Orientador: Luciane Dias de Oliveira / Coorientador: Mariella Vieira Pereira Leão / Banca: Antonio Olavo Cardoso Jorge / Banca: Renata Falchete do Prado / Resumo: De acordo com a literatura, o uso frequente de probióticos em humanos favorece a modulação do sistema imunológico, por mecanismos ainda não totalmente definidos. O objetivo do presente estudo foi avaliar a capacidade de Lactobacillus rhamnosus ou seus produtos induzirem a liberação de mediadores pró e anti-inflamatórios (TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 e óxido nítrico) por macrófagos de camundongo (RAW 264.7). Para tanto, foram realizadas 3 preparações do microrganismo: SpL: suspensão de bactérias vivas (5 x 107 UFC/mL), SpLA: suspensão de bactérias autoclavadas a 121ºC por 15 min (5 x 107 células/mL); e SnLA: sobrenadante da suspensão anterior (SpLA) após centrifugação. As células (macrófagos RAW 264.7) foram cultivadas (37ºC, 5% de CO2) em três diferentes situações: na presença de SpL, SpLA ou SnLA. Após 2 h e 30 min de cultivo, o meio de cultura foi trocado e as células foram cultivadas por mais 16 h. Em seguida, os sobrenadantes foram removidos e estocados em freezer (-80ºC) para posterior análise. Como controle positivo foi utilizado LPS de Escherichia coli (10 EU/mL) e como controle negativo solução fisiológica. A quantificação de citocinas foi realizada pelo teste imunoenzimático (ELISA) utilizando anticorpos específicos. A produção de óxido nítrico foi determinada indiretamente pela concentração de nitrito detectada pelo reagente de Griess. Os resultados foram analisados estatisticamente, pela análise de variância ANOVA, com nível de significância de 5%, e pelo teste de Tukey. As suspensões SpL e SpLA foram capazes de induzir produção significativamente superior de TNF-α, IL-6, IL-10 e óxido nítrico em relação ao controle negativo (p<0,05). SnLA também induziu aumento significativo na... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: According to the literature, the frequent use of probiotics in humans favors the modulation of the immune system by mechanisms not yet fully defined. The aim of this study was to evaluate the ability of Lactobacillus rhamnosus or their products induce the release of proinflammatory mediators and anti-inflammatory (TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 and nitric oxide) by mouse macrophages (RAW 264.7). To this end, there were three preparations of the microorganism: SPL: suspension of live bacteria (5 x 107 UFC/ mL), SPLA: bacteria suspension autoclaved at 121 ° C for 15 min (5 x 107 UFC / mL) and SnLA: supernatant (SPLA) after centrifugation. The cells (RAW 264.7 macrophages) were cultured (37 ° C, 5% CO2) in three different situations: in the SpL, SPLA or SnLA presence. After 2 h 30 min cultivation, the culture medium was changed and cells were cultured for more 16 h. Then, the supernatants were removed and stored in a freezer (-80 °C) for later analysis. As positive control was used Escherichia coli LPS (10 EU / mL) and physiological solution as negative control. Cytokine quantitation was performed by immunoenzymatic test (ELISA) using specific antibodies. The production of nitric oxide was indirectly determined by nitrite concentration detected by the Griess reagent. The results were statistically analyzed by ANOVA with a significance level of 5%, and Tukey test. SPL and SPLA suspensions were able to induce significantly higher production of TNF-α, IL-6, IL-10 and nitric oxide than the negative control (p <0.05). SnLA also induced a significant increase in the production of TNF-α, IL-10 and nitric oxide (p <0.05), however, did not induce significant production of IL-6 in relation to the negative control (p> 0.05). It was not observed production of IL-4 and IL-1β, by any of the suspensions analyzed. In relation to... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Maria Julia Marques / Tese(mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-27T04:05:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Minatel_Elaine_M.pdf: 3919056 bytes, checksum: d240bd20bc93021c33a6a6666a17948c (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: O objetivo do presente trabalho foi investigar se fibras musculares regeneradas de camundongos normais apresentam alteração no padrão de distribuição dos receptores de acetilcolina (AChRs) e na expressão da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) e comparar os resultados obtidos com fibras regeneradas de camundongos mdx. Para tanto, a degeneração/regeneração foi induzida através de injeções de cloridrato de lidocaína no músculo esternomastóideo (STN) esquerdo de camundongos normais. O lado contralateral foi utilizado como controle. Após 21 dias os músculos foram retirados e marcados com rodamina-a-bungarotoxina para observação dos AChRs, com o anticorpo primário monoclonal anti-nNOS para observação da expressão da nNOS e montados para tluorêscencia. Foi adicionado ao meio de montagem o marcador de DNA nuclear DAPI o que possibilitou a observação dos núcleos celulares. Através da microscopia confocal de tluorêscencia observamos que a distribuição dos AChRs nas fibras regeneradas estava alterada em relação ao padrão das fibras do músculo controle. As fibras musculares regeneradas normais exibiram o mesmo padrão de distribuição dos AChRs observado em fibras regeneradas distróficas, ou seja, os braços juncionais estavam fragmentados, originando ilhas de receptores. Nossos resultados sugerem que a alteração no padrão de distribuição dos AChRs, que é observada no camundongo mdx, pode ser conseqüência apenas da degeneração/regeneração da fibra muscular e não devido a deficiência de distrofina. Quanto a nNOS, não houve alteração de sua expressão em fibras musculares regeneradas quando comparada com fibras do músculo controle. Isto sugere que a diminuição de sua expressão observada nos camundongos mdx pode ser atribuída a ausência de distrofina / Abstract: The aim of the present investigation was to study whether normal regenerated muscle fibers show changes in the pattem of distribution of the acetylcholine receptors (AChRs) and in neuronal nitric oxide synthase (nNOS) expression. Degenerative-regenerative changes were experimentaly induced in normal muscle fibers of mouse left sternomastoid (STN) muscle by injecting lidocaine hydrochIoride. The contralateral side .served as a controI. 21 days after lidocaine injection, the STNs (right and left) were removed, labelled with rhodamin a-bungarotoxin for AChRs observation, with anti-nNOS for nNOS observation and mounted in special mouting media for fluorescence with DAPI, a DNA stain for nuclei. By using fluorescence confocal microscopy regenerated muscle fibers showed disrupted AChRs distribution when compared to controls. Normal regenerated fibers exhibited the same pattem of AChR distribution as seen in dystrophic regenerated fibers. Our results suggest that changes in AChRs distribution seen in mdx were probably a consequence of muscle fiber degeneration-regeneration, rather than a symptom of dystrophin deficiency. Conversely, there were no changes in nNOS expression in normal regenerated fibers when compared to normal fibers, suggesting that the decrease in nNOS expression reported for mdx mice might be attributed to the absence of dystrophin / Mestrado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores : Claudia Herrera Tambeli, Maria Cecilia F. A. Veiga / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-01T18:26:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Macari_Marcelo_M.pdf: 2079236 bytes, checksum: ac3a27e17e67bcc47e4935c350f5665a (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: As condições dolorosas temporomandibulares têm sido relacionadas ao Óxido Nítrico(NO), entretanto, seu envolvimento nessas condições ainda é pouco conhecido. O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito do NO periférico num modelo comportamental de dor, utilizando o teste da formalina na ATM. Para isso, solução salina (NaCI 0,9%) ou o inibidor da óxido nítrico sintase, L-NMMA (NGmonomethyl- L-arginina) e doadores periféricos de NO; SNAP S-Nitroso-Nacetylpenicillamine) e SIN-1 (3-Morpholinosydnonimine); foram co-administrados com formalina 3% na região da ATM de ratos, em diferentes concentrações, ou seja, L-NMMA na concentração de 900µg e SIN-1 ou SNAP nas concentrações de 50,200,600 ou 1200µg. Numa segunda etapa, o L-NMMA (150,450 e 900µg)e seu isômero inativo D-NMMA (NG-monomethyl-D-arginina) (900µg) foram coadministrados com a formalina (0,5%,). Com o objetivo de investigar um possível efeito sistêmico, o L-NMMA, o SNAP e o SIN-1 foram administrados na máxima concentração citada anteriormente, na região da ATM contralateral à da administração de formalina (1,5%). Após os diferentes tratamentos farmacológicos, as respostas nociceptivas sinalizadas nos animais, caracterizadas pelo ato de coçar a região orofacial (CO) e levantar rapidamente a cabeça (LC) foram quantificadas por 45 mino Os resultados obtidos demonstraram que os doadores de NO; SNAP e SIN-1, antagonizam a hiperalgesia causada pela formalina, sugerindo que o NO exógeno tem efeito periférico antinociceptivo na dor induzida pela formalina e que o L-NMMA aumenta a sensibilidade dolorosa, evidenciando o envolvimento (efeito antinociceptivo) do NO endógeno periférico no teste da formalina na ATM de ratos / Abstract: Although the TMJ pain conditions are associated to a very high levei of an intracellular messenger, the nitric oxide, in the TMJ sinovial fluid (TAKAHASHI et ai, 1996), the role of the endogenous peripheral nitric oxide in the pain conditions is not very clear. Considering the recent development of a behavioral model in our laboratory to stud the TMJ pain conditions, the objective of this study was verifying in this model, the role of peripheral endogenous nitric oxide. Firstly, aqueous solution of NaCI 0,9% or the Nitric Oxide Sinthase (NOS) inhibitor, the L-NMMA and the peripheral NO donors SIN-1 or SNAP was co-administered with aqueous solution of Formaldehyde (3%) in the TMJ region of rats in diferents concentrations. L-NMMA was administered in 50, 150,450 or 90°µg and SNAP or SIN-1 were administered 50,200, 600 or 12001µg.Secondly, L-NMMA (150, 450, 900 µg)and its inactive isomer D-NMMA (900 µg) were co-administered with formaline (0,5%). To investigate a possible systemic effect, L-NMMA, SNAP and SIN-1 were administrated in the maximum concentration described above, in the TMJ contralateral region to the formaline administration (1,5%). After different pharmacological treatment, the nociceptives responses characterized by rubbing the orofacial region and flinching the head quickly were quantified for 45 minutes. The results of this work showed that the NO donnors, SNAP and SIN-1, antagonize the formaline hiperalgesy, it suggests that the exogenous NO has an antinociceptive peripheric effect, induced by formalin and that L-NMMA increases the nociceptive sensibility, evidencing the peripheric exogenous NO envolvement in the formaline test accomplished in TMJ of rats. To verify the specificity of efects unchained by L-NMMA, its inactive isomer D-NMMA (900µg) was co-administered with formaldheyde solution, like previously described. To investigate a possible sistemic effect of L-NMMA, it was administered in the maximum concentration utilized in these study, in the TMJ region to the contralateral administration of formaldheyde solution (1,5%). The results were submited to ANOVA and Tukey tests (p<0,05) / Mestrado / Fisiologia Oral / Mestre em Odontologia

Orientador : Edson Antunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T20:21:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_JulianoFernandesde_M.pdf: 21030681 bytes, checksum: 655e7f6fcc823363d39f60d09044b1d9 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: o óxido nítrico (NO) é atualmente reconhecido como o mais importante neurotransmissor inibitório liberado de terminações nervosas não-adrenérgicas não-colinér gicas (NANC) responsável pelo relaxamento de corpo cavernoso. O NO relaxa os corpos cavernosos através da ativação da guanilato cic1ase solúvel, a qual causa um aumento nos níveis de GMP cíc1ico que leva como conseqüência ao relaxamento deste tecido. A excitabilidade elétrica das células musculares lisas que formam os corpos cavernosos do pênis é fundamental para o funcionamento deste órgão. Um grande número de toxinas biológicas exerce seus efeitos modificando as propriedades de canais de Na+ dependentes de voltagem, envolvidos na geração de potenciais de ação. O objetivo deste estudo foi investigar a capacidade de agonistas de canais de Na+ (aconitina, veratridina, toxina de anêmona, toxina gamma e brevetoxinas) em induzir relaxamento no corpo cavernoso isolado de coelho, bem como os mecanismos farmacológicos envolvidos neste processo. A adição de aconitina (30 11M),veratridina (30 11M)e de brevetoxina-3 (100 nM) ao banho causou relaxamento de desenvolvimento lento e gradual, os quais foram marcantemente reduzidos pelo L-NAME (100 11M)e restaurados pela L-arginina (1 mM). Os relaxamentos evocados por estes três agonistas também foram significativamente reduzidos pelo ODQ. OS bloqueadores de canais de Na+, tetrodotoxina (100 nM) e saxitoxina (100 nM), quando adicionados previamente ao banho, aboliram o relaxamento de corpo cavernoso induzido por estes agonistas. A adição de toxina gamma (1 11M)ao banho produziu relaxamento transitório seguido de retomo gradual à linha de base. A adição de L-NAME inibiu o relaxamento causado pela toxina gamma e a pré-incubação com L-arginina impediu este efeito inibitório. Além disso, o relaxamento evocado pela toxina gamma foi abolido na presença de ODQ, tetrodotoxina e saxitoxina. A adição do inibidor seletivo para fosfodiesterase tipo 5, sildenafil (100 nM), potencializou significativamente o relaxamento de corpo cavernoso de coelho induzido pela aconitina, veratridina, toxina gamma e brevetoxina-3. Nossos resultados demonstram que o relaxamento de corpo cavernoso evocado por estes agonistas são dependentes da liberação de NO de fibras nitrérgicas e da ativação da via NO-GMPc na musculatura lisa do tecido erétil / Abstract: Nitric oxide (NO) is now recognized as the most important inhibitory neurotransmitter released by the nitrergic NANC fibers responsible for the corpus cavernosum relaxations and penile erection. NO relaxes the corpus cavernosum through the stimulation of the soluble guanylyl ciclase, causing an increase in the levels of cyclic GMP in the smooth muscle cavernosal tissues. The electric excitability via voltage-dependent Na+ channels of the smooth muscle cells that form the corpus cavernosum is essential for the erectile function. A number of biological toxins exert their effects modifying the properties of voltage-gated Na+ channels. The objective of this study was to investigate the capacity of Na+ channels agonists (aconitine, veratridine, anemone toxin, gamma toxin and brevetoxins) to induce relaxation of rabbit isolated corpus cavemosum (RbCC), and the pharmacological mechanisms involved in this phenomenon. The addition of aconitine (30 ~M), veratridine (30 ~M) and brevetoxin-3 (100 nM) to the organ-bath preparations caused slow-onset RbCC relaxations, which were markedly reduced by the NO synthase inhibitor L-NAME (100 ~M) and reversed by L-arginine (1 mM). The RbCC relaxations evoked by these agents were also significantly reduced by the soluble guanylyl ciclase inhibitor ODQ (10 ~M). The Na+ channels blockers tetrodotoxin (100 nM) and saxitoxin (100 nM), when previously added to the bath, abolished the RbCC relaxations by these agonists. The addition of gamma toxin (1 ~M) produced transitory relaxations followed by a gradual retum to the base line. The addition of L-NAME inhibited the gamma toxin-induced RbCC relaxations caused and L-arginine prevented the inhibitory effect. Besides, these relaxations were abolished in the presence of ODQ, tetrodotoxin and saxitoxin. The selective inhibitors for hosphodiesterase type 5, sildenafil (100 nM), significantly potentiated the RbCC relaxations by the aconitine, veratridine, gamma toxin and brevetoxin-3. Our results indicate that the RbCC relaxations evoked by 151 Na+ channel agonists are dependent of the release of NO from nitrergic nerve fibres and of the activation of the pathway NO-GMPc in the smooth musc1ecells of the erectile tissue / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador : Lucia Pereira da Silva / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T23:42:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silveira_LeonardodosReis_D.pdf: 5178373 bytes, checksum: b6a1f4dd4f5fda026138aa19f6e9deda (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Embora níveis moderados de ERas e NO possam exercer importantes funções fisiológicas no tecido muscular, como regulação do fluxo sanguíneo, angiogênese e aumento da força de contração, pouco é conhecido a respeito da formação intracelular de ERas e NO durante a atividade muscular. Por outro lado, uma excessiva produção dessas espécies pode ser prejudicial ao nosso organismo, superando a capacidade do sistema de defesa antioxidante e conduzindo a um desequilibro no estado redox intracelular. Em nosso estudo, examinamos a formação intra e extracelular do NO e H202 em culturas de células, a formação extracelular do H202 em músculo esquelético de rato in vivo e a formação de O2. - em culturas de células e músculos isolados. Para realização deste estudo nós utilizamos as sondas fluorescentes DAF-2-DA (reativa ao NO), DCFH-DA (reativa ao H2O2) e fluoróforo nitróxido (reativa ao ). Nossos resultados in vitro usando culturas de células musculares mostraram que o H2O2 e NO são formados em grandes quantidades no meio intracelular, seguido de um grande efluxo para o espaço extracelular durante atividade muscular intensa (P < 0,05). Por outro lado, durante atividade muscular moderada a produção dessas espécies é mantida em níveis basais sem nenhuma alteração significativa na sua produção (P > 0,05). Os resultados in vitro utilizando cultura de célula e músculos sóleo e EDL isolados mostraram um alto efluxo do do meio intra para o meio extracelular dirante contrações intensas (P < 0,05). O músculo EDL apresentou um maior efluxo do quando comparado que o músculo sóleo (P < 0,05). Os resultados in vivo utilizando o DCFH em combinação com a técnica de microdiálise mostraram uma alta detecção de H2O2 no meio intersticial quando os valores de repouso foram comparados com os valores durante a atividade muscular intensa, sugerindo um alto efluxo dessa espécie do meio intra para o meio extracelular. Nossos resultados mostram que estas sondas fluorescentes utilizadas em nosso estudo são de grande sensibilidade e especificidade na detecção de ERas e NO em tecido muscular submetido a contrações. Em adição, nossos resultados sugerem que a atividade muscular intensa aumenta significativamente a produção de ERas e NO e que essas espécies produzidas intracelularmente são amplamente transportadas para o meio extracelular, processo que protege as células contra os possíveis ataques oxidativos intracelulares gerados por essas espécies / Abstract: Although moderate levels of ROS and NO may exert important physiological functions in muscle tissue, such as regulation of blood flow, angiogenesis and contractile force, little is still known about ROS and NO formation in response to muscle activity. In addition, an excessive level of these species may be harmful as it may overcome the antioxidant capacity, leading to oxidative stress. In this study we examined intra- and extracellular H2O2 and NO formation during contractions in primary rat skeletal musc1e cell culture and isolated muscle. The fluorescent probes DCFH-DA/DCFH (2,7-DicWorofluoresceindiacetate/2,7-DicWorofluorescein) and DAF-2-DA/DAF-2 (4, 5-diamino fluorescein diacetate/4,5-diaminofluorescein) were used to detect H2O2 and NO, respectively. Intense electrical stimulation of musc1e cells increased the intra- and extracellular DCF fluorescence by 171% and 105% respectively, compared with control non-stimulated cells (P < 0.05). Addition of glutathione (GSH) or tiron prior to electrical stimulation inhibited the intracellular DCFH oxidation (P < 0.05), whereas addition of GSH-PX + GSH inhibited the extracellular DCFH oxidation (P < 0.05). Intense electrical stimulation also increased (P < 0.05) the intra- and extracellular DAF-2 fluorescence signal by 56% and 20%, respectively. Addition of W-nitro-L-arginine (L-NA) completely removed the intra- and extracellular DAF-2 fluorescent signal. In isolated musc1es intense estimulation increase superoxide release compared with control non-stimulated (P < 0.05). H202 detection in vivo through DCFH-BSA combined with microdia1ysis technique showed an significant increase on DCFH oxidation during intense contractions. GSH-PX antioxidant completely inhibited DCFH oxidation. The current results show that H2O2, NO and O-z are formed in skeletal musc1e cells during contractions. Our results also suggest that a rapid release of these species may constitute an important defense mechanism against the formation of intracellular 'OH and 'ONOO. Furthermore, our data show that DCFH and DAF-2 are suitable probes for the detection of ROS and NO both intra- and extra-cellulary in skeletal musc1e cell cultures / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Stephen Hyslo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:43:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Melo_SilviaElainedeSousaFerreiraCarvalhode_M.pdf: 20518302 bytes, checksum: 2c61842087a09767e6486f92531be39b (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Venenos de serpentes do gênero Bothrops produzem efeitos locais (dor, edema, inflamação, hemorragia, necrose), e sistêmicos (coagulopatias, hemorragia, hipotensão/choque, insuficiência renal aguda). Neste estudo, avaliamos a ação hipotensora do veneno da B. altematus em ratos anestesiados e investigamos os mediadores envolvidos neste fenômeno. Ratos Wistar machos anestesiadoscom pentobarbital sódico (40 mg/kg, Lp.) foram canulados para medição da pressão arterial (artéria carótida) e administração de veneno e de drogas (veia femora!). A pressão arterial e a freqüência cardíaca foram registradas continuamente durante o experimento. O veneno, suas frações e as drogas foram dissolvidos em salina e administrados in bolus (0,1 ml) após 15 minutos para a estabilização da pressão. Em alguns experimentos o veneno foi dialisado utilizando-se membranas de celulose (limites de filtração de 2 kDa e 12 kDa) antes de ser administrado aos ratos. Para identificar a fração hipotensora, o veneno foi fracionado por gel filtração em resina Superdex 75 e as frações testadas na pressão arterial. O veneno causou hipotensão de ormadose-dependente(1-100j.lg/kg)com quedamáximade 69,8.:!::6,2%na maior dose (média:t desvio padrão, n=5) e com retorno da pressão a 80% dos níveis basais em 30 minoO pré-tratamento de ratos com atropina (antagonista muscarínico; 4 mg/kg, Lv.) ou glibenclamida (antagonista de canais de K+ ATP-dependentes; 50 mg/kg, Lv.) não alterou de forma significativa a hipotensão causada pelo veneno (100 j.lg/kg, Lv.). Por outro lado, o N'úJ-L-nitro-argininameti! éster (L-NAME, 20 mg/kg, Lv.), inibidor da biossíntese de óxido nítrico (NO), reduziu a hipotensão máxima causada pelo veneno (100 j.lg/kg) de 69,8.:!:6,2%para 29,1.:!::16,6%(n=5, p<0,05). Ratos prétratados com captopril (2 mg/kg), um inibidor da enzima conversora da angiotensina e potencializador do efeito da bradicinina, apresentaram acentuação da hipotensão máxima causada pelo veneno (50 j.lg/kg) de 51,2:t5,5% para 80,8:t9,4% (n=5, p<0,05). A indometacina (inibidor da ciclooxigenase, 10 mg/kg, Lv.) causou pequena redução na hipotensão máxima, e potencializou a recuperação da pressão para níveis basais; também aumentou a resistência dos ratos a doses maiores. A pré-incubação do veneno com antiveneno comercial aboliu totalmente a atividade hipotensora enquanto que a administração separada do antiveneno antes ou após o veneno não afetou a hipotensão subseqüente. O veneno dialisado produziu hipotensão de 46,9::t6,8% e 30,3::t5,5% com a dose de 100 ~g/kg após diálise em membranas com limites de filtração de 2 kDa e 12 kDa, respectivamente (p<0,05 comparados à queda de 69,8:!:6,2% com veneno não dialisado). Das frações obtidas por gel filtração do veneno, nenhuma sozinha (100 ~g/kg) reproduziu o efeito observado com o veneno total. Na combinação de frações, apenas as frações 2 e 4 reproduziram o quadro hipotensor do veneno, sendo que a fração 4 potencializou a fração 2. A ação da fração 2 também foi potencializada (p<0,05) pelo captopril enquanto que a fração 4 potencializou (p<0,05) a hipotensão causada pela bradicinina (1 mg/kg, Lv.). Estes resultados mostram que o veneno da B. altematus produziu resposta hipotensora dose-dependente em ratos que foi parcialmente mediada por NO, o qual pode ter sido liberado pela bradicinina proveniente da atividade cininogênica do veneno e presente na fração 2. A ação potencializadora da fração 4 sugere a presença de peptídeos potencializadores da bradicinina no veneno. Metabólitos do ácido araquidônico parecem estar envolvidos mais na manutenção da hipotensão do que na queda inicial. A via muscarínica e os canais de K+ATPdependentes parecem não estar envolvidos na hipotensão induzida pelo veneno / Abstract: The venoms of Bothrops snakes produce systemic effects characterized by disseminated bleeding, coagulopathies, shock and acute renal failure. In this study, we investigated the mediators involved in hypotension induced by Bothrops altematus snake venom. Male Wistar rats anesthetized with sodium pentobarbital were cannulated for measurement of blood pressure and heart rate, and for administration of drugs and venom. Venom (1-100 j.!g/kg) produced dosedependent hypotension with no effect on heart rate; a higher dose (200 j.!g/kg)also produced progressive cardiac depression. L-NAME attenuated the venom-induced hypotension whereas captopril potentiated the fali in blood pressure. Indomethacin enhanced the recovery to normal values and prolonged the survival of rats at venom doses up to 200 og/kg, but atropine and glibenclamide had no effect on the hypotensive response. Preincubating venom with commercial antivenom abolished the hypotensive activity. Fractionation of venom by gel filtration chromatography resulted in four peaks, of which only peaks 2 and 4 in combination reproduced the hypotension caused by whole venom. Peak 2 was also potentiated by captopril while peak 4 potentiated the response to bradykinin. These results indicate that the hypotension produced by B. altematus venom is mediated partly by nitric oxide whose formation may be stimulated by bradykinin and potentiated by captopril. Arachidonic acid metabolites may contribute to sustaining the hypotension whereas muscarinic receptors and ATP-dependent K+channels are not involved. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Gilberto de Nucci, Heitor Moreno Junior / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-24T14:03:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_JoseEduardoTanusdos_D.pdf: 1675172 bytes, checksum: f5387132a5014ae092c21ec04cb80d53 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: O óxido nítrico (NO) tem sido usado no tratamento da hipertensão pulmonar. Alguns estudos experimentais têm sugerido efeitos terapêuticos do NO após embolia com microesferas. Num primeiro estudo, os efeitos protetores da inalação de NO previamente a uma embolia aérea pulmonar (EAP) foram avaliados. Um segundo estudo avaliou os efeitos terapêuticos do NO durante uma infusão endovenosa de ar (IVA). Também foram estudados a liberação de tromboxano A2 e a produção endógena de NO. No primeiro estudo, NO (3ppm) inalatório foi iniciado em 6 cães mestiços anestesiados (grupo NO), enquanto que os controles (n=7) não receberam NO. Decorridos 20 min, os cães receberam 2,5 ml/kg de ar injetados em veia periférica. Foram realizadas avaliações hemodinâmicas e coletadas amostras de sangue (arterial e venoso misto) para análise gasimétrica antes e após a inalação de NO, bem como 5-60 min a após a EAP. Três cães do grupo controle morreram ao passo que apenas um cão tratado com NO morreu. A EAP diminuiu a pressão arterial e o débito cardíaco por mais de 15 min após a EAP no grupo controle, enquanto que os animais tratados com NO apresentaram hipotensão transitória. O NO atenuou a hipertensão pulmonar após a EAP, pois houve menores aumentos de pressão arterial e resistência vascular pulmonares no grupo NO quando comparado com os controles. Estes efeitos hemodinâmicos do NO não foram associados a uma melhor oxigenação sangüínea. No segundo estudo, cães anestesiados receberam uma IV A (0.2 ml.kg-1.min-1) após ter sido feita uma avaliação hemodinâmica basal (BL). Os controles (n=8) não receberam 6outros tratamentos. Após 30 min de IVA (momento EMB), os cães do grupo NO (n=7) inalaram NO 3ppm por 30 min (momento NO 3) e, a seguir, ficaram por mais 30 min sem inalar NO (momento NO O). Nos 30 min seguintes, estes animais inalaram NO 40 ppm (momento NO 40). As variáveis hemodinâmicas foram registradas e foram coletadas amostras de sangue arterial e venoso misto para análise gasimétrica, determinação do tromboxano B2 (por ELlSA) e nitratos/nitritos (por HPLC) nos seguintes momentos do estudo: BL, EMB, NO 3, NO O e NO 40. O índice cardíaco aumentou 24% (p<0.05) e o índice de resistência vascular pulmonar diminuiu 30% (p<0.05) durante ambas inalações de NO. A PaO2 e a SaO2 diminuíram após a inalação de NO. As concentrações de nitratos/nitritos não mudaram no grupo controle. Não houve diferença nas concentrações de nitratos/nitritos entre o sangue arterial e venoso misto. As concentrações de nitrito permaneceram abaixo de 1 µM em ambos os grupos, enquanto que as concentrações de nitrato aumentaram apenas no momento NO 40 (p<0.05). As concentrações de TxB2 aumentaram após 60 min de IVA no grupo controle (p<0.05), porém nenhum aumento foi observado nos animais tratados com NO. Estes resultados indicam que o NO atenuou as alterações hemodinâmicas induzidas pela EAP e pela IVA em cães, contudo sem melhorar a oxigenação pulmonar. Estes efeitos foram associados a menores concentrações de TxA2 nos animais tratados com NO, sem que s-e observasse diferença entre 3 ppm e 40 ppm. Ainda, a produção endógena de NO não foi comprometida pela IVA em cães / Abstract: Inhaled nitric oxide (NO) has been used in cases of pulmonary hypertension. Experimental studies have suggested therapeutic effects of NO after pulmonary microembolism. The protective effects of NO inhalation before a massive pulmonary air embolism (PAE) were evaluated in a first study. A second study focused the therapeutic effects of NO inhalation during a venous air infusion (VAI). The thromboxane a release and in vivo NO production were also studied. In the first study NO(3ppm) was initiated in 6 anesthetized mongrel dogs (NO group) but not in the control group (n=7). After 20 min, each dog received a venous air injection of 2.5 ml/kg. Hemodynamicevaluation was performed and blood samples (arterial and mixed venous) were drawn for blood gas analysis before and after NO inhalation, and 5-60 min after the PAE. Three dogs died in the control group vvhereas one dog died in the NO group. PAE decreased both arterial pressure and cardiac output in the control group for- more than 15 min after PAE, while NO¬ treated animals showed only a transient hypotension. NO attenuated the pulmonary hypertension after PAE, as demonstrated by the lower increases in pulmonary artery pressure and vascular resistance in NO-treated animals compared to the controls. These hemodynamic effects of NO were associated with no differences in blood oxygenation. In the second study, anesthetized mongrel dogs received a VAI (0.2 ml.kg-1.min-1) after a baseline (BL) hemodynamic evaluation. Controls (n=8) received no further treatment. After 30 min of VAI (EMB time point), NO 3ppm was initiated in .the NO group (n=7) for 30 min (NO 3 time point), followed by 30 min without NO inhalation (NO O time point). Thereafter NO 40 ppm was inhaled for 30 min (NO 40 time point). Hemodynamic variables were registered and arterial and mixed venous blood samples were drawn for gas analysis, and serum determinations of thromboxane B2 (by ELlSA) and nitrate/nitrite (by HPLC) at BL, EMB, NO 3, NO O and NO 40 time points. Cardiac index increased 24% (p<0.05) and pulmonary vascular resistance index decreased 30% (p<0.05) during both NO inhalation. PaO2 and SaO2 were slightly lower (p<0.05) after NO therapy. Nitrate/nitrite concentrations did not change in the control group. No differences between arterial and mixed venous serum nitrate/nitrite were found. Nitrite concentrations remained below 1 µ M in both groups whereas nitrate concentration increased only at NO 40 (p<0.05). Serum TxB2 increased after 60 min of VAI in the control group (p<0.05), whereas no increase was observed in NO-treated animals. These results indicate that NO attenuates the hemodynamic changes induced by PAE and by a VAI in dogs, without improving pulmonary oxygenation, however. These effects were associated with lower TxA2 concentrations in NO-treated animals and no differences were observed between NO 3 ppm and 40 ppm. Furthermore, endogenous NO release is not impaired afier a VAI in dogs / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Nora Marcela Haun Quiros / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T12:27:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Torsoni_AdrianaSouza_M.pdf: 20635048 bytes, checksum: a01b9994fce1e6c4b016aa22794ba653 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: A farmacodinâmica vascular da síntese endógena de NO ficou conhecida devido ao efeito de drogas nitrovasodilatadoras. Esses agentes exógenos, tais como o nitroprussiato de sódio, agem como doadores de NO e exercem efeito hipotensivo in vivo direto promovendo diminuição na resistência vascular sistêmica decorrente de um aumento nos níveis de GMP cíclico. Nosso interesse reside na possibilidade de complexos de rutênio transnitrosilaminados servirem como veículo para a liberação controlada de NO em sistemas biológicos e, assim, produzir efeitos farmacológicos. O objetivo desse trabalho foi investigar o efeito hipotensor e a toxicidade de um novo complexo de rutênio, o t-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO](PF6)3 devido a sua habilidade em liberar NO espontaneamente em solução aquosa. Medidas diretas de PA foram realizadas em ratos Wistar machos adultos cronicamente instrumentados. O efeito hipotensor foi determinado em ratos conscientes (n=10) submetidos a injeções endovenosas "in bolus" de trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO](PF6)3 e nitroprussiato de sódio (NaNP). Concentrações de 0,0025 a 0,08 µmoles/Kg do complexo de rutênio induziram resposta hipotensora imediata (PAM controle 104 ± 4,1 mmHg) em uma faixa de ação de 7 a 27%, similar ao efeito observado para o NaNP (11a 32%). Uma correlação dose-efeito positiva foi observada. A toxicidade foi avaliada em cultura de células (IC50) e pela toxicidade aguda em camundongos (LD50). Estudos da citotoxicidade foram conduzidos em cultura de hepatócitos (células metabolizantes), V79 (células não metabolizantes) e V79 tratada com o complexo biotransformado pelos hepatócitos. Hepatócitos de rato foram isolados pelo método de perfusão com colagenase em duas etapas do fígado inteiro. A viabilidade celular foi avaliada por três ensaios, os quais são indicativos de citotoxicidade: redução do MTT, incorporação do vermelho neutro (VN) e conteúdo de ácidos nuclêicos (DNA). Esses ensaios permitiram a avaliação dos valores de IC50 para o trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO](PF6)3 em células V79 e hepatócitos. Na cultura de hepatócitos valores de IC50 superiores a 3,0 mM foram obtidos para todos os ensaios realizados, sugerindo uma baixa toxicidade do complexo. Para cultura de células V79, nossos resultados mostraram efeito citotóxico similar para os três ensaios investigados, com valores de IC50 ao redor de 2,0 mM, mostrando ser este composto menos tóxico que o NaNP (IC50 ~ 0,056 mM). O produto da biorransformação foi avaliado e mostrou baixa toxicidade para os ensaios de DNA, MTT e alta toxicidade para o VN, i.e., o composto biotransformado modificou a integridade lisossomal. A toxicidade aguda foi avaliada e um valor de LD50 igual a 216 mg/Kg foi obtido indicando baixa toxicidade do complexo in vivo. / Abstract: The vascular pharmacology of endogenously synthesised NO is largely predicted by the known effects of nitrovasodilator drugs. These exogenous agents, such as sodium nitroprusside, act as NO donors and exert direct hypotensive effects in vivo promoting a decrease in systemic vascular resistance by increasing levels of cyclic GMP. We have been interested in the possibility that trans-nitrosylammine ruthenium complexes, might serve as vehicles for the controlled delivery of NO into a biological system and thus display useful pharmacological effects, promoting hypotensive effect. The aim of this work was to investigate the hypotensor effect and toxicity of a new ruthenium complex t-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO](PF6)3 due to their ability to spontaneously NO release in aqueous solution. Direct measurements of blood pressure were performed in chronically instrumented adult male Wistar rats. The hypotensor effect was determined in conscious rats (n=10) submitted to in bolus intravenous doses of the trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO](PF6)3 and sodium nitroprusside (NaNP). Concentration range of 0.0025 to 0.08 µmols/Kg induced hypotensive response (MAP control: 104 ±4.1 mmHg) immediately in action range of 7 to 27% similar to that observed for NaNP effect (11 to 32%). A positive dose-effect correlation was observed. The toxicity was evaluated on cell culture (IC50) and by acute dose in mice. Cytotoxicity studies were carried out on cultures of rat hepatocytes (metabolizant cells), V79 (non-metabolizant cells) and V79 treated with the supernatant of the biotransformed complex by hepatocytes. Hepatocytes were isolated from adult male Wistar rats by the two-step collagenase liver perfusion. Cell viability was evaluated by three endpoints which are indicative of cytotoxicity: MTT reduction, Neutral Red Uptake (NRU) and Nucleic Acid Content (DNA). These assays permit the evaluation of IC50 values of trans- [Ru(NH3)4P(OEt)3NO](PF6)3 on V79 and rat hepatocyte cells. On hepatocyte culture values higher than 3.0 mM were determined for all tests, suggesting a low toxicity for the complex. For V79 cultures our results showed a similar cytotoxic effects for the three studied endpoints with an IC50 ranging around 2.0 mM, showing be less toxic than NaNP. The biotransformated product was evaluted and showed low toxicity for DNA, MTT assays and high toxicity for NRU, i.e., the compound biotransformed changed the lysosomal integrity. The acute toxicity was carried out and a LD50 value of 216 mg/Kg was obtained indicating a low toxicity in vivo. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Edson Antunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-25T19:01:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Penteado_CarlaFernandaFranco_M.pdf: 2582288 bytes, checksum: b84812ec12fc6c20a7e59cc8b9799a0b (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Neste trabalho investigamos a participação do NO no edema de pata, permeabilidade vascular e influxo de neutrófilos para cavidade peritoneal induzidos pela enterotoxina estafilocócica tipo B (SEB) em camundongos. Para tanto, utilizamos inibidores não-seletivos (L- NAME) e seletivos (aminoguanidina e 7 -nitroindazol) da NO-sintase, assun como a dexametasona (inibidor da indução da iNOS). Nossos resultados mostraram que o L-NAME (7-28 mg!kg, i.v.) e aminoguanidina (25-75 mg!kg, i.v.) reduziram significativamente o edema de pata induzido pela SEB (25 ~g/pata). A administração subplantar de tais inibidores também causou significante redução do edema de pata. Por outro lado, apenas as maiores doses destes inibidores (administrados pela via endovenosa) foram capazes de inibir de maneira significativa, o extrayasamento de proteínas induzido pela toxina. O D- NAME (enântiomero inativo), administrado local ou sistemicamente, não alterou a resposta edematogênica induzida pela SEB. A inibição do edema de pata causada pelo L-NAME e aminoguanidina foi revertida pelo iloprost (análogo da prostaciclina), sugerindo que o efeito inibitório destes inibidores deve-se, provavelmente, à redução de fluxo sangiiíneo local como conseqüência da inibição do NO. Aadministração sistêmica do L-NAME (14-56 mg!kg), aminoguanidina (25-75 mg!kg) ou dexametasona (0,25-1,0 mg!kg) atenuou o influxo de neutrófilos induzido pela SEB em cavidades peritoneais com número de macrófagos normais. Em cavidades com o número de macrófagos aumentado, os inibidores foram menos eficazes em reduzir o influxo dessas células. O D-NAME não afetou o influxo de neutrófilos induzido pela SEB nas duas cavidades estudadas. Os resultados da medida da atividade da NOS mostraram que a nNOS do cérebro foi significativamente inibida pelo L-NAME 4 (28 mg/kg) e 12 h (14-56 mg/kg) após administração endovenosa deste inibidor. A aminoguanidina (75 mg/kg, i.v.) reduziu a atividade da nNOS em 4 h, mas não em 12 h após a administração sistêmica. O 7-nitroindazol (5-15 mg/kg) não modificou a nNOS em quaisquer das doses utilizadas. A atividade da iNOS foi inibida significativamente pelo L-NAME (14-56 mg/kg, i.v., 12 h) e aminoguanidina (25-75 mg/kg, i.v., 12 h). Concluímos que o NO é um mediador importante na resposta edematogênica e no influxo de neutrófilos induzidos pela SEB. A síntese do NO, no sítio inflamatório, parece envolver a cNOS na fase inicial (4 h) e a iNOS na fase de mais tardia (12 h) / Abstract: In this study we attempted to investigate the role of nitric oxide (NO) on the inflammatory responses (hindpaw oedema, vascular permeability and neutrophil migration) induced by the staphylococcal enterotoxin type B (SEB) in mouse. To achieve this, both non-selective (L-NAME) and selective (aminoguanidine and 7-nitroindazole) NO-synthase (NOS) inhibitors as well as dexamethasone (iNOS induction inhibitor) were used. Our results showed that L-NAME (7-28 mg/kg, i.v.) and aminoguanidine (25-75 mg/kg, i.v.) significantly reduced SEB-induced paw oedema. Similar results were observed when these inhibitors were administered intraplantarly. The inactive enantiomer D-NAME had no effect on the SEB-induced oedema formation. The inhibition of paw oedema by both L- NAME and aminoguanidine were significantly reversed by the local . administration of the prostacyclin analogue iloprost. This suggest that these inhibitors probably acts by reducting regional blood flow. The compound 7¬nitroindazole, a substance which preferentially inhibit nNOS, had no effect on the exsudation and paw oedema induced by SEB. L-NAME and aminoguanidine as well as dexamethasone significant reduced neutrophil accumulation induced. by SEB into mouse peritonenl cavity. In thioglycollate-pretreated cavities, a condition where the number of macrophages is increased, L-NAME and aminoguanidine caused a smaller inhibition of SEB-induced neutrophil migration, as compared to naive cavities. D-NAME had no effect on the neutrophil migration induced by SEB, either in non-stimulated or thioglycollate-treated cavities. In addition, bNOS activity was reduced by L-NAME at 4 h (28 mg/kg) and 12 h (14-56 mg/kg) after endovenous administration, while aminoguanidine (75 mg/kg, i. v.) was able to reduce the nNOs activity only when this inhibitor was injected 4 h before. The nNOS activity was unchanged by 7 -nitroindazole. The activity of iNOS was significant1y inhibited by L-NAME (14-56 mg/kg, i.v., 12 h) and aminoguanidine (25-75 mg/kg, i.v., 12 h).In conclusion, our results indicate that NO modulate both oedema and neutrophil migration induced by SEB. We suggest that NO involved in inflammatory response was produced by cNOS in the early phase (4 h) and iNOS during the sustained phase (12 h) / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Ione Salgado / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T03:06:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Modolo_LuziaValentina_D.pdf: 799010 bytes, checksum: 1363bbb027c17ac1fd3b4e9f93479455 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A origem do óxido nítrico (?NO) em plantas tem sido controversa e uma enzima do tipo óxido nítrico sintase (NOS), bem como nitrato redutase (NR) são consideradas possíveis fontes deste radical livre. Contudo, ainda não há nenhuma evidência direta da formação de ?NO a partir da NR durante interações planta-patógeno. Nos estudos aqui descritos foram utilizadas plantas de Arabidopsis thaliana deficientes na enzima NR para investigar o mecanismo de produção de ?NO em resposta à inoculação da bactéria Pseudomonas syringae pv. maculicola (Psm). Aumento na síntese de L-citrulina a partir de L-arginina foi observado em homogenatos de folhas de plantas do tipo selvagem e daquelas deficientes na síntese de NR, após inoculação com Psm. Experimentos de ressonância paramagnética eletrônica, contudo, mostraram uma produção muito maior de ?NO dependente de NO2-, mas não de L-arginina ou NO3-, síntese esta inibida por alta concentração de L-arginina. A inibição da cadeia de transporte de elétrons da mitocôndria aboliu ou inibiu parcialmente esta atividade em plantas mutantes ou selvagens, respectivamente. A utilização do marcador fluorescente 4,5 diaminofluoresceína diacetato (DAF-2DA) mostrou que a inoculação com Psm aumentou substancialmente a produção de ?NO in situ em plantas selvagens, mas não em mutantes deficientes na síntese de NR. No entanto, a infiltração de L-arginina ou NO2- causou uma produção de ?NO in vivo nas plantas mutantes. Plantas de A. thaliana deficientes na síntese de NR mostraram suscetibilidade à P. syringae que foi prevenida pela co-infiltração de NO2-. O conjunto de resultados sugere que NOS, NR e uma importante atividade mitocondrial de redução de NO2- podem cooperar para produzir ?NO em quantidade suficiente para prevenir a disseminação de Psm em plantas de A. thaliana / Abstract: The origin of nitric oxide (?NO) in plants has been controversial and nitric oxide synthase (NOS)-like enzyme and nitrate reductase (NR) are claimed as potential sources. However, there is still no direct evidence for ?NO formation from NR during plant-pathogen interactions. Here, we used NR-defective double mutants of Arabidopsis thaliana to investigate the mechanism of ?NO production following infection by an avirulent strain of Pseudomonas syringae pv. maculicola (Psm). Increased formation of L-citrulline from L-arginine was observed in leaf homogenates of both wild-type and nia1 nia2 mutant plants. Electron paramagnetic resonance experiments, however, showed a much higher ?NO production that was dependent on NO2- rather than on L-arginine or NO3- and was also inhibited at high L-arginine concentrations. Inhibition of mitochondrial electron transport abolished and inhibited partially this activity in nia1 nia2 mutants and wild-types, respectively. In situ ?NO production was substantially increased in wild type-plants but not in mutants, following Psm challenge, as measured with the fluorescent probe 4,5-diaminofluorescein diacetate. However, in vivo ·NO production in NR-deficient mutants was visualized only after L-arginine or NO2- infiltration into the leaves. A. thaliana plants defective in NR showed susceptibility to P. syringae that was prevented by infiltration of NO2-. The overall results suggest that NOS, NR, and an important mitochondrial-dependent nitrite-reducing activity cooperate to produce ?NO in amounts enough to prevent Psm dissemination in A. thaliana plants / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular