Orientador: Marta Helena Krieger / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T17:17:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wanschel_AmarylisClaudineBonitoAzeredo_D.pdf: 3059995 bytes, checksum: afbb018ffe3bb06b61c7420a0fa4664f (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar a biodisponibilidade do óxido nítrico (NOo) nas disfunções cardiovasculares, especificamente na hipertrofia ventricular esquerda e na aterosclerose. Para tanto, realizamos dois estudos em camundongos deficientes do receptor de LDL (LDLr-/-): o primeiro realizado em continuidade aos estudos desenvolvidos anteriormente em nosso grupo de pesquisa, os quais demonstraram a ação do doador de NOo na prevenção da hipertrofia ventricular esquerda e na proteção contra arritmia via indução do acoplamento adrenoceptor-beta2 (ß2AR) à proteína G inibitória (Gi); e no segundo estudo, foi avaliada a biodisponibilidade de NOo na fase inicial da aterogênese, com objetivo de caracterizar as alterações sistêmicas e locais. No primeiro estudo mostramos que o doador de NOo, S-Nitroso-N-acetilcisteína (SNAC) administrado, promoveu ação cardioprotetora contra o remodelamento cardíaco via redução do estresse oxidativo e apoptose celular, os quais foram determinados pelas medidas ventriculares da produção de superóxido (O-o2) e peróxido de hidrogênio (H2O2) e pelo índice de morte celular por apoptose. Esta ação cardioprotetora foi vista no aumento da expressão e no conteúdo de S-nitrosação do ß2AR. Estes efeitos foram associados à cardioproteção contra a arritmia via indução do acoplamento ß2AR à Gi. O objetivo do segundo estudo foi avaliar a biodisponibilidade de NOo na fase inicial da aterogênese em camundongos LDLr-/- no curso temporal de 15 a 60 dias de dieta, com a quantificação de parâmetros sistêmicos representados pela pressão arterial, perfil lipidêmico e ateroma, bem como de parâmetros locais representados pela atividade e expressão da via NO/NOS e suas modificações póstraducionais no processo inflamatório via CD40-CD40L. Camundongos LDLr-/-submetidos à dieta rica em gordura apresentaram progressão do tamanho do ateroma no curso temporal analisado, contudo não foi associado a similares incrementos nos níveis de dislipidemia. Não foram detectadas alterações na pressão arterial do fenótipo hipertenso deste animal. Contudo, localmente foi verificado incremento na atividade da eNOS via fosforilação de resíduos de serina 1179 (S1179) em 30 dias de dieta rica em gordura, que pode ser considerado um mecanismo emergencial à aterosclerose . Posteriormente, com a evolução do ateroma (60 dias) houve redução desta ativação, bem como do conteúdo de proteínas S-nitrosadas. O desenvolvimento de ateroma em 30 e 60 dias induzido pela dieta mostrou aumento da atividade inflamatória por meio da denitrosação de tióis críticos da via CD40. Portanto, a análise das alterações no curso temporal apresentou somente mudanças locais como alteração na biodisponibilidade de NOo, ativação inflamatória via denitrosação do receptor CD40 e redução do conteúdo de S-nitrosação total, enquanto as alterações sistêmicas neste período de tempo ainda não são evidentes / Abstract: The objective of this study was to evaluate the bioavailability of nitric oxide (NOo) in cardiovascular disorders, specifically on the left ventricular hypertrophy and atherosclerosis. Therefore, we performed two studies with LDL receptor-deficient mice (LDLr-/-): the first one was performed in sequence to the studies previously developed in our research group, which showed the NOo donor action on the prevention of left ventricular hypertrophy and protection against arrhythmia via induction of the coupling from beta adrenoceptor-2 (ß2AR) to the inhibitory G protein (Gi); and the second study,it was evaluated the bioavailability of NOo to characterize the systemic and local alterations in the early stages of atherogenesis. The first study showed that the administration of NOo donor S-Nitroso-N-Acetylcysteine (SNAC) promoted cardioprotective action by blocked the cardiac remodeling through reduction of oxidative stress and of apoptosis, which were determined by measures of ventricular superoxide (O-o2) and hydrogen peroxide (H2O2) production and the cell death index, respectively. This cardiprotective action was charactherized by the increase of expression and content of S-nitrosation of ß2AR. These effects were associated with cardioprotection against arrhythimia via induction of ß2AR coupling Gi. The objective of the second study was to evaluate the bioavailability of NOo in the LDLr-/- mice early atherogenesis in LDLr-/ - mice from 15 to 60 days, with the quantification of systemic parameters represented by the blood pressure, lipidemic profile and atheroma as well as local ones represented by the activity and expression of NO/NOS pathway and its post-translational modifications on the inflammatory process via CD40- CD40L. Mice LDLr-/ - maintained on high-fat diet showed progression of atheroma size, although it was not associated with similar increase in dyslipidemic profile. No changes in blood pressure were detected in the hypertensive phenotype of this animal. However, increased activity of eNOS via phosphorylation of Ser1179 (S1179) at 30 days of high-fat diet was detected and it can be considered an emergential mechanism to early atherosclerosis. The development of atheroma (60 days) blocked that activation as well as the protein content of S-nitrosated. The atheroma induced at 30 and 60 days by high-fat diet revealed increase inflammatory activity through denitrosation of critical thiols via CD40. Therefore, the analysis of changes in this time course showed only local changes as changes on NOo bioavailability alteration inflammatory activation via denitrosation of CD40 receptor and the content of total S-nitrosation reduction. However, systemic changes in this period of time have not been evident yet / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Cássio Luís Zanettini Riccetto, Marcelo Ganzarolli de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T02:05:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_AlessandroCorreaPrudentedos_M.pdf: 2396933 bytes, checksum: 15e0ba5362fd0f6648c8ca4f6aea3f8c (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Introdução: A introdução de telas de polipropileno no reparo de incontinência urinária e distopias genitais diminuiu a recorrência do problema, mas também trouxe o inconveniente de complicações como extrusões vaginais. O óxido nítrico (NO) tem propriedades vasodilatadoras e moduladoras dos processos inflamatórios. Assim, o recobrimento das telas com matriz polimérica eluidora de um carreador de NO pode modificar a resposta tecidual ao implante em organismos biológicos. Objetivo: Estudar o efeito do recobrimento com matriz polimérica eluidora do carreador de NO, S-nitrosoglutationa (GSNO), na resposta biológica tecidual de telas de polipropileno (PP) monofilamentar implantadas no subcutâneo de ratas adultas. Materiais e Métodos: Utilizaram-se 20 ratas fêmeas da raça Wistar (peso médio= 250 g). Cada animal recebeu o implante de 4 fragmentos de tela medindo 10 x 10 mm no subcutâneo. As amostras obtidas dos animais foram divididas em 7 grupos, designados como: grupo PP - tela de PP sem recobrimento (grupo controle) (n=20); grupo PVA -tela de PP com recobrimento de poli(alcool vinílico) (n=10); grupo PVA/PVP - tela de PP com recobrimento de blenda de poli(alcool vinílico)/poli(vinil pirrolidona) (n=10); grupo PVA/GSNO 1 - tela de PP com recobrimento de poli(alcool vinílico), contendo GSNO 1 mM (n=10); grupo PVA/GSNO 10 - tela de PP com recobrimento de poli(alcool vinílico) contendo GSNO 10mM (n= 10), grupo PVA/PVP/GSNO 1 - tela de PP com recobrimento de poli(álcool vinílico)/poli(vinil pirrolodona), contendo GSNO 1mM (n=10); grupo PVA/PVP/GSNO 10 - tela de PP com recobrimento de poli(alcool vinílico)/poli(vinil pirrolodona) contendo GSNO 10mM (n= 10). Dez ratas foram eutanasiadas após 2 dias e outras dez após 21 dias do procedimento cirúrgico. Após a eutanásia, uma excisão em bloco da parede abdominal foi feita para análises microscópicas. Infiltrado inflamatório, edema e angiogênese foram avaliados em lâminas coradas com Hematoxilina-Eosina (HE). A deposição colágena foi avaliada em lâminas coradas com Picrosirius Red. As variáveis estudadas nas lâminas HE foram categorizadas em ausente, leve, moderado ou intenso. A formação colágena foi quantificada com método estereológico. Todas as avaliações foram feitas pelo mesmo pesquisador, que não sabia de que animal ou fragmento se tratava a lâmina que estava analisando. Resultados: Nas ratas eutanasiadas após dois dias do procedimento, não se identificou diferença estatística entre os diversos tratamentos. No entanto, naquelas estudadas após 21 dias do implante, observou-se menor edema (p=0.0039) tecidual e maior angiogênese (p=0.0031) no grupo PVA/GSNO 1. O grupo PVA também demonstrou maior formação vascular que o controle (p=0.0027). Além disso, ratas eutanasiadas aos 21 dias apresentaram maior infiltrado inflamatório (p= 0,0474) e menor edema (p=0,0064) quando comparadas àquelas aos 2 dias. Na quantificação de fibras colágenas, não houve diferença significativa entre os fragmentos. Conclusões: O recobrimento com PVA e PVA contendo GSNO modificou a resposta biológica tecidual de telas de PP monofilamentar implantadas no subcutâneo de ratas adultas. O recobrimento com PVA, isoladamente ou contendo GSNO 1mM demonstrou efeito angiogênico. O grupo PVA/GSNO 1 apresentou, ainda, redução do edema. Não houve diferenças significativas da deposição colágena / Abstract: Introduction: The use of polypropylene (PP) mesh to repair urinary incontinence and vaginal prolapse has decreased recurrence. However, it has also been related to specific complications such as vaginal erosions. Nitric oxide (NO) can produce vasodilatation and modulate inflammatory reaction. The NO containing (S-nitrosoglutathione - GSNO) eluted from a polymeric coating could modify tissue response of meshes. Objective: To study the effect of a NO containing (S-nitrosoglutathione - GSNO) eluted from a polymeric coating in the tissue response of monofilament polypropylene mesh implanted in subcutaneous of rats. Materials and Methods: Twenty adult female Wistar rats were used (mean weight: 250g). Four mesh fragments measuring 10 x 10 mm were implanted in subcutaneous tissue of each rat. The samples were divided in 7 groups: PP group - PP mesh without coating (control) (n=20); PVA group - PP mesh coated with poly(vinyl alcohol) (PVA) (n=10); PVA/PVP group - PP mesh coated with a solution of poly(vinyl alcohol) and poly(vinyl pyrrolidone) (PVA/PVP) (n=10); PVA/GSNO 1 group - PP mesh coated with PVA containing GSNO 1mM (n=10); PVA/GSNO 10 group - PP mesh coated with PVA containing GSNO 10mM (n=10); PVA/PVP/GSNO 1 group - PP mesh coated with PVA/PVP containing GSNO 1mM (n=10); PVA/PVP/GSNO 10 group - PP mesh coated with PVA/PVP containing GSNO 10mM (n=10);. Ten rats were euthanized at 2 days and the other at 21 days postoperatively. Abdominal wall was excised en bloc for microscopic analyses. Inflammatory infiltrate, edema and angiogenesis were analyzed in hematoxilin-eosin (HE) slices and categorized as absent, mild, moderate or severe. The collagen deposition was stained with Picrosirius red and quantified using stereological method. The same researcher did all evaluations without knowing what fragment he was analyzing. Results: No statistical difference was identified among treatments in euthanized rats at two days after the implants. However, in rats studied at 21 days, less edema (p=0.0039) and greater angiogenesis (p=0.0031) were observed for PVA/GSNO 1 group. PVA group also was related to induced a higher angiogenesis (p=0.0027). Furthermore, euthanized rats at 21 days demonstrated a greater inflammatory infiltrate (p= 0,0474) and less edema (p= 0,0064) than those at two days. In collagen deposition analyses no statistical difference was identified among treatments. Conclusion: Coating monofilament PP meshes with GSNO-containing PVA modified the tissue response when implanted in subcutaneous of rats. The PVA alone or with GSNO 1 showed angiogenic effect. The PVA/GSNO1 group presented less edema too. There were not effects in collagen deposition / Mestrado / Cirurgia / Mestre em Cirurgia

Orientador: Luis Carlos Spolidorio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-10T20:01:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Neves_KarinaAntunes_D.pdf: 1751187 bytes, checksum: adac4b09e6d649c2ec3a0006d3b1ae83 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Vários relatos na literatura sugerem que a Ciclosporina A (CsA) aumenta a remodelação óssea com a reabsorção excedendo a formação, resultando em perda óssea. Os mecanismos da perda óssea associada à CsA são complexos e envolvem marcadores ósseos celulares e produtos dos osteoblastos e osteoclastos. Dentre os mediadores imunológicos, a CsA parece ter efeitos na produção de óxido nítrico (NO), o qual exerce efeitos bifásicos sobre o osso. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos da CsA sobre o osso através da mensuração da densidade mineral óssea (BMD), análise bioquímica (fosfatase alcalina total, cálcio sérico e fósforo) e relacionar com a expressão de NO e TNFa pelos macrófagos peritoniais de camundongos. Sessenta camundongos foram divididos em 4 grupos e receberam injeções subcutâneas diárias de CsA 50mg/kg peso corporal, durante os períodos de 7, 14, 28 e 60 dias (n=lO) e o controle recebeu solução salina (n=5). Amostras sanguíneas foram obtidas através de punção cardíaca e foram analisados: cálcio sérico, fósforo e fosfatase alcalina. Os macrófagos peritoniais foram obtidos de cada camundongo, 3 dias após a injeção intraperitonial de tioglicolato de sódio. As células foram incubadas com lipopolossacarídeo . (LPS) e os sobrenadantes foram usados para o ensaio de produção de NO e TNFa. As radiografias digitais dos fêmures foram obtidas através de um sistema de imagem digital, CDRR. A densidade mineral óssea -(BMD) foi avaliada com o auxílio do software Photoshop 7,0 (Microsoft, 2003). A concentração dos marcadores séricos ósseos variou com o tempo de administração da CsA. Houve diminuição de cálcio após 28 dias e fósforo e ALP após 7 dias. A BMD diminuiu significativamente na epífise distal dos fêmures, a partir de 14 dias e na epífise proximal, somente após 60 dias, nos camundongos submetidos ao tratamento com CsA. A produção de NO e TNF-a aumentou significativamente nos camundongos tratados com CsA (período de 7 e 14 dias). A partir dos resultados do presente trabalho confirmamos que a CsA induziu perda óssea. Houve um sinergismo entre a perda óssea e a diminuição de ALP' cálcio e fósforo sérico, assim como o aumento dos níveis de NO e TNF-a / Abstract: Several reports suggest that Cyclosporin A (CsA) causes increased bone turnover and remodeling with resorption exceeding formation, resulting in bone loss. The mechanism of CsA-induced bone loss is complex and can involve cellular bone markers and osteoblasts and osteoclasts products. CsA seems to have effects on nitric oxide (NO) production, which has a biphasic effect on osteoclastic bone resorption. The aim of the present study was to evaluate the effects of the CsA on bone by Bone Mineral Density (BMD), biochemical analysis (Total Alkaline Phosphatase - ALP and serum calcium) and to relate them with the expression of NO and Tumor necrosis factor alpha (TNFa.) by peritoneal macrophage of mice. Sixty male mice were distributed into 4 groups and CsA (Sandimmun Novartis) was injected subcutaneously in a daily dose of 50mg/kg body weight during the periods of 7, 14, 28 and 60 days (n=10), whereas control mice received saline solution (n=5). Blood samples were obtained by direct cardiac puncture. Serum calcium and total alkaline phosphatase levels were obtained. Macrophages were obtained trom the peritoneal cavities of treated and control mice 3 days after intraperitoneal administration of sodium thyoglycollate. Cells were incubated with lipopolysaccharide (LPS). After incubation, the culture supernatants were used for NO-and TNFa production assays. Digital radiographs of femurs were obtained with the use of a computerized imaging system, CDR R. Bone mineral density (BMD) measurements were made with the help of the software Photoshop 7,0 (Microsoft, 2003). The concentration of serum bone markers varied with the period of CsA administration. There was a significant decrease in the calcium levels after 28 days and ALP after 7 days. The BMD decreased significantly on distal epiphysis of femurs after 14 days and on proximal epiphysis after 60 days, in the mice submitted to CsA therapy. NO and TNF-a production had a significant increase in mice treated with CsA (7 and 14 days). Based on the results ofthe present study we confirmed that CsA induces bone loss in vivo. There was a synergism between the bone loss and the decrease of alkaline phosphatase, and calcium, and the increase ofNO and TNF-a / Doutorado / Patologia / Doutor em Estomatopatologia

Orientador: Edson Rosa Pimentel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T04:20:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tomiosso_TatianaCarla_D.pdf: 1449667 bytes, checksum: 16212cbce1bbf2fc92408a250881b4b4 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os tendões são estruturas que transmitem a força muscular ao osso. São formados por células imersas em uma matriz extracelular rica em fibras de colágeno paralelas. Tendões, como o calcanear, são resistentes, contudo podem ser acometidos por lesões. Esse tecido lesado não se regenera totalmente e a organização, estrutura e propriedades mecânicas do tendão reparado são inferiores ao tendão saudável. Além disso, há formação de adesão entre o tendão e o tecido conjuntivo adjacente, o que constitui um problema clínico. Tem sido reportado que o oxido nítrico (NO) tem influência na regeneração do tecido e que a inibição da síntese de NO poderia estar diretamente relacionada a uma não recuperação do tecido lesado. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo analisar o dano estrutural e o acúmulo de células inflamatórias após a injúria em tendão calcanear de ratos adultos não tratados e tratados com o inibidor da oxido nítrico sintetase (NOS), L-NAME (N?-nitro-L-arginina metil éster). Para tanto, os animais tiveram seus tendões parcialmente seccionados. Os animais tratados com L-NAME receberam a droga na água de beber quatro dias antes da secção e isto se manteve durante todo o período experimental. Os tendões de animais não tratados e tratados com L-NAME foram removidos aos 7, 14 e 21 dias pós-injúria, e processados para rotina em parafina (Histosec). Foram realizados cortes longitudinais de 7 µm de espessura, corados com Hematoxilina-Eosina (HE), Azul de Toluidina (AT) e Xilidine Ponceau (XP) e analisados em microscopia de luz comum e de polarização. Analisando o material não tratado com L-NAME, foi observada grande quantidade de fibroblastos, hemácias e células inflamatórias, principalmente macrófagos e mastócitos nos tendões de 7 dias pós-injúria, com diminuição progressiva para 14 e 21 dias. Com relação às fibras de colágeno, observou-se o início da reorganização das fibras em 14 dias após a lesão. Em 21 dias o grau de reorganização das fibras é maior, embora se mostre inferior se comparado a um tendão normal. Em contraste, os tendões dos animais tratados com L-NAME, em todos os três tempos, mostraram-se mais acentuadamente infiltrados por células inflamatórias. Em 21 dias pós-injúria essas células inflamatórias persistem, a matriz ainda mostra-se desorganizada e há formação de adesão entre o tendão e o tecido conjuntivo adjacente. Para as análises bioquímicas, os tendões foram divididos em regiões de compressão, de secção e de tensão. A análise em SDS-PAGE dos tendões seccionados normal mostrou uma maior quantidade de colágeno neste, e uma presença marcante de proteínas com Mr entre 14 e 67 kDa nos tendões seccionados de 7 e 14 dias pós-injúria de animais não tratados com L-NAME. O tendão de 21 dias pós-injúria apresenta um padrão de bandas eletroforéticas muito similar ao normal. Nos animais tratados, todos os três tempos apresentaram presença marcante daquelas proteínas. A dosagem de proteínas e quantificação de hidroxiprolina mostrou uma maior quantidade desses componentes nos animais tratados com L-NAME. Entretanto, foi observada uma maior concentração de glicosaminoglicanos (GAGs) nos animais não tratados. Com relação ao tipo de GAG presente nos tendões seccionados foi possível identificar a presença de dermatan sulfato. Os tendões também foram submetidos ao ensaio mecânico sobre tração a fim de avaliar suas propriedades biomecânicas. Durante este ensaio foi constatado que os tendões dos animais tratados com L-NAME são menos resistentes à ruptura. Nossos resultados mostram que o reparo do tendão é complexo e que a presença de NO é fundamental para a recuperação do tecido, visto que nos tendões de animais tratados com L-NAME, o tecido mostrou uma inflamação persistente / Abstract: The tendons are sctructures capable of transmiting force from the muscle to bone. They are formed by cells immersed into a extracellular matrix (ECM) rich in collagen fibres. Tendons, as the calcanear tendons, are capable of supporting high tension force, may also undergoes damages. The damaged tissue does not regenerate completely, and the organization, structure and mechanical properties of a repaired tendon are usually inferior to the healthy tendon. Adhesion between the tendon and the adjacent connective tissue occurs, resulting in a clinical problem. Nitric oxide (NO) influences tissue regeneration, and this inhibition may be correlated a non recuperation of the injured tissue. The aim of this work was to analyze the structural damage and the presence of inflammatory cells after the injury of rats calcaneal tendons non-treated and treated with L-NAME (N?-nitro-L-arginine methyl ester), a nitric oxide sinthase (NOS) inhibitor. The animals had its tendons partially transected. In the NO synthase inhibition experiments animals received L-NAME in their drinking water, ad libitum, for four days prior to surgical lesion of the calcaneal tendon and throughout the post-operative experimental period. The tendons non-treated and treated L-NAME animals were removed at 7, 14 and 21 days post-injury, and processed for paraffin inclusion (Histosec). Longitudinal sections with 7 µm were stained with Hematoxilin-Eosin (HE), Toluidine Blue (TB) and Xylidine Ponceau (XP). The non-treated tendons exhibited large amount of fibroblasts, blood cells and inflammatory cells as macrophages and mast cells, mainly in 7 days post-injury, with progressive decrease at 14 and 21 days. The reorganization of collagen fibers was observed since the 14 days after injury. At day 21 the organization of the collagen fibers, was higher compared to 14 days, but lesser than in the normal tendon. The tendons of L-NAME treated rats, in all periods, exhibited great infiltration of inflammatory cells. In 21 days post-injury of L-NAME treated rats, these inflammatory cells were still present, the ECM disorganization was observed and also adhesion between the tendon and adjacent adhesions tissue. For biochemical analysis, the tendons were divided in compression, section and tension regious. SDS-PAGE analysis of transected and normal tendons, showed a more expressive presence of collagen in normal rats and a remarkable presence of proteins with Mr between 14 and 67 kDa in transected tendons of non treated animals at 7 and 14 days post-injury. The rats, at 21 days post-injury, exhibited protein profile similar to the normal tendon. In L-NAME treated animals, in all tree-points, it was found a significative amount of these proteins. The analysis of protein and hydroxyproline content showed a larger amount of both components larger than in treated animals. On the other hand, a larger concentration of glycosaminoglycans (GAGs) was observed in non-treated animals. The analysis of GAGs in agarose gel showed a proeminent presence of dermatan-sulfate in the section region of both non-treated and treated animals. The biomechanical tests indicated that the L-NAME treated tendons were lesser resistents to rupture than the non-treated tendons. Our results revealed that the repair in tendons is a complex process and that NO is essential for the healing and complete recovering of the tissue, as in tendon of L-NAME treated animals, the tissue exhibited a persistent inflammatory process / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Fernando Ferreira Costa, Nicola Conran Zorzetto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T06:25:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Canalli_AndreiaAverci_D.pdf: 1313778 bytes, checksum: 1832f98c252279d3722a62951dcfc9c0 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A hemoglobina S (HbS) é decorrente de uma mutação de ponto que ocasiona a troca do ácido glutâmico pela valina na cadeia polipeptídica da globina beta. A polimerização da HbS desoxigenada (pouco solúvel), torna as hemácias menos flexíveis e favorece a impactação das mesmas na microcirculação com subseqüente obstrução da luz do endotélio e vaso-oclusão, seguida de lesões a orgãos alvos, responsáveis pela morbi-mortalidade associada a essa doença. Numerosas evidências sugerem que outros fatores participem da fisiopatologia da vaso-oclusão e do processo inflamatório crônico característico da anema falciforme (AF). A redução da biodisponibilidade do óxido nítrico (NO) pode ser um fator que favoreça a vaso-oclusão, uma vez que ele é um gás vasodilatador e pode inibir a adesão leucocitária. Nesse contexto, os objetivos do presente trabalho foram avaliar as propriedades adesivas dos neutrófilos de pacientes com AF e investigar o papel da via de sinalização do NO e dos nucleotídeos cíclicos (AMPc e GMPc) nos processos de vaso oclusão na AF. Os neutrófilos de pacientes com AF apresentaram maior adesão in vitro para ambos ligantes, fibronectina (FN) e molécula de adesão intercelular (ICAM-1), quando comparados à adesão de neutrófilos de controles. A co-incubação dos neutrófilos de pacientes com AF com agentes doadores de NO, nitroprussiato de sódio (SNP), dietilamina NANOato (DEANO) e com estimulador da guanilato ciclase solúvel (GCs), BAY 412272, diminuíram significativamente o aumento da adesão dos neutrófilos à FN e ao ICAM-1. O oxidiazolo [4,3-a]quinoxalin-1-one, um inibidor da GCs, reverteu a inibição da adesão provocada pelo SNP e DEANO à FN, indicando que a sinalização ependente de GMPc participa desse mecanismo. Os níveis intracelulares de GMPc foram significativamente maiores nos neutrófilos de pacientes que fizeram uso de terapias com hidroxiurea (HU). Em concordância com esses resultados, a adesão dos neutrófilos à FN e ao ICAM-1 foi significativamente menor em pacientes com AF em uso de HU se comparada com os neutrófilos de pacientes com AF sem terapia com HU. Adicionalmente, a co-incubação dos neutrófilos de pacientes com AF com KT5720 (um inibidor de PKA) reduziu a adesão basal enquanto que a co-incubação das células com KT5823 (inibidor de PKG) não alterou a adesão dos neutrófilos à FN. O estímulo dos neutrófilos de pacientes com AF com interleucina 8 (IL-8) aumentou significativamente a adesão à FN e esse aumento na adesão foi reduzido pela KT5720. Esses dados indicam que a regulação da sinalização da via dependente de AMPc tem um importante papel na alteração das propriedades adesivas nos pacientes com AF. Tal alteração pode ter implicação na fisiopatologia da AF e tanto a via PKA dependente de AMPc pode representar um alvo terapêutico para reduzir a alteração na função leucocitária, como agentes que estimulam a via de NO dependente de GMPc podem ter efeitos benéficos na função leucocitária desses pacientes / Abstract: Increased leukocyte adhesion to vascular endothelium contributes to vaso-occlusion in sickle cell disease (SCD). Since nitric oxide (NO) bioavailability is decreased in SCD and NO may inhibit leukocyte adhesion, we determined whether stimulation of NO-signalling pathways can decrease the adhesive properties of neutrophils from SCD individuals (SCDneu). SCDneu presented greater adhesion, in vitro, to both fibronectin (FN) and ICAM-1 than control neutrophils; co-incubation of SCDneu with the NO-donor agents, sodium nitroprusside (SNP) and dietheylamine NONOate (DEANO), and the guanylate cyclase stimulator, BAY41-2272, all significantly diminished increased adhesion to FN/ICAM-1. Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one, a guanylate cyclase inhibitor, reversed SNP/DEANO-diminished adhesion to FN, implicating cGMP-dependent signalling in this mechanism. Interestingly, intracellular cGMP was significantly higher in neutrophils from SCD individuals on hydroxyurea (SCDHUneu) and, accordingly, SCDHUneu adhesion to FN/ICAM-1 was significantly lower than that of SCDneu. In addition, co-incubation of SCDneu with KT5720 (an inhibitor of PKA), but not KT5823 (inhibitor of PKG), abrogated increased basal SCDneu adhesion. Stimulation of SCDneu with IL-8 also significantly augmented SCDneu adhesion to FN and this increase in adhesion was abolished by KT5720. Data indicate that up-regulated cAMP signalling plays a significant role in altered adhesive properties in SCDneu. Such alterations may have significant implications for the pathophysiology of the disease and the cAMP-PKA pathway may represent a therapeutic target for the abrogation of altered leukocyte function. Agents that stimulate the NO/cGMP-dependent pathway may have beneficial effects on leukocyte function if used in these individuals / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Ione Salgado / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T11:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wulff_Alfredo_M.pdf: 2480773 bytes, checksum: f1cbea2506b80bbad1e739df2bd5c1c4 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi estudar os mecanismo s de síntese e de degradação do radical óxido nítrico (NO) pela mitocôndria vegetal, com ênfase à influência das NAD(P)H desidrogenases e da oxidase alternativa (AOX) nestes processos. Os experimentos foram realizados com mitocôndrias isoladas de células em cultura da planta modelo Arabidopsis thaliana. Inicialmente estabeleceu-se um protocolo para o isolamento e purificação de mitocôndrias, cuja integridade funcional foi determinada pelo controle respiratório, potencial elétrico de membrana e transporte eletroforético de cálcio. Os processos de síntese e de degradação de NO foram analisados monitorando-se o consumo de oxigênio e as concentrações de NO no meio de reação, com eletrodos específicos. Os resultados mostraram que o nitrito inibiu a respiração das mitocôndrias de A. thaliana em competição com o oxigênio do meio. Esta inibição foi revertida por cPTIO, um seqüestrador de NO. Quando a AOX foi inibida por n-propilgalato, o efeito inibitório do nitrito na respiração mitocondrial foi aumentado, enquanto que, na presença de myxothiazol, que previne a redução da citocromo c oxidase (COX), o nitrito não teve efeito na respiração. Os efeitos observados do nitrito no consumo de oxigênio sugeriram que NO foi sintetizado pelas mitocôndrias de A. thaliana através de uma atividade redutora de nitrito. Entretanto, a síntese de NO a partir de nitrito foi principalmente detectada em anaerobiose. Em altas concentrações de nitrito (1-5 mM), a produção de NO se mostrou praticamente insensível aos inibidores da cadeia respiratória, enquanto que, em concentrações menores de nitrito (100 -200 ?M) a COX, mas não a AOX, contribuiu para a síntese de NO. A exposição das mitocôndrias ao NO ou ao nitrito causou uma inibição transiente e menor no consumo de oxigênio quando NAD(P)H f oi utilizado como substrato respiratório, em relação ao succinato. Estas inibições foram potencializadas por superóxido dismutase, sugerindo um mecanismo de degradação de NO dependente de NAD(P)He de oxigênio pelas mitocôndrias de A. thaliana. O conjunto dos resultados mostra que o NO pode ser produzido pela mitocôndria de A. thaliana através de uma atividade redutora de nitrito e que as NAD(P)H desidrogenases e a AOX, além da COX, podem interferir nesta produção. Em aerobiose, a quantidade de NO produzido pode ser controlada pelas atividades de degradação das NAD(P)H desidrogenases e pela COX. A AOX contribui de maneira oposta, ajudando a manter a concentração de NO. Em anaerobiose a atividade redutora de nitrito é favorecida sendo o NO produzido nestas condições pela COX e também devido ao estado mais reduzido da cadeia respiratória. Ainda, em anaerobiose, os mecanismos de degradação de NO, dependentes de oxigênio, estão inibidos. Em conclusão, os resultados deste trabalho mostram a importância das proteínas alternativas da cadeia respiratória da mitocôndria para a homeostase do NO na planta / Abstract: The objective of this work was to study the mechanisms of synthesis and degradation of NO by plant mitochondria, with emphasis on the influence of the NAD(P)H dehydrogenases and the alternative oxidase (AOX) in these processes. The experiments were carried out with mitochondria isolated from cells in culture of the model plant Arabidopsis thaliana. Initially, a protocol for the isolation and purification of mitochondria was established, and their functional integrity was determined by respiratory control, electric membrane potential and electrophoretic calcium transport. The processes of synthesis and degradation of NO were analyzed by monitoring oxygen consumption and NO concentration in the reaction medium with specific electrodes. The results showed that nitrite inhibited respiration of A. thaliana mitochondria, in competition with oxygen in the medium. This inhibition was reversed by cPTIO, an NO scavenger. When AOX was inhibited by n-propylgalate, the inhibitory effect of nitrite in mitochondrial respiration was increased, whereas in the presence of myxothiazol, which prevents the reduction of cytochrome c oxidase (COX), nitrite had no effect on respirati on. The observed effects of nitrite in the oxygen consumption suggested that NO was synthes ized by A. Thaliana mitochondria through a nitrite reductase activity. Meanwhile, the synthesis of NO from nitrite was mainly detected under anaerobiosis. At high concentrations of nitrite (1-5 mM), the production of NO was virtually insensitive to inhibitors of the respiratory chain, while at lower concentrations of nitrite (100-200 ?M) COX, but not AOX, contributed for the synthesis of NO. The exposure of mitochondria to NO or nitrite caused a transient and lower inhibition in oxygen consumption when NAD(P)H was used as respiratory substrate, compared to succinate. These inhibitions were enhanced by superoxide dismutase, suggesting an NAD(P)H- and oxygendependent mechanism for NO degradation by mitochondria of A. thaliana. The overall results show that NO can be produced by A. thaliana mitochondria through a nitrite reductase activity and that NAD(P)H dehydrogenases and AOX, in addition to COX, can interfere in this production. In aerobiosis the amount of NO produced can be controlled by the degradation activities of NAD(P)H dehydrogenases and COX. The AOX has an opposite effect, keeping the concentration of NO. In anaerobiosis the nitrite reductase activity is favore d and NO is produced in these circumstances by COX, and also due the more reduced state of the respiratory chain. Additionally, in anaerobiosis, the oxygen -dependent mechanisms of NO degradation are inhibited. In conclusion, the results of this study show the importance of the alternative proteins of the mitochondrial respiratory chain for NO homeostasis in the plant / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Marta Helena Krieger, Regina Celia Spadari / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T11:44:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caceres_VivianedeMenezes_M.pdf: 892273 bytes, checksum: 832dcecc572cc26759a9832b12d09b9e (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os objetivos do presente estudo são investigar e comparar o efeito do nitrosotiol doador de NO (SNAC) e do doador de NO-/HNO (Sal de Angelis) na estrutura e função do miocárdio sob processo aterogênico precoce induzido pela dieta em camundongos com deleção gênica do receptor de LDL (LDLr-/-). Os dados obtidos possibilitam avaliar a eficácia destas espécies químicas, bem como os mecanismos de ação envolvidos nos efeitos preventivos promovidos pelo sistema NO/NOS e pela via HNO, na hipertrofia ventricular esquerda, neste modelo animal. O papel dos adrenoceptores beta no controle da função cardíaca destes camundongos LDLr-/- também foi avaliado. A deleção gênica do receptor de LDL resultou em déficit contrátil cardíaco, sem alteração na homogeneidade da população miocárdica de adrenoceptores ß1, mas quando associada à dieta hiperlipídica induziu participação de adrenoceptores ß2, com conseqüente alteração da sensibilidade aos efeitos inotrópico e cronotrópico da isoprenalina. O tratamento com SNAC e Sal de Angelis (SA) preveniu o aumento da sensibilidade à isoprenalina, provavelmente ao induzir o acoplamento dos adrenoceptores ß 2 com a proteína Gi. Além disso, o SA foi capaz de corrigir o déficit contrátil do miocárdio. Camundongos LDLr-/- também apresentaram hipertensão, a qual foi prevenida pelo tratamento com SNAC. Quando a deleção gênica estava associada à dieta hiperlipídica, os camundongos apresentaram hipertensão e hipertrofia ventricular esquerda. O SNAC e o SA previniram a hipertrofia, mas não a hipertensão. Concluímos que camundongos com deleção gênica do receptor de LDL, alimentados com dieta hiperlipídica são um modelo interessante de alterações cardíacas e hemodinâmicas, especialmente quando enfocamos alterações das respostas dos adrenoceptores beta adrenérgicos, e que compostos doadores de NO e seus congêneres podem se tornar uma alternativa para prevenir tais alterações / Abstract: The aim of this study is to analyze and to compare the effects of a nitrosothiol NO donnor (SNAC) and of a NO-/HNO donor (Angelis Salt, AS) on the structure and functioning of myocardium under atherogenic process induced by a hyperlipic diet in LDL receptor knockout mice (LDLr-/-). The role played by the ß adrenoceptor subtypes in the control of the cardiac function of LDLr-/- mice has also been analysed. LDLr-/- mice exhibited a contractile deficit in the myocardium, with no alteration in the response to isoprenaline, which is mediated by a homogeneous population of ß1 adrenoceptors. However, when it was associated with a hyperlipidic diet, ß2 adrenoceptors participate in the inotropic and chronotropic responses to isoprenaline, causing an alteration on tissue sensitivity to the agonist. LDLr-/- knockout mice treatment with SNAC or AS avoided the atria supersensitivity to isoprenaline by inducing ß2 adrenoceptors coupling to Gi protein. Moreover, AS but not SNAC was able to recover the atria contractile performance. LDLr-/- mice also presented hypertension that it was prevented by the SNAC treatment. Hypertension was accompanied by ventricular hypertrophy when the gene deletion was associated with a hyperlipidic diet. SNAC or AS treatment prevented the hypertrophy, but not the hypertension. We concluded that LDLr-/- mice fed with a hyperlipidic diet are useful models for the study of haemodynamic and cardiac diseases related to a hypercholesterolemic profile, mostly when the focus is to investigate the participation of the adrenoceptors in the involved processes, and that NO donnors or similar compounds may be an alternative tool to prevent such alterations / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Paulo Cesar Rodrigues Palma, Cassio Luis Zanettini Riccetto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T15:13:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souto_SophiaConsuelo_M.pdf: 4211847 bytes, checksum: 42d0aabe09e9a27f66e06e5f8b6d381f (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Introdução: O sexo é parte do cotidiano das pessoas não estando limitado à concepção. Diversos fatores podem inibir a resposta sexual da mulher, tanto de forma transitória como prolongada. A resposta sexual sofre efeitos da: idade, tabaco, colesterol, hipertensão e diabetes. É uma condição multifatorial, com componentes anatômicos, fisiológicos, médicos, psicológicos e sociais. (Wyman JF; et al, 1987) O aumento do fluxo sanguíneo clitoridiano ocorre em decorrência do estímulo sexual, sendo parte da resposta sexual feminina. (Levin RJ, 1980) Sendo, portanto, uma boa forma de avaliar um método de tratamento para disfunção sexual feminina. O óxido nítrico (NO) e peptídeos vasoativos intestinais estão implicados no ingurgitamento de tecido clitoridiano após estimulação sexual. O NO constitui uma das menores e mais simples moléculas biossintetizadas, é um radical livre, gasoso, inorgânico, incolor, que possui sete elétrons do nitrogênio e oito do oxigênio, tendo um elétron de oxigênio desemparelhado. (Beckman JS & Koppenol WH, 1996) Objetivo Avaliar através do exame de ultra-sonografia Doppler se a aplicação tópica de um gel doador de óxido nítrico aumentaria o fluxo sanguíneo clitoridiano de mulheres normais. Materiais e Métodos No presente estudo, foram avaliadas vinte mulheres normais das quais passaram por exame de ultra-sonografia Doppler na artéria clitoridiana, comparando o fluxo sanguíneo normal e o fluxo sanguíneo com a utilização do gel doador de óxido nítrico. A analise hemodinâmíca constou de: velocidade sistólica de pico, velocidade diastólica e índice de resistência do vaso. Resultados: Na análise estatística verificou-se diferença significância para todos os parâmetros estudados (p < 0,05). A velocidade sistólíca mediana inicial foi de 104 e após aplicação do gel doador de óxido nítrico foi de 109 (p=0,002). A velocidade diastólica mediana inicial foi de 107 e após aplicação do gel passou a 106 (p=0,043) e a resistência mediana inicial foi de 105 e após aplicação do gel tornou-se 107 (p=0,005). Conclusão: Concluímos que a utilização tópica deste gel doador de óxido nítrico foi eficaz para aumentar o fluxo sanguíneo na região clitoridiana / Abstract: Introduction Sex is a part of the daily life of people and it is not just limited to conception. Different factors may inhibit female's sexual response, in a transitory or prolonged way. The sexual response is affected by age, tobacco, cholesterol, hypertension and diabetes. It is a multifactor condition, with anatomical, physiological, medical, psychological and social factors. (Wyman JF; et al, 1987) The increase of blood flow in the clitoris is due to sexual stimulation, being a part of the female's sexual response. (Levin RJ, 1980) That makes it a good way to asses a treatment for female sexual dysfunction. The nitric oxide (NO) and intestinal vase active peptides are involved in the ingurgitation of clitoridean tissue after sexual stimulation. The nitric oxide is one of the smallest and most simple biosynthesized molecules, and it is a gaseous, inorganic, colorless free radical, with seven electrons from nitrogen and eight from oxygen, and one oxygen electron is uneven. (Beckman JS & Koppenol WH, 1996) Objective Evaluate through the Doppler ultra-sound if the topic use of a nitric oxide donor gel would increase the blood flow in the clitoris of healthy women. Materials and method In this study we evaluated twenty healthy women who underwent ultrasound of the clitoris artery, comparing the normal blood flow and the flow with the use of the gel. The hemodynamic analysis considered: systolic peak speed, diastolic speed and vase resistance index. Results In the statistical analysis we found significant statistical differences in all the parameters measured (p < 0,05). The mean initial systolic speed was 104 and after the gel use it was 109 (p=0,002). The mean initial diastolic speed was 107 and with Abstract the gel it was 106 (p=0,043) and the mean initial resistance was 105 and after the use of the gel it was 107 (p=0,005). Conclusion The use of the topic gel proved to be effective to increase the blood flow in the area of the clitoris / Mestrado / Pesquisa Experimental / Mestre em Cirurgia

Orientador: Edson Antunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:38:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SouzaFilho_LuisGustavode1974-_M.pdf: 2079653 bytes, checksum: 497d01659ac0eed18bd9c81662ca0b59 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os inibidores das óxido nítrico sintases (NOS) são amplamente utilizados para avaliar a contribuição do NO na alergia pulmonar, mas os dados obtidos pela utilização de tais inibidores são controversos. Neste estudo, ensaios farmacológicos, bioquímicos e farmacocinéticos foram realizados para se avaliar os efeitos dos tratamentos agudo e crônico com o inibidor não seletivo da NOS, L-NAME, assim como do inibidor seletivo para NOS induzível (iNOS), aminoguanidina, sobre a inflamação das vias aéreas em camundongos BALB/c desafiados com ovalbumina (OVA). O tratamento crônico com L-NAME (50 e 150 mg/kg/dia, por três semanas) aumentou significativamente o número de eosinófilos no lavado broncoalveolar (LBA) de animais desafiados com ovalbumina (OVA; 0,19 ± 0,02 e 0,34 ± 0,03 x 106células/LBA, respectivamente; P<0,0001) em relação aos não tratados (0,13 ± 0,02 x 106 células/LBA). No parênquima pulmonar, o tratamento crônico com L-NAME (150 mg/kg/dia) também elevou significativamente o número de eosinófilos nos animais desafiados com OVA em relação aos animais não tratados (27,0 ± 5,1 e 18,2 ± 1,6 eosinófilos/brônquio, respectivamente; P<0,05). Contrariamente, os tratamentos agudo com L-NAME (50 mg/kg; gavagem 30 min antes do primeiro desafio com OVA) e crônico com aminoguanidina (20 mg/kg/dia, por três semanas) reduziram o número de eosinófilos no LBA (0,05 ± 0,01 e 0,04 ± 0,02 x 106 células/LBA, respectivamente; P<0,05) em relação ao controle. Os tratamentos agudo e crônico com L-NAME reduziram a atividade da NOS constitutiva (cNOS) no cérebro em relação aos animais não tratados (tratamento agudo: 5,8 ± 0,4 e 3,6 ± 0,2 pmol/min/mg de proteína; tratamento crônico: 5,7 ± 0,3 e 0,7 ± 0,2 pmol/min/mg de proteína, para controle e tratado, respectivamente; P<0,05). A atividade da NOS induzível (iNOS) pulmonar foi significativamente reduzida pelos tratamentos agudo com L-NAME e crônico com aminoguanidina (0,7 ± 0,05 e 0,04 ± 0,02 pmol/min/mg de proteína, respectivamente; P<0,05) em relação aos animais não tratados (1,2 ± 0,2 pmol/min/mg de proteína). Contudo, o tratamento crônico com L-NAME não afetou a atividade da iNOS pulmonar. Os níveis séricos de IgE mostraram-se elevados nos animais desafiados com OVA, mas não foram afetados por nenhum dos tratamentos. O tratamento crônico com aminoguanidina (mas não o tratamento crônico com L-NAME) reduziu os níveis elevados de eotaxina no LBA (3,4 ± 1,2 e 1,0 ± 0,5 pg/ml, para controle e tratado, respectivamente; P<0,05). As reduções dos níveis de NOx no LBA pelos tratamentos agudo com L-NAME e crônico com aminoguanidina (1,8 ± 0,4 e 0,6 ± 0,3 µM, respectivamente) foram maiores quando comparadas ao tratamento crônico com L-NAME (6,8 ± 0,6 µM) em relação aos animais não tratados (8,8 ± 0,8 µM). Os protocolos farmacocinéticos mostraram que o L-NAME não é biodisponível quando dado via oral. As concentrações séricas do metabólito do L-NAME, N?-nitro-L-arginina, diminuiram progressivamente de 30 min a 24 horas após a administração (72,0 a 32,1 ng/mL). No tratamento crônico com L-NAME, a concentração do N?-nitro-L-arginina (16,2 ng/mL) mostrou-se próxima do limite de detecção do método (10 ng/ml). Em conclusão, o tratamento crônico com L-NAME por três semanas produziu baixas concentrações séricas do N?-nitro-L-arginina, causando inibição preferencial da atividade da cNOS. Portanto, a potenciação do influxo de eosinófilos pelo tratamento crônico com L-NAME supostamente remove o NO protetor derivado da cNOS, com nenhuma interferência sobre o agravamento da inflamação devido ao NO oriundo da iNOS / Abstract: Nitric oxide synthase (NOS) inhibitors are largely used to evaluate the NO contribution to pulmonary allergy, but contrasting data have been obtained. In this study, pharmacological, biochemical and pharmacokinetic studies were performed to evaluate the effects of acute and chronic treatment of BALB/C mice with non-selective (L-NAME) and selective (aminoguanidine) NOS inhibitors in ovalbumin (OVA)-challenged mice. Long-term L-NAME treatment (50 and 150 mg/kg/day, three weeks) significantly increased the eosinophil number in bronchoalveolar lavage (BAL) fluid (0.19 ± 0.02 and 0.34 ± 0.03 x 106 cells / BAL, respectively; P<0.0001) in comparison with non-treated animals (0.13 ± 0.02 x 106 cells / BAL). In the bronchiolar parenchyma, chronic L-NAME treatment (150 mg/kg/day) also increased the eosinophil number (18.2 ± 1.6 and 27.0 ± 5.1 eosinophils/bronchio, for treated and untreated, respectively; P<0.05). On the other hand, acute L-NAME (50 mg/kg, given by gavage 30 min prior to the first OVA challenge) and aminoguanidine (20 mg/kg/day, three weeks) rather reduced the eosinophil number (0.05 ± 0.0 and 0.04 ± 0.02 x 106 cells / BAL, respectively; P<0.05). Chronic and acute L-NAME treatments markedly reduced the constitutive NOS (cNOS) activity in brain (0.7 ± 0.2 and 3.6 ± 0.2 pmol/min/mg of protein, respectively; P<0.05) in comparison with untreated animals (5.7 ± 0.3 and 5.8 ± 0.4 pmol/min/mg of protein, respectively). The inducible pulmonary NOS (iNOS) activity was markedly reduced by acute L-NAME and aminoguanidine (0.7 ± 0.05 and 0.04 ± 0.02 pmol/min/mg of protein, respectively; P<0.05) compared with untreated animals (1.2 ± 0.2 pmol/min/mg of protein). In contrast, chronic L-NAME failed to affect the iNOS activity. The increased serum IgE levels seen in OVA-challenged animals were not affected by any treatment. Aminoguanidine (but not chronic L-NAME) restored the increased eotaxin levels in BAL (3.4 ± 1.2 and 1.0 ± 0.5 pg/ml; P<0.05). The NOx- levels in BAL fluid were reduced by both acute and chronic L-NAME, as well as by aminoguanidine (1.8 ± 0.4, 6.8 ± 0.6 and 0.6 ± 0.3 µM, respectively; P<0.05) compared with untreated animals (8.8 ± 0.8 µM); however, the reductions of NOx- levels by acute L-NAME and aminoguanidine were significantly higher than the chronic L-NAME treatment. The pharmacokinetic protocols showed that L-NAME per se is not bioavailable when given per os. The serum concentrations of its metabolite N?-nitro-L-arginine decreased from 30 min to 24 h (72.0 to 32.1 ng/mL) after acute L-NAME intake. In chronic treatment, N?-nitro-L-arginine concentration (16.2 ng/mL) was close to the detection limit (10 ng/mL). In conclusion, 3-week treatment with L-NAME yields low serum N?-nitro-L-arginine concentrations, causing a preferential inhibition of cNOS activity. Therefore, potentiation of eosinophil influx by chronic L-NAME reflects a removal of protective cNOS-derived NO, with no interference on the ongoing inflammation due to iNOS-derived NO / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Edson Arantes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:45:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lintomen_Leticia_D.pdf: 1121941 bytes, checksum: 2c92a8ddfce83c01ed6c71e524096e0b (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os eosinófilos participam da patogênese de várias doenças inflamatórias, incluindo infecções parasíticas e doenças alérgicas. Dentre as doenças alérgicas, a eosinofilia tem presença marcante na asma. Atualmente, a asma afeta 300 milhões de indivíduos no mundo, sendo considerada um problema de saúde pública mundial. A asma é uma doença inflamatória crônica que envolve interações entre fatores externos e genéticos, e tem como características principais a inflamação pulmonar e a hiperresponsividade brônquica. O recrutamento de eosinófilos para as vias aeríferas contribui para o caráter crônico da asma. A migração de eosinófilos para o tecido inflamado é um processo complexo, que é regulado por numerosos fatores, incluindo citocinas, quimiocinas, óxido nítrico (NO) e interações de moléculas de adesão. Estudos prévios investigaram as interações funcionais entre NO e CC-quimiocinas. Young e colaboradores (1999) mostraram que o número de eosinófilos no lavado broncoalveolar (LBA) de macacos desafiados está marcadamente aumentado 24 horas após o desafio, e que este aumento é acompanhado de altos níveis de NO no ar exalado e de eotaxina no LBA. Em pacientes com rinite, a eotaxina aumentou o número de eosinófilos no fluido do lavado nasal e também os níveis de NO nasal (Hanazawa et al., 1999). Em contraste, em modelos murinos de asma a inibição seletiva da NOS induzível resultou na redução da migração eosinofílica para os pulmões (Feder et al., 1997; Iijima et al., 2001), que estava associada com o aumento da expressão da CC-quimiocina proteína quimiotática para monócito-1 (MCP-1) no tecido pulmonar (Trifilieff et al., 2000). Além disso, NO (ou doadores de NO) também são capazes de inibir a produção de RANTES (Frank et al., 2000). O NO via formação de peroxinitrito (ONOO-) também pode reduzir a migração de eosinófilos induzida por eotaxina (Sato et al., 2000). Entretanto, o papel modulatório do NO nas funções do eosinófilo mediadas por CC-quimiocinas ainda permanece contraditório. Portanto, o presente trabalho investigou o efeito modulatório do NO na adesão aumentada, quimiotaxia e desgranulação do eosinófilo induzidas pelas Ccquimiocinas eotaxina e RANTES in vitro, e a expressão de VLA-4 e Mac-1 na superfície do eosinófilo. Nós realizamos ensaios funcionais (adesão e desgranulação), análise da expressão de moléculas de adesão por citometria de fluxo (VLA-4 e Mac-1) e a investigação de resíduos de tirosina nitrada para avaliar interações do NO com CC-quimiocinas em eosinófilos humanos. Os ensaios de MTT mostraram que as incubações de eosinófilos por 2, 3, ou 4 horas com eotaxina (10, 100 e 1000 ng/ml) ou RANTES (10, 100 e 1000 ng/ml) não afetam a viabilidade celular e, em determinadas condições, até promovem a ativação das células. Os resultados de adesão à fibronectina mostraram que a eotaxina (10, 100 e 1000 ng/ml) ou RANTES (10, 100 e 1000 ng/ml) não aumentam a adesão de eosinófilos em períodos de incubação de 2 e 3 horas. Entretanto, a incubação de eosinófilos por 4 horas com eotaxina ou RANTES aumentou significativamente a adesão à fibronectina. O L-NAME (0.1 mM), individualmente, aumentou significativamente a adesão de eosinófilos à fibronectina; porém a co-incubação de L-NAME com eotaxina (ou RANTES) não afetou a adesão observada com cada agente isoladamente. Além disso, a expressão de VLA-4 e de Mac-1 não foi modificada em nenhuma das condições experimentais testadas. Eotaxina e RANTES também não foram capazes de aumentar os níveis de GMPc nos eosinófilos, em condições onde o SNP (0.1 mM), usado como controle positivo, aumentou significativamente os níveis desse segundo mensageiro. Além disso, eosinófilos tratados com L-NAME, eotaxina e RANTES, individualmente, foram capazes de desgranular estas células, mas a co-incubação de LNAME com eotaxina (ou RANTES), não alterou esta resposta. Os resultados de quimiotaxia mostraram migração significativa de eosinófilos (tratados ou não com LNAME) em resposta à eotaxina ou RANTES. Os resultados obtidos de Western blotting para 3-nitrotirosina mostraram ausência de proteínas nitradas nos eosinófilos de indivíduos sadios ou asmáticos. No conjunto, nossos resultados mostram que, nas condições experimentais estabelecidas, o NO não modula adesão, migração e desgranulação em eosinófilos estimulados com eotaxina ou RANTES / Abstract: Eosinophils participate in the pathogenesis of many inflammatory diseases, including parasitic infections and allergic diseases. Of the allergic diseases, asthma is characterized by eosinophilia. Currently, asthma affects 300 million people in world, and is an important public health problem. Asthma is an inflammatory chronic disease that involves interactions between external and genetic factors, and has lung inflammation and bronchial hyperresponsiveness as major features. The recruitment of eosinophils into airways contributes to the asthma chronic character. The eosinophil migration to inflamed tissue is a complex process regulated by several factors, including cytokines, chemokines, nitric oxide (NO) and adhesion molecule interactions. Previous studies have investigated the functional interactions between NO and CC-chemokines. Young et al. (1999) showed that the number of eosinophils in the bronchoalveolar lavage (BAL) fluid of challenged monkeys is markedly increased at 24 h post-challenge, accompanied by higher levels of both exhaled NO and eotaxin in BAL fluid. In rhinitis patients, eotaxin increased the number of eosinophils in the nasal lavage fluid, and that was also accompanied by elevated nasal NO levels (Hanazawa et al., 1999). In contrast, in murine models of asthma, selective inhibition of inducible NOS resulted in a reduction in pulmonary eosinophil migration (Feder et al., 1997; Iijima et al., 2001), with an increased expression of the CC-chemokine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in the lung tissue (Trifilieff et al., 2000). Moreover, NO (or NO donors) have also been shown to inhibit the production of RANTES (Frank et al., 2000). Nitric oxide via peroxynitrite (ONOO-) formation is reported to reduce eotaxin-induced eosinophil migration (Sato et al., 2000). However, the modulatory role of NO in the CC-chemokines-mediated eosinophil functions is still not well understood. Therefore, the present study was designed to investigate the modulatory effect of NO in the enhanced eosinophil adhesion, chemotaxis and degranulation induced by the Ccchemokines eotaxin and RANTES in vitro, and the expression of VLA-4 and Mac-1 on the eosinophil surface. We therefore carried out functional assays (adhesion and degranulation), flow cytometry analysis of adhesion molecules (VLA-4 and Mac-1 expression) and investigation of tyrosine nitration to evaluate the interactions between NO and CC-chemokines in human eosinophils. MTT assays showed that incubation of eosinophils for 2, 3 or 4 hours with eotaxin (10, 100 and 1000 ng/ml) or RANTES (10, 100 and 1000 ng/ml) did not affect cellular viability and, in some conditions, even caused cellular activation. The results of adhesion to fibronectin showed that eotaxin (10, 100 and 1000 ng/ml) or RANTES (10, 100 and 1000 ng/ml) did not increase eosinophil adhesion at 2 or 3 hours of incubation. Nevertheless, the incubation of eosinophils for 4 hours with eotaxin or RANTES significantly increased adhesion to fibronectin. L-NAME (0.1 mM), alone, significantly increased eosinophil adhesion to fibronectin; however the co-incubation of L-NAME with eotaxin (or RANTES) did not affect the adhesion of each agent. Moreover, expression of VLA-4 and Mac-1 were not modified by any of the experimental conditions. Eotaxin and RANTES did not increase eosinophil cGMP levels under the same conditions in which SNP (0.1mM), used as a positive control, significantly increased the levels of this second messenger. Furthermore, eosinophils treated with L-NAME, eotaxin and RANTES, alone, demonstrated degranulation, however the co-incubation of eosinophils with L-NAME and eotaxin (or RANTES) did not alter this response. Chemotaxis assays showed a significant eosinophil (treated or not with L-NAME) migration in response to eotaxin or RANTES. Western blotting for 3-nitrotyrosine-3 showed a lack of nitrated proteins in eosinophils from healthy or asthmatic donors. Taken together, results show that, under the experimental conditions established, NO does not modulate adhesion, migration and degranulation in eotaxin or RANTES-stimulated eosinophils / Doutorado / Doutor em Farmacologia