A cultura do citros é produzida mundialmente, sendo consumidos in natura ou na forma de produtos industrializados. Os frutos cítricos são hospedeiros de muitos patógenos. A pinta preta é uma doença que afeta a citricultura, e tem como agente causal Guignardia citricarpa Kiely. A pinta preta dos citros é controlada mais comumente com defensivos sintéticos, mas esta prática tem acarretado em consequências indesejáveis, tais como, aumento do custo de produção, contaminação do meio ambiente, envenenamento de produtores e consumidores. Em vista disso, faz-se necessário a procura por novos defensivos agrícolas alternativos de baixo impacto ambiental. Desde muito tempo, diversos estudos têm mostrado a ação antagônica de inúmeras linhagens dos fungos do gênero Trichoderma sobre outros fungos. Embora existam estudos sobre o controle de Guignardia citricarpa kiely com espécies de Trichoderma, é sabido que a variabilidade genética entre linhagens do antagonista e do patógeno apresentam uma consequência diferencial na eficiência do controle. Este trabalho teve por objetivo avaliar a capacidade antagonista de quatro linhagens de Trichoderma spp sobre Guignardia citricarpa, buscando identificar os isolados que possam ser aplicadas nos cultivos de citros no Rio Grande do Sul, com incidência da pinta preta. Para tal estudo foram feitos teste de antagonismo e teste de compostos voláteis com as linhagens T1A, T4, T17 e T8 de Tricodema spp. Avaliação da atividade enzimática quitinolítica com as linhagens T1A e T17 e avaliação da sobrevivência dos conídeos dos isolados T1A e T17 de Trichoderma spp. na parte aérea das mudas de laranjeira da variedade valência. Os isolados T8, T4, T1A e T17 de Trichoderma spp. em cultura dupla apresentam maior velocidade de crescimento que o isolado A49/11 de Guignardia citricarpa, estas mesmas linhagens em cultura dupla desenvolveram micoparasitismo sobre o isolado A49/11 de Guignardia citricarpa. Os isolados T8, T4, T1A e T17 de Trichoderma spp. foram capazes de inibir o crescimento micelial do isolado A49/11 de Guignardia citricarpa por emissão de metabólitos voláteis. Os isolados T1A e T17 de Trichoderma spp. liberaram quitinases ativas na presença de micélio desativado de G. citricarpa e Trichoderma spp. A população de Trichoderma spp. aspergida na parte aérea das plantas reduz acentuadamente no período de trinta dias, porém ainda mantém uma concentração que possivelmente pode agir como agente de controle biológico. Sendo assim as linhagens de Trichoderma utilizadas neste trabalho podem ser uma alternativa aos defensivos sintéticos para o controle da pinta preta dos citros. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2015-05-28T16:52:56Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Kamila Pinto de Azevedo de Souza.pdf: 1394349 bytes, checksum: d885d9f6c081ad87ac5a0007818cf0ad (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-28T16:52:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Kamila Pinto de Azevedo de Souza.pdf: 1394349 bytes, checksum: d885d9f6c081ad87ac5a0007818cf0ad (MD5) / The culture of citrus is produced worldwide, being consumed in natura or as industrialized products. The citric fruits, such as the orange trees, host many pathogens. The black spot is one disease that affects the citrus culture and has as its usual cause agent Guignardia citricarpa Kiely. The black spot of citrus is more commonly controlled with synthetic pesticides, but this measure has caused undesirable consequences such as the increase of production costs, environment contamination, producers and consumer poisoning. Due to this fact, it is necessary the search for new alternatives of agricultural pesticides of low environmental impact. Since long time ago, several studies have shown the opposite action of several lineages of fungi of genre Trichoderma over other fungi. Although there are studies about the control of Guignardia citricarpa kiely with species of Trichoderma, it is known that the genetic variability of the antagonist and the pathogens show a significant consequence in the efficiency control. This paper has as its objective to evaluate the antagonist capacity of four lineages of Trichoderma spp in controlling Guignardia citricarpa, looking for the identification of isolated ones that could be applied in the citrus cropping in Rio Grande do Sul, with incidence of the black spot. For this study, antagonism tests and volatile compounds tests were carried out with lineages T1A, T4, T17 and T8 of Tricodema spp. Evaluation of enzyme chitinolytic with lineages T1A and T17and evaluation survival of conidium of isolated T1A and T17 de Trichoderma spp in the top part of seedling of orange trees of the Valencia type. The isolated T8, T4, T1A and T17 of Trichoderma spp. in coupled culture show faster speed growing than the isolated A49/11 of Guignardia citricarpa, the same lineages of coupled culture have developed mycoparasitism over the isolated A49/11 of Guignardia citricarpa. The isolated T8, T4, T1A and T17 of Trichoderma spp were capable of inhibiting the mycelia growing of isolated A49/11 of Guignardia citricarpa by emission of volatile metabolites. The isolated T1A and T17 of Trichoderma spp released active chitinases in the presence of non active mycelium of G. citricarpa and Trichoderma spp. The population of Trichoderma spp. sprayed in the top parts of plants sharply reduces in the period of thirty day, however it still maintains a concentration that can possibly acts as a biologic control agent. As a consequence the lineages of Trichoderma spp. used in this paper can be an alternative to synthetic pesticides to control the citrus black spot.

Orientador: Oswaldo Durival Rossi Junior / Banca: Angela Cleusa de Fátima Banzatto de Carvalho / Banca: Laudicéia Giacometti Lopes / Resumo: O gelo é um excelente meio de prolongar o frescor do peixe e na indústria alimentícia tem um dos mais importantes papéis, uma vez que retarda a multiplicação bacteriana e, se fabricado sob más condições sanitárias pode se tornar um fator de risco para os consumidores. Sendo assim, este estudo objetivou avaliar a qualidade microbiológica do gelo utilizado na conservação do pescado por meio da quantificação de microrganismos heterotróficos mesófilos e psicrotróficos viáveis, coliformes totais e termotolerantes, além de investigar a presença de Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Salmonella spp. Para tal, foram colhidas 63 amostras de gelo de seis estabelecimentos, sendo cinco hipermercados e uma peixaria, situados no município de Ribeirão Preto/SP. Os resultados obtidos mostraram populações de microrganismos heterotróficos mesófilos variando entre 1,0 x 10 e 3,0 x 104 UFC.mL-1 e psicrotróficos variando entre 1,0 x 10 e 1,0 x 106 UFC/mL, sendo que 19,05% das amostras contendo microrganismos mesófilos encontravam-se com populações acima do permitido pela legislação vigente. Já 22,22% das amostras foram positivas para coliformes totais e 9,52% para coliformes termotolerantes. A presença de Staphylococcus aureus foi confirmada em três amostras, E. coli e Salmonella spp. não foram encontradas. Portanto, a avaliação da qualidade microbiológica do gelo, neste experimento, permitiu concluir que a água utilizada na fabricação de gelo utilizado para conservação de pescado comercializado nos estabelecimentos pode ser contaminada por manuseio inadequado e seu incorreto acondicionamento, o que é um fator de risco para a saúde do consumidor uma vez que o gelo em contato com o peixe pode contaminá-lo / Abstract: The ice is an excellent way to prolong the freshness of the fish and in the food industry has one of the most important roles, since it slows the bacterial growth, and if it is manufactured under poor sanitary conditions could become a risk factor for consumers. So, this study had as objective to evaluate the microbiological quality of the ice used in the seafood conservation by counting of mesophilic and psychrotrophics, total and thermoresistant coliforms and to investigate the presence or not of Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Salmonella spp. For such, sixty-three samples of ice were collected from five supermarkets and one fish market located in the municipality of Ribeirão Preto/SP. The results showed populations of mesophilic heterotrophic microorganisms ranging from 1,0 x 10 to 3,0 x 104 UFC/mL and psychrotrophics ranging from 1,0 x 10 to 1,0 x 106 UFC/mL, being 19,05% of the samples containing mesophilic microorganisms above the allowed by the current legislation. It was found that 22,22% of the samples were positive for total coliforms and 9,52% for thermoresistant. The presence of Staphylococcus aureus was confirmed in three samples and E. coli and Salmonella spp. were not found. So, the evaluation of the microbiological quality in this study permitted to conclude that though there is a specific legislation about water quality, the unpotable water still in use in the ice manufactured utilized in the seafood conservation commercialized in food stores, what is a risk factor to the consumers health since the ice in contact with the fish can contaminate it / Mestre

Orientador: Oswaldo Durival Rossi Junior / Banca: Angela Cleusa de Fatima Banzatto de Carvalho / Banca: Francisca Neide Costa / Resumo: Tem sido evidente o aumento no consumo de pescado, especialmente do salmão (Salmo salar) sob a forma "in natura", em pratos da cozinha oriental. Como conseqüência, tem havido maior preocupação quanto às suas características higiênico-sanitárias, tendo em vista a facilidade que microrganismos encontram para se desenvolverem em sua carne, o que pode expor os consumidores a agentes que causam desde uma simples gastrenterite até o óbito. Diante desta preocupação, desenvolveu-se este estudo com objetivos de avaliar características microbiológicas do salmão por meio da quantificação de microrganismos heterotróficos mesófilos, coliformes totais e termotolerantes, o perigo de veiculação de Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus aureus, Salmonella sp., Escherichia coli e Aeromonas sp. através da carne e contribuir com subsídios técnicos para criar uma legislação brasileira com padrões microbiológicos específicos para o pescado consumido cru. Foram colhidas 31 amostras de salmão, 16 refrigeradas e 15 congeladas, no comércio varejista de cidades da região nordeste do estado de São Paulo. Os resultados obtidos mostram populações de microrganismos heterotróficos mesófilos variando entre 1,0 x 10 e 3,9 x 106 UFC/g, coliformes totais e termotolerantes em, respectivamente, 32,24% e 19,33% das amostras e Aeromonas sp. em 35,48% das amostras com variação populacional de 2,0 x 102 a 8,0 x 103 UFC/g. Ainda houve a presença de Staphylococcus aureus em uma amostra e ausência de Vibrio parahaemolyticus, Salmonella sp. e Escherichia coli. Os resultados obtidos podem servir de parâmetro para a criação de um padrão microbiológico específico para o pescado consumido cru e servem também de alerta para os consumidores do produto tendo em vista a veiculação de microrganismos potencialmente patogênicos. / Abstract: The increasing of seafood consumption has become evident especially in the use of salmon (Salmo salar) consumed raw in oriental dishes. Consequently, it has risen up the concern related to their hygienic-sanitary characteristics due to the facility that microorganisms multiply in the meat which can expose consumers to the causative agents of a mild gastroenteritis until the death. Regarding such informations, this study was aimed to evaluate microbiological characteristics of salmon by quantifying microrganisms heterotrophic mesophiles, total coliforms and thermotolerant. It was also evaluated the danger of transmission of Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus aureus, Salmonella sp., Escherichia coli and Aeromonas sp. on the fish muscle and contributed to technical informations to create a Brazilian regulations about specific microbiological standards for consumption of raw seafood. Thirty-one samples of salmon were collected, 16 chilled and 15 frozen, from the retail market in cities of the northeast region of São Paulo State. The results show populations of mesophilic heterotrophic microorganisms ranging from 1.0 x 10 and 3.9 x 106 CFU/g, in total and fecal coliforms, respectively, 32.24% and 19.33% of samples and Aeromonas sp. in 35.48% of samples ranging population of 2.0 x 102 to 8.0 x 103 CFU/g. Staphylococcus aureus was present in one sample and were not found Vibrio parahaemolyticus, Salmonella sp. and Escherichia coli. The results may serve as a parameter for the establishment of a microbiological standard for the consumption of raw seafood and also as a warning to consumers of the product for the presence of potentially pathogenic microorganisms. / Mestre

Biofilmes são comunidades bacterianas tridimensionais complexas, que vivem organizadas e aderidas a uma superfície, biótica ou abiótica, embebidas em uma matriz exopolimérica. Cerca de 80% das bactérias vivem organizadas na forma de biofilmes, pois dentro destas estruturas são menos sensíveis aos antibióticos e à resposta imune do hospedeiro. Dentre as principais bactérias formadoras de biofilmes têm-se Staphylococcus spp., Pseudomonas aeruginosa e enterobacteriaceas. Estas bactérias formadoras de biofilmes são importantes colonizadoras da superfície de dispositivos médicos e implantes, aumentando a morbidade e mortalidade dos pacientes que apresentam este tipo de infecção. A investigação de novas estratégias para prevenção e tratamento de infecções por biofilmes é urgentemente necessária. Dentre estas estratégias estão a pesquisa de diferentes mecanismos ou substâncias capazes de provocar a inibição da formação ou a erradicação do biofilme formado. Neste contexto, os venenos animais representam uma fonte ainda inexplorada de uma vasta quantidade de moléculas bioativas, candidatas ao desenvolvimento de novas terapias, inclusive antibiofilme. O principal objetivo deste estudo é avaliar diferentes venenos de serpentes e análogos sintéticos como fonte de moléculas contra biofilmes bacterianos patogênicos. O capítulo 1 revisa estudos que relatam a atividade antimicrobiana (contra bactérias, vírus, protozoários e fungos) de 170 peptídeos isolados de venenos de oito diferentes animais. Peptídeos antimicrobianos vêm ganhando destaque em pesquisas para o tratamento de infecções e peptídeos com atividade antibiofilme são uma nova e promissora abordagem, para o tratamento de infecções relacionadas. O capítulo 2 mostra as atividades antimicrobiana, antibiofilme e de erradicação de biofilmes pré-estabelicidos de 18 análogos de peptídeos de oriundos de venenos de serpentes. Inicialmente foram analisadas e alinhadas 170 sequências peptídeos oriundos de venenos animais. O pepptídeos 16 apresentou considerável atividade antimicrobiana contra cepas bacterianas Gram-positivas, sensíveis e resistentes. Para S. epidermidis os peptídeos 1, 2, 3, 4, 12, 13 e 16 apresentaram menos de 50% de formação de biofilme e os peptídeos 2, 3 e 16 reduziram o biofilme pré-formad. A citotoxicidade e a actividade hemolítica foram testadas e os peptídeos ativos 2 e 16 apresentaram citotoxicidade e hemólise significativas em comparação com os controles. A posição dos aminoácidos pode contribuir para as atividades, sendo que mais testes são necessários para entender a relação das posições de aminoácidos na ação. O capítulo 3 mostra as atividades antiformação e erradicação de biofilmes pré-estabelecidos de dezessete diferentes venenos de serpentes, duas de escorpiões e três de anêmonas marinhas, bem como as secreções de pele de três espécies de sapos. Consideráveis atividades antiformação e de erradicação foram verificadas contra as cepas de S. aureus, S. epidermidis e E. cloaceae por todos os venenos de serpentes testados, em diferentes concentrações. Além disso, um fracionamento inicial foi realizado e as melhores condições foram selecionadas para um novo fracionamento, onde foram testadas 27 frações de veneno de B. diporus. As frações 8, 14 e 23 apresentaram atividades com menos de 50% de formação de biofilme e menos de 80% do biofilme remanescente. Os resultados indicam a capacidade dos venenos, especialmente da serpente de B. diporus, de serem potenciais fontes de moléculas como estratégia para combater os biofilmes patogênicos bacterianos. O presente estudo aborda o potencial de venenos animais, principalmente venenos de serpentes, como fonte de moléculas, que podem apresentar inúmeras atividades farmacológicas inéditas, incluindo àquelas relacionadas com a prevenção da formação e de erradicação de biofilmes bacterianos patogênicos. Atualmente, existem seis medicamentos aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA), oriundos de venenos, como o Captopril (Capoten®). Este estudo mostra a capacidade de venenos como fonte de novas moléculas ativas contra biofilmes patogênicos. / Biofilms are complex three-dimensional bacterial communities living organized and attached on a surface, embedded in exopolimeric matrix. About 80% of live bacteria are organized in the form of biofilms because in these structures are less sensitive to antibiotics and host immune response. Staphylococcus spp., Pseudomonas aeruginosa and enterobacteriaceas are the main biofilm forming bacteria. These forming biofilms bacteria are important colonizing surface of medical devices and implants, increasing the morbidity and mortality of patients with this kind of infection. The investigation of new strategies for prevention and treatment of infections caused by biofilms is urgently needed. Among these strategies, there are the research of different mechanisms or substances capable of inhibit the formation or to eradicate the formed biofilm. In this context, animal venoms represent an untapped source of vast amounts of bioactive molecules, candidates for the development of new therapies, including antibiofilm. The main objective of this study is to evaluate different venoms of snakes and synthetic analogs as source of molecules against pathogenic bacterial biofilms. The chapter 1 reviewed numerous studies reporting the antimicrobial activity (against bacteria, viruses, protozoa and fungi) of 170 peptides isolated from venoms of eight different animals. Antimicrobial peptides have been gaining attention in research for the treatment of infections and peptides with antibiofilm activity are a new and promising approach for the treatment of infections related. The chapter 2 shows the antimicrobial, antibiofilm and eradication of established biofilms activities of 18 analogs of peptides derived from snake venoms. Initially, 170 peptide sequences from animal venoms were analyzed and aligned. The peptide 16 showed considerable antimicrobial activity against Gram-positive bacterial strains, sensitive and resistant. For S. epidermidis, the peptides 1, 2, 3, 4, 12, 13 and 16 showed less than 50% of biofilm formation and peptides 2, 3 and 16 reduced preformed biofilm. Cytotoxicity and hemolytic activity were tested and active peptides 2 and 16 showed significant cytotoxicity and hemolysis compared with the controls. The position of the amino acids can contribute to the activities and more tests are needed to understand the relationship of the amino acid positions in the action. The chapter 3 shows the antiformation and eradication of established biofilms activities of seventeen different venoms of snakes, two of scorpions and three of marine anemones, as well as the skin secretions of three species of frogs. Significant activities were observed against strains of S. aureus, S. epidermidis and E. cloaceae for all venom of snakes tested at different concentrations. In addition, an initial fractionation was performed and the best conditions were selected for a new fractionation, where 27 fractions of B. diporus enom were tested. Fractions 8, 14 and 23 presented activities with less than 50% of biofilm formation and less than 80% of the remaining biofilm. The results indicate the ability of venoms, especially the snake B. diporus, to be potential sources of molecules as a strategy to combat bacterial pathogenic biofilms. This study addresses the potential of animal venoms, especially snake venoms, as source of molecules, which can present numerous unpublished pharmacological activities, including those related to the prevention of the formation and eradication of pathogenic bacterial biofilms. Currently, there are six drugs approved by Food and Drug Administration (FDA), derived from venoms, such as Captopril®. This study shows the ability of venoms as source of new bioactive molecules against pathogenic biofilms.

Neste trabalho foi estuda a interação da E. coli patogênica aviária (APEC), agente etiológico da colibacilose aviária, e células não fagocitárias. A APEC é uma ExPEC (E. coli extra-intestinais), grupo que também inclui a UPEC (E. coli uropatogênica) e a NMEC (E. coli de meningite neonatal). Foi analisado o comportamento de 8 cepas APEC - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - frente a duas linhagens de células não-fagocitárias, fibroblastos aviários CEC-32 e células endoteliais humanas EAhy926. Foi realizada a genotipagem de 33 genes associados à virulência, verificou-se capacidade de associação (adesão e invasão), de invasão e de multiplicação intracelular, de citotoxicidade e de ativação das caspases 3/7 das cepas após infecção de fibroblastos aviários. Foi observado que enquanto todas as cepas foram capazes de aderir aos fibroblastos aviários, somente a cepa MT78 foi capaz de invadí-los em níveis comparáveis à bactéria invasiva Salmonella Typhymurium SL1344. As cepas APEC não induziram ativação de capases 3/7, nem foram citotóxicas aos fibroblastos. Uma vez que a cepa invasiva, MT78, e a não invasiva, IMT2470, apresentam genótipos de virulência muito similares, foi realizado o estudo da expressão por RT-PCR dos genes de virulência da bactéria crescida com e sem fibroblastos aviários, por 3 h. Os resultados mostraram a expressão de adesinas, sideróforos e protectinas/estruturas de resistência ao soro para ambas as cepas na ausência e presença de fibroblastos. A análise da expressão dos genes fimH, ompA, ibeA e gimB pela técnica RT-qPCR revelou a repressão do gene fimH na MT78, mas indução do mesmo na IMT2470. Já as invasinas, gimB e ibeA, estavam induzidas em MT78 e reprimidas em IMT2470, enquanto o gene ompA estava sendo expresso em ambas as cepas. A expressão das invasinas gimB e ibeA explica em parte o fenótipo invasivo da MT78. No presente estudo também foi analisado o comportamento das 8 cepas APEC em relação ao perfil de associação, invasão e multiplicação intracelular ao infectarem células EAhy926. As cepas não mostraram capacidade de invadir as células mas apresentaram um nível de associação muito superior ao dos fibroblastos aviários (até 14 vezes superior para algumas cepas). Este trabalho mostrou que o ensaio in vitro com CEC-32 é um modelo adequado para o estudo da interação celular entre APEC e células eucarióticas e agregou mais conhecimento sobre o patotipo. / In this work the interaction between avian pathogenic E. coli (APEC), the etiological agent of avian colibacillosis, and non-phagocytic cells was studied. APEC is an ExPEC (extraintestinal E. coli), a group that also includes UPEC (uropathogenic E. coli) and NMEC (E. coli neonatal meningitis). We analysed the behavior of 8 APEC strains - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - against two non-phagocytic cell lines, avian fibroblasts (CEC-32) and human endothelial cells (Eahy926). Strains were genotyped for 33 virulence associated genes, and investigated the association capacity (adhesion and invasion), the invasion ability, intracellular multiplication, cytotoxicity and activation of caspases 3/7 of the strains after infecting avian fibroblasts. While all strains were able to adhere to avian fibroblasts, only the strain MT78 was able to invade them at levels comparable to the invasive bacterium Salmonella Typhymurium SL1344. APEC strains could not induce activation of caspases 3/7, nor were cytotoxic to fibroblasts. Since the invasive MT78 and the non-invasive IMT2470 strains presented very similar virulence genotypes, the expression of virulence genes of the bacteria grown in the absence and presence of avian fibroblasts by 3 h was analysed by RT-PCR. Results showed the expression of adhesins, siderophores and protectins/serum resistance structures for both strains in the two culture conditions, with and without fibroblasts. Analysis of the expression of fimH, ompA, ibeA and gimB by RT-qPCR revealed the repression of fimH in MT78, but the induction in IMT2470. In relation to ibeA and gimB invasins, they were induced in MT78 but repressed in IMT2470, while the ompA gene was expressed in both strains. The expression of invasins partly explains the invasive phenotype of MT78. It was also analysed the behaviour of the strains in relation to the association profile, invasion and intracellular multiplication when infecting EAhy926 human endothelial cells. The strains showed no ability to invade endothelial cells but showed a high level of association (up to 14 times higher than for fibroblasts cells for some strains). This study showed that the CEC-32 in vitro model is suitable for the study of cellular interaction between APEC and eukaryotic cells, and added more knowledge about the pathotype.

A eficácia do fungo filamentoso Metarhizium anisopliae para controle de carrapatos foi evidenciada em vários experimentos in vitro, entretanto, há poucos relatos de ensaios em condições de campo para demonstrar a real aplicação do controle biológico. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a eficácia de M. anisopliae no controle de Rhipicephalus microplus em condições de laboratório e de campo associado ou não a acaricidas químicos, utilizando bovinos. Inicialmente, foi avaliada a compatibilidade de M. anisopliae (cepa E6) em ensaio in vitro com cinco produtos comerciais contendo: amitraz, cipermetrina, clorpirifós e duas associações de piretróides sintéticos e organofosforados (PS+OF). Em geral os acaricidas apresentaram pouco efeito na viabilidade do fungo. Quando M. anisopliae foi associado ao amitraz e a clorpirifós, ocorreu diminuição na viabilidade em aproximadamente 63% e 67% a 48 e 96 horas após a mistura, respectivamente. A eficácia de M. anisopliae (cepa E6) também foi avaliada sobre uma cepa de R. microplus multiresistente a acaricidas. Foram realizados experimentos in vitro e em condições de campo, utilizando o fungo isoladamente ou em associação com um acaricida comercial de pulverização em bovinos infestados com a cepa Jaguar (de R. microplus resistente a carrapaticidas). Para os ensaios a campo, vinte bovinos foram divididos em quatro grupos (n = 5): (i) o grupo tratado com acaricida; (ii) o grupo tratado com o fungo, (iii) o grupo tratado com a associação de fungo + acaricida, e (iv) o grupo controle (não tratado). Os animais foram separados em piquetes com animais naturalmente infestados e também com infestação experimental com a cepa Jaguar. Em cada infestação foram utilizadas 20.000 larvas de R. microplus, aplicadas em três semanas a -21, -14 e -7 dias antes do primeiro tratamento e uma semana depois de cada tratamento. Os animais dos grupos tratados foram pulverizados com o fungo na concentração de 108 conídios/mL com intervalo de 21 a 28 dias sendo realizados sete tratamentos. Desde o primeiro tratamento até o final do experimento, os três grupos tratados, apresentaram nas contagens, número de carrapatos inferior ao grupo controle (P <0,05). Os grupos tratados com a suspensão de esporos de fungo ou com acaricida isoladamente apresentaram um controle semelhante, com um mínimo de 50% de eficácia e média de 75%. Mais significativo foi o tratamento com associação do fungo com o acaricida que resultou em eficácia de 91,7%, após o primeiro tratamento e acima de 98% após os outros seis tratamentos. Assim, fica aqui demonstrada a real aplicabilidade do uso do fungo M. anisopliae (Cepa E6) para controle de R. microplus resistentes a acaricida, em especial a sua associação com acaricidas. / The of the fungus Metarhizium anisopliae to control ticks has been shown in several in vitro experiments. However, there have been few reports of assays in field conditions in order to demonstrate the real applicability of the biological control. Thus aim of the present study was to evaluate the efficacy of M. anisopliae to control Rhipicephalus microplus under laboratory and field conditions. Firstly the compatibility of M. anisopliae (strain E6) to acaricides was tested in vitro using five commercial acaricides: amitraz, cypermethrin, chlorpyriphos and two associations of synthetic pyrethroid and organophosphate (SP+OP). In general, the acaricides only displayed mild effects on fungus viability. The lower fungal viability was with amitraz and chlorpyriphos, approximately 63% of fungus viability at 48 hours post-mixture and 67% at 96 hours, respectively. Secondly, the efficacy of M. anisopliae (strain E6) to control a multiacaricide-resistant strain of R. microplus (Jaguar) was evaluated, in vitro and under field conditions in tick infested bovines, using the fungus alone or in association with a commercial acaricide by manual spraying. The field experiment was conducted with twenty bovines divided into four groups (n = 5); (i) acaricide-treated group, (ii) fungus-treated group, (iii) fungus+acaricide group, and (iv) control non-treated group. Animals were allocated into highly infested paddocks and were also experimentally infested with 20.000 larvae of R. microplus in three weeks -21, -14, and -7 days before the first treatment and one week after each treatment. Animals in the treated groups were sprayed with M. anisopliae at a concentration of 108 conidia/mL at 21 or 28 days intervals (seven treatments). From the first treatment to the end of the experiment, the treated groups had lower tick infestation (P < 0.05). Groups treated with fungus suspension and acaricide alone, presented a similar efficacy, with minimal of 50% and 75% average. Importantly, the association of fungus and acaricide promoted a minimal percent of 91.7% tick-control after the first treatment and over 98% tick-control in the other six treatments. Thus in this work we demonstrate the real applicability of the use of M. anisopliae (strain E6) to control acaricide resistant ticks R. microplus in particular using the association of fungal spores and acaricides.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade biolÃgica de uma quitinase recombinante (rVuChi) de feijÃo-caupi (Vigna unguiculata) contra o fungo fitopatogÃnico Lasiodiplodia theobromae. A proteÃna recombinante foi expressa em Pichia pastoris, coletada e purificada apÃs 72h de induÃÃo, utilizando cromatografia de afinidade em matriz de quitina. A quitinase foi eluÃda a partir da cromatografia de afinidade com Ãcido acÃtico a 0,1 M. Ensaio enzimÃtico foi realizado contra o substrato sintÃtico (quitina coloidal), a fim de determinar a atividade da proteÃna recombinante purificada. A quitinase apresentou atividade especÃfica de 5.637,32 U/mg de proteÃna. Testes biolÃgicos foram realizados. Nestes testes trÃs diferentes isolados de L. theobromae, identificados como CNPAT CCJ-127, CNPAT CCJ-166 e CNPAT CCJ-184, foram utilizados e os experimentos foram realizados em triplicata. Os isolados fÃngicos foram obtidos da coleÃÃo de trabalho do LaboratÃrio de Fitopatologia da Embrapa AgroindÃstria Tropical (Fortaleza-CE, Brasil). Em todos os ensaios biolÃgicos o fungicida Carbomax 500 SC (Carbendazim), a uma concentraÃÃo de 2 mL/L, e Ãgua destilada estÃril foram utilizados como controles positivos e negativos, respectivamente. Um total de 50, 100 e 300 Âg de quitinase recombinante (rVuChi) foi utilizado em todos os testes. O primeiro ensaio foi baseado na metodologia de difusÃo em disco de papel de filtro em que foram investigados os efeitos da proteÃna sobre o crescimento do micÃlio, bem como a formaÃÃo de halo de inibiÃÃo sobre o crescimento micelial do fungo. O segundo ensaio foi baseado no ensaio de difusÃo em Ãgar. Fotografias foram usadas para registrar as observaÃÃes. A quitinase rVuChi mostrou efeito fungistÃtico variando de moderado a forte sobre o crescimento micelial de todos os isolados de L. theobromae, particularmente quando usada nas doses de 100 e 300 Âg, no ensaio de difusÃo em disco. CNPAT CCJ-127 foi o isolado mais resistente à aÃÃo fungistÃtica de rVuChi, como observado pelo menor impacto da proteÃna em seu crescimento micelial. No teste de difusÃo em Ãgar a quantidade de 300 Âg foi a mais efetiva, da mesma forma como observado para o de difusÃo em disco de papel de filtro. AlÃm disso, o efeito da proteÃna foi mais pronunciado nos isolados CNPAT CCJ-166 e CNPAT CCJ-184 e menos impactante no isolado CNPAT CCJ-127. A quitinase recombinante rVuCHi mostrou ser um inibidor do crescimento micelial de trÃs diferentes isolados de L. theobromae. Os efeitos fungistÃticos da proteÃna aqui descritos podem ser devido à sua capacidade de degradar quitina, um biopolÃmero estrutural que faz parte da parede celular de vÃrios fungos fitopatogÃnicos, incluindo L. theobromae. Entretanto, mais estudos precisam ser conduzidos para revelar os possÃveis mecanismos de aÃÃo de rVuChi sobre L. theobromae. / The aim of this work was to evaluate the biological activity of a recombinant chitinase (rVuChi) from cowpea (Vigna unguiculata) against the phytopathogenic fungus Lasiodiplodia theobromae. The recombinant protein was expressed in Pichia pastoris, collected and purified after 72h of induction, using a chitin affinity chromatography. The chitinase was eluted from the affinity chromatography using 0.1 M acetic acid. Enzymatic assay was performed against the synthetic substrate (colloidal chitin) in order to determine the activity of the purified recombinant protein. The chitinase displayed a specific activity of 5,637.32 U/mg of protein. Biological tests were performed. In these tests three different isolates of L. theobromae, identified as CNPAT CCJ-127, CNPAT CCJ-166 and CNPAT CCJ-184, were used and the experiments were performed on triplicate. The fungal isolates were obtained from the collection of work from the laboratory of plant pathology from the Embrapa AgroindÃstria Tropical (Fortaleza-CE, Brasil). In all biological assays the fungicide Carbomax 500 SC (Carbendazim) at a concentration of 2 mL/L and sterile distilled water were used as positive and negative controls, respectively. A total of 50, 100 and 300 Âg of recombinant chitinase (rVuChi) was used in all tests. The first test was based on the disk diffusion methodology using filter paper in which the effects of the protein on the mycelium growth, as well as the formation of an inhibition zone on the fungal hyphae were investigated. The second test was based on the diffusion assay in agar. Photographs were used to register the observations. The rVuChi showed moderate to strong fungistatic activities on the mycelial growth of all L. theobromae isolates when used at 100 and 300 Âg in the disk diffusion assay. CNPAT CCJ-127 was the most resistant specimen to the rVuChi fungistatic action, as observed by the lower impact of the protein on it is mycelial growth. In the agar diffusion test the amount of 300 Âg was the most effective, as observed in the disk diffusion test. In addition, the effect of the protein was most pronounced on the isolates CNPAT CCJ-166 and CNPAT CCJ-184 and less impacting on CNPAT CCJ-127. The recombinant chitinase rVuCHi showed to be an inhibitor of the mycelial growth of three L. theobromae isolates. The fungistatic effects of the protein described here may be due to its ability to degrade chitin, a structural biopolymer that makes part of the cell wall of several phytopathogenic fungi, including L. theobromae. Once this is only a scientific speculation, more studies need to be made to definitely reveal the mechanism of action of rVuChi on L. theobromae.

Neste trabalho foi estuda a interação da E. coli patogênica aviária (APEC), agente etiológico da colibacilose aviária, e células não fagocitárias. A APEC é uma ExPEC (E. coli extra-intestinais), grupo que também inclui a UPEC (E. coli uropatogênica) e a NMEC (E. coli de meningite neonatal). Foi analisado o comportamento de 8 cepas APEC - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - frente a duas linhagens de células não-fagocitárias, fibroblastos aviários CEC-32 e células endoteliais humanas EAhy926. Foi realizada a genotipagem de 33 genes associados à virulência, verificou-se capacidade de associação (adesão e invasão), de invasão e de multiplicação intracelular, de citotoxicidade e de ativação das caspases 3/7 das cepas após infecção de fibroblastos aviários. Foi observado que enquanto todas as cepas foram capazes de aderir aos fibroblastos aviários, somente a cepa MT78 foi capaz de invadí-los em níveis comparáveis à bactéria invasiva Salmonella Typhymurium SL1344. As cepas APEC não induziram ativação de capases 3/7, nem foram citotóxicas aos fibroblastos. Uma vez que a cepa invasiva, MT78, e a não invasiva, IMT2470, apresentam genótipos de virulência muito similares, foi realizado o estudo da expressão por RT-PCR dos genes de virulência da bactéria crescida com e sem fibroblastos aviários, por 3 h. Os resultados mostraram a expressão de adesinas, sideróforos e protectinas/estruturas de resistência ao soro para ambas as cepas na ausência e presença de fibroblastos. A análise da expressão dos genes fimH, ompA, ibeA e gimB pela técnica RT-qPCR revelou a repressão do gene fimH na MT78, mas indução do mesmo na IMT2470. Já as invasinas, gimB e ibeA, estavam induzidas em MT78 e reprimidas em IMT2470, enquanto o gene ompA estava sendo expresso em ambas as cepas. A expressão das invasinas gimB e ibeA explica em parte o fenótipo invasivo da MT78. No presente estudo também foi analisado o comportamento das 8 cepas APEC em relação ao perfil de associação, invasão e multiplicação intracelular ao infectarem células EAhy926. As cepas não mostraram capacidade de invadir as células mas apresentaram um nível de associação muito superior ao dos fibroblastos aviários (até 14 vezes superior para algumas cepas). Este trabalho mostrou que o ensaio in vitro com CEC-32 é um modelo adequado para o estudo da interação celular entre APEC e células eucarióticas e agregou mais conhecimento sobre o patotipo. / In this work the interaction between avian pathogenic E. coli (APEC), the etiological agent of avian colibacillosis, and non-phagocytic cells was studied. APEC is an ExPEC (extraintestinal E. coli), a group that also includes UPEC (uropathogenic E. coli) and NMEC (E. coli neonatal meningitis). We analysed the behavior of 8 APEC strains - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - against two non-phagocytic cell lines, avian fibroblasts (CEC-32) and human endothelial cells (Eahy926). Strains were genotyped for 33 virulence associated genes, and investigated the association capacity (adhesion and invasion), the invasion ability, intracellular multiplication, cytotoxicity and activation of caspases 3/7 of the strains after infecting avian fibroblasts. While all strains were able to adhere to avian fibroblasts, only the strain MT78 was able to invade them at levels comparable to the invasive bacterium Salmonella Typhymurium SL1344. APEC strains could not induce activation of caspases 3/7, nor were cytotoxic to fibroblasts. Since the invasive MT78 and the non-invasive IMT2470 strains presented very similar virulence genotypes, the expression of virulence genes of the bacteria grown in the absence and presence of avian fibroblasts by 3 h was analysed by RT-PCR. Results showed the expression of adhesins, siderophores and protectins/serum resistance structures for both strains in the two culture conditions, with and without fibroblasts. Analysis of the expression of fimH, ompA, ibeA and gimB by RT-qPCR revealed the repression of fimH in MT78, but the induction in IMT2470. In relation to ibeA and gimB invasins, they were induced in MT78 but repressed in IMT2470, while the ompA gene was expressed in both strains. The expression of invasins partly explains the invasive phenotype of MT78. It was also analysed the behaviour of the strains in relation to the association profile, invasion and intracellular multiplication when infecting EAhy926 human endothelial cells. The strains showed no ability to invade endothelial cells but showed a high level of association (up to 14 times higher than for fibroblasts cells for some strains). This study showed that the CEC-32 in vitro model is suitable for the study of cellular interaction between APEC and eukaryotic cells, and added more knowledge about the pathotype.

A eficácia do fungo filamentoso Metarhizium anisopliae para controle de carrapatos foi evidenciada em vários experimentos in vitro, entretanto, há poucos relatos de ensaios em condições de campo para demonstrar a real aplicação do controle biológico. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a eficácia de M. anisopliae no controle de Rhipicephalus microplus em condições de laboratório e de campo associado ou não a acaricidas químicos, utilizando bovinos. Inicialmente, foi avaliada a compatibilidade de M. anisopliae (cepa E6) em ensaio in vitro com cinco produtos comerciais contendo: amitraz, cipermetrina, clorpirifós e duas associações de piretróides sintéticos e organofosforados (PS+OF). Em geral os acaricidas apresentaram pouco efeito na viabilidade do fungo. Quando M. anisopliae foi associado ao amitraz e a clorpirifós, ocorreu diminuição na viabilidade em aproximadamente 63% e 67% a 48 e 96 horas após a mistura, respectivamente. A eficácia de M. anisopliae (cepa E6) também foi avaliada sobre uma cepa de R. microplus multiresistente a acaricidas. Foram realizados experimentos in vitro e em condições de campo, utilizando o fungo isoladamente ou em associação com um acaricida comercial de pulverização em bovinos infestados com a cepa Jaguar (de R. microplus resistente a carrapaticidas). Para os ensaios a campo, vinte bovinos foram divididos em quatro grupos (n = 5): (i) o grupo tratado com acaricida; (ii) o grupo tratado com o fungo, (iii) o grupo tratado com a associação de fungo + acaricida, e (iv) o grupo controle (não tratado). Os animais foram separados em piquetes com animais naturalmente infestados e também com infestação experimental com a cepa Jaguar. Em cada infestação foram utilizadas 20.000 larvas de R. microplus, aplicadas em três semanas a -21, -14 e -7 dias antes do primeiro tratamento e uma semana depois de cada tratamento. Os animais dos grupos tratados foram pulverizados com o fungo na concentração de 108 conídios/mL com intervalo de 21 a 28 dias sendo realizados sete tratamentos. Desde o primeiro tratamento até o final do experimento, os três grupos tratados, apresentaram nas contagens, número de carrapatos inferior ao grupo controle (P <0,05). Os grupos tratados com a suspensão de esporos de fungo ou com acaricida isoladamente apresentaram um controle semelhante, com um mínimo de 50% de eficácia e média de 75%. Mais significativo foi o tratamento com associação do fungo com o acaricida que resultou em eficácia de 91,7%, após o primeiro tratamento e acima de 98% após os outros seis tratamentos. Assim, fica aqui demonstrada a real aplicabilidade do uso do fungo M. anisopliae (Cepa E6) para controle de R. microplus resistentes a acaricida, em especial a sua associação com acaricidas. / The of the fungus Metarhizium anisopliae to control ticks has been shown in several in vitro experiments. However, there have been few reports of assays in field conditions in order to demonstrate the real applicability of the biological control. Thus aim of the present study was to evaluate the efficacy of M. anisopliae to control Rhipicephalus microplus under laboratory and field conditions. Firstly the compatibility of M. anisopliae (strain E6) to acaricides was tested in vitro using five commercial acaricides: amitraz, cypermethrin, chlorpyriphos and two associations of synthetic pyrethroid and organophosphate (SP+OP). In general, the acaricides only displayed mild effects on fungus viability. The lower fungal viability was with amitraz and chlorpyriphos, approximately 63% of fungus viability at 48 hours post-mixture and 67% at 96 hours, respectively. Secondly, the efficacy of M. anisopliae (strain E6) to control a multiacaricide-resistant strain of R. microplus (Jaguar) was evaluated, in vitro and under field conditions in tick infested bovines, using the fungus alone or in association with a commercial acaricide by manual spraying. The field experiment was conducted with twenty bovines divided into four groups (n = 5); (i) acaricide-treated group, (ii) fungus-treated group, (iii) fungus+acaricide group, and (iv) control non-treated group. Animals were allocated into highly infested paddocks and were also experimentally infested with 20.000 larvae of R. microplus in three weeks -21, -14, and -7 days before the first treatment and one week after each treatment. Animals in the treated groups were sprayed with M. anisopliae at a concentration of 108 conidia/mL at 21 or 28 days intervals (seven treatments). From the first treatment to the end of the experiment, the treated groups had lower tick infestation (P < 0.05). Groups treated with fungus suspension and acaricide alone, presented a similar efficacy, with minimal of 50% and 75% average. Importantly, the association of fungus and acaricide promoted a minimal percent of 91.7% tick-control after the first treatment and over 98% tick-control in the other six treatments. Thus in this work we demonstrate the real applicability of the use of M. anisopliae (strain E6) to control acaricide resistant ticks R. microplus in particular using the association of fungal spores and acaricides.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-06-09T11:58:37Z No. of bitstreams: 1 Renata Valenca Vaz.pdf: 1168629 bytes, checksum: da995b8f267acdbf4f809c234e53f7f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-09T11:58:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Renata Valenca Vaz.pdf: 1168629 bytes, checksum: da995b8f267acdbf4f809c234e53f7f1 (MD5) Previous issue date: 2014-06-09 / In the present study, we investigated the pathogenic potential of Escherichia coli isolates from samples of chicken livers from carcasses approved for human consumption. The samples ( n = 110 ) were obtained from an abattoir in the State of Pernambuco , Brazil. The bacterial isolates were presumptively identified form Agar Eosin Methylene Blue. The antibiotic resistance profile of the isolates was assessed by the disk diffusion method, according to criteria established by the Committee for Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Hereafter, ten isolates resistant to three or more antibiotics and ten susceptible isolates were selected and tested for resistance to serum of chicken and human tests. Our results demonstrated the existence of isolates with resistance phenotypes to streptomycin (84.04 %) , tetracycline (44.68 %) , Amikacin (29.78% ) Ceftazidina (21.27 %) and gentamicin (21.27%) . Likewise, in general , the multiresistant isolates showed resistance to the bactericidal effects of serum and human serum birds. The multiresistant isolates (n = 20 ) were phylogenetically investigated and screened for the presence of ISS gene (Increased serum survival). It was observed that the strains were distributed between the four main phylogenetical groups (B2, D, B1, A) and seven isolates of groups B2, B1 and D had the gene iss . In conclusion, our results indicate the presence of E. coli strains multiresistant to antibiotics and potentially pathogenic in chicken carcasses approved for human consumption. / No presente estudo, o potencial patogênico de Escherichia coli isoladas de amostras de fígados de frango de carcaças aprovadas para o consumo humano foi investigado. As amostras (n = 110) foram obtidas de um abatedouro no Estado de Pernambuco, Brasil, e os isolados bacterianos identificados de forma presuntiva em Ágar Eosina Azul de Metileno. O perfil de resistência aos antibióticos dos isolados foi avaliado pelo método de disco-difusão, segundo critérios estipulados pelo Comitê para Padronização de Laboratórios Clínicos (CLSI). A seguir, dez isolados resistentes a três ou mais antibióticos e dez susceptíveis foram selecionados e submetidos a testes de resistência ao soro sanguíneo de frango e humano. Nossos resultados demonstraram a existência de isolados com fenótipos de resistência à Estreptomicina (84,04%), Tetraciclina (44,68%), Amicacina (29,78%), Ceftazidina (21,27%) e Gentamicina (21,27%). Ainda, de maneira geral, os isolados multirresistentes aos antibióticos também apresentaram resistência aos efeitos bactericidas do soro de aves e ao soro humano. Estes isolados (n = 20) foram investigados filogeneticamente e pesquisados em relação à presença do gene iss (increased serum survival). Foi observado que os isolados apresentaram-se distribuídos filogeneticamente entre os quatros principais grupos (B2, D, B1, A) e sete isolados dos grupos B2, D e B1 apresentaram o gene iss. Em conclusão, nossos resultados apontam a presença de cepas de E.coli multirresistentes aos antibióticos e potencialmente patogênicas em carcaças de frango aprovadas para o consumo humano.