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Urease de Helicobacter pylori : ativação de plaquetas e neutrófilosUberti, Augusto Frantz January 2010 (has links)
Ureases (3.5.1.5), enzimas níquel dependentes que catalisam a reação de hidrólise da uréia em amônia e dióxido de carbono, apresentam ampla distribuição em plantas, fungos e bactérias. A espiroqueta Helicobacter pylori causa úlceras pépticas e câncer gástrico por mecanismos ainda não totalmente conhecidos. H. pylori produz grande quantidade de urease, que neutraliza o meio ácido e permite sua sobrevivência no estômago. Nosso grupo demonstrou que as ureases de Canavalia ensiformis, soja e Bacillus pasteurii induzem agregação plaquetária independentemente de sua atividade ureolítica, por uma rota que requer ativação de canais de cálcio. ativação da rota do ácido araquidônico e secreção plaquetária. Estudos prévios mostraram ainda que a canatoxina, uma isoforma da urease de C.ensiformis, possui atividade pró-inflamatória, induzindo edema de pata em ratos. Neste trabalho, caracterizamos as propriedades ativadora de plaquetas e pró-inflamatória da urease recombinante de H. pylori (HPU). Em plaquetas, estudamos as vias recrutadas pela proteína na agregação plaquetária e comparamos com dados prévios para a canatoxina e a urease de Bacillus pasteurii. Em neutrófilos, demonstramos que a HPU, em doses nanomolares, induz quimiotaxia e produção de espécie reativas de oxigênio. A taxa de apoptose de neutrófilos ativados por HPU foi inibida, acompanhando alterações dos níveis de proteínas pró- e antiapoptóticas. Por último, mostramos que a resposta dos neutrófilos a HPU envolve aumento dos níveis de lipoxigenase(s), sem, contudo, haver alterações das ciclooxigenase( s). Concluímos que as propriedades não enzimáticas aqui descritas para a HPU podem potencialmente contribuir para o processo inflamatório promovido por H. pylori. / Ureases (EC 3.5.1.5), nickel-dependent enzymes that hydrolyze urea into ammonia and carbon dioxide, are widespread among plants, bacteria and fungi. The spirochete Helicobacter pylori is the etiological agent of gastric ulcers and gastric adenocarcinoma by mechanisms not yet fully understood. H. pylori produces high amounts of urease, which enables the bacterium to survive in the acidic medium of the stomach. We have previously reported that ureases from jackbean, soybean or Bacillus pasteurii induce blood platelet aggregation independently of their enzyme activity by a pathway requiring activation of calcium channels, lipoxigenase-derived eicosanoids and platelet secretion. We also showed that canatoxin, an isoform of C. ensiformis urease, presents pro-inflammatory property demonstrated by rat paw oedema. In this work we characterized the platelet aggregating and pro-inflammatory properties of the recombinant H. pylori urease (HPU). In platelets we studied the pathways recruited by the protein to induce platelet aggregation and compared the data to those previously reported for the plant urease canatoxin and for Bacillus pasteurii urease. Using neutrophils we demonstrated that nanomolar doses of HPU induce chemotaxis and production of oxygen reactive species in human neutrophils. The rate of apoptosis was decreased in HPU-treated neutrophils, accompanied by alterations in the levels of proand anti-apoptotic proteins. Moreover, we showed that the response of neutrophils to HPU requires increased levels of lipoxygenase(s) with no alterations of cyclooxygenase( s). We concluded that the non-enzymatic properties of HPU here described potentially contribute to the inflammatory process that underlies H. pylori infection.
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Efeito de variáveis pré-analíticas nos níveis de mieloperoxidaseWendland, Andrea Elisabet January 2009 (has links)
Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima derivada de leucócitos que catalisa a formação de numerosas espécies reativas oxidantes. Além de integrantes da resposta imune inata, evidências têm comprovado a contribuição destes oxidantes para o dano tecidual durante inflamação. A MPO participa de atividades biológicas pró-aterogênicas relacionadas à evolução da doença cardiovascular, incluindo iniciação, propagação e as fases de complicação aguda do processo aterosclerótico. Desta forma, a MPO e sua cascata inflamatória representam um alvo atrativo para investigação prognóstica e terapêutica na doença aterosclerótica cardiovascular. Vários estudos apontam para o efeito independente dos níveis de MPO na evolução da doença e ocorrência de eventos em pacientes com síndrome coronariana aguda. Entretanto, ainda não é consistente o valor preditivo adicional da dosagem de MPO na estratificação de risco cardiovascular para incorporá-la à prática clínica como sinalizadora de vulnerabilidade de placa. Estudos adicionais são necessários para avaliar os níveis de MPO como preditor de risco cardiovascular em curto e longo prazo, bem como o potencial benefício em utilizá-la para definir estratégias terapêuticas, além da padronização do ensaio, ponto fundamental para a transição desse marcador do ambiente de pesquisa para uso na rotina clínica.
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Glutamina encapsulada em lipossomas convencionais e avaliação da viabilidade dos neutrófilosCOSTA, Larissa Chaves 25 February 2013 (has links)
Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-07-05T22:48:06Z
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Previous issue date: 2013-02-25 / CAPES / A glutamina é um aminoácido que apresenta, dentre varias funções, uma importante influência nas células do sistema imunológico. Em determinadas situações, a sua síntese não supre a demanda exigida pelo organismo, repercutindo na imunodeficiência. Assim, a suplementação da glutamina vem sendo utilizada para ativar o sistema imune e melhorar a recuperação de pacientes. No entanto, a administração da mesma na sua forma livre pode promover nefropatias, principalmente em pacientes diabéticos. Deste modo, a utilização da glutamina encapsulada em nanosistemas, como os lipossomas convencionais, pode ser uma alternativa para reduzir os possíveis efeitos tóxicos, além de promover uma potencialização na eficácia terapêutica, uma vez que estes lipossomas são reconhecidos e capturados pelas células do sistema imune. Neste contexto, o objetivo do trabalho foi nanoencapsular a glutamina em lipossomas convencionais, desenvolver um método analítico em CLAE para a quantificação da glutamina encapsulada e avaliar a viabilidade dos neutrófilos. As formulações foram preparadas utilizando a técnica de hidratação do filme lipídico seguido de sonicação e caracterizadas segundo pH, tamanho das vesículas, potencial zeta e eficiência de encapsulação, além de avaliação da estabilidade ao armazenamento. Um planejamento fatorial foi realizado com a finalidade de estudar a influência da concentração dos constituintes lipídicos e da glutamina na formulação e assim escolher a preparação ideal. A viabilidade celular foi avaliada por citometria de fluxo, a partir de neutrófilos provenientes de ratos wistar sadios, 2h após administração por via intraperitoneal de glutamina livre (Gln), nanoencapsulada em lipossomas (LG), lipossomas branco (LB) e solução salina como controle (C). A formulação escolhida apresentou tamanho médio de 114,65 ± 1,82 nm com índice de polidispersão de 0,300 ± 0,00 e pH 7,69. O potencial zeta foi positivo (36,30 ± 1,38 mV) e a eficiência de encapsulação foi de 39,49 ± 0,74 %. O método cromatográfico desenvolvido foi eficiente para a quantificação da glutamina encapsulada, obtendo pico no tempo de retenção em torno de 3,8 minutos. Após tratamento, apesar dos neutrófilos permanecerem viáveis em todos os grupos testados, uma maior viabilidade foi observada no grupo tratado com glutamina encapsulada em relação ao grupo controle (20%). Assim, a glutamina encapsulada em lipossomas é capaz de manter os neutrófilos viáveis, tornando-se uma nova e promissora estratégia para aumentar a resposta em situações de imunodeficiência, com possível redução de sua toxicidade. / Glutamine is an amino acid that has, among several functions, an important influence on immune cells. In certain situations, their synthesis does not supply the demand required by the body, resulting in immunodeficiency. Thus, glutamine supplementation has been used to activate the immune system and improve the recovery of patients. However, the administration in its free form can promote kidney disease especially in diabetic patients. In that way, the use of glutamine encapsulated into nanosystems, such as conventional liposomes, may be an alternative to reducing possible toxic effects, and promote a potentiation in therapeutic efficacy, since these liposomes are recognized and captured by the immune system cells. In this context, the goal of this research work was nanoencapsulate glutamine into conventional liposomes, develop an analytical HPLC method for the quantification of encapsulated glutamine and evaluate the viability of neutrophils. Liposomes were prepared using the technique of thin-film hydration followed by sonication and characterized according to pH, size, zeta potential and encapsulation efficiency. The stability of liposomes was evaluated for at least 45 days. An experimental design was performed to study experimental conditions such as the concentration of lipids and glutamine, as well as choose the ideal preparation. Viability of neutrophils, from healthy wistar rats, was assessed, by using a flow cytometer, 2 hours after intraperitoneal administration of free glutamine (Gln), glutamine-loaded liposomes (GL), unloaded-liposome (UL) and saline solution as control (C). The chosen formulation presented a mean diameter of 114.65 ± 1.82 nm with a polydispersion index of 0.30 ± 0.00, and pH 7.69 . The zeta potential was positive (36.30 ± 1.38 mV) and the encapsulation efficiency was 39.49 ± 0.74 %. The chromatographic method developed was efficient for the quantification of encapsulated glutamine, obtaining a peak at retention time around 3.8 minutes. After treatment, although neutrophils remain viable in all groups, greater viability was observed in the group treated with glutamine encapsulated compared with control group (20%). Thus, glutamine encapsulated into liposomes is able to maintain viable neutrophils becoming a new and promising strategy to increase the response in immunodeficiency conditions, with a possible reduction of glutamine toxicity.
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Participação do oxido nitrico na inflamação aguda induzida pela enterotoxina estafilococica do tipo B em camundongosPenteado, Carla Fernanda Franco 30 September 1999 (has links)
Orientador: Edson Antunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-25T19:01:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 1999 / Resumo: Neste trabalho investigamos a participação do NO no edema de pata, permeabilidade vascular e influxo de neutrófilos para cavidade peritoneal induzidos pela enterotoxina estafilocócica tipo B (SEB) em camundongos. Para tanto, utilizamos inibidores não-seletivos (L- NAME) e seletivos (aminoguanidina e 7 -nitroindazol) da NO-sintase, assun como a dexametasona (inibidor da indução da iNOS). Nossos resultados mostraram que o L-NAME (7-28 mg!kg, i.v.) e aminoguanidina (25-75 mg!kg, i.v.) reduziram significativamente o edema de pata induzido pela SEB (25 ~g/pata). A administração subplantar de tais inibidores também causou significante redução do edema de pata. Por outro lado, apenas as maiores doses destes inibidores (administrados pela via endovenosa) foram capazes de inibir de maneira significativa, o extrayasamento de proteínas induzido pela toxina. O D- NAME (enântiomero inativo), administrado local ou sistemicamente, não alterou a resposta edematogênica induzida pela SEB. A inibição do edema de pata causada pelo L-NAME e aminoguanidina foi revertida pelo iloprost (análogo da prostaciclina), sugerindo que o efeito inibitório destes inibidores deve-se, provavelmente, à redução de fluxo sangiiíneo local como conseqüência da inibição do NO. Aadministração sistêmica do L-NAME (14-56 mg!kg), aminoguanidina (25-75 mg!kg) ou dexametasona (0,25-1,0 mg!kg) atenuou o influxo de neutrófilos induzido pela SEB em cavidades peritoneais com número de macrófagos normais. Em cavidades com o número de macrófagos aumentado, os inibidores foram menos eficazes em reduzir o influxo dessas células. O D-NAME não afetou o influxo de neutrófilos induzido pela SEB nas duas cavidades estudadas. Os resultados da medida da atividade da NOS mostraram que a nNOS do cérebro foi significativamente inibida pelo L-NAME 4 (28 mg/kg) e 12 h (14-56 mg/kg) após administração endovenosa deste inibidor. A aminoguanidina (75 mg/kg, i.v.) reduziu a atividade da nNOS em 4 h, mas não em 12 h após a administração sistêmica. O 7-nitroindazol (5-15 mg/kg) não modificou a nNOS em quaisquer das doses utilizadas. A atividade da iNOS foi inibida significativamente pelo L-NAME (14-56 mg/kg, i.v., 12 h) e aminoguanidina (25-75 mg/kg, i.v., 12 h). Concluímos que o NO é um mediador importante na resposta edematogênica e no influxo de neutrófilos induzidos pela SEB. A síntese do NO, no sítio inflamatório, parece envolver a cNOS na fase inicial (4 h) e a iNOS na fase de mais tardia (12 h) / Abstract: In this study we attempted to investigate the role of nitric oxide (NO) on the inflammatory responses (hindpaw oedema, vascular permeability and neutrophil migration) induced by the staphylococcal enterotoxin type B (SEB) in mouse. To achieve this, both non-selective (L-NAME) and selective (aminoguanidine and 7-nitroindazole) NO-synthase (NOS) inhibitors as well as dexamethasone (iNOS induction inhibitor) were used. Our results showed that L-NAME (7-28 mg/kg, i.v.) and aminoguanidine (25-75 mg/kg, i.v.) significantly reduced SEB-induced paw oedema. Similar results were observed when these inhibitors were administered intraplantarly. The inactive enantiomer D-NAME had no effect on the SEB-induced oedema formation. The inhibition of paw oedema by both L- NAME and aminoguanidine were significantly reversed by the local . administration of the prostacyclin analogue iloprost. This suggest that these inhibitors probably acts by reducting regional blood flow. The compound 7¬nitroindazole, a substance which preferentially inhibit nNOS, had no effect on the exsudation and paw oedema induced by SEB. L-NAME and aminoguanidine as well as dexamethasone significant reduced neutrophil accumulation induced. by SEB into mouse peritonenl cavity. In thioglycollate-pretreated cavities, a condition where the number of macrophages is increased, L-NAME and aminoguanidine caused a smaller inhibition of SEB-induced neutrophil migration, as compared to naive cavities. D-NAME had no effect on the neutrophil migration induced by SEB, either in non-stimulated or thioglycollate-treated cavities. In addition, bNOS activity was reduced by L-NAME at 4 h (28 mg/kg) and 12 h (14-56 mg/kg) after endovenous administration, while aminoguanidine (75 mg/kg, i. v.) was able to reduce the nNOs activity only when this inhibitor was injected 4 h before. The nNOS activity was unchanged by 7 -nitroindazole. The activity of iNOS was significant1y inhibited by L-NAME (14-56 mg/kg, i.v., 12 h) and aminoguanidine (25-75 mg/kg, i.v., 12 h).In conclusion, our results indicate that NO modulate both oedema and neutrophil migration induced by SEB. We suggest that NO involved in inflammatory response was produced by cNOS in the early phase (4 h) and iNOS during the sustained phase (12 h) / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências Médicas
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Estudo "in vivo" da atividade antiinflamatoria de inibidores de secreção acidaBecker, Tagliane Liza 17 February 2005 (has links)
Orientador: Jose Pedrazzoli Junior / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T15:29:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2005 / Resumo: As principais causas de ulceração da mucosa gástrica são o uso prolongado de antiinflamatórios não-esteroidais (AINEs) e a infecção pelo Helicobacter pylori. Pacientes com ulcerações gástrica são tratados, principalmente, com antagonistas de receptor de histamina-2 e inibidores de bomba protônica, que neutralizam elou reduzem a secreção ácida. Estudos têm mostrado que estas drogas possuem propriedades adicionais de inibirem funções leucocitárias. Estas propriedades são de relevante importância, visto que a lesão na mucosa gástrica induzida tanto por AINEs quanto pelo H. pylori, envolve diretamente a participação de neutrófilos. Baseado nestes relatos, os objetivos deste trabalho foram: 1) padronizar o modelo de inflamação induzida por H. pylori em bolsa de ar na pele dorsal de ratos; 2) avaliar a possível atividade antiinflamatória de inibidores de secreção ácida modelo experimental. A inoculação de H. pylori na bolsa de ar em ratos causou um significativo infiltrado neutrofílico, sendo este, dependente da concentração e, independente da viabilidade e do genótipo das linhagens inoculadas. Nota-se que após o tratamento com os inibidores de secreção ácida, durante 7 ou 28 dias, a produção de exsudato inflamatório e migração de leucócitos na bolsa de ar incubada com H. pylori ou carragenina não foi alterada. Em contraste, a dexametasona, antiinflamatório esteroidal, inibe significantemente a resposta inflamatória. Ao contrário dos estudos anteriores, esses resultados indicam que os inibidores de bomba protônica e os antagonistas de receptor H2 não possuem atividade antiinflamatória no modelo de inflamação in vivo induzido pelo H. pylori em bolsa de ar em ratos, quando utilizados por curto ou longo período / Abstract: Helicobacter pylori infection and the administration of nonsteroidal antiinflammatory drugs are the main causes of gastric ulcerations. In the clinical setting, patients with gastric ulcerations are treated with histamine-2 (H2) receptor antagonists and proton pump inhibitors (PPI) to neutralize or reduce the acid secretion. Recently, studies have shown that these drugs have additional properties related to their capacity to inhibit some neutrophil functions. Since the damage to gastric mucosa, associated with H. pylori or nonsteroidal anti-inflammatory drugs, is also induced by neutrophils these properties could be beneficial. In the present study, we characterized the inflammatory response induced by H. pylori in the rat air pouch model. We also evaluated the anti-inflammatory activity of acid secretion inhibitors such as omeprazole, lanzoprazole, pantoprazole and cimetidine in this experimental model. The injection of H. pylori into rat air pouch caused pronounced neutrophil infiltration. This response was dependent upon the number of bacteria injected and independent of bacterial viability and genotype. The duration of treatment with the acid secretion inhibitors did not affect the ability of neutrophils to migrate in response to H. py/ori or carrageenan. On the other hand, dexamethasone, a classic anti-inflammatory drug, reduced the exudate formation and leukocyte migration. Our results indicate that proton pump inhibitors or histamine-2 receptor antagonists have no anti-inflammatory activity in vivo / Mestrado / Mestre em Farmacologia
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Interferon-[beta] disminuye el reclutamiento de neutrófilos inducido por LPS sobre fibroblastos cardíacosAnfossi Matus, Renatto Claudio January 2016 (has links)
Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En los últimos años se ha descrito y dado énfasis al rol determinante
que tiene el fibroblasto cardiaco (FC) en el proceso inflamatorio, dónde
cumple un rol clave a fin de mantener la homeostasis del órgano. En los
procesos inflamatorios y en cualquier episodio de daño, los neutrófilos son la
primera línea de defensa del organismo, los cuales son atraídos al sitio de
daño por la quimioquina, interleuquina 8 (IL-8), quien además, provoca su
activación. Posteriormente, el reclutamiento de neutrófilos en los sitios de
daño es dependiente de las proteínas de adhesión E-selectina, ICAM-1 y
VCAM-1. Por lo tanto, controlar la expresión de estas proteínas constituye un
nuevo enfoque terapéutico en el tratamiento de los procesos inflamatorios.
En ese sentido, el interferón beta (IFN-β), ha demostrado moderar la
respuesta inflamatoria; pero hasta la fecha no se ha demostrado su utilidad
como agente antiinflamatorio en el corazón y específicamente en el FC.
Debido a estos antecedentes, el objetivo general fue estudiar el efecto
preventivo del IFN-β sobre la expresión de IL-8, ICAM-1 y VCAM-1 bajo un
contexto inflamatorio, inducido por estímulo con LPS. Consecuente con este
hallazgo, se observó que el IFN-β disminuye la adhesión de neutrófilos sobre
FC inducida por LPS. De esta manera, se demostró que el tratamiento con
IFN-β puede modular la cascada inflamatoria, y así, transformarse en una
potencial y valiosa herramienta terapéutica capaz de controlar la expresión
de estas proteínas de vital importancia partícipes del proceso inflamatorio
luego de algún evento de injuria cardiaca como lo puede ser una miocarditis,
o bien, un infarto al miocardio / In recent years it is described the determining role that cardiac
fibroblast (CF) has in the inflammatory process, where plays a major role to
maintain homeostasis. In inflammatory process and any event of damage,
neutrophils are the first line of defense, which are attracted to the site of
damage through interleukin 8 (IL-8), who initially causes activation.
Subsequently, neutrophil recruitment at sites of damage depends on Eselectin,
ICAM-1 and VCAM-1 adhesion proteins. Therefore, controlling the
expression of these proteins is a new therapeutic approach in the treatment
of inflammatory process. In this sense, interferon beta (IFN-β) has shown be
a inflammatory moderator; but to date it has not been proved useful as an
anti-inflammatory agent in the heart, specifically on CF. On the basis of this
background, the overall objective was to study the preventive effect of IFN-β
on the expression of IL-8, ICAM-1 and VCAM-1 on CF under an inflammatory
stimuli with LPS and evaluate neutrophil adhesion to CF. The results showed
that IFN-β prevents the increased expression on IL-8, ICAM-1 and VCAM-1
induced by LPS. Consistent with this finding, we observed that IL-8, ICAM-1
and VCAM-1 decreases the neutrophil adhesion induced also by LPS on CF.
Thus, it was shown that IL-8, ICAM-1 and VCAM-1 can modulate the
inflammatory cascade, and thus become a potentially valuable therapeutic
tool able to manage these important participants proteins of the inflammatory
process after an event of cardiac injury as can be a myocarditis, or myocardial
infarction
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Efeitos do laser de baixa potência in vivo na ativação de neutrófilos na paracoccidioidomicose experimental murinaMENDES, Ana Carolina Silvério Cerqueira 05 September 2014 (has links)
A imunidade inata mostra-se importante na defesa do hospedeiro contra a infecção por fungos, e dentro desse contexto macrófagos e neutrófilos (PMN) desempenham papel central na Paracoccidioidomicose. O tratamento desta doença inclui o uso de antifúngicos que, além do prolongado tempo de administração, podem ter diversos efeitos colaterais, sendo necessário pesquisa de tratamentos mais eficientes ou adjuvantes. A laserterapia de baixa potência (LLLT) vem sendo utlizada como tratamento adjuvante para muitas enfermidades, e já foi demonstrado seu efeito modulador em células imunes. Neste trabalho avaliamos os efeitos da LLLT (λ= 780 nm e 50 mW) aplicadas in vivo e em dias alternado em dois pontos das patas traseiras de camundongos Swiss inoculados pela via “air pouch” subcutânea com P. brasiliensis cepa 18 (Pb18) ou com Zymosan. Grupos de animais que não sofreram irradiação foram utilizados como controle. Após 10 dias da infecção nós obtivemos uma população de PMN altamente pura, que posteriormente foram mantidos em cultura na presença de Pb18 para ensaios de produção de proteínas, avaliação da atividade mitocondrial, produção de metabólitos do oxigênio e quantificação de fungos viáveis por ensaios de UFC. Os resultados mostraram que os PMN de animais que sofreram irradiação, independente do estímulo in vivo para sua obtenção, apresentaram maior produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), atividade mitocondrial elevada e maior atividade fungicida. Com relação à produção de proteínas, os PMN de animais que não sofreram irradiação in vivo apresentaram crescimento constante na produção, enquanto que nos PMN de animais que sofreram irradiação essa produção diminuiu com o tempo de incubação. Podemos concluir que a LLLT rende aos PMN maior atividade metabólica, o que resulta em maior atividade fungicida contra o Pb18, provavelmente devido à maior produção de ERO independente do estímulo utilizado para sua obtenção. / Innate immunity is an important component of host defense against by fungi, and into this context macrophages and neutrophils (PMN) play a central role in paracoccidioidomycosis. The treatment of this disease includes the use of antifungals that, which in addition to the prolonged administration time needed may have many side effects, so research for more efficient drugs or adjuvant treatments is needed. Low level laser therapy (LLLT) has been used as adjuvant treatment for many ailments, and its modulating effect on immune cells has already been demonstrated. In this work, we evaluated the effects of LLLT (λ= 780 nm e 50 mW) applied “in vivo” in alternate days at two points of hind paws of Swiss mice inoculated in the subcutaneous air pouch with the virulent P. brasiliensis Pb18 isolated or with Zymosan. Unirradiated animals were used as controls. After 10 days of infection we obtained a highly pure population of PMN, which subsequently were maintained in culture in presence of Pb18 for trials to protein production, evaluation of mitochondrial activity, production of reactive oxygen species (ROS) and quantification of viable fungi. The results showed that PMN from irradiated animals, regardless of the “in vivo” stimulus for their obtention, presented higher production of ROS, elevated mitochondrial activity and increased fungicidal capacity. Regarding the production of proteins, PMN from unirradiated animals showed increased production, while the treated group decreased gradually this production with the time of incubation. We conclude that LLLT renders PMN more active metabolically, resulting in higher fungicidal activity against Pb18, probably due to increased production of ROS, independently of the stimulus used to obtain it.
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Ação do nitróxido tempol sobre a atividade do complexo enzimático NADPH oxidase (Nox2) em neutrófilosSANTOS, Gérsika Bitencourt 02 September 2016 (has links)
A identificação de novos alvos para controlar o processo inflamatório é, provavelmente, o principal desafio que dificulta o desenvolvimento de novas drogas anti-inflamatórias. Assim, a modulação das vias de sinalização intracelulares em fagócitos desponta como uma forma interessante de alcançar este objetivo. No entanto, isso pode trazer como consequência a diminuição da defesa do hospedeiro contra patógenos. Este estudo teve como objetivo examinar se o nitróxido 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi (Tempol) exerce efeito sobre produção de oxidantes por neutrófilos inflamatórios através da regulação da atividade de proteínas quinases e da proteína dissulfeto isomerase (PDI), uma chaperona cujos sítios ativos contêm o motivo Cys-Gly-His-Cys (CXXC) e está envolvida na montagem do complexo enzimático NADPH oxidase (Nox2) de fagócitos. Vias bioquímicas diferentes foram ativadas para a liberação de espécies reativas de oxigênio por neutrófilos inflamatórios, e, paralelamente, a atividade de proteínas quinases foi determinada sob efeito de Tempol nos fagócitos. O nitróxido inibiu significativamente o burst oxidativo dos neutrófilos de maneira dependente da concentração. Este efeito foi detectado pelo consumo de oxigênio, onde a IC50 encontrada foi de 45±4 μM. Utilizando-se ensaios de quimioluminescência dependente de luminol ou de isoluminol, mostramos que o Tempol provocou um atraso no período de resposta latente da ativação de Nox2 dos neutrófilos sob diferentes estímulos. Coerentemente, o nitróxido inibiu a atividade de proteínas quinases de neutrófilos estimuladas por diferentes vias bioquímicas, como quantificado por ensaios quimioluminescentes e por teste dot blot. Nas mesmas condições, Tempol reduziu a atividade fungicida de neutrófilos contra Candida albicans. Na presença de Tempol a atividade redutase de PDI foi reversivelmente afetada tanto in vitro como em neutrófilos inflamatórios estimulados, cuja IC50 de 35±3,3 μM foi calculada através de metodologia de espectrofluorescência. Esta atividade inibitória foi confirmada com o método espectrofotométrico de enovelamento de insulina. Foi utilizada PDI recombinante para ser estudado o mecanismo de inibição que o Tempol exerce sobre a esta tiol óxido-redutase, através de espectrometria de massa. Na análise da proteína total, 1 e 4 moléculas de Tempol foram detectadas ligadas à proteína. No entanto, somente uma molécula do nitróxido foi encontrada ligada covalentemente à PDI. Mais especificamente, a Cys400 foi modificada por Tempol. Em conjunto, os resultados revelam um novo mecanismo do Tempol sobre a regulação de enzimas associadas à atividade do complexo Nox2 de neutrófilos inflamatórios, os quais apresentam aplicações clínicas potenciais para intervenção terapêutica em processos patológicos. Entretanto, o possível uso do Tempol como agente anti-inflamatório deve ser cauteloso, uma vez que este nitróxido diminuiu a resposta microbicida de neutrófilos. / The identification of new targets for controlling inflammatory processes is, almost certainly, the major challenge that hampers the development of new anti-inflammatory drugs. Thus, the modulation of intracellular signaling pathways in phagocytes emerges as an interesting way to achieve this goal. However, this strategy can bring the effect of lowering the host defense against pathogens. This study aimed to examine whether the nitroxide 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy (Tempol) has an effect on production of oxidants by inflammatory neutrophils through regulation of protein kinase activity and protein disulfide isomerase (PDI), a chaperone whose active sites containing the motif Cys-Gly-His-Cys (CXXC) and is involved in the assembly of the NADPH oxidase enzyme complex (Nox2) on phagocytes. Different biochemical pathways were activated for the release of reactive oxygen species by inflammatory neutrophils, and, in parallel, the protein kinase activities were determined under Tempol treatment of phagocytes. The nitroxide significantly inhibited oxidative burst of neutrophils in a concentration dependent manner. This effect was detected by oxygen consumption, where the IC50 was found to be 45±4 µM. By means of chemiluminescence luminol- or isoluminol-dependent assay, we showed that Tempol caused a delay in the lag period of neutrophils Nox2 activation under different stimuli. Accordingly, the nitroxide inhibited the activity of protein kinases in neutrophils stimulated by various biochemical pathways, as quantitated by chemiluminescent assays and dot blot test. Under the same conditions, Tempol reduced neutrophil fungicidal activity against Candida albicans. In the presence of Tempol, PDI reductase activity was reversibly affected both in vitro and in stimulated inflammatory neutrophils, whose IC50 of 35±3.3 µM was calculated by fluorescent methodology. This inhibitory activity was confirmed by the spectrophotometric insulin method. Recombinant PDI was used for the purpose of studying the mechanism of inhibition that Tempol exerts on this thiol oxide reductase enzyme, by mass spectrometry. In the analysis of total protein, 1 and 4 molecules of Tempol were detected bound to the protein. However, only one molecule of the nitroxide was found covalently linked to PDI. More specifically, Cys400 has been changed by Tempol. Together, these results reveal a novel mechanism of Tempol on the regulation of enzymes associated with Nox2 complex inflammatory activity of neutrophils, which have potential clinical applications for therapeutic intervention in pathological processes. However, the promising use of Tempol as an anti-inflammatory agent must be taken with caution, since this nitroxide decreased neutrophil microbicidal response.
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Papel das Neutrophil Extracellular Traps no controle da infecção por Chikungunya / Role of Neutrophil Extracellular Traps on the control of Chikungunya infectionCarlos Hiroji Hiroki 30 October 2018 (has links)
O Chikungunya é um vírus reemergente que causa uma doença caracterizada por uma artralgia incapacitante que afeta milhares de pessoas. A resposta inata contra este vírus é bem descrita pela participação de macrófagos, células dendríticas e células NK, porém há poucos trabalhos que demonstram o papel dos neutrófilos nesta infecção. As Neutrophil Extracellular Traps (NETs) constituem uma rede de DNA complexada a enzimas antimicrobianas que foram descritas por combaterem diversos patógenos. Porém, não há trabalhos que demonstram sua importância em infecção por Chikungunya. Nosso objetivo foi investigar se há produção de NETs na infecção por Chikungunya, descrever seus mecanismos e demonstrar sua importância in vitro e in vivo. Observamos que neutrófilos murinos e humanos incubados com Chikungunya são capazes de produzir NETs via Toll-Like 7 e produção de espécies reativas de oxigênio. Estas NETs foram capazes de capturar o vírus e impedir sua infecção in vitro. Mais além, animais infectados com Chikungunya e tratados com rhDNAse apresentam maior carga viral e são mais suscetíveis à infecção, demonstrando sua importância in vivo. Por fim, pacientes diagnosticados em fase aguda de infecção por Chikungunya possuem elevados níveis de NETs correlacionados com uma alta carga viral. / Chikungunya is a reemerging virus which causes a disease characterized by an incapacitanting arthralgia and affects thousands of people. Innate response against this virus is well described by participation of macrophages, dendritic cells and NK cells, however few works demonstrate the roe of neutrophils in this infection. Neutrophils Extracellular Traps are a web of DNA complexed with antimicrobial enzymes which were described for fighting against many pathogens. However, there are no works which demonstrate its relevance in Chikungunya infection. Our objective was to evaluate if there is release of NETs in Chikungunya infection, describe its mechanisms and demonstrate its relevance in vitro and in vivo. We observed that mouse and human neutrophils incubated with Chikungunya are able to produce NETs via Toll-Like 7 and reactive oxygen species production. These NETs were able to capture the virus and inhibit its infection in vitro. Moreover, animals infected with Chikungunya virus and treated with rhDNAse demonstrated higher viral load and are more susceptible to the infection, showing its importance in vivo. Lastly, patients diagnosed during acute infection of Chikungunya infection have high levels of NETs correlated with a high viral load.
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Papel das Neutrophil Extracellular Traps no controle da infecção por Chikungunya / Role of Neutrophil Extracellular Traps on the control of Chikungunya infectionHiroki, Carlos Hiroji 30 October 2018 (has links)
O Chikungunya é um vírus reemergente que causa uma doença caracterizada por uma artralgia incapacitante que afeta milhares de pessoas. A resposta inata contra este vírus é bem descrita pela participação de macrófagos, células dendríticas e células NK, porém há poucos trabalhos que demonstram o papel dos neutrófilos nesta infecção. As Neutrophil Extracellular Traps (NETs) constituem uma rede de DNA complexada a enzimas antimicrobianas que foram descritas por combaterem diversos patógenos. Porém, não há trabalhos que demonstram sua importância em infecção por Chikungunya. Nosso objetivo foi investigar se há produção de NETs na infecção por Chikungunya, descrever seus mecanismos e demonstrar sua importância in vitro e in vivo. Observamos que neutrófilos murinos e humanos incubados com Chikungunya são capazes de produzir NETs via Toll-Like 7 e produção de espécies reativas de oxigênio. Estas NETs foram capazes de capturar o vírus e impedir sua infecção in vitro. Mais além, animais infectados com Chikungunya e tratados com rhDNAse apresentam maior carga viral e são mais suscetíveis à infecção, demonstrando sua importância in vivo. Por fim, pacientes diagnosticados em fase aguda de infecção por Chikungunya possuem elevados níveis de NETs correlacionados com uma alta carga viral. / Chikungunya is a reemerging virus which causes a disease characterized by an incapacitanting arthralgia and affects thousands of people. Innate response against this virus is well described by participation of macrophages, dendritic cells and NK cells, however few works demonstrate the roe of neutrophils in this infection. Neutrophils Extracellular Traps are a web of DNA complexed with antimicrobial enzymes which were described for fighting against many pathogens. However, there are no works which demonstrate its relevance in Chikungunya infection. Our objective was to evaluate if there is release of NETs in Chikungunya infection, describe its mechanisms and demonstrate its relevance in vitro and in vivo. We observed that mouse and human neutrophils incubated with Chikungunya are able to produce NETs via Toll-Like 7 and reactive oxygen species production. These NETs were able to capture the virus and inhibit its infection in vitro. Moreover, animals infected with Chikungunya virus and treated with rhDNAse demonstrated higher viral load and are more susceptible to the infection, showing its importance in vivo. Lastly, patients diagnosed during acute infection of Chikungunya infection have high levels of NETs correlated with a high viral load.
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