC, cytologic evaluation of blood smear), serum biochemistry (total protein, albumin, alkaline phosphatase, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, gama glutamil transferase, bilirubins, urea and creatinin), and molecular assays for hemoplasma DNA detection in blood samples. Among the anemic cats, 25 samples were positive by Nested-PCR for the gender Mycoplasma using primers targeting the 16S rRNA. For species identification, sequencing of the products revealed that 23 cats were infected with Mycoplasma haemofelis, one with \"Candidatus M. turicensis\" and another with M. haemocanis. The GenBank accession numbers of the nucleotide sequences derived in this study are from EU442616 to EU442640 (EU442629 and EU442623 refer to \"Candidatus M. turicensis\" and M. haemocanis, respectively). M. haemofelis-infected cats presented significantly more severe anemia and higher bilirubins concentration and ALT serum activity. Additionally, with purpose to evaluate the role play by the retrovirus in the development or aggravation of the anemia caused by hemotrophic mycoplasmas, all cats were tested for FeLV p27 antigenemia by enzyme-linked immunosorbent assay and by indirect immunofluorescence, and anti-FIV antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay and viral DNA by Nested-PCR. None of the healthy cats presented infection with hemotrophic mycoplasmas and/or retroviruses. The association between M. haemofelis and retroviruses (FIV, p=0,009 and FeLV, p=0,015) in anemic cats was evidenced. In the \"Candidatus M. turicensis\"-infected cat, slightly decreased hematocrit with no signs of regeneration were observed; and in the M. haemocanis-infected cat anemia was severe and regenerative. In the first, retroviruses infections were not detected, whereas the second was infected with FIV and FeLV. The hematological and biochemistry abnormalities correlated to the M. haemofelis infection had evidenced the pathogenic potential of this hemoplasma species. In conclusion, immunological dysfunction resulting from retrovirus infection may predispose to M. haemofelis infection, without excluding the possibility of infection with other hemoplasma.

Un mini-transposon qui permet une mutagénèse stable et non marquée a été modifié pour permettre l’expression de gènes chez les mycoplasmes. Cet outil a tout d’abord été utilisé pour le développement de mycoplasmes fluorescents. Pour ce faire, les protéines mCherry, mKO2 et mNeonGreen ont été insérées dans le chromosome de deux espèces de mycoplasmes phylogénétiquement distants : Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (Mmm) et Mycoplasma bovis (M. bovis). Cette insertion a permis l’observation sans précédent de colonies fluorescentes vertes et rouges chez les deux espèces et ce, sans toxicité apparente. De plus, des niveaux de fluorescence équivalents ont été quantifiés par cytométrie en flux chez les deux espèces, ce qui suggère que l’outil développé peut être largement utilisé chez les mycoplasmes. Ces mycoplasmes fluorescents ont ensuite été utilisés pour effectuer des études d’adhésion, d’invasion et de persistance de ces deux espèces de mycoplasmes avec différents types cellulaires bovins. Ces analyses ont confirmé que M. bovis présente de meilleures capacités d’adhésion et prolifération au support de culture, ainsi qu’aux cellules embryonnaires épithéliales qu’il envahi. Il présente aussi une meilleure résistance à la l’élimination par les macrophages. Néanmoins, Mmm a aussi été détecté à l’intérieur des macrophages après 72 heures d’infection, et ce, même à des MOI faibles et en présence de concentrations bactériostatiques d’antibiotique. Ensuite, le système d’expression a été utilisé pour tester la possibilité d’utiliser les mycoplasmes en tant que vecteurs vaccinaux. Le gène de la protéine H du virus de la peste des petits ruminants, utilisé avec succès dans des vaccins recombinants, a été inséré dans un mycoplasme caprin comme preuve de concept d’un vaccin multivalent. Cependant, malgré la détection d’ARNm spécifique, l’expression de la protéine virale n’a pas été mise en évidence, et ce, malgré le recours à une technique très sensible de détection par spectrométrie de masse. La preuve de concept n’a donc pas pu être réalisée. Pour conclure, les systèmes d’expression de gènes de fluorescences développés dans ces travaux sont bien adaptés aux études d’interaction hôte-pathogène et offrent une multitude de perspectives pour l’analyses fonctionnelle chez les mycoplasmes in vitro et in vivo.. / A mini-transposon affording unmarked, stable mutagenesis in mycoplasmas was modified to allow gene expression. This tool was first used for the development of fluorescence expression for stable and innocuous whole mycoplasma cell labelling. For this purpose, the fluorescent proteins GFP2, mCherry, mKO2 and mNeonGreen were introduced as chromosomal tags in the phylogenetically distant species Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (Mmm) and Mycoplasma bovis (M. bovis), resulting in the unprecedented observation of red and green fluorescent mycoplasma colonies in the two species, with no apparent cytotoxicity. Equivalent fluorescence expression levels were quantified by flow cytometry in both species, suggesting that these tools can be broadly applied in mycoplasmas. These fluorescent mycoplasmas were then used to compare the adhesion, invasion and persistence of the two species in different bovine cells. They notably confirmed that M. bovis shows a higher adhesion and proliferation capacity to the inert culture surface and higher adhesion to embryonic lung epithelial cells, which it invades. It also shows an increased resistance to elimination by macrophages. However, fluorescent Mmm were also detected inside the phagocytes 72h post-infection, even at a low MOI. Finally, the expression vector was used to assess the possible use of mycoplasmas as vaccine vectors. For this purpose, we introduced the H gene of the “peste des petits ruminants” virus, already used in effective recombinant vaccines, in a caprine mycoplasma as proof-of-concept of a mycoplasma-based multivalent vaccine. However, despite the detection of specific mRNA, the expression of the viral protein could not be evidenced using a highly a sensitive peptide detection technique by mass spectrometry, so this prove of concept could not be delivered. Still, the fluorescence expression tools developed in this study are suitable for host-pathogen interaction studies and offer innumerable perspectives for the functional analysis of mycoplasmas both in vitro and in vivo.

Orientador: Lucia Helena O'Dwyer de Oliveira / Banca: Katia Denise Saraiva Bresciani / Banca: Alessandro Francisco Talamini do Amarante / Resumo: O trabalho teve como objetivo investigar a ocorrência de Hepatozoon spp., piroplasmas e hemoplasmas em felídeos neotropicais nascidos em vida livre. Amostras sanguíneas foram colhidas de 11 Leopardus pardalis, 10 Leopardus tigrinus, oito Puma yagouaroundi, um Leopardus wiedii e um Puma concolor, provenientes dos Estados do Pará, Maranhão, Piauí, Ceará e Minas Gerais. Esfregaços sangüíneos foram realizados para observação dos hemoparasitas e a extração de DNA foi feita para utilização em técnicas moleculares. Hepatozoon spp. e piroplasmas foram diagnosticados pela Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) e hemoplasmas felinos foram pesquisados pela PCR- RFLP e "Nested"-PCR. A caracterização molecular dos isolados obtidos foi feita após o sequenciamento e a análise filogenética. A ocorrência de pelo menos um hemoparasita diagnosticado pela técnica do esfregaço sanguíneo foi de 6,45% (2/31) e pela PCR foi de 45,16% (14/31), sendo observadas, 16,12% (5/31), 3,22% (1/31) e 38,70% (12/31) de infecções por Hepatozoon sp., Cytauxzoon felis e hemoplasmas (das espécies Mycoplasma haemofelis e/ou "Candidatus Mycoplasma haemominutum"), respectivamente. Foram encontradas infecções únicas e mistas nos felídeos. O diagnóstico positivo foi maior nos adultos (92,85%) (p=0,007) e na espécie L. pardalis (57,14% - 8/14). A detecção de C. felis em exemplar juvenil de P. concolor, recém capturado na natureza, indica sua presença na população de felídeos neotropicais de vida livre no Brasil. A caracterização molecular de Hepatozoon sp. em felídeos neotropicais e os relatos das infecções por este hemoparasita em L. tigrinus e por M. haemofelis e "Candidatus M. haemominutum" em P. yagouaroundi são inéditos no mundo. / Abstract: The aim of this study was to investigate the occurrence of Hepatozoon spp., piroplasms and hemoplasms in wild caught neotropical felids. Blood samples were drawn from 11 Leopardus pardalis, 10 Leopardus tigrinus, eight Puma yagouaroundi, one Leopardus wiedii and one Puma concolor coming from the States of Para, Maranhão, Piauí, Ceará and Minas Gerais. Blood smears were evaluated for parasites and DNA was extracted for molecular techniques. Hepatozoon spp. and piroplasms were diagnosed by Polymerase Chain Reaction (PCR) and feline hemoplasms were examined by both RFLP-PCR and Nested- PCR. Molecular characterization of the isolates obtained was performed after sequencing and phylogenetic analyses. The occurrence of at least one hemoparasite diagnosed by blood smear technique was 6.45% (2/31) and by PCR was 45.16% (14/31). Infections of Hepatozoon sp., Cytauxzoon felis and feline hemoplasms (from species Mycoplasma haemofelis and/or "Candidatus Mycoplasma haemominutum") were observed, respectively, in 16.12% (5/31), 3.22% (1/31) and 38.70% (12/31) from the total of animals studied. Infections and co-infections were found among felids. The positive diagnosis were higher in adults (92.85%) (p= 0,007) and in L. pardalis (57.14% - 8/14). The detection of C. felis in a juvenile, recently wild caught P. concolor, indicates the presence of this piroplasm in the wild felid population of Brazil. The molecular characterization of Hepatozoon sp. in neotropical felids and the report of this hemoparasite infection in L. tigrinus as well as the report of M. haemofelis and "Candidatus M. haemominutum" in P. yagouaroundi are novelties in the world. / Mestre

Le groupe ‘M. mycoides’ constitue une branche phylogénétique homogène des mycoplasmes regroupant 6 taxons pathogènes des ruminants, responsables pour la plupart de maladies inscrites sur la liste de l’OIE. L’identification taxinomique sur laquelle repose le diagnostic reste délicate à cause de réactions antigéniques et génétiques croisées et d’un manque d’universalité intra-taxon des PCR, notamment pour les taxons Mcc, MmmLC et Mbg7. Une approche par hybridation soustractive sélective a été développée pour 1) appréhender les différences moléculaires entre ces 3 taxons ; 2) analyser globalement la diversité au sein du groupe ‘M. mycoides’ et 3) rechercher de nouveaux marqueurs d’intérêt diagnostique. Nos résultats montrent un important partage de séquences entre ces taxons, MmmLC et Mcc étant très polymorphes par rapport à Mbg7, plus homogène et qui représente une sorte de chimère entre les taxons Mcc et MmmSC. Nos données nous ont permis de développer un test PCR spécifique pour Mcc mais la diversité génétique du groupe ‘M. mycoides’ dépasse les frontières entre taxons rendant difficile et peu pertinente l’identification taxinomique. Un typage des souches en fonction de la virulence indépendamment de l’espèce serait l’approche diagnostique alternative. La faisabilité d’une telle approche a été explorée dans le cas du taxon MmmLC mais aucun critère susceptible de différencier les souches issues de foyers de celles issues de portage dans des troupeaux sans antécédent clinique n’a pu être mis en évidence. Ce continuum génétique entre souches, probablement lié à des transferts génétiques horizontaux, imposera à l’avenir une surveillance globalisée des mycoplasmoses / The ‘M. mycoides’ cluster, a homogenous phylogenetic branch of the Mollicutes, includes 6 taxa which are responsible for diseases in ruminants, most of which are listed by the OIE. Their taxonomic identification, on which current diagnosis is based, is impaired by antigenic and genetic cross-reactivity and by the lack of a universal, intra-taxon PCR assay, especially for the Mcc, MmmLC and Mbg7 taxa. A suppression subtractive hybridization approach was developed to: 1) define molecular differences between these 3 taxa; 2) analyze the overall genetic diversity within the ‘M. mycoides’ cluster and 3) search for new markers useful for diagnosis. Results obtained here showed that several sequences are shared across taxa, with Mcc and MmmLC being very polymorphic compared to Mbg7 which is more homogeneous, representing a sort of chimera between Mcc and MmmLC. From these analyses, a specific PCR assay was designed for Mcc identification but, because of the genetic diversity existing within the ‘M. mycoides’, the taxonomic identification of new strain appears less and less relevant. Instead, regardless of their species, strain typing on the basis of their virulence would offer an alternative approach for diagnosis. We assessed this type of approach for the MmmLC taxon but so far, our attempts to uncover markers that would distinguish pathogenic strains from carrier strains, isolated from herds with no clinical history, have failed. The genetic continuum observed between strains is remnant of horizontal gene transfers and imposes the development of a more global approach for mycoplasmosis surveillance