Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Coorientador: Luciano Takeshi Kish / Banca: Mariana Carina Frigieri Salaro / Banca: Daniel Guariz Pinheiro / Resumo: RESUMO- Os biocombustíveis são uma alternativa atraente para a substituição de combustíveis fósseis que impulsionaram o interesse global na conversão de biomassa lignocelulósica. Diversos trabalhos são realizados para otimização das etapas para produção de etanol de segunda geração em termos de custo global para o processo. A demanda pela busca de enzimas específicas utilizadas em processos industriais tem impulsionado a prospecção de novas enzimas microbianas com capacidade de desconstruir biomassa vegetal. Dentre elas, as enzimas do grupo das carboidrases são as principais atuantes envolvidas no processo de conversão de biomassa. Diante disso, foi realizada a caracterização de uma comunidade microbiana denominada CB10b, que tem potencialidade em degradar a biomassa. Os estudos foram realizados a partir do sequenciamento total do DNA obtido da comunidade e da prospecção de genes úteis nos processos de conversão de biomassa vegetal. Foram isoladas 6 bactérias pertencentes aos respectivos gêneros: Chitinophaga (que apresentou atividade enzimática em carboximetilcelulose), Pandoraea e Labrys, identificado pelas análises do gene 16S rRNA e da região espaçadora intergênica (ITS) entre os genes 16S-23S rRNA. Por meio das análises dos genes foi possível identificar 16.340 ORFs, sendo anotadas 624 ORFs associadas ao banco de dados do CAZy, distribuídas entre as classes glicosil hidrolases (GHs) com 37,98% (237 ORFs); glicosil transferases (GTs) com 21,63% (135 ORFs); polissacarídeo ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: ABSTRACT- Biofuels are an attractive alternative for replacing fossil fuels, bringing the world's attention to the conversion processes of lignocellulosic biomass. Multiple works are currently being done with to optimize the steps in second-generation ethanol production, seeking to reduce the global costs in this process. Demand for specific microbial enzymes is driving the prospection of novel ones able to degrade plant biomass. Among those, carbohydrases are the protagonists in these processes. In this context, we characterized a microbial community called CB10b and tested it's potential to degrade biomass. We performed studies on this community by total DNA sequencing followed by prospecting genes related to conversion of plant biomass. Six bacteria were isolated, belonging to the genera: Chitinophaga, who presented enzymatic activity on for carboxymethyl cellulose; Pandoraea and Labrys, identified through 16S rRNA and 16S-23S rRNA internal transcribed spacer (ITS) gene analysis. Some 16,340 ORFs were identified, of which 624 were associated with CAZy database, 37.98% (237 ORFs) classified as glycosyl hydrolases (GHs); 21.63% (135 ORFs) as glycosyltransferases (GTs); 17.00% (106 ORFs) were carbohydrate esterases (CEs); 15.38% (96 ORFs) as carbohydrate-binding modules; 4.81% (30 ORFs) as auxiliary activities (AAs) and 3.18% (20 ORFs) as polysaccharide lyase. In addition, it was possible to recover by metagenome analysis the partial genome of a bacterium of the genus Pandora... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Regina Maria Barretto Cicarelli / Banca: Raquel Mantuaneli Scarel Caminaga / Banca: Joyce Aparecida Martins Lopes Ferraz / Resumo: O DNA mitocondrial é uma molécula circular, dupla fita, que se encontra na mitocôndria, uma organela responsável pela respiração e produção de energia da célula. Este DNA é herdado exclusivamente por via materna e possui polimorfismos que permitem diferenciar indivíduos, auxiliando nas investigações forenses e corroborando com outros exames de identificação humana. Devido à possibilidade de compatibilidade deste DNA entre indivíduos não relacionados por via materna, é necessário estimar as frequências haplotípicas utilizando bancos de dados populacionais. Com a finalidade de se compilar e avaliar a utilização do DNA mitocondrial no Brasil realizou-se um estudo sobre os haplótipos depositados no banco de dados do European DNA Profiling Mitochondrial DNA Population Database (EMPOP) e acessando artigos científicos sobre dados de populações brasileiras, observando os países participantes e seus respectivos dados depositados. Na avaliação dos dados do EMPOP, a América do Norte foi o continente com maior número de haplótipos depositados no banco, principalmente pela participação dos Estados Unidos. A América do Sul contém 3172 haplótipos, sendo 782 desse total correspondentes ao Brasil. Esses números parecem insuficientes para representar a população grande e miscigenada do país. Na literatura, encontrou-se um total de 2367 haplótipos, os quais foram organizados por haplogrupos e as regiões brasileiras correspondentes: Sudeste e Nordeste apresentaram-se similares, com predomínio de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mitochondrial DNA is a circular and double-stranded molecule found in the mitochondria, an organelle responsible for breathing and energy production of the cell. This DNA is exclusively inherited through maternal and has polymorphisms that allow differentiating individuals, it assists in forensic investigations and corroborates with other tests of human identification. Due to the possibility of compatibility of this DNA between unrelated individuals, it is necessary to estimate the haplotype frequencies through population databases. In order to compile and evaluate the use of mitochondrial DNA in Brazil, a study was carried out about the haplotypes deposited in the European DNA Profiling Mitochondrial DNA Population Database (EMPOP), and acessing scientific articles with data from Brazilian populations, verifying participating countries and their respective deposited data. In the evaluation of EMPOP data, North America was the continent with the highest number of data deposited in the bank, mainly by the participation of the United States. South America contains 3172 haplotypes, 782 of which correspond to Brazil. These numbers seem insufficient to represent the large and mixed population of this country. In the literature, a total of 2367 haplotypes were found, which were organized by haplogroups and the corresponding Brazilian regions: the Southeast and Northeast were similar, with predominance of African ancestry (44%), while the South had a predominantly European origin (6... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: Flávia Maria de Souza Carvalho / Coorientador: Roberto Hirochi Herai / Banca: Henrique Ferreira / Banca: José Belasque Júnior / Banca: Marcos Túlio de Oliveira / Banca: Alessandro de Mello Varani / Resumo: Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é o agente causal do cancro cítrico, uma das principais doenças que acometem a citricultura mundial. Atualmente não há uma maneira eficiente de controle do cancro, e novos métodos devem ser desenvolvidos para o tratamento desta doença. Assim, o estudo dos mecanismos utilizados pela Xac durante o processo infeccioso pode revelar novos alvos para o desenvolvimento de compostos farmacológicos que possam eliminar ou controlar o patógeno. Neste estudo, a técnica de RNA-Seq foi utilizada para a identificação de genes diferencialmente expressos (GDE) na Xac em condições in vivo e in vitro. Para isso, cinco variedades de citros com níveis diferentes de suscetibilidade ao cancro cítrico, e meios de cultura indutores de fatores de virulência foram utilizados. Muitos dos genes que codificam para proteínas relacionadas ao sistema de secreção tipo 3 (T3SS), enzimas extracelulares, resposta ao estresse oxidativo, transportadores de ferro e fósforo foram induzidos pela Xac nas condições in vivo. No entanto, in vitro, os perfis de expressão para estes mesmos genes foram diferentes. Estes dados permitiram compreender melhor o ambiente intracelular do hospedeiro, e como este se relaciona com os mecanismos de ativação dos fatores de virulência e patogenicidade de Xac. Neste sentido, os dados apresentados neste estudo mostraram que o T3SS é o principal fator de virulência expresso por esta bactéria em condições in vivo. Além disso, nossos resultados sugerem t... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the causal agent of citrus canker, a major disease affecting citrus worldwide. Currently there is no effective way of cancer control, and new methods must be developed for the treatment of this disease. Thus, the study of the mechanisms used by Xac during the infectious process can reveal new targets for the development of pharmacologic compounds that can eliminate or control the pathogen. In this study, RNA-Seq technique was used to identify Xac differentially expressed genes (DEG) in vivo and in vitro conditions. For this purpose, five citrus varieties with different levels of susceptibility to citrus canker and culture mediums inducing virulence factors were used. Many of the genes encoding proteins of the type 3 protein secretion system (T3SS), extracellular enzymes, oxidative stress response, iron and phosphorus transport were induced in Xac in vivo conditions. However, the expression profiles for these same genes were different than observed in vitro conditions. These data allowed us to better understand the intracellular environment of the host, and how this relates to the activation mechanisms of pathogenicity and virulence factors in Xac. In this context, the data presented in this study show the T3SS as the main virulence factor expressed by the bacteria in vivo conditions. Furthermore, our results also suggest that low concentrations of inorganic phosphorus (Pi) and nitrogen, that bacteria sense in the plant apoplast, are ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Fernando Carlos Pagnocca / Banca: Luiz Carlos Forti / Banca: Simone Possedente de Lira / Banca: Odair Correa Bueno / Banca: Andre Rodrigues / Resumo: As relações das formigas da tribo Attini com seu fungo mutualista e outros micro-organismos são estudadas há mais de 120 anos, porém o vínculo com fungos negros foi recentemente descoberto e até o momento pouco explorado. O grande incentivo para a pesquisa nessa área ocorreu em 2007 a partir da constatação que fungos negros relacionados ao gênero Phialophora poderiam ser parte ativa da simbiose dessas formigas. Assim, este trabalho teve como objetivo explorar a diversidade de fungos negros no integumento de formigas cortadeiras de folhas (tribo Attini), fomentando a literatura com novas espécies descritas, e melhor esclarecer sua relação ecológica com outros micro-organismos simbiontes. De maneira geral, as principais conclusões da tese são: i) a comunidade de fungos negros no integumento de formigas cortadeiras de folhas é muito diversa. Os isolamentos realizados em dois anos de coleta mostraram espécies desconhecidas e outras reportadas pela primeira vez neste microambiente; ii) o método de pirosequenciamento revelou a presença de diversos fungos não cultiváveis e a predominância marcante do gênero Cladosporium no integumento de formigas cortadeiras de folhas aladas; iii) utilizando análises filogenéticas e morfológicas, seis espécies de Xenopenidiella, uma espécie de Penidiellopsis e um gênero da família Teratosphaeriaceae associados às formigas são descritos; iv) actinobactérias, como Amycolatopsis, Pseudonocardia e Streptomyces, encontradas no integumento de formigas ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The relationship of Attini ants with their mutualistic fungi and other microorganisms are studied for over 120 years, but the connection with black fungi was recently discovered and so far poorly explored. Major incentive for research in this area took place in 2007 when it was reported that black fungi related to the genus Phialophora could be an active part of the ants symbiosis. Thus, this study aimed to explore the diversity of black fungi on the integument of leaf-cutting ants (Attini tribe), improving the literature with new species, and to clarify its ecological relationship with other attine symbiotic microorganisms. Overall, the main conclusions of the thesis are: i) the community of black fungi in leaf-cutting ants' integument is diverse. Isolations performed in two collection years revealed unknown species and others first reported in this microenvironment; ii) the pyrosequencing method showed the presence of several uncultured fungi and the remarkable prevalence of Cladosporium on the integument of winged ants; iii) using phylogenetic and morphological analysis, six Xenopenidiella species, one Penidiellopsis species and one genus in the Teratosphaeriaceae family related to the ants are described; iv) actinomycetes, as Amycolatopsis, Pseudonocardia and Streptomyces, associated with the integument of Attini ants are able to inhibit the growth of a broad range of black fungi, including Phialophora species. Therefore, the integument of leaf-cutting ants proved to be ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Ana Maria Centola Vidal / Banca: Heidge Fukumasu / Banca: Vera Letticie de Azevedo Ruiz / Banca: Naia Carla Marchi de Rezende Lago / Banca: Rachel Zoccal Saba / Resumo: As espécies do grupo do Bacillus cereus são comumente ocorrentes na cadeia produtiva de leite e derivados e frequentemente estão envolvidas em doenças transmitidas por alimentos. Constituem uma preocupação constante à indústria de lácteos, por conta de sua capacidade de formar biofilmes em superfícies sólidas, ocasionando a contaminação persistente dos produtos processados e representando risco à saúde pública. Objetivou-se neste estudo verificar a distribuição e ocorrência de linhagens e genes específicos relacionados à formação de biofilmes de Bacillus cereus isolados dos diversos estágios da cadeia produtiva de leite e produtos lácteos, classifica-los quanto à potencialcialidade em formar biofilmes, e ainda, avaliar a atuação e eficiência do ácido peracético e do hipoclorito de sódio junto ao sistema "clean in place", simulado em escala piloto, sobre biofilmes formados em superfícies de aço inoxidável em contato com o leite. Para tanto, foram isolados microrganismos do grupo do Bacillus cereus de propriedades leiteiras, industrias e produtos lácteos, identificados genes específicos (sipW, tasA, Spo0A e PlcR) por sequenciamento genômico e avaliada a capacidade de formar biofilmes em microplacas de poliestireno. Selecionou-se um isolado sabidamente produtor de biofilmes, e por meio de contaminação experimental, induziu-se a adesão em superfícies de cupóns de aço inoxidável, em três circunstâncias distintas, incluindo contaminação por esporos, células vegetativas, e contamina... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Species included in B. cereus group are widely distributed in dairy environment and were frequently involved in foodborne diseases. They are considered as a concern for dairy industries despite they pose a risk for public health, also despite the able to biofilm formation on stainless steel surfaces, causing the persistent contamination of processed dairy products. This study aimed to investigate if specific strains and genes for biofilm formation are significantly distributed and overpresented in distinct stages of dairy production chain, classifies the potential for biofilm formation, and evaluate the performance and efficiency of peracetic acid and sodium hypochlorite, on a pilot scale simulated clean in place, on biofilms in the stainless steel surfaces in contact with milk. Bacillus cereus microorganisms from dairy farms, industries and dairy products were identified, specific genes (sipW, tasA, Spo0A and PlcR) were identified by genomic sequencing and to form biofilms was performed using polystyrene microplates. Was selected one isolate known to produce biofilms, and by means of experimental contamination, adhesion was induced on stainless steel coupon surfaces, in three different circumstances, including spore contamination, vegetative cells, and contamination followed by pasteurization. In the sequence, the coupons were subjected to the action of peracetic acid and sodium hypochlorite, applying them to the clean in place system, performed on a pilot scale. Among 69 is... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-05T17:31:20Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 984014 bytes, checksum: be90a4017cede4cf64800fd29be9a2f3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T17:31:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 984014 bytes, checksum: be90a4017cede4cf64800fd29be9a2f3 (MD5) Previous issue date: 2005-08-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O conteúdo de gordura intramuscular tem sofrido um decréscimo contínuo devido à seleção para aumento da quantidade de carne magra na carcaça, o que tem provocado uma diminuição na qualidade da carne suína. Devido a suas propriedades fisiológicas, as proteínas ligadoras de ácidos graxos, foram sugeridas estar associadas ao aumento no conteúdo de gordura intramuscular, melhorando a qualidade da carne suína. A primeira parte deste trabalho foi realizado com o objetivo de seqüênciar as regiões codificadoras do gene da A-FABP (proteína de ligação de ácidos graxos - adipócitos), e comparar tais seqüências na busca de polimorfismos entre a raça naturalizada brasileira Piau e linhas comerciais (constituinte da geração parental de um cruzamento F2) e comparar com as seqüências depositadas no GenBank. Após seqüênciamento foi feita comparação das seqüências de nucleotídeos entre as raças de suínos e a referência depositada no GenBank e verificou-se que não existe nenhum polimorfismo de nucleotídeos nos fragmentos seqüenciados nestes animais. O aumento no número de marcadores de DNA disponíveis, aliado ao desenvolvimento dos métodos de genotipagem e das metodologias estatísticas, tornou possível a identificação de loci de características quantitativas (QTL) responsáveis pela variação genética de características de importância econômica na suinocultura. A segunda parte deste trabalho foi realizado com o objetivo de mapear QTL no cromossomo 4 de suínos (SSC4) e associá-los a diversas características de desempenho, carcaça e qualidade da carne. Para isto, foi desenvolvida uma população F2 com 800 animais a partir do acasalamento da geração F1, obtida do cruzamento divergente entre machos da raça naturalizada brasileira Piau e 18 fêmeas comerciais (Landrace x Large White x Piétrain) e genotipada para 13 marcadores tipo microssatélites. Foi utilizado o método de regressão por intervalo de mapeamento, por meio do programa QTL EXPRESS. Para as características de desempenho, foram encontrados um QTL sugestivo (P<0,10) para número de tetos na posição 73 cM e dois QTL significativos (P<0,05) para peso aos 21 dias, sendo um na posição 45 e outro a 96 cM. Para as características de carcaça, órgãos e vísceras foram encontrados um QTL sugestivo (P<0,10) para comprimento de intestino na posição 75 cM, dois QTL significativos (P<0,05), sendo um para peso de coração na posição 79 cM e o outro para peso de pulmão na posição 69 cM e um QTL significativo (P<0,01) para espessura de bacon na posição 69 cM. Para as características de corte de carcaça foram identificados três QTL sugestivos (P<0,10), sendo um para peso de pernil limpo na posição 95 cM, um para peso de paleta limpa na posição 95 cM e um para peso de costela na posição 7 cM. Para as características de qualidade da carne foram encontrados dois QTL sugestivos (P<0,1), sendo um QTL associado a gordura intramuscular na posição 3 cM e um QTL associado a características de coloração da carne, mais especificamente ao índice de amarelo, também na posição 3 cM. / The intramuscular fat content has decreased due to selection for lean meat content, what has been reduced the meat quality. Due to their physiologic properties, the fatty acid-biding proteins were suggested to be associated with the increase in the intramuscular fat content, what could improve the pork quality. The objective of the first part of this study was sequencing DNA fragments of the A-FABP gene and compare these sequences to find polymorphisms between the Brazilian naturalized Piau swine and commercial lines (parental generation of the F2 crossbred) and to compare with the one in GenBank. The sequences comparisons between the swine breeds and the GenBank reference showed no nucleotide polymorphism in the analyzed fragments. The increase number of available DNA markers, ally to the development of the genotyping methods and statistical methodologies, it was possible the identification of quantitative trait loci (QTL) responsible for the genetic variation of economic importance traits in pork industry. The objective of the second part of this study was mapping quantitative trait loci (QTL) on porcine chromosome 4 (SSC4), and associate them to several performance, carcass and meat quality traits. For this, a F2 pig population with 800 animals was established from a cross of the F1 generation, produced by crossing using two naturalized Brazilian Piau sires and 18 commercial dams (Landrace x Large White X Piétrain). The population was genotyped for 13 microsatellite markers. Data were analyzed by multiple regressions developed for analysis of outbred lines crosses, using QTL EXPRESS software. To performance traits was found one suggestive QTL (P<0,10) for teat number located at about 73 cM and two significant QTL (P<0,05) for weight at 21 days, one located about 45 cM and another at 96 cM. To carcass traits was found one suggestive QTL (P<0,10) for intestine length xilocated at about 75 cM, two significant QTL (P<0,05), one for weight of heart located at about 79 cM and another for weight of lung located at about 69 cM and one significant QTL (P<0,01) for bacon depth locate at about 69 cM. To carcass cuts traits were identified three suggestive QTL (P<0,10), one for ham weight without skin and fat located at about 95 cM, one for shoulder blade weight without skin and fat located at about 95 cM and one for ribs weight located at about 7 cM. To meat quality traits were found two suggestive QTL (P<0,10), one associated to intramuscular fat content located at about 3 cM and one associated to muscle color Minolta measurements, more specifically to the yellowness, located at about 3 cM.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-09-01T16:34:42Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 480210 bytes, checksum: 50d18bd67c0f2b08ed0c2edff62365e4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T16:34:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 480210 bytes, checksum: 50d18bd67c0f2b08ed0c2edff62365e4 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O fungo fitopatogênico Corynespora cassiicola (Berk. & M. A. Curtis) C. T. Wei é uma espécie cosmopolita com relatos de ocorrência em folhas, hastes e raízes em diversas espécies de plantas, sendo frequentemente associada como agente causal da mancha alvo em diferentes espécies de importância agronômica. Este estudo analisou uma coleção de 32 isolados de C. cassiicola, obtidos de diferentes hospedeiros e locais no Brasil. Sete genes nucleares e um gene mitocondrial foram parcialmente sequenciados e analisados de modo a explorar as relações filogenéticas e filogeográficas entre os isolados e verificar se existe associação entre o gene precursor da toxina produzida pelo fungo, a cassiicolina, e as linhagens encontradas. Adicionalmente, a presença de mutações pontuais independentes – E198A, F200Y e G143A – que conferem resistência a fungicidas foram investigadas. Os isolados se agruparam em três linhagens. A distribuição dos isolados entre as linhagens não esteve associada a hospedeiro ou origem geográfica dos isolados. Isolados da coleção contêm uma de quatro possíveis isoformas da cassiicolina. Em geral, associação entre as isoformas e clados filogenéticos foi ausente. As três mutações pontuais que conferem resistência a fungicidas estão presentes (sozinhas ou combinadas) em oito isolados. Duas dessas mutações (E198A e F200Y) nunca haviam sido identificadas em isolados de C. cassiicola. As evidências de variabilidade genética entre os isolados e a ocorrência de três mutações pontuais independentes, em conjunto com o hábito polífago de C. cassiicola, comprometem as atuais práticas de manejo da doença na agricultura brasileira. As informações obtidas neste estudo poderão ser úteis em análises ecológicas e epidemiológicas de C. cassiicola, bem como no desenvolvimento de medidas de manejo da mancha alvo. / The plant pathogenic fungus Corynespora cassiicola (Berk. & M. A. Curtis) C. T. Wei is a cosmopolitan species with reports of occurrence in leaves, stems and roots in several plant species, being frequently associated as the causal agent of the target spot in different plant species of agronomic importance. This study analyzed a collection of 32 isolates of C. cassiicola obtained from different hosts and locations in Brazil. Seven nuclear genes and a mitochondrial gene were partially sequenced and analyzed in order to explore the phylogenetic and phylogeographic relationships among the isolates and to verify if there is an association between the precursor gene of the toxin produced by the fungus, the cassiicolin, and the lineages we found. Additionally, the presence of independent point mutations - E198A, F200Y and G143A - that confer resistance to fungicides were investigated. The isolates were grouped into three lineages. The distribution of the isolates between the lineages was neither associated with host nor geographical origin of the isolates. The isolates of the collection contain one of four possible cassiicolin isoforms. In general, association between isoforms and phylogenetic clades was absent. The three point mutations that confer resistance to fungicides were present (alone or in combination) in eight isolates. Two of these mutations (E198A and F200Y) had never been identified in isolates of C. cassiicola. The evidence of genetic variability among the isolates and the occurrence of three independent point mutations, along with the polyphagous habit of C. cassiicola, compromise the current disease management practices in the Brazilian agriculture. Therefore, the information generated may be useful in ecological and epidemiological analysis of C. cassiicola, as well as in the development of management measures against the target spot.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A APOBEC3G (A3G) tem sido descrita como um fator celular que inibe a replicação do HIV-1. Durante a transcrição reversa, a A3G promove a desaminação de citidinas para uracilas nas fitas negativas de DNA viral, induzindo hipermutação de guaninas para adeninas nas fitas positivas. O HIV-1 contra-ataca esse efeito pela atividade da proteína viral Vif, que neutraliza complexos A3G através de um mecanismo de degradação proteassômica. Apesar de alguns polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) terem sido descritos ocorrendo ao longo do gene A3G, seus efeitos sobre a progressão da infecção pelo HIV-1 não são claros. Este estudo tentou estabelecer, na população brasileira, a freqüência de 7 SNPs descritos anteriormente e seu impacto na carga viral e contagem de células T CD4+, em associação com a presença de hipermutação no gene da integrase. Além disso, foi analisada a diversidade genética do gene vif a fim de estabelecer sua associação com o estado clínico e os polimorfismos da A3G. Foram analisadas 400 amostras provenientes de indivíduos infectados pelo HIV-1 que não foram submetidos a tratamento antiretroviral. Os SNPs na A3G foram detectados por resequenciamento. Com o auxílio de ferramentas de bioinformática, foram utilizados modelos baseados em códons para estudar o processo evolutivo do gene vif, a partir de 156 sequências do subtipo B do HIV-1. A hipermutação foi investigada utilizando o corante Bisbenzamida-PEG durante a eletroforese em gel de agarose. Os géis foram analisados utilizando o software Image J e de acordo com a posição das bandas, quando comparados aos controles, as amostras foram categorizadas. Foi verificado que brasileiros e europeus têm freqüências genotípicas similares no gene A3G. A análise também revelou que os polimorfismos na maioria dos loci da A3G não tiveram qualquer influência na carga viral e contagem de células T CD4+. A análise das amostras em gel de agarose com HA-Yellow encontrou 36% de hipermutação. Notavelmente, códons sob o efeito de epistasia no gene vif foram associados com os níveis de células T CD4+. As análises baseadas em filogenia revelaram que os polimorfismos na A3G e a hipermutação tiveram um impacto insignificante na taxa de mutação neutra no gene vif. No entanto, códons sob selecção positiva foram detectados no gene vif entre as regiões MKSLVK e YRHHY, e nas regiões de interação com a BC-Box e Cullin5-Box. Estas regiões são envolvidas na degradação de Vif induzida por complexos A3G. Em conclusão, foi observado que a evolução do vif é parcialmente explicada pela resposta adaptativa otimizada para neutralizar a atividade da A3G, o que demonstra a plasticidade evolutiva do HIV-1 para se adaptar aos genes com função antiviral do hospedeiro. / APOBEC3G (A3G) has been described as a cellular factor that inhibits replication of HIV-1. During reverse transcription, A3G promotes deamination of cytidine to uracil in the minus strand viral DNA, inducing hypermutation of guanines to adenines in plus strand DNA. The HIV-1 counters this effect by the activity of the viral protein Vif, which counteracts A3G complexes through a mechanism of proteasome degradation. Although some single nucleotide polymorphisms (SNPs) have been described occurring along the A3G gene, its effects on the progression of HIV-1 are unclear. This study attempted to establish, in the Brazilian population, the frequency of seven SNPs previous described and their impact on viral load and CD4 cell count, in association with the presence of hypermutation in the integrase gene. In addition, we analyzed the genetic diversity of the vif gene to establish its association with clinical status and polymorphisms of A3G. We analyzed 400 samples from drug naïve infected HIV-1 patients. SNPs were detected by resequencing. Bioinformatic tools for HIV-1 sequences analyses were used for studying the evolutionary process of gene vif. Hypermutation has been investigated using the dye-PEG Bisbenzimide in agarose gel electrophoresis. The gels were analyzed using Image J software and according to the position of the bands, when compared to controls, the samples were categorized. It was found that Brazilians and Europeans have similar genotype frequencies in the A3G gene. The analysis also revealed that the polymorphisms in most loci of A3G had no impact on viral load and CD4 + T cells counts. Analysis using agarose gels with HA-Yellow found that 36% of all samples ware hypermutated. Notably, the codons under epistasis influence in the vif gene were associated with levels of CD4 + T cells. The phylogenetic-based analysis revealed that A3G polymorphisms and hypermutation had insignificant impact in the rate of neutral mutation in vif gene. However, codons under positive selection were detected between the MKSLVK and YRHHY regions and within the BC-Box and the Cullin5-Box of vif gene. These regions are involved in the degradation of Vif-induced A3G complexes. In conclusion, we observed that the evolution of vif is partly explained by the optimized adaptive response to counteract A3G activity, which demonstrates evolutionary plasticity of HIV-1 to adapt to host genes with antiviral function. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:23:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 nathalia_ramos_ioc_dout_2015.pdf: 5459718 bytes, checksum: e0b760351d18c4b9bdd34e2ba0fe3de2 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) representa um grave problema de saúde pública no Brasil e apesar dos recentes progressos, o tratamento ainda é um dos maiores desafios tanto em termos de efetividade clínica como de custo-benefício. A anemia hemolítica induzida pela ribavirina (RBV) é o principal efeito colateral no tratamento antiviral. Além dos fatores virais, fatores do hospedeiro têm papel fundamental no controle da infecção. Estudos recentes demonstraram que polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) nos genes da interleucina 28B (IL28B) estão fortemente associadas com a resolução espontânea (RE) da doença e com resposta virológica sustentada (RVS) e, no gene da inosina trifosfato pirofosfatase (ITPA) estão relacionados com a proteção contra a anemia. No gene IL28B, os genótipos CC no rs12979860, e TT no rs8099917 estão associados com a cura espontânea e com a resposta à terapia. No gene da ITPA, os genótipos CC no rs1127354 e AA no rs7270101 apresentam associação com a anemia. No entanto, a maioria dos métodos de identificação destes polimorfismos, atualmente disponíveis, é custosa. O objetivo geral deste trabalho foi determinar o perfil alélico dos genes IL28B e ITPA em amostras de pacientes com hepatite C, avaliar a associação dos polimorfismos do gene IL28B com resolução espontânea e terapêutica e, do gene da ITPA com a redução dos níveis de hemoglobina durante o tratamento antiviral. Neste trabalho, numa etapa inicial para o gene IL28B, quatro metodologias foram avaliadas em termos de especificidade, custo e tempo de execução: tetra-primer amplification-refractory mutation system-polymerase chain reaction (ARMS-PCR), polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição (RFLP); reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e sequenciamento nucleotídeo Devido a próxima localização dos SNPs do gene ITPA, a genotipagem foi realizada por meio de sequenciamento nucleotídico. Um total de 281 amostras de sangue total de pacientes com infecção crônica pelo HCV foi estudado. Protocolos próprios para as técnicas ARMS-PCR e RFLP foram desenvolvidos e otimizados e, os resultados comparados com os do sequenciamento. Todos os métodos foram específicos, contudo o método ARMS-PCR apresentou os melhores resultados de acordo com a análise de custo-benefício. Em um segundo estudo, a frequência de polimorfismos do rs1127354 e rs7270101 do gene da ITPA foi avaliada em 200 pacientes com hepatite C crônica, e em 100 indivíduos saudáveis e, a associação com o desenvolvimento de anemia foi investigado em 97 pacientes que concluíram a terapia antiviral. A frequência global de distribuição alélica em rs7270101 e rs1127354 mostrou altas taxas dos genótipos AA (84,0%) e CC (94,3%), respectivamente, sugerindo que a coorte estudada possui uma grande propensão para o desenvolvimento de anemia induzida pela RBV. Ademais, constatamos uma diminuição progressiva de hemoglobina durante a terapia antiviral, sendo mais significante na 12ª semana e em pacientes do sexo masculino. No terceiro estudo, analisamos a associação entre os genótipos dos SNPs da IL28B com RE em 24 pacientes com hepatite aguda e em 111 pacientes crônicos com RVS tratados com PEG-IFN/RBV. O genótipo CC (rs12979860) e o genótipo TT (rs8099917) apresentaram associação com RE e o alelo C (rs12979860) apresentou forte associação (p=0,0045) com a RVS Estes dados confirmaram a importância destes genótipos no controle da infecção. Os resultados obtidos neste trabalho são importantes para um melhor entendimento dos fatores do hospedeiro associados com a eliminação espontânea do vírus, com a RVS e com a anemia induzida pela ribavirina no tratamento antiviral da infecção pelo HCV / Hepatitis C virus (HCV) i nfection is a leading public health problem in Brazil . D espite of the recent progress, the treatment is still a major challenge in terms of both clinical - and cost - effectiveness. The r ibavirin (RBV) - induced anemi a is the major hematological effect of antiviral treatment. In addition to viral factors, the host factors play a fundamental role in infection control . Recent studies have shown that single nucleoti de polymorphisms (SNPs) in the genes of interleukin 28B ( IL28B) and inosine triphosphate pyrophosphatase (ITPA) are strongly associated with spontaneous clearence ( SC ) of the virus, with sustained virologic response (SVR) and with protection against anemia. In the IL28B gene, the CC genotype at rs12979860 and TT genotype at rs8099917 are associated with spontaneous clearance of virus and with response to therapy. In ITPA gene, CC genotype in rs1127354 and AA genotype at rs7270101 show association with anemia. However, most of the methods currently available for i dentifying these polymorphisms are costly. The aim of this study was to determine the allelic profile of IL28B and ITPA genes in samples from patients with hepatitis C, evaluate the association of polymorphisms in IL28B gene with spontaneous and treatment - induced clearance of HCV and , ITPA gene , w ith development of anemia during antiviral therapy. In this work, initially for IL28 gene , four techniques were evaluated in terms of specificity, cost and time of execution: tetra - primer amplification refractory m utation system - polymerase - chain reaction (ARMS - PCR), restriction fragment length polymorphism (RFLP); chain reaction quantitative polymerase (qPCR) and direct nucleotide sequencing . Due to SNPs location in ITPA gene, genotyping was performed by nucleotide sequencing. A total of 281 whole blood samples from patients with chronic HCV infection w ere studi ed. P rotocols for ARMS - PCR and RFLP techniques were developed and optimized and the results compared with those of sequencing. All methods were specific; howe ver, ARMS - PCR method showed the best results according to the cost - benefit analysis. In a second study, the frequency of rs1127354 and rs7270101 polymorphisms in ITPA gene was evaluated in 200 patients with chronic hepatitis C , and in 100 healthy individua ls, and the association with the development of anemia was investigated in 97 patients who completed the antiviral therapy. The overall allele frequency distribution at rs7270101 and at rs1127354 showed high rates of AA genotypes (84 .0 %) and CC genotypes ( 94.3%), respectively. These results suggest ed that the cohort has a high propensity for the development of RBV - induced anemia . Moreover, we noticed a progressive decrease in hemoglobin during antiviral therapy , more significant ly in the 12 th weeks and in male patients. In the third study, we analyzed the association between the IL28B SNPs with SC in 24 patients with acute hepatitis and in 111 chronic patients with SVR treated with PEG - IFN/ RBV. The CC genotype (rs12979860) and the TT genotype (rs8099917) we re associated with SC and the C allele (rs12979860) showed a strong association ( p = 0.0045) with the S VR . The data confirm the importance of these genotypes in infection control. Th ese results are also important for a better understanding of host factors associated with spontaneous clearance of the virus, with SVR and with RBV - induced anemia in antiviral treatment of HCV infection

INTRODUÇÃO A malformação arteriovenosa (MAV) cerebral é uma causa de hemorragia intracraniana (HIC). Foi realizado a genotipagem de 7 polimorfismos em genes associados com a resposta inflamatória e vias angiogênicas, baseados em hipótese biológica e resultados prévios. O objetivo desse estudo é replicar e avaliar a associação de cada polimorfismo com a suscetibilidade do paciente à MAV e ao risco de apresentação hemorrágica. MÉTODO Um total de 63 pacientes com MAV e 96 indivíduos saudáveis foram recrutados. Os polimorfismos selecionados para avaliação foram: apolipoproteína E (APOE), fator de necrose tumoral alfa (TNF 238G>A - rs361525), Interleucina 1 beta (IL1B 511C>T - rs16944 e IL1B -31T>C - rs1143627), quinase tipo receptor de ativina (ACVRL1 IVS3-35A>G - rs2071219), endoglina (ENG 207G>A - rs11545664) e interleucina 6 (IL6 174G>C - rs1800795). Os modelos dominante e multiplicativo foram utilizados para calcular tanto o risco de MAV quanto de apresentação com hemorragia. Um modelo de regressão multivariável foi realizado para controle para sexo, idade, etnia (autoclassificação) para risco de MAV. A escala de Spetzler-Martin foi utilizada para análise multivariável para risco de apresentação com HIC. RESULTADOS Na análise univariável, foi observado diferença estatisticamente significativa entre pacientes com MAV e indivíduos controles para a distribuição alélica da IL1B -31T>C (rs1143627) (P=0,02). A IL1B 511C>T (rs16944) demonstrou uma tendência à associação com susceptibilidade à MAV (P=0,07). Na análise de regressão logística não houve associação com risco de MAV. Nenhum polimorfismo demonstrou associação com apresentação hemorrágica tanto na análise uni quanto multivariável. CONCLUSÃO Nessa população, a suscetibilidade à MAV e o risco de apresentação hemorrágica não foram associados com os polimorfismos selecionados.