Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2010. / Submitted by Jadiana Paiva Dantas (jadi@bce.unb.br) on 2011-06-29T22:31:15Z No. of bitstreams: 1 2010_AnneCarolineDiasNeves.pdf: 2909388 bytes, checksum: 0e35b081fa1d4e2d81290e6b8c897464 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-07-14T22:36:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_AnneCarolineDiasNeves.pdf: 2909388 bytes, checksum: 0e35b081fa1d4e2d81290e6b8c897464 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-14T22:36:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_AnneCarolineDiasNeves.pdf: 2909388 bytes, checksum: 0e35b081fa1d4e2d81290e6b8c897464 (MD5) / Os neutrófilos são células do sistema imune responsáveis pelo combate inicial contra microrganismos, tais como bactérias e fungos. Possuem uma vida curta, em torno de 6 a 10h na circulação periférica sendo os primeiros a chegarem ao local injuriado. Os neutrófilos podem ser ativados por várias substâncias, entre elas o fMLP (N-formil Metionil-Leucil-Fenilalanina), um peptídeo presente em bactérias Gram-positivas responsável pela ativação dos neutrófilos principalmente em pacientes acometidos por sepse. Essa ativação envolve proteínas centrais na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) como ERK, p38MAPK e PKC, envolvidas não só na montagem da NADPH oxidase, mas também na reorganização do citoesqueleto favorecendo os processos de desgranulação, transmigração e diapedese. Além da produção de ROS, também são produzidas inúmeras citocinas e quimiocinas, assim como mediadores da inflamação como prostaglandinas e leucotrienos. O presente estudo tem como objetivo comparar o mapa proteômico ácido de neutrófilos quiescentes com o mapa proteômico ácido de neutrófilos ativados com fMLP, evidenciando proteínas com expressão diferencial significativa. A comparação revelou 157 spots exclusivos da condição quiescente, sendo sete identificadas [CLIC1 (canal de cloreto), Dimethylglycine Dehydrogenase (desmetila a N-dimetilglicina em sarcosina e formaldeído), PIPTβ (transporta fosfatidilcolina e fosfatidilinositol sem gasto de energia), Scinderin (proteína estrutural responsável pela fragmentação da actina), Rab 14 e Rabaptin_Rab2GTPase (ambas envolvidas no transporte de grânulos no RE e Complexo de Golgi)] e 77 spots exclusivos da condição fMLP, sendo três proteínas identificadas [Posmeiotic Segregation Increased 2 (envolvido no reparo celular), Pyrophosphatase (hidrolisa o pirofosfato em fosfato inorgânico) e Coactosin like protein (F-actina envolvida na formação de LTB4)]. O mesmo pareamento possibilitou a detecção de spots diferencialmente expressos, sendo 24 com expressão significativamente aumentada para fMLP e três identificadas [Vimentin (filamento intermediário), Septin 11 (atua reorganizando os microtubulos e actina durante a desgranulação) e CLIC4 (canal de cloreto)] e 28 spots com expressão diminuída para fMLP, sendo sete identificadas [Promyelocite Leukemia Protein (envolvida na mutação do receptor do ácido retinóico); Zinc Finger (proteína efetora com sítio de ligação para PIP3); Modulator of retrovirus infection (modula o proteassoma diminuindo a degradação de material genético viral), tubulin1B, tubulin1A e tubulin4A (formam os microtubulos presentes no citoesqueleto). _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Neutrophils are cells of the immune system that are the first-responders against microorganisms, like bacteria and fungus. They have a short-life, that lasts from 6 up to 10 hours in peripheral blood, migrating quickly to the injured area. Neutrophils can be activated by various substances, like fMLP, a bacterial Gram-positive peptide responsible for the neutrophil activation in patients who were stricken by sepsis. This activation involves central proteins in reactive oxygen species (ROS) production like ERK, o38MAPK and PKC. The activation of neutrophils caused by fMLP is not restricted to the NADPH oxidase assembly, but also includes the cytoskeleton reorganization, favoring the degranulation process, transmigration and cell extravasation. Besides the ROS production, cytokines and chemokines are also produced, along with inflammation mediators like prostaglandines and leukotrienes. This research has as objective to compare the proteomic map of quiescent neutrophils with the proteomic map of fMLP activated ones, highlighting proteins with significant differential expression. The proteomic map pairing of quiescent and fMLP activated neutrophils revealed 157 exclusive spots of the quiescent cells, and 7 from these proteins were identified [CLIC1 (chloride channel), Dimethylglycine Dehydrogenase (demethylates the N-dimethylglicine in sarcosine and fornaldehyde), PIPTβ (transports phosphatidilinositol with no energy cost), Scinderin (structural protein responsible for the fragmentation of actinin), Rab 14 and Rabaptin_Rab2GTPase (both proteins involved in the transport of granules in the ER and Golgi Apparatus)] and 77 spots exclusive of fMLP activated neutrophils, 3 of which were identified [Posmeiotic Segregation Increased 2 (involved in cell repair), Pyrophosphatase (hydrolyses the pyrophosphate in inorganic phosphate) and Coactosin like protein (F-actin involved in LTB4 formation)]. This pairing also resulted in detection of differentially expressed proteins, 24 with up regulated expression by fMLP. Also, 28 spots presented down-regulated expression by fMLP. Among the statistically verified spots, three proteins with up-regulated expression by fMLP: Vimentin (intermediary filament), Septin 11 (acts reorganizing the microtubules and actin during degranulation) and CLIC4 (chloride channel) and seven proteins with down-regulated expression by fMLP: Promyelocite Leukemia Protein (involved in the retinoic acid mutation), Zinc Finger (effector protein with PIP3 bond site), Modulator of retrovirus infection (protein that regulates the proteasome, diminishing the viral genetic material degradation), tubulin1B, tubulin 1A and tubulin 4A (forms the microtubules present in the cytoskeleton)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-09-11T20:09:07Z No. of bitstreams: 1 Dissert_Elaine Aquino.pdf: 4777164 bytes, checksum: 492d4891951a52b966da83970d5f7f30 (MD5) / Approved for entry into archive by Luis Felipe Souza Silva(luis@bce.unb.br) on 2009-09-21T17:29:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_Elaine Aquino.pdf: 4777164 bytes, checksum: 492d4891951a52b966da83970d5f7f30 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-09-21T17:29:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_Elaine Aquino.pdf: 4777164 bytes, checksum: 492d4891951a52b966da83970d5f7f30 (MD5) Previous issue date: 2008 / Os neutrófilos huμanos são celulas já diferenciadas do sangue periférico, constituindo 40−70% dos leucócitos na circulação em condições normais. É o o primeiro tipo celular a atingir o local da infecção. Eles possuem 3 fenótipos diferentes: quiescente, estimulado e ativado. Várias moléculas pró−inflamatórias podem causar estimulação e ativação dos neutrófilos, incluíndo o mediador lipídico pró−inflamatório PAF. O PAF tem potentes efeitos diretos sobre o neutrófilo e pode induzir quimiotaxia, polimerização de actina, produção de ROS em pouca quantidade e agregação, além de outras ações de estimulação. Nesse estudo, os neutrófilos foram purificados a partir do sangue venoso periférico de voluntários sadios, obtidos após centrifugação do sangue total pelo gradiente de percoll (pureza > 97% e viabilidade > 98%). 107 células foram estimuladas com 20 nM de PAF por 30 minutos. As análises citométricas mensuraram a explosão respiratória, viabilidade e pureza dos neutrófilos. Foram preparados géis bidimensionais de extratos de neutrófilos quiescentes e estimulados por PAF, comparados seus mapas proteômicos e identificadas proteínas por PMF e MS/MS. A análise comparativa dos géis 2D entre as condições revelou 108 spots com expressão diferencial, sendo que 66 spots representam um aumento na expressão protéica após estimulação pelo PAF e 42 representam diminuição (p•0,05). Além disso, 114 spots foram considerados como pertencentes apenas ao mapa do gel quiescente e 129 spots exclusivos do mapa neutrofílicos estimulados por PAF. Forμa identificados 50 proteínas, sendo 3 coμ auμento de expressão após estiμulação, 2 coμ diμinuição de expressão, 1 exclusiva da condição quiescente e 42 sem expressão diferencial. Proteínas coμ aumento de expressão foraμ: vimentina, filamento interμediário, uμ coμponente do citoesqueleto; tubulina beta, uμa proteína presente nos μicrotúbulos, também considerada uμ componente do citoesqueleto e SNAP− , uma proteína envolvida no processo de fusão dos grânulos à μeμbrana plasμática. Proteínas que diμinuíraμ a expressão: subunidade 5 da Arp 2/3, proteína que muda a direção da polimerização da actina e proteína S10A9−humana com possível função quimiotática. Proteína exclusiva: anexina A5 inibe a ação da fosfolipase A2. O presente estudo representa uma importante etapa para se coμpreender as vias de estimulação dos neutrófilos durante o processo inflamatório. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Human neutrophils are differentiated cells in peripheral blood, which constitute 40 70% of circulating white blood cells, counted under normal conditions. Neutrophils are the first cells recruited froμ the bloodstream to sites of infection. These cells exhibit three different phenotypes: quiescent, priμed and activated. Several proinflammatory molecules can induce the primed and activated state, including the PAF. The PAF, a proinflammatory lipid mediator, has potent direct effects on eutrophils and can induce chemotaxis, actin polymerization, production of small amount of ROS and aggregation, and other priming−type actions. In this study, human neutrophils were prepared from peripheral venous blood of healthy volunteers (> 97% purity, > 98% viability) and were obtained by density centrifugation on Percoll gradient. 107 cells were stimulated with 20 nM PAF for 30 minutes. Cytometric analysis was executed for measurement of respiratory burst, viability and purity of neutrophils. Quiescent and PAF stimulated neutrophils were submitted to two−dimensional electrophoresis to, compare their proteomic map and to identify proteins by PMF and MS/MS. The comparison between the two conditions revealed 108 spots differentially expressed, among which 66 spots were upregulated after PAF stimulation and 42 were downregulated in this condition (p•0,05). Moreover, 114 spots were regarded as belonging only to quiescent gels, and 129 spots were exclusive of the PAF stimulated neutrophil map. We identified 50 proteins, 3 with increased expression after stiμulation, 2 with decreased expression, 1 exclusive of the quiescent condition and 42 without differential expression. Proteins with increased expression were: vimentin, the intermediate filament, classified as a coμponent of the cytoskeleton; tubulin beta, present in μicrotubules, also a component of the cytoskeleton; and SNAP− , involved in the fusion of granules to the plasma membrane. Proteins that decreased expression: complex Arp2/3 subunit 5, a protein that changes the direction of polymerization of the actin and S10A9−Human, a protein with a possible chemotactic function. Protein exclusive: annexin A5, that inhibits the action of phospholipase A2. This study presents a further step towards the understanding of stiμulation pathways in neutrophils during an inflammatory process.

PEDROSA, Alano Martins. Estudo de citotoxicidade, inflamação e estresse oxidativo em neutrófilos de pacientes com anemia falciforme : influência do tratamento com hidroxiuréia. 2013. 111 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-05-17T16:35:04Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_ampedrosa.pdf: 808373 bytes, checksum: b4f933762ac58a15a0212b4c8cbefccf (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-05-20T12:59:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_ampedrosa.pdf: 808373 bytes, checksum: b4f933762ac58a15a0212b4c8cbefccf (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-20T12:59:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_ampedrosa.pdf: 808373 bytes, checksum: b4f933762ac58a15a0212b4c8cbefccf (MD5) Previous issue date: 2013 / Falciform Anemia (FA) is a hereditary hemoglobinopathy resulting from a β-globin gene mutation (α2β26 GLU→ VAL) that originates a hemoglobin variant called S (HbS). Its polymerization promotes hemolytic and vaso-occlusive crises (VOC). Nowadays it is known that these reactions are initial FA events that unleash a chain reaction that ends with the generation of oxygen reactive types (ORT) nitric oxide (NO) bioavailability reduction, endothelial lesion, susceptibility to infections and a chronic inflammatory process with direct involvement of neutrophils in the development of such mechanisms. Neutrophils of FA patients, besides developing more rigid, non-deformable structures, also show alterations in the expression of adhesion molecules and the production of cytokines and other mediators that may induce or aggravate clinical events observed in the disease. Hydroxyurea (HU) is the most important improvement in FA treatment and the only medicine with a strong impact on the patients’ quality of life, reducing the number of VOC, hospitalizations and deaths resulting from this condition. However, not much is known about the effects of this medicine on neutrophils and on the functionality of these cells. The present study aimed at investigating cytotoxicity, inflammation and oxidative stress markers in neutrophils of FA patients, as well as the effect of HU treatment over these parameters in hematology ambulatory patients from a university hospital and a blood center, both reference centers in Fortaleza – Ceará. The sample included 101 adult patients of both sexes diagnosed with FA through molecular study and it was divided into two groups: the SS Group – composed of 47 FA patients and the SSHU Group – composed of 54 FA patients under HU treatment. A control Group AA was composed of 50 healthy individuals, voluntary blood donors matched by age and sex. Neutrophils were isolated from whole blood by differential gradient and used to measure test. In toxicity tests carried out, it was observed that HU did not have any cytotoxic effect on patients’ neutrophils, however, was shown a cytoprotective action when compared to group AA and SS patients, with a significant reduction (p<0,001) in lactate dehydrogenase (LDH) levels and an increase in the percentage of viable cells through the metil tiazol tetrazolium (MTT) (p<0,001) and the Trypan Blue exclusion tests. Analyzing neutrophil involvement in inflammatory and oxidative stress processes and in FA, there was a significant elevation in the levels of cytokines and pro-inflammatory markers (TNF-α, MPO) and reduced antiinflammatory interleukin IL-10 group SS, as well as a significant decrease in the activity of antioxidant enzymes (SOD and GSH-Px). Patients under medical treatment with the tested medicine showed similar levels to those found in group AA. Oxidative damage were analyzed through malonaldehyde measurement (MDA), which was evidenced statistical differences between all studied groups (p<0,001), however with a higher average value in the non-treated group of patients. The present study ratified the important role of neutrophils in the inflammatory response promoted by the AF, and shown in an unprecedented way, with the Northeast-BR patients, treatment with HU did not reduce the viability of neutrophils, and modulates its mechanisms pro-inflammatory and pro -oxidants at levels comparable to those of healthy individuals. / Anemia Falciforme (AF) é uma hemoglobinopatia hereditária resultante de uma mutação pontual do gene da β-globina (α2β26 GLU→ VAL), originando a hemoglobina S (HbS), cuja polimerização promove crises hemolíticas e vaso-oclusivas (CVO). Atualmente, sabe-se que as mesmas são eventos iniciais na AF desencadeando uma cascata de reações que culmina com geração de espécies reativas de oxigênio, redução da biodisponibilidade do óxido nítrico, lesão endotelial, susceptibilidade às infecções e processo inflamatório crônico, com envolvimento direto dos neutrófilos nesses mecanismos. Os neutrófilos de pacientes com AF exibem estruturas mais rígidas e indeformáveis e alterações na expressão de moléculas de adesão e produção de citocinas e outros mediadores que podem induzir ou agravar as manifestações clínicas da doença. A hidroxiuréia (HU) constitui o avanço mais importante no tratamento da AF, sendo o único medicamento que, efetivamente, tem forte impacto na melhora da qualidade de vida dos pacientes, reduzindo o número de CVO, hospitalizações e óbitos. No entanto, pouco se sabe sobre os efeitos deste medicamento sobre os neutrófilos e na funcionalidade dessas células. O estudo teve como objetivo principal investigar a citotoxicidade, inflamação e estresse oxidativo em neutrófilos de pacientes com AF, bem como o efeito do tratamento com HU sobre esses parâmetros em pacientes atendidos pelos serviços ambulatoriais de hematologia de um hospital universitário e de um hemocentro, ambos de referência em Fortaleza-Ceará. A amostra foi constituída por 101 pacientes adultos, de ambos os sexos, diagnosticados por estudo molecular, sendo divididos em dois grupos: Grupo SS– formado por 47 pacientes com AF, e, Grupo SSHU– formado por 54 pacientes em tratamento com HU. Um grupo controle, Grupo AA, foi formado por 50 indivíduos saudáveis, doadores voluntários de sangue, com idade e sexo pareados. Os neutrófilos foram isolados do sangue total por diferença de gradiente e utilizados para mensuração dos testes. Nos ensaios de toxicidade, observou-se que a HU não exerceu efeito citotóxico nos neutrófilos dos pacientes, entretanto, foi evidenciado uma ação citoprotetora sobre os mesmos quando comparados aos pacientes SS e grupo AA, com uma redução significativa (p<0,001) na atividade de lactato desidrogenase (LDH) e aumento no percentual de células viáveis pelo teste de exclusão por Azul de Tripan e ensaio do metil tiazol tetrazólio (MTT) (p<0,001). Analisando o envolvimento dos neutrófilos nos processos de inflamação e estresse oxidativo na AF, constatou-se uma significativa elevação nos níveis de citocinas e marcadores pró-inflamatórios (TNF-α, MPO) e uma redução da interleucina anti-inflamatória IL-10 no grupo SS, bem como uma diminuição significante da atividade das enzimas antioxidantes (SOD e GSH-Px). Os pacientes em terapia com HU apresentaram níveis semelhantes aos encontrados no grupo AA. Danos oxidativos foram analisados pela mensuração do malonaldeído (MDA), evidenciando diferença estatística entre todos os grupos do estudo (p<0,001), porém, com valor de média superior no grupo SS. O presente estudo ratificou o papel preponderante dos neutrófilos na resposta inflamatória promovida pela AF, e mostrou de maneira inédita, com pacientes do Nordeste-BR, que o tratamento com HU não reduziu a viabilidade de neutrófilos, e modulou seus mecanismos pró-inflamatórios e pró-oxidantes a níveis comparáveis aos de indivíduos sadios.

WANDERLEY, Carlos Wagner de Souza. Veneno da serpente Bothrops jararacussu induz uma resposta inflamatória local dependente de protanóides e da migração de neutrófilos. 2014. 93 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-08-27T13:12:18Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_cwswanderley.pdf: 1416460 bytes, checksum: 8eb00a82635e311b2d474e81e1c9e47e (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-08-27T13:30:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_cwswanderley.pdf: 1416460 bytes, checksum: 8eb00a82635e311b2d474e81e1c9e47e (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-27T13:30:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_cwswanderley.pdf: 1416460 bytes, checksum: 8eb00a82635e311b2d474e81e1c9e47e (MD5) Previous issue date: 2014 / Local tissue reactions provoked by Bothrops venoms are characterized by edema, hemorrhage, pain, and inflammation; however, the mechanisms of tissue damage vary depending upon the species of snake. This mechanistic variability reduces the efficacy of antivenom treatment. Considering the diversity of intraspecific pathophysiological responses, we investigated the mechanisms and mediators involved in the local inflammatory response induced by the Bothrops jararacussu venom (VBjsu). Female Swiss mice were injected with either saline or VBjsu (0.125-8 µg/paw). In a subset of VBjsu-treated mice, loratadine (an H1 receptor antagonist), compound 48/80 (for mast cell depletion), capsaicin (for C-fiber desensitization), infliximab (an anti-TNF-α antibody), indomethacin (a non-specific COX inhibitor), celecoxib (a selective COX-2 inhibitor) or fucoidan (a P- and L-selectins modulator) were administered before VBjsu treatment. Paw edema was measured by plethysmography. In addition, paw tissues were collected for the measurement of myeloperoxidase (MPO) activity, TNF-α and IL-1 levels, and COX-2 immunoexpression. The direct chemotactic effect of VBjsu was also studied using a Boyden chamber assay, and the in vitro calcium dynamic in neutrophils was investigated using confocal microscopy. VBjsu caused concentration- and time-dependent edematogenic responses and increased the local production of TNF-α and IL-1β as well as COX-2 expression vs. saline group (P<0.05). Both edema and neutrophil migration were prevented by pretreatment with cyclooxygenase inhibitors (indomethacin or celecoxib) or by the P- and L-selectins modulator, fucoidan vs. VBjsu (P<0.05). Furthermore, VBjsu induced a direct in vitro neutrophil chemotaxis by increasing intracellular calcium vs. RPMI (P<0.05). Therefore, VBjsu induces an early onset edema dependent upon prostanoid production and neutrophil migration. / Os efeitos locais provocados por venenos botrópicos são caracterizados por edema, hemorragia e dor local. No entanto, os mecanismos fisiopatológicos relacionados a esses venenos podem variar de acordo com a espécie. Esta característica espécie-específica pode prejudicar a eficácia da soroterapia. Desta forma, considerando a diversidade da resposta fisiopatológica dos venenos, investigamos os mecanismos e mediadores envolvidos na resposta inflamatória local induzida pelo veneno da Bothrops jararacussu (VBjsu). Camundongos Swiss fêmeas foram submetidos à injeção intraplantar de solução salina ou VBjsu (0,125-8 µg/pata). Para o estudo dos mecanismos e mediadores envolvidos, diferentes sub-grupos de animais foram submetidas ao pré-tratamento com loratadina (um antagonista do receptor H1), composto 48/80 (para induzir a depleção dos mastócitos), capsaicina (para promover a dessensibilização das fibras C), infliximabe (um anticorpo anti-TNF-α), indometacina (um inibidor não-específico da COX), celecoxibe (um inibidor seletivo da COX-2) ou fucoidina (um modulador de P- e L-selectinas) administrados antes do VBjsu. O edema da pata foi medido por pletismografia. Além disso, os tecidos da pata foram recolhidos para determinação da atividade da mieloperoxidase (MPO), dosagem dos níveis de TNF-α, IL-1 e da imunoexpressão da COX-2. O efeito quimiotático direto do VBjsu também foi estudado por meio do ensaio da câmara de Boyden, e o estado de ativação dos neutrófilos humanos foi avaliado através da dinâmica intracelular de cálcio em neutrófilos realizado in vitro com auxilio da microscopia confocal. O VBjsu causou uma resposta edematogênica concentração e tempo dependentes com aumento da produção local de TNF-α, IL-1β e da imunoexpressão da COX-2 nos tecidos quando comparado ao grupo salina (P<0,05). Ambos, edema e migração de neutrófilos foram impedidos pelos inibidores da COX (indometacina ou celecoxibe), ou pelo modulador de P - e L-selectinas (fucoidina) vs. VBjsu (P<0,05). O exame histopatológico revelou que o VBjsu induz uma precoce migração de neutrófilos para o local da lesão vs. o grupo salina (P<0,05). Além disso, o VBjsu induz a quimiotaxia e ativa neutrófilos in vitro aumentando diretamente a dinâmica de cálcio intracelular quando comparado ao RPMI (P<0,05). Portanto, o VBjsu induz uma resposta edematogênica precoce dependente da produção de prostanoides e da migração de neutrófilos.

LUZ, Patrícia Bastos. Fração proteica isolada do látex de Calotropis procera (AIT.) R.Br reduz hipernocicepção inflamatória mecânica em camundongos : mecanismos e mediadores envolvidos. 2012. 87 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-07-25T13:55:10Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_pbluz.pdf: 803076 bytes, checksum: 095ce0bb59da741a7baabdc3b28fc2ea (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-08-06T11:54:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_pbluz.pdf: 803076 bytes, checksum: 095ce0bb59da741a7baabdc3b28fc2ea (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T11:54:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_pbluz.pdf: 803076 bytes, checksum: 095ce0bb59da741a7baabdc3b28fc2ea (MD5) Previous issue date: 2012 / Calotropis procera é uma planta laticífera encontrada na Ásia, África e América do Sul. Este vegetal tem sido bastante utilizado na medicina tradicional para diversas patologias. Seu látex é rico em proteínas que apresentam relevantes atividades farmacológicas. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade das proteínas do látex de Calotropis procera (LP) em modelos de dor aguda induzida por carragenina (Cg), por prostaglandina E2 (PGE2), epinefrina e dor persistente induzida por adjuvante completo de Freud (CFA) pelo método Von Frey eletrônico. Foram utilizados camundongos Swiss (n=5-8, 25-30g). Na hipernocicepção mecânica (HM), os animais foram pré-tratados com LP (0,5; 5 e 50 mg/Kg e.v.), 30 min antes da aplicação de Cg (300μg/pata) e avaliados 1, 3 e 5h após Cg. Após 3 h da injeção de Cg, tecido subplantar foi coletado para quantificação do envolvimento de neutrófilos (MPO), citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-1β), PGE2 e KC. Na HM induzida por PGE2 (100ng/pata), os animais receberam LP (5 e 50 mg/Kg e.v.) e avaliados 3h após PGE2. Para avaliar a participação de NO e canais de K+ATP os animais foram pré-tratados com L-NAME (30 mg/kg i.p.) ou Glibenclamida (5 mg/kg i.p.). Na HM induzida por epinefrina (100ng/pata) os animais receberam LP (5 mg/Kg e.v.) e avaliados 2h após a injeção de epinefrina. Em modelo de dor persistente induzida por CFA foram avaliados HM e edema de pata durante 7 dias. Animais foram tratados com salina (controle, e.v.); LP (5mg/kg, e.v.), dexametasona (2mg/kg, s.c.) diariamente e, enquanto que o CFA (20 μL/pata, i.pl) foi injetado apenas no primeiro dia. No 8º dia a atividade motora dos animais foi avaliada através do teste rota rod (4RPM/min) e após este procedimento o tecido subplantar foi coletado para quantificação de MPO. LP (5 mg/kg) reduziu (p<0,05) a HM em 25%, 55% e 46% e LP 50 mg/kg em 39%, 64% e 60% na 1ª, 3ª e 5ª hora, respectivamente, quando comparadas ao grupo Cg. As doses 5 e 50mg/kg de LP diminuíram a concentração de MPO em 80% e 94%, respectivamente, quando comparadas ao grupo Cg. A dose 5mg/kg de LP reduziu a concentração de TNF-α, IL-1β, PGE2 e KC em 71%, 81%, 72% e 72% respectivamente, quando comparada ao grupo Cg. Em modelo de HM induzida por PGE2, as doses de 5 e 50mg/kg de LP reduziram (p<0,05) a HM em 40% e 42%, respectivamente, quando comparadas ao grupo PGE2. Este efeito antinociceptivo do LP foi revertido com L-NAME (inibidor inespecífico da NO sintase) e glibenclamida (bloqueador dos canais de K+ATP). A HM induzida por epinefrina foi reduzida pela LP. Na dor persistente, LP também reduziu HM e edema de pata em 42% e 59%, respectivamente, quando comparado ao grupo CFA. Nenhum grupo apresentou comprometimento do sistema motor. LP reduziu (p<0,05) MPO em 45% comparado ao grupo CFA. A partir destes dados podemos sugerir que o efeito antinociceptivo do LP estar intimamente relacionado com a diminuição de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-1β), PGE2, KC e da migração de neutrófilos, além do envolvimento de NO, canais de K+ATP sensíveis a glibenclamida.

Made available in DSpace on 2016-03-28T12:39:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 luana_correa_ioc_mest_2015.pdf: 2768105 bytes, checksum: b1e9a130c709b0d2bade1edd2959792a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O galato de metila (GM) é um derivado de ácidos fenólicos encontrado em várias espécies de plantas, que apresenta efeitos biológicos dos quais se destacam sua ação antioxidante, antitumoral e antimicrobiana. Evidências indiretas sugerem um possível efeito antiinflamatório do GM, dentre eles a redução da produção de interleucina (IL)-6 e óxido nítrico (NO) ao inibir a fosforilação de ERK1/2 em macrófagos estimuladas por LPS. No entanto, não há relatos na literatura demostrando o efeito anti-inflamatório do GM em modelos in vivo. A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune, inflamatória e sistêmica no qual fatores genéticos e ambientais contribuem para o seu desenvolvimento. A inflamação e o dano articular são mediados pelo influxo de leucócitos para o espaço sinovial, como neutrófilos e macrófagos. Essas células são responsáveis pela produção de mediadores inflamatórios tais como citocinas, quimiocinas e mediadores lipídicos que contribuem para a formação de um tecido invasivo denominado de pannus. Diferentes modelos experimentais são utilizados para o estudo da fisiopatologia da AR, incluindo a artrite induzida por zimosan que apresenta similaridades com a doença humana. Nas últimas décadas, a AR tem sido tratada com anti-inflamatórios não esteroidais, glicocorticoides e os fármacos antirreumáticos modificadores da doença. Recentemente, agentes biológicos (anticorpos ou receptores solúveis) foram incorporados a terapia. Apesar da eficácia clínica desses medicamentos, muitos pacientes não têm uma resposta significativa ou interrompem o tratamento devido a efeitos adversos Além disso, a disponibilidade limitada de produtos biológicos eficazes em países em desenvolvimento, a necessidade de administração parentérica, e o custo relativamente elevado destes produtos, restringem o acesso a essas terapias em muitos pacientes com AR e isso promove uma busca contínua para a identificação de novos alvos terapêuticos e desenvolvimento de novos medicamentos. Produtos derivados de plantas com ação anti-inflamatória têm um potencial na luta contra a artrite. Estes incluem os flavonóides, terpenos, quinonas, catequinas, alcaloides e derivados de ácidos fenólicos. No presente trabalho, demonstramos que o GM possui efeito anti-inflamatório nos modelos de edema de pata, pleurisia e artrite induzidos por zimosan. O GM foi capaz de inibir diferentes parâmetros da artrite experimental tais como: a formação de edema articular, a migração de leucócitos para a articulação inflamada e a produção de mediadores inflamatórios tanto proteicos quanto lipídicos em dois períodos do processo inflamatório, 6 e 24 horas. Além disso, o GM foi capaz de inibir diretamente a migração e adesão dos neutrófilos e também alterou a polimerização de filamentos de actina necessários para mobilização celular. Por fim, o GM foi capaz de inibir a ativação de macrófagos induzida por zimosan e IFN-\03B3 através da redução da produção da citocina IL-6, NO, expressão das enzimas COX-2 e iNOS, além de diminuir o influxo de cálcio dos compartimentos intracelulares para o citosol da célula. Tomados em conjunto, os resultados demonstraram um efeito anti-inflamatório do GM em modelos de inflamação induzido pelo zimosan, principalmente na artrite experimental inibindo o acúmulo de neutrófilos e a ativação de macrófagos / Methyl Gallate (MG) is a phenolic acids derivative found in several plant species, which has biological effects with the following highlights antioxidant, antimicrobial and antitumor actions. Indirect evidences suggest a possible anti - inflammatory effect o f MG , among them the reduction in the interleukin (IL) - 6 and nitric oxide (NO) production by inhibiting the ERK1/2 phosphorylation in LPS - stimulated macrophages. However, there are no reports in the literature demonstrating the anti - inflammatory effect of M G in in vivo models. Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune, inflammatory and systemic disease, wherein genetic and environmental factors contribute to their development. Inflammation and joint damage are mediated by the leukocytes influx into the syn ovial space, such as neutrophils and macrophages. These cells are responsible for inflamm atory mediators production such as cytokines, chemokines, and lipid mediators that contribute to the formation of an invasive tissue called pannus. Different experimen tal models are used to study the RA pathophysiology, including zymosan - induced arthritis which presents similarities to the human disease. In recent decades, RA has been treated with nonsteroidal anti - inflammatory drugs, glucocorticoids and the disease - mod ifying antirheumatic drugs. Recently, biological agents (antibodies or soluble receptors) were added to the therapy. Despite the clinical efficacy of these drugs, many patients do not have a significant response or interrupt the treatment due to adverse ef fects. In addition, the limited availability of effective biological products in developing countries, the need of parenteral administration, and the relatively high cost of these products, restrict access to these therapies in many patients with RA and th at promotes a continuous search for identification of new therapeutic targets and development of new medicines. Products derived from plants with anti - inflammatory action have a potential in combating arthritis. These include flavonoids, terpenes, quinones , catechins, alkaloids and derivatives of phenolic acids. In this study, we demonstrate that MG has anti - inflammatory effects on paw edema, pleurisy and arthritis models induced by zymosan. M G was able to inhibit different parameters of the experimental ar thritis such as edema formation, leukocyte migration into the inflamed joint, and inflammatory mediators production protein and lipid mediators in two periods of the inflammatory process, 6 and 24 hours. Moreover, the MG was able to directly inhibit the ne utrophil migration and adhesion and has also changed the actin filaments polymerization required for cell mobilization. Finally, the MG was able to inhibit macrophage activation induced by zymosan and IFN - γ by reducing the cytokine IL - 6 and NO production , COX - 2 and iNOS expression , in addition to reduce the calcium influx of intracellular compartments into the cytosol of the cell. Taken together, the results demonstrated an anti - inflammatory effect of MG in zymosan - induced inflammation models, especially in the experimental arthritis by inhibiting the neutrophils accumulation and macrophage activation

RABELO, Alana Fonteles Lima. Caracterização in vivo e in vitro da resposta inflamatória aguda induzida por uma fração proteica isolada do látex de Calotropis procera (Ait.) R. Br. 2014. 117 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-12-15T11:46:29Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_aflrabelo.pdf: 1019084 bytes, checksum: 67992b254190eddc21a2c38443f21e3a (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-12-15T11:46:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_aflrabelo.pdf: 1019084 bytes, checksum: 67992b254190eddc21a2c38443f21e3a (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-15T11:46:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_aflrabelo.pdf: 1019084 bytes, checksum: 67992b254190eddc21a2c38443f21e3a (MD5) Previous issue date: 2014 / Calotropis procera is a laticiferous plant belonging to the family Apocynaceae, found in Asia, Africa and South America. Its latex is comprised of a large number of bioactive molecules that show significant pharmacological properties including anti- and pro- inflammatory, antitumor, healing, antimicrobial, among others. The proteins extracted from this latex have multiple immunomodulatory effects, depending on the route of administration utilized. The objective of this study was to characterize the pro- inflammatory response of protein fraction PL latex Calotropis procera in models of peritonitis and subcutaneous air pouch; neutrophil chemotaxis (in vivo and in vitro); the role of resident cells and mediators involved. Swiss mice were used (25-30 g). It was found that PL induced neutrophil migration (MN) in a dose- and time - dependent in models of peritonitis and subcutaneous air pouch. An increase in vascular permeability induced by the administration of PL (1 mg / cav) in the peritoneal cavity in the Evans blue model was demonstrated. The increase in the population of resident macrophages after pre-treatment with thioglycolate intensified the MN induced by PL, with the similar result observed with the mast cell -depleted group by compound 48/80. Mast cells appear to exert an inhibitory modulatory role on neutrophil chemotaxis, whereas macrophages potentiate the MN, possibly through the release of mediators. For investigation of involved mediators, blocking drugs were used before administration of the PL. Pharmacological modulation Dexamethasone (0.5 mg/kg , s.c.), Pentoxifylline (100 mg/kg , s.c.), Thalidomide (50 mg/kg , s.c.), Indomethacin (3 mg/kg , s.c.) and Celecoxib (30 mg/kg , s.c.), but not with Meclizine (40 mg/kg , s.c.) and PCA (10 mg/kg, s.c.) inhibited the MN induced by PL. It was verified by ELISA, that levels of mediators IL-1 and IL-6 were elevated in the peritoneal fluid 4 hours after administration of PL (1 mg/cav, i.p.). The nitrite levels were also higher in the subcutaneous air pouch fluid, demonstrating the involvement of nitric oxide (NO) in the pro-inflammatory effects of LP. PL induced rolling and adhesion of leukocytes to the vascular endothelium of mesenteric mice and neutrophil chemotaxis in vitro. Furthermore, it can directly interact with neutrophils by inducing the synthesis of pro-inflammatory mediators TNF-α, IL- 1β, PGE2 and NO in neutrophil’s culture. In conclusion, PL induces an acute inflammatory response characterized by intense neutrophil migration and increase of vascular permeability. Promotes neutrophil chemotaxis indirectly, via resident macrophages and directly interacting with neutrophils, inducing rolling and adhesion to the endothelium and release of pro-inflammatory mediators. / Calotropis procera é uma planta laticífera pertencente à família Apocynaceae, encontrada na Ásia, África e América do Sul. Seu látex é constituído por um grande número de moléculas bioativas que apresentam relevantes propriedades farmacológicas que inclui anti- e pró-inflamatória, antitumoral, cicatrizante, antimicrobiana, entre outras. As proteínas extraídas deste látex possuem múltiplos efeitos imunomodulatórios, dependendo da via de administração utilizada. Assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a resposta pró-inflamatória da fração proteica (PL) do látex de Calotropis procera nos modelos de peritonite e bolsa de ar subcutânea; investigando a quimiotaxia de neutrófilos (in vivo e in vitro); o papel das células residentes e os mediadores envolvidos. Foram utilizados camundongos Swiss (25-30 g). Verificou-se que PL induziu migração de neutrófilos (MN) de forma dose-e-tempo dependente nos modelos de peritonite e bolsa de ar subcutânea. Foi demonstrado um aumento na permeabilidade vascular induzido pela administração da PL (1 mg/cav) na cavidade peritoneal no modelo de Azul de Evans. O aumento na população de macrófagos residentes pelo pré-tratamento com tioglicolato, intensificou a MN induzida por PL, sendo observado um resultado semelhante com o grupo depletado de mastócitos pelo composto 48/80. Os mastócitos parecem exercer um papel modulador inibitório sobre a quimiotaxia de neutrófilos, enquanto os macrófagos potencializam a MN, possivelmente por meio da liberação de mediadores. Para investigação dos mediadores envolvidos foram utilizados fármacos bloqueadores específicos antes da administração da PL. A modulação farmacológica com Dexametasona (0,5 mg/kg, s.c.), Pentoxifilina (100 mg/kg, s.c.), Talidomida (50 mg/kg, s.c.), Indometacina (3 mg/kg, s.c.) e Celecoxib (30 mg/kg, s.c.), mas não com Meclizina (40 mg/kg, s.c.) e PCA (10 mg/kg; s.c.), inibiram a MN induzida por PL. Foi verificado por ELISA que os níveis dos mediadores IL-1 e IL-6 estavam aumentados no fluido peritoneal 4 h após a administração de PL (1 mg/cav, i.p.). Os níveis de nitrito também estavam aumentados no fluido da bolsa de ar subcutânea, demonstrando um envolvimento do óxido nítrico (NO) no efeito pró-inflamatório da PL. A PL induziu rolamento e adesão de leucócitos ao endotélio vascular do mesentério de camundongos, bem como quimiotaxia de neutrófilos in vitro. Além disso, foi capaz de interagir diretamente com neutrófilos, induzindo a síntese dos mediadores pró-inflamatórios TNF-α, IL-1β, PGE2 e NO em cultura de neutrófilos. Em conclusão, PL induz uma resposta inflamatória aguda, caracterizada pela intensa migração de neutrófilos e aumento da permeabilidade vascular. Promove quimiotaxia para neutrófilos de forma indireta, via macrófagos residentes, e de forma direta, interagindo com neutrófilos, induzindo rolamento e adesão no endotélio e liberação de mediadores pró-inflamatórios.

CARMO, Luana David do. Proteínas isoladas do látex de Himatanthus drasticus (MART.) Plumel apocynaceae reduzem a resposta inflamatória e nociceptiva na artrite induzida por zymosan em camundongos. 2015. 91 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-04-10T14:14:08Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_ldcarmo.pdf: 1347108 bytes, checksum: 71a70f834b3099fffa263f0419790148 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-04-10T14:21:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_ldcarmo.pdf: 1347108 bytes, checksum: 71a70f834b3099fffa263f0419790148 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-10T14:21:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_ldcarmo.pdf: 1347108 bytes, checksum: 71a70f834b3099fffa263f0419790148 (MD5) Previous issue date: 2015 / Himatanthus drasticus is a laticiferous plant of the family Apocynaceae found in South America and popularly known as janaguba. Your latex is known as "janaguba milk" and has several pharmacological activities. This work aimed to study the effect of isolated proteins from Himatanthus drasticus latex (HdLP) zymosan (Zy) induced arthritis. Arthritis was induced in male Swiss mice (n = 6) by administering 0.1 mg Zy intra-articular. The animals were treated with HdLP (5 and 50 mg/kg i.v.) or Saline i.v. 1 hour after the Zy and HdLP (50 mg/kg v.o.) or Dexamethasone (2 mg/kg s.c.) 1 hour before Zy. After six hours of induction the animals were euthanized, the joint washing carried, and collected for leukocyte count, determination of the myeloperoxidase (MPO) activity and inflammatory mediators (NO, TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-10). The edema was evaluated by measuring the diameter articular and the vascular permeabilitym through extravasation. In addition, we evaluated the effect of HdLP on synovial inflammation as well the mechanical hypernociception. For statistical analysis we used the ANOVA/Bonferroni or Kruskal Wallis/Dunns; p <0.05 considered significant. This study was approved by the Ethics Committee on Animal Research of the UFC - CEPA (38/14). HdLP (50 mg/kg i.v.) a significant decrease on the leukocyte count in MPO activity and levels (NO, IL-1β, and IL-6). It was also observed a decrease in swelling and damage to the synovial membrane. The nociceptive threshold was increased by HdLP 50 mg/kg i.v. and 50 mg/kg v.o. HdLP has antinociceptive and anti-inflammatory activity in the model of arthritis induced by Zy. The effect seems to be related to the decreased migration of neutrophils and the release of inflammatory mediators, reducing damage to the synovial membrane and hypernociception. / Himatanthus drasticus é uma planta laticífera pertencente à família Apocynaceae encontrada na América do Sul e conhecida popularmente como janaguba. Seu látex é conhecido como “leite de janaguba” e apresenta várias atividades farmacológicas. O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito das proteínas isoladas do látex de Himatanthus drasticus (HdLP) em modelo de artrite experimental induzida por zymosan (Zy). A artrite foi induzida em camundongos machos swiss (n=6) através da administração de 0,1 mg Zy i.a. Os animais foram tratados com HdLP (5 e 50 mg/kg i.v.) ou Salina i.v. 1 hora após o Zy e com HdLP (50 mg/kg v.o.) ou Dexametasona (2 mg/kg s.c.) 1 hora antes do Zy. Seis horas após a indução os animais foram eutanasiados, foi realizada a lavagem da articulação e o lavado articular coletado para avaliação do efeito de HdLP sobre a migração de leucócitos, atividade da mieloperoxidase (MPO) e liberação de mediadores inflamatórios (NO, TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-10). O edema foi avaliado pela medição do diâmetro transversal da articulação e pela avaliação da permeabilidade vascular. Além disso, foi avaliado o efeito de HdLP sobre processo inflamatório na membrana sinovial e sobre a hipernocicepção mecânica utilizando uma versão eletrônica (VonFrey). Para as análises estatísticas foi utilizado o teste ANOVA/Bonferroni ou Kruskal Wallis/Dunns; p <0,05 foi considerado significante. Este estudo foi aprovado pela Comissão de ética em Pesquisas com Animais da UFC - CEPA (38/14). HdLP 50 mg/kg i.v. apresentou uma diminuição significativa na contagem de leucócitos, nos níveis de MPO e na liberação de medidores inflamatórios (NO, IL-1β, e IL-6). Também foi observado uma diminuição do edema e no dano à membrana sinovial. Na hipernocicepção mecânica os grupos (HdLP 50 mg/kg i.v. e 50 mg/kg v.o.) apresentaram um aumento no limiar nociceptivo. HdLP apresenta atividade antinociceptiva e anti-inflamatória no modelo de artrite induzida por Zy. O efeito parece estar relacionado com a diminuição da migração de neutrófilos e da liberação de mediadores inflamatórios, reduzindo o dano na membrana sinovial e a hipernocicepção.

SIMÃO, Antônio Felipe Leite. Efeito inibitório do pré-condicionamento isquêmico a distância sobre a migração de neutrófilos: mecanismos e mediadores. 2010. 140 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-06T16:30:27Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_aflsimão.pdf: 1240434 bytes, checksum: eb336efc4efecb613952674e3f5ecb50 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-07T11:38:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_aflsimão.pdf: 1240434 bytes, checksum: eb336efc4efecb613952674e3f5ecb50 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-07T11:38:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_aflsimão.pdf: 1240434 bytes, checksum: eb336efc4efecb613952674e3f5ecb50 (MD5) Previous issue date: 2010 / Ischemic preconditioning (IPC) has been considered as a potent endogenous mechanism capable of inhibiting the inflammatory response. The migration of neutrophils (mn) is a central event in the development of inflammation. Our group has demonstrated that PCI inhibits mn in experimental models, however the mechanisms and mediators involved are not yet known. Aim: To study the involvement of mediators nitric oxide and carbon monoxide, adhesion proteins (ICAM-1 and β2-integrin) and expression of CXCR2 in the inhibitory effect of PCI on the distance min. Methods: The model of distance PCI was performed with a tourniquet in the right hind limb of mice for 10 minutes followed by 30 reperfusion. Involvement of NO and CO was investigated using inhibitors of iNOS (1400 W, 3 mg/kg or aminoguanidine (Amg), 50 mg/kg) and HO-1 (ZnPPIX, 10 mg/kg) as pretreatment 30 min. Later, peritonitis was induced by carrageenan (Cg) (500 mg/cav). Four hours later the peritoneal cavity (pc) was washed and leukocytes were counted. After that same procedure, the animals were subjected to intravital microscopy (IVM) to evaluate the effects of NO and CO in the mesenteric venules of 3rd order. Neutrophils from animals preconditioned and pre-treated or untreated, were used for testing chemotaxis in vitro, using the stimulus to chemokine KC (30ng/ml). The expression of GRK2 and CXCR2 in neutrophils was determined by flow cytometry and immunohistochemistry, respectively. The stakes and ICAM-1/CD54 β2-integrina/CD11b been investigated in knockout mice for genes of these molecules. The mn in these animals was evaluated according to protocol previously described by washed peritonela. In the investigation of the role of NO and CO in the modulation of cell adhesion protein (β2-integrin), we used iNOS inhibitor (1400W, 3 mg/kg or Amg, 50 mg/kg, sc), HO-1 (ZnPPIX, 10 mg/kg, sc) and guanylate cyclase (ODQ (5 µmol/kg, ip)) in pre-treatment 30 min before PCI. After peritonitis, blood was collected and the expression of CD11b on neutrophils was determined by flow cytometry. For statistical analysis, we used ANOVA/Bonferroni. P<0,05 was accepted. Results: The CO and NO inhibitors prevented the inhibitory effect of PCI on mn (P<0,05). Moreover, neutrophils from animals preconditioned showed reduced chemotaxis (p<0,05), a finding that correlated with decreased expression of CXCR2 in the membrane of neutrophils (p<0,05) and increased expression of GRK2. There was no change in chemotaxis or the expression of GRK2 when neutrophils were obtained from animals pre-conditioned and pretreated with inhibitors of CO, NO and sGC. Preconditioned animals showed a reduction in circulating neutrophils and the grip on IVM, which were prevented by pretreatment with inhibitors (P<0,05). The inhibitory effect of PCI was shown in knockout animals for β2-integrin, which was not observed in the knockout animals to ICAM-1. Moreover, neutrophils from animals preconditioned showed a significant reduction in the expression of CD11b, which was prevented in animals pretreated with inhibitors of iNOS, HO-1 and GCs. Conclusions: The results suggest that NO and CO act in the inhibitory effect of PCI via iNOS and HO-1 in place apart by modulating ICAM-1, β2-integrin and CXCR2 via GRK2. / O pré-condicionamento isquêmico (PCI) vem sendo considerado como um potente mecanismo endógeno capaz de inibir a resposta inflamatória. A migração de neutrófilos (mn) é um evento central no desenvolvimento da reação inflamatória. Nosso grupo tem demonstrado que o PCI inibe a mn em modelos experimentais, entretanto os mecanismos e mediadores envolvidos ainda não são conhecidos.Objetivo:Estudar a participação dos mediadores Óxido nítrico e Monóxido de carbono, proteínas de adesão (ICAM-1 e β2-integrina) e da expressão de CXCR2 no efeito inibitório do PCI a distância sobre a mn. Métodos:O modelo de PCI a distância foi realizado com um torniquete no membro posterior direito de camundongos durante 10 minutos seguidos de 30 de reperfusão. Participação do NO e CO foi investigada através de inibidores de iNOS (1400 W, 3 mg/kg ou Aminoguanidina (Amg), 50 mg/kg) e HO-1 (ZnPPIX, 10 mg/kg) como pré-tratamento de 30 min. Posteriormente, induziu-se peritonite comCarragenina(Cg) (500 mg /cav). Quatro horas após, a cavidade peritoneal (cp) era lavada e leucócitos eram contados. Após aquele mesmo procedimento, os animais foram submetidos a microscopia intravital (miv) para avaliar os efeitos do NO e CO nas vênulas mesentéricas de 3ª ordem.Neutrófilos de animais pré-condicionados e pré-tratados ou não, foram utilizados para o ensaio de quimiotaxiain vitro, usandocomo estímulo a quimiocina KC(30ng/ml). Aexpressão de CXCR2 e GRK2 dos neutrófilos foi determinada por citometria de fluxo e imunofluorescência, respectivamente.Asparticipações de ICAM-1/CD54 e β2-integrina/CD11b foram investigadas em camundongos nocautes para os genes dessas moléculas. A mn nesses animais foi avaliada segundo protocolo já descrito pelo lavado peritonela.Na investigação do papel do NO e CO na modulação da proteína de adesão celular (β2-integrina), utilizou-se inibidores da iNOS (1400W, 3 mg/kg ou Amg, 50 mg/kg, sc), HO-1 (ZnPPIX, 10 mg/kg, sc) eGuanilato Ciclase (ODQ (5 µmol/kg, ip)) em pré-tratamento de 30 min antes do PCI. Após peritonite, o sangue foi colhido e a expressão de CD11bem neutrófilos foi determinada por citometria de fluxo. Para análise estatística, utilizou-se ANOVA/Bonferroni. P<0,05 foi aceito. Resultados:Os inibidores de CO e NO preveniram o efeito inibitório do PCIsobre a mn (p <0,05). Além disso, os neutrófilos de animais pré-condicionados apresentaram redução de quimiotaxia (p <0,05),achado que se correlacionou com a diminuição da expressãode CXCR2 na membrana dos neutrófilos (p <0,05) e comaumento da expressão de GRK2. Não houve alteração da quimiotaxia, nem da expressão de GRK2 quando os neutrófilos foram obtidos a partir de animais pré-condicionados e pré-tratados com inibidores de de CO, NO e GCs. Os animais pré-condicionados apresentaram redução nos neutrófilos circulantes e da aderênciana miv, as quais foram prevenidas pelo pré-tratamento com os inibidores (p <0,05). O efeito inibitório do PCI persistiu em animais nocautes para β2-integrina, o que não se observou nos animais nocautes para ICAM-1. Além disso, os neutrófilos de animais pré-condicionados apresentaram redução significativa na expressão de CD11b, que foi prevenida nos animais pré-tratados com os inibidores de iNOS, HO-1 e GCs.Conclusões: Os resultados sugerem que o NO e CO atuam no efeito inibitório do PCI via iNOS e HO-1 em sitio distante, modulando ICAM-1, β2-integrina e CXCR2 via GRK2.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-04-13T21:19:06Z No. of bitstreams: 1 2017_RobertoVieiraResende.pdf: 3460980 bytes, checksum: ee92906dcea8b64da90b6b60babe2513 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-05-09T12:19:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_RobertoVieiraResende.pdf: 3460980 bytes, checksum: ee92906dcea8b64da90b6b60babe2513 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-09T12:19:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_RobertoVieiraResende.pdf: 3460980 bytes, checksum: ee92906dcea8b64da90b6b60babe2513 (MD5) Previous issue date: 2018-05-09 / Os glóbulos brancos neutrófilos são as primeiras células de defesa a chegar a qualquer local lesionado, seja lesão por processo biológico, seja por trauma acidental ou cirúrgico. No caso de implantes osteointegráveis, os neutrófilos interagem com a superfície dos implantes desencadeando uma série de sinalização. O titânio é reconhecidamente o material de implante mais bem estudado com altos índices de sucesso. Recentemente, a zircônia está tendendo a substituir o titânio, em diversas partes do corpo humano, como material de implante. Foram separados neutrófilos do sangue periférico de 8 doadores, jovens, sadios, do sexo masculino. Esses neutrófilos foram colocados sobre superfícies de titânio, zircônia comum, zircônia sinterizada e polietileno (controle), e incubados por 1 hora, para permitir a ativação. Depois, as amostras foram centrifugadas para testar a adesão dos neutrófilos e descartar aqueles fracamente aderidos. Tanto as amostras quanto o precipitado foram preparadas para microscopia eletrônica de varredura, teste de produção de espécies reativas de oxigênio (NBT lâmina e colorimétrico). Os exames de microscopia mostraram neutrófilos altamente ativados e aderidos às superfícies de titânio, zircônia e zircônia sinterizada. Quanto à produção de EROs, o titânio causou maior produção que a zircônia comum que, por sua vez causou maior produção que a zircônia sinterizada. Pode-se concluir que superfícies de titânio, zircônia e zircônia sinterizada promovem ativação de neutrófilos, que se aderem fortemente a suas superfícies, e produzem espécies reativas de oxigênio. Há necessidades de mais pesquisas para desvendar os mecanismos e mediadores dessa adesão. / Neutrophil white blood cells are the first imune cells to reach any injured part of the human body, when wounded by biological causes, accidental or surgical trauma. In relation to osteointegrated implants, the neutrophils interact with the surface of the implants triggering a series of signaling. Titanium is recognized as the best studied implant material with high success rates. Recently, zirconia was proposed as a substitute to titanium as implant material in different parts of the human body. In our experimental design, neutrophils were separated from the blood of 8 healthy young, male donors. These neutrophils were placed on surfaces of titanium, common zirconia, sintered zirconia and polyethylene (control), and incubated for 1 hour to allow activation. The samples were then centrifuged to test for adhesion of neutrophils and to separate the weakly adhered cells. Both the samples and the precipitate were prepared for scanning electron microscopy, and reactive oxygen species production test (colorimetric and slide NBT). Microscopy studies showed highly activated neutrophils adhering to the surfaces of titanium, zirconia and sintered zirconia. The tests for detection of ROS showed that titanium produced higher level than ordinary zirconia, which showed higher production than sintered zirconia. Conclusions were that titanium, zirconia and sintered zirconia surfaces promote activation of neutrophils, which adhere strongly to their surfaces, and produce Reactive Oxygen Species. There is a need for deep researches to find out the mechanisms and mediators of these adhesion and signaling.