Este trabalho está dividido em duas partes: (i) estudo da adsorção da enzima horseradish peroxidase (HRP) sobre substratos planos (lâminas de Si/SiO2, filmes ASP/Si/SiO2, filmes CABads/Si/SiO2, filmes CABspin/Si/SiO2 e filmes CMCABspin/Si/SiO2) seguida de testes da atividade enzimática da HRP imobilizada sobre estes substratos e (ii) obtenção de oligômeros divinílicos mediada pela HRP. Na primeira parte, a imobilização da HRP sobre substratos planos foi estudada através de elipsometria, microscopia de força atômica (AFM) e medidas de ângulo de contato. As isotermas de adsorção da HRP sobre Si/SiO2, APS/Si/SiO2 e CABads/Si/SiO2 apresentaram um aumento contínuo da quantidade de material adsorvido ΓHRP em função da concentração da solução de enzima até atingir um patamar de adsorção no qual verificou-se a formação de uma monocamada de HRP adsorvida. Nestes casos, o processo de adsorção da HRP pode ser descrito pelo modelo de adsorção aleatória (RSA). Para filmes HRP/CABspin/Si/SiO2 e HRP/CMCABspin/Si/SiO2 observou-se adsorção cooperativa de moléculas de HRP e formação de multicamadas. A adsorção da HRP sobre Si/SiO2, filmes APS, CABads e CMCABspin é um processo irreversível. Ao contrário, HRP adsorve reversivelmente sobre filmes CABspin, fato evidenciado pelo decréscimo de ~30% na espessura dos filmes de enzima. A atividade catalítica dos filmes de HRP imobilizados sobre substratos planos foi verificada na reação de oxidação do ABTS. Os testes de atividade catalítica mostraram que os substratos com a HRP adsorvida podem ser reutilizados 3 vezes sem dessorção ou perda da atividade catalítica da enzima, com exceção dos filmes HRP/CABspin/Si/SiO2 que se tornam inativos após a primeira catálise. A condição de máxima atividade catalítica de HRP imobilizada foi correlacionada com grau de cobertura de ~55%. O emprego do monômero etileno glicol dimetacrilato (EGDMA) em reações de polimerização catalisadas por filmes HRP/Si/SiO2 ou pela HRP livre em solução à temperatura ambiente revelou a formação de partículas cristalinas com geometria poligonal. Com objetivo de compreender a formação das estruturas cristalinas, a segunda parte do trabalho focou a formação de oligômeros de EGDMA e trietileno glicol dimetacrilato (TEGDMA) em meio aquoso catalisada pela HRP na presença H2O2 a temperatura ambiente. Os oligômeros de EGDMA e/ou TEGDMA foram caracterizados por gravimetria, cromatografia de permeação em gel, espectroscopia vibracional na região do infravermelho e espectroscopia 1H RMN. A auto-associação dos oligômeros originou partículas cristalinas com ângulos retos, como evidenciado pelas imagens de microscopia eletrônica de varredura. As medidas de calorimetria exploratória diferencial e difração de raio-x confIrmaram a cristalinidade das amostras. Os oligômeros de EGDMA, TEGDMA e EGDMA-co-TEGDMA sintetizados na presença do sistema HRP-H2O2 apresentaram grupos vinila pendentes, boa solubilidade em clorofórmio e ponto de fusão bem definido, evidenciando pouca reticulação ou ciclização e mostrando que as propriedades catalíticas da HRP propiciam um ambiente reacional apropriado para produzir materiais poliméricos com novas características. / This work is divided into two parts: (i) study on the adsorption of the enzyme horseradish peroxidase (HRP) onto flat substrates (silicon wafers, ASP/Si/SiO2 films, CABads/Si/SiO2 films, CABspin/Si/SiO2 films, and CMCABspin/Si/SiO2 films) followed by enzymatic catalytic tests of HRP immobilized onto these substrates, and (ii) formation of divinyl-based oligomers mediated by HRP. In the first part, the HRP immobilization onto flat substrates was investigated by means of ellipsometry, atomic force microscopy (AFM), and contact angle measurements. Adsorption isotherms of HRP onto silicon wafers, APS/Si/SiO2, and CABads/Si/SiO2 presented the continuous increase of HRP adsorbed amount ΓHRP as a function of enzyme solution concentration until an adsorption plateau, which evidenced monolayer formation. In these cases, the HRP adsorption process can be described by the random sequential adsorption model (RSA). For HRP/CABspin/Si/SiO2 and HRP/CMCABspin/Si/SiO2 cooperative adsorption of HRP molecules and multilayer formation were evidenced. The HRP adsorption onto silicon wafers, APS, CABads, and CMCABspin films is an irreversible process. Contrarily, HRP adsorbed reversibly onto CABspin films, since desorption of ~30% could be detected. The catalytic activity of HRP films immobilized onto flat substrates was verified by oxidation reaction of ABTS. Catalytic tests showed that substrates with adsorbed HRP can be reused three times without desorption or catalytic activity lost, except for HRP/CABspin/Si/SiO2 films, which became inactive after first use. The emulsion polymerization of ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) in mediated by HRP/Si/SiO2 films or by free HRP at room temperature revealed the formation of crystalline particles with polygonal geometry. In order to understand the formation of such crystalline structures, the second part of this thesis focused on EGDMA and/or triethylene glycol dimethacrylate (TEGDMA) oligomers formation in aqueous medium catalyzed by HRP in the presence of H2O2 at room temperature. EGDMA and/or TEGDMA oligomers were characterized by means of gravimetry, gel permeation chromatography, infrared vibrational spectroscopy and 1H NMR spectroscopy. Self-assembling of oligomers led to right-angled crystalline particles, as evidenced by scanning electron microscopy images. Differential scanning calorimetry and X-ray diffractometry measurements ratified the samples crystallinity. EGDMA, TEGDMA and EGDMA-co-TEGDMA oligomers synthesized in the presence of HRP-H2O2 system presented pendant vinyl groups along the chains, good solubility in chloroform, and well defined melting point. These features evidenced few crosslinking or cyclization and revealed that the catalytic properties of HRP provide an appropriate environrnent for production of materials with new characteristics.

La maladie d'Alzheimer (AD) est un désordre neurodégénératif progressif et la forme la plus commune de démence. A l’heure actuelle, il n'y a aucun remède et la maladie est toujours fatale. Une des caractéristiques histopathologiques de l'AD est la présence de dépôts protéiques, les plaques amyloïdes, dans le cerveau. Ces plaques sont formées par les peptides amyloïdes β (Aβ) de 40 et 42 résidus, qui sont les produits de clivage par des protéases de la protéine précurseur de l’amyloïde (l'APP). L'élucidation de certains des processus clés dans la cause et le développement de l'AD est une étape cruciale pour le développement de traitements nouveaux et efficaces.<p><p>Les propriétés conformationnelles du segment transmembranaire (TM) de l’APP peuvent affecter sa protéolyse par la γ-sécrétase. Ces propriétés ne sont pas encore clairement établies. Afin de comprendre le rôle des variations structurelles du TM dans le traitement de l'APP, des détails structurels des peptides APP_TM4K, chimiquement synthétisés, ont été étudiés dans la bicouche lipidique en utilisant la réflexion totale atténuée par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (ATR-FTIR) et la résonance magnétique nucléaire à l’état solide (ssNMR). Tandis que la structure secondaire globale du peptide APP_TM4K est hélicoidale, une hétérogénéité conformationnelle et orientée a été observée pour le site de clivage γ et, dans une plus faible mesure, pour le site de clivage ζ. Ces variabilités conformationnelles autour des sites de clivage γ et ζ peuvent avoir des implications importantes dans le mécanisme de clivage et donc dans la production d’Aβ. Il a été aussi démontré que la dernière glycine dans le motif de dimérisation GxxxG est transmembranaire. Ceci peut impliquer que la dimérisation via ce motif pourrait servir d’ancrage et conférer une orientation transmembranaire stable au segment transmembranaire de l’APP.<p><p>Le peptide amyloïde β est directement lié à la maladie d’Alzheimer. Partant de sa forme monomérique, l’Aβ s'agrège pour produire en final des fibrilles et aussi de manière transitoire toute une gamme d'oligomères, ces derniers étant la plupart neurotoxiques. Une dérégulation de l’homéostasie du Ca2+ dans le cerveau vieillissant et dans des troubles neurodégénératifs joue un rôle crucial dans de nombreux processus et contribue au dysfonctionnement et à la mort cellulaire. Nous avons postulé que le calcium peut permettre ou accélérer l'accumulation d'Aβ. Le modèle d'accumulation d'Aβ (1-40) et celui d'Aβ (1-40) E22G, un peptide amyloïde portant la mutation arctique qui cause une apparition prématurée de la maladie, ont été comparé. Nous avons constaté qu'en présence de Ca2+, l’Aβ (1-40) forme de préférence des oligomères semblables à ceux formés par l’Aβ (1-40) E22G avec ou sans Ca2+, tandis qu'en absence de Ca2+ l'Aβ (1-40) s’agrège sous forme de fibrilles. Les ressemblances morphologiques entre oligomères ont été confirmées par microscopie de force atomique. La distribution des oligomères et des fibrilles dans des échantillons différents a été détectée par électrophorèse sur gel suivie d’une analyse par Western blot, dont les résultats ont été confirmés par des expériences de fluorescence à la thioflavine T. Dans les échantillons sans Ca2+, l’ATR-FTIR révèle la conversion des oligomères en feuillets β antiparallèles en la conformation caractéristique des fibrilles en feuillets β parallèles. En général, ces résultats nous ont ameré à conclure que les ions calcium stimulent la formation d'oligomères d'Aβ (1-40), qui sont impliqués dans la pathogénèse d'AD.<p><p>Malgré les progrès énormes obtenus dans la compréhension de la maladie (AD), il reste un défi majeur, celui du développement de médicaments nouveaux et efficaces. Afin d’obtenir des éclaircissements sur le mécanisme d'action de deux nouveaux puissants modulateurs de la γ-sécrétase - le benzyl-carprofen et le sulfonyl-carprofen dans la bicouche lipidique, la technique de RMN à l’état solide a été employée. Précédemment, les dérivés du carprofen ont été localisés dans des membranes de lipides par des expériences de diffusion (scattering) des neutrons. Les contraintes déterminées à partir des expériences de ssNMR ont permis d’affiner leurs positions et d’obtenir une orientation précise dans la double couche lipidique. Ces résultats combinés indiquent que le mécanisme probable de modulation du clivage par la γ-sécrétase est une interaction directe des carprofènes avec le domaine TM de l’APP. Une telle interaction, empêcherait à la formation de dimères d'APP, dimérisation nécessaire au clivage séquentiel par la γ-sécrétase, diminuant ou réduisant ainsi énormément la production d’Aβ, tout particulièrement d’Aβ42.<p><p>Les résultats de ce travail apporte de nouvelles informations sur les processus clés impliqués dans l'AD; Production de l'Aβ à partir de l'APP, formation des oligomères d'Aβ et mécanisme d'action potentiel de molécules thérapeutiques. Nous pensons que ces résultats pourront permettre une meilleure compréhension de la maladie et pourront aider dans la conception de nouveaux médicaments contre cette maladie.<p><p>Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder and the most common form of dementia. There is no cure and the disease is fatal. One of the characteristic histopathological markers of AD is the presence of proteinaceous deposits, amyloid plaques, in the brain. These plaques are formed by the amyloid β-peptides (Aβ) 40- and 42-residue-long, which are protease cleavage products of the amyloid precursor protein (APP). Elucidation of some of the key processes in the cause and the development of AD is crucial for the development of new and efficient treatments.<p><p>Conformational properties of the transmembrane (TM) segment of APP may affect its proteolytic processing by γ-secretase. These properties have not been definitely established. In addressing the role of structural variations of the TM sequence in APP processing, structural details of the chemically synthesized APP_TM4K peptides within the membrane bilayers were studied using Attenuated total reflection Fourier transform spectroscopy (ATR-FTIR) and solid-state nuclear magnetic resonance (ssNMR) techniques. While the overall secondary structure of the APP_TM4K peptide is an α-helix, conformational and orientational heterogeneity was observed for the γ-cleavage site and, to a smaller extent, for the ζ-cleavage site. Evidence for the conformational variability around γ- and ζ-cleavage sites may have important implications for the cleavage mechanism and hence for the Aβ production. It was also found that the last glycine within the sequence of GxxxG motifs is in the transmembrane orientation, implying that dimerization via these motifs may act as an anchor, confining the TM dimer to the stable transmembrane orientation. <p><p>Amyloid β-peptide is directly linked to AD. Starting from its monomeric form, Aβ aggregates into fibrils and / or oligomers, the latter being the most neurotoxic. Dysregulation of Ca2+ homeostasis in aging brains and in neurodegenerative disorders plays a crucial role in numerous processes and contributes to cell dysfunction and death. Here we postulated that calcium may enable or accelerate the aggregation of Aβ. The aggregation pattern of Aβ(1-40) and of Aβ(1-40)E22G, an amyloid peptide carrying the Arctic mutation that causes early onset of the disease, were compared. We found that in the presence of Ca2+, Aβ(1-40) preferentially formed oligomers similar to those formed by Aβ(1-40)E22G with or without added Ca2+, whereas in the absence of added Ca2+ the Aβ(1-40) aggregated to form fibrils. Morphological similarities of the oligomers were confirmed by contact mode atomic force microscopy (AFM) imaging. The distribution of oligomeric and fibrillar species in different samples was detected by gel electrophoresis and Western blot analysis, the results which were further supported by thioflavin T fluorescence experiments. In the samples without Ca2+, Fourier transform infrared spectroscopy revealed conversion of oligomers from an anti-parallel β-sheet to the parallel β-sheet conformation characteristic of fibrils. Overall, these results led us to conclude that calcium ions stimulate the formation of oligomers of Aβ(1-40), that have been implicated in the pathogenesis of AD. <p><p>Despite the tremendous progress in understanding AD, there remains the challenge of the development of new and efficient drugs. In order to shed light onto the mechanism of action of two new potent γ-secretase modulators -- benzyl-carprofen and sulfonyl-carprofen within lipid bilayers, ssNMR technique was employed. Using neutron scattering experiments it was previously found that sulfonyl-carprofen and benzyl-carprofen partition into the headgroup region of the lipid bilayer. The orientational constraints derived from the ssNMR experiments refined their position into precise orientation. Combined, these results indicate that carprofen-derivatives can directly interact with the region of APP that mediates dimerization. Such interaction, would interfere with proper APP-dimer formation, which is necessary for the sequential cleavage by γ-secretase, diminishing or greatly reducing Aβ42 production.<p><p>Results obtained during this work shed new light onto some of the key processes in AD: Aβ production from APP, formation of Aβ oligomers and insights into the mechanism of action of potential therapeutics. We believe that these results will promote a better understanding of the disease and will help in future drug design.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

In Parkinson’s disease (PD) and dementia with Lewy bodies (DLB), aggregated α-synuclein deposit inside cells within the brain. Smaller soluble α-synuclein aggregates, oligomers, are present both intra- and extracellularly. The α-synuclein oligomers are known to be particularly harmful, although the underlying neurotoxic mechanisms are not fully understood. The aim of this thesis was to investigate the pathogenic roles of α-synuclein oligomers and the possibility to target such species with antibody treatment. Passive immunotherapy with α-synuclein antibodies can lead to reduced pathology and ameliorated symptoms in transgenic mice. However, it remains unknown whether the antibodies are taken up by cells or whether they act extracellularly. In Paper I, we assessed cellular internalization of various α-synuclein monoclonal antibodies. The oligomer selective mAb47 displayed the highest uptake, which was promoted by the extracellular presence of α-synuclein. Alpha-synuclein aggregates can be found in both neurons and glial cells, but the pathogenic role of glial deposits has only been sparsely investigated. In Paper II, co-cultures of neurons and glia were exposed to α-synuclein oligomers. The astrocytes in the cultures rapidly accumulated oligomers, which were only partially degraded by lysosomes. The sustained intracellular α-synuclein deposits were associated with mitochondrial stress reactions in the astrocytes.  In Paper III, we sought to explore whether the astrocytic pathology induced by α-synuclein oligomers could be ameliorated by antibody treatment. Pre-incubation of oligomers with mAb47 promoted α-synuclein clearance, reduced astrocytic accumulation and rescued cells from mitochondrial stress. We could demonstrate that binding of the antibody to its antigen in the extracellular space was crucial for these effects to occur. The progressive pathology in PD is believed to be driven by cell-to-cell spreading of α-synuclein aggregates, potentially via exosomes and other extracellular vesicles (EVs). In Paper IV, we found that either fusing α-synuclein to a non-physiological protein tag or introducing the PD-causing A53T mutation directed α-synuclein towards EV secretion. Also, EV-associated α-synuclein was particularly prone to induce toxicity in recipient cells. In conclusion, this thesis sheds new light on the cellular dysfunction related to α-synuclein pathology and on how the underlying pathogenic processes may be targeted by antibody treatment.

La maladie d'Alzheimer, maladie neurodégénérative la plus courante, est la cause de50% des cas de démence. La maladie d’Alzheimer est provoquée par l'agrégation d'unamyloïde, le peptide Aβ1-42, dans le cerveau des patients.De nombreuses études relient la toxicité des amyloïdes à l'existence de diversesstructures intermédiaires survenant avant la formation des fibres et / ou leur interactionspécifique avec les membranes.Dans cette étude, nous nous sommes centrés sur l'interaction entre des modèlesmembranaires et le peptide Aβ1-42 (WT et des mutants plus ou moins toxiques) évaluée parplusieurs techniques biophysiques (ellipsométrie, PM-IRRAS, fluorescence de la ThT, fuitede calcéine, PWR, cryo-MET). Nous avons tout d'abord étudié l’interaction avec des modèlesde membrane simples (100% DOPG ou 100% DOPC). Nous avons établi que la force motricede l'interaction entre tous les peptides et la membrane n’est pas régie par des interactionsélectrostatiques, mais est favorisée en présence des têtes polaires PG qui peuvent interagiravec le peptide par l'intermédiaire de liaisons hydrogènes. Nous avons démontré quel'oligomère le plus toxique induit des dommages sur les membranes de PG, ce qui diminue laformation de fibres.Une nouvelle composition lipidique constituée de GM1, cholestérol, sphingomyélineet POPC a été choisie pour mimer les membranes neuronales. Des techniques innovantes : laspectroscopie infrarouge à l'échelle nanométrique et l’AFM haute-vitesse ont été utilisées,respectivement, pour accéder à la morphologie et la structure secondaire des peptides enprésence de membranes et observer la dynamique de cette interaction. Les résultats obtenusmontrent que les gangliosides GM1 et le cholestérol jouent un rôle central dans l'interactiond’Aβ avec les membranes. Nous avons été en mesure de proposer un modèle du mécanismed'interaction : Aβ1-42 s’accumule sur les domaines de GM1 présents dans la membrane via desliaisons hydrogène, puis s’insère dans la membrane par les domaines enrichis en cholestérol.Le cholestérol et les gangliosides sont nécessaires pour l'interaction d’Aβ1-42 avec lamembrane.Afin de suivre la cinétique d'agrégation d’Aβ et de comprendre ses différents étatsd'agrégation par spectroscopie infrarouge, l’élaboration d’une cellule microfluidique adaptée aété entreprise. / Alzheimer’s disease is the most common neurodegenerative disease, leading to 50% ofdementia cases, caused by the aggregation of an amyloid, the Aβ1-42 peptide in patients brain.Many studies link the toxicity of amyloids, as A1-42 involved in Alzheimer disease, tothe existence of various intermediate structures prior to fiber formation and /or their specificinteraction with membranes.In this study we focused on the interaction between membrane models and A1-42peptides and variants more or less toxic with several biophysical techniques (ellipsometry,PM-IRRAS, ThT fluorescence, calceine leakage, PWR, cryo-TEM). First, with simplemembrane models (pure DOPG or pure DOPC), we established that the driving force for theinteraction between all the peptides and membrane is not governed by electrostatic interactionbut is favored in presence of PG headgroups that may interact with peptide via hydrogenbonding. We demonstrated that the most toxic oligomer induces PG membrane damage,decreasing the formation of fibers.New lipid composition GM1, cholesterol, sphingomyelin and POPC has been chosento mimic neuronal membranes. Innovative techniques: as nanoscale infrared spectroscopy andhigh-speed AFM were used to assess to the morphology and the secondary structure of thepeptides in presence of membrane and to observe the dynamic of this interaction,respectively. The results obtained show that the gangliosides GM1 and the cholesterol play acentral role in the interaction of Aβ with membranes. We were able to propose a model of theinteraction mechanism: Aβ1-42 firstly accumulates on the GM1 domains present in themembrane via hydrogen bonding and then inserts the membrane in the cholesterol enricheddomains. Cholesterol and gangliosides are required for the interaction of Aβ1-42 withmembrane.In order to follow the kinetic of Aβ agregation and understand its different agregationstates with infrared spectroscopy, a microfluidic cell fabrication has been investigated.

Dans le cadre de la formation sélective d'oligomères cycliques à partir du cyclo-octène, des matériaux hybrides organiques-inorganiques mésostructurés bien-définis contenant les unités Ru-NHC dissymétriques le long des canaux poreux de leur matrice de silice ont été développés et caractérisés à un niveau moléculaire. Tous les systèmes obtenus ont montré des fortes activités et sélectivités en oligomères cycliques (dimères : 50% et trimères : 25%) en RO-RCM du cyclo-octène, contrairement aux complexes homogènes Ru-NHC analogues symétriques (G-II et GH-II), qui conduisent préférentiellement à la formation de polymères. La variation de la longueur et de la flexibilité des bras espaceurs, dans le cas des catalyseurs hétérogènes, a prouvé que les bras courts et flexibles stabilisent grandement les sites actifs Ru-NHC pendant la réaction de métathèse et ce, grâce à la présence d'interactions entre les sites Ru-NHC catalytiquement actifs et la surface silicique. La présence de telles interactions a été mise en évidence par RMN du phosphore 31 à l'état solide. Des études supplémentaires concernant les performances catalytiques de complexes organométalliques Ru-NHC dissymétriques (analogues aux sites Ru-NHC contenus dans les catalyseurs hétérogènes) et Ru-NHC symétriques (G-II et Nolan) ont clairement montré que le facteur clé influençant la sélectivité en oligomères cycliques est la dissymétrie des ligands NHC. Cette dissymétrie génère la présence de deux sites actifs de configurations différentes au sein même des espèces Ru-NHC. Un des sites favorise la réaction intramoléculaire de fermeture de cycle par métathèse alors que l'autre site permet la réaction intermoléculaire d'ouverture de cycle conduisant ainsi à la formation des oligomères cycliques de petite taille / In the context of the selective formation of cyclic oligomers from cyclooctene, well-defined hybrid organic-inorganic mesoporous materials containing unsymmetrical Ru-NHC units along the pore channel of their silica matrix have been developed and characterized at a molecular level. All systems displayed high activity and selectivity towards the formation of lower cyclic oligomers in the RO-RCM of cyclooctene yielding mainly the dimer and the trimer with 50% and 25% selectivity, respectively, in contrast to classical symmetrical homogeneous analogues (G-II and GH-II), which yield mainly to polymers. Variation of length and flexibility of the tethers showed that flexible short tethers were critical for high stability of the catalysts during metathesis, which is consistent with the stabilization of Ru-NHC active sites by surface functionalities; this surface interaction was further corroborated by the absence of a PCy3 ligand coordinated to Ru when short flexible linkers are used. Further investigations using homogeneous symmetrical (G-II and Nolan) and unsymmetrical (analogues to heterogeneous catalysts) Ru-NHC catalysts clearly showed that the key factor influencing the selectivity towards low cyclic oligomers is the unsymmetrical nature of NHC ligands, which creates dual site configuration in the catalyst architecture thus alternatively favouring one reaction over another, Ring Opening (ROM) vs. Ring Closing (RCM) Metathesis (propagation vs. backbiting), thus leading to the selective tandem RO RCM of cyclooctene. Finally, we have also investigated Grubbs Hoveyda-II (GH-II) type catalysts immobilized on silica support through adsorption, which showed the same product selectivity as that of the well-defined Ru-NHC materials. This result implies that the adsorbed symmetrical GH-II catalyst “becomes unsymmetrical upon adsorption”. Adsorbing unsymmetrical molecular GH II catalysts did not however improve the performances of these types of catalysts. Overall, the unique property of unsymmetrical NHC Ru catalyst, whether supported or not, opens new perspectives in the selective synthesis of macrocycles from other cyclic alkenes via metathesis

Aucun traitement de la maladie d’Alzheimer (MA) n’existe, justifiant le développement de stratégies thérapeutiques. La toxicité des oligomères solubles du peptide amyloïde β (Aβ) est centrale dans les pertes synaptiques et cellulaires précoces dans la maladie. Dans le cadre de cette hypothèse, nous proposons qu’empêcher ces effets puisse prévenir le déclin cognitif dans la MA. Les facteurs neurotrophiques sont de bons candidats pour prévenir la mort cellulaire mais nécessitent une application ciblée et continue. Nous avons utilisé la technologie d’encapsulation cellulaire pour produire des bioréacteurs implantables contenant des cellules C2C12 sécrétant le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF). Notre objectif était d’établir la preuve du concept que la production à long terme de CNTF in situ dans le cerveau puisse prévenir les déficits cognitifs liés à l’Aβ.Nos études prouvent que le CNTF produit par les bioréacteurs prévient la cytotoxicité et l’apoptose induites par le peptide Aβ in vitro. La neuroprotection dépend de l’activation de la PI3-Kinase et du facteur STAT3. In vivo, l’implantation des bioréacteurs dans le cerveau prévient les troubles cognitifs induits par l’injection icv d’Aβ ou retarde leur apparition chez la souris Tg2576. Dans nos deux modèles précliniques de la MA, la protection comportementale est associée au maintien des protéines synaptiques dans l’hippocampe. Aussi, la production in situ de CNTF est une approche thérapeutique préventive efficace contre la toxicité et les déficits cognitifs liés à l’Aβ. Ces résultats suggèrent également que l’implantation de cellules encapsulées est un bon procédé pour délivrer des molécules thérapeutiques au cerveau / No cure against Alzheimer’s Disease (AD) exists yet, justifying the development of therapeutic strategies. Toxicity of soluble amyloid β peptide is a key-player in early synaptic and cellular loss in AD. According to this hypothesis, we propose that preventing Aβ peptide effects could prevent cogninitive decline in AD. Neurotrophic factors are good candidates to prevent cell death but require a targeted and continuous delivery. We used the cell encapsulation technology to produce graftable bioreactors that contain C2C12 cells secreting the Ciliary Neurotrophic factor (CNTF). Our goal was to realize the proof-of-concept that CNTF long term in situ delivery could prevent Aβ-induced cognitive decline.Our studies prove that bioreactor-produced CNTF prevents Aβ-induced cytotoxicity and apoptosis in vitro. Neuroprotection relies on PI3K and STAT3 activation. In vivo, bioreactor implantation in brain prevents cognitive impairment induced by Aβ icv injection or delays their appearance in Tg2576 mice. In both of our preclinical model of AD, behavioral protection was associated with synapse maintenance in hippocampus.Therefore, in situ long term CNTF delivery is an efficient preventive therapeutic strategy against toxicity and Aβ-linked cognitive disturbances. These results also suggest that encapsulated cells graft is a good way to deliver therapeutic molecules to the brain

L’objectif de ces travaux était l’utilisation d’oligomères de polyéthylène fonctionnels comme agents d’interface pour la formulation de matériaux polymères. Une première partie s’est portée sur la compréhension de l’évolution de la morphologie de mélanges composés d’une résine polypropylène ou polyéthylène et d’un oligomère de polyéthylène de faible masse molaire au cours de leur mise en œuvre et de leur cristallisation. Il a été constaté qu’un tel oligomère pouvait être incorporé sans difficulté aux résines sélectionnées, et ce grâce à une diffusion rapide ainsi qu’à une bonne miscibilité à l’état fondu. Cependant, il est apparu que ces mélanges étaient sujets à une séparation de phase solide-liquide lors de leur cristallisation, entraînant la formation de matériaux biphasiques à l’état solide. Dans une deuxième partie, un système réactif composé de deux oligomères fonctionnels a été étudié comme une potentielle stratégie de compatibilisation de mélanges polyéthylène/polyamide. Malgré les morphologies et propriétés intéressantes observées, il a été conclu que l’utilisation d’un tel système réactif n’était pas efficace comparé aux agents compatibilisants usuels. Enfin, des oligomères de polyéthylène fonctionnels ont été étudiés en tant qu’agents d’interface dans du polyéthylène renforcé par des fibres de verre dans l’optique d’en améliorer la facilité de mise en œuvre et les propriétés mécaniques. Il a ainsi été démontré que des oligomères avec les fonctionnalités appropriées pouvaient être utilisés comme agents d’interface en réduisant les interactions interparticulaires au cours de la mise en œuvre et en améliorant l’adhésion interfacial matrice-fibre à l’état solide / The objective of this work was to use end-functionalized polyethylene oligomers as interface agents in glass fibre-reinforced thermoplastics as well as compatibilizer precursors in immiscible polymer blends. The first part of this work was focused on the understanding of the morphology developments occurring during the melt processing and crystallization of binary systems where a low molar mass polyethylene oligomer was blended with polypropylene and polyethylene resins. It was found that the polyethylene oligomer was easily incorporated into the selected polyolefins thanks to rapid molecular diffusion and good miscibility in the molten state. However, it appeared that the blends underwent solid-liquid phase separation upon crystallization, leading to biphasic materials in the solid state. In a second part, a reactive system consisting of two functional oligomers was studied as a new strategy for the compatibilization of immiscible polyethylene/polyamide blends. Despite the interesting morphologies and properties observed, it was concluded that the use of such a reactive system did not result in efficient compatibilization compared to commonly used compatibilizer precursors. Lastly, polyethylene oligomers with various functionalities were investigated as interface agents in glass fibre-reinforced polyethylene, with the aim of improving both processability and mechanical properties. It was demonstrated that polyethylene oligomers with adequate functional groups could be successfully used as dispersants by reducing interparticle interactions during melt processing as well as coupling agents improving matrix-filler interfacial adhesion in the solid state

The contamination of foods with hydrocarbon mixtures migrating from food contact materials (FCM) was first observed for jute and sisal bags treated with batching oil in the 1990s. Since the millennium, the focus has shifted to printing inks and recycled cardboard packaging as most recognized sources for hydrocarbon contamination from FCM. Mineral oil containing printing inks can either release hydrocarbons directly from the printing of folding boxes into food or indirectly entering the recycling chain of cardboard material by printed products, such as newspapers. The contamination of dry foods with mineral oil hydrocarbons (MOH) from recycled fiber packaging has been reported to reach up to 100 mg/kg [1]. Using LC-GC-FID technique the MOH were categorized into mineral oil saturated hydrocarbons (MOSH) and mineral oil aromatic hydrocarbons (MOAH). The molecular mass, which is assumed to be toxicological relevant, is derived from the GC retention times of accumulated MOSH in human tissues and is limited to n C16 to n-C35 [2]. MOSH is the most significant contaminant of the human body reaching 1-10 g per person, which is of particular concern since a formation of microgranulomas (causing inflammatory reactions) in the liver was observed in rats fed with saturated hydrocarbons [3]. Furthermore, some MOAH are assumed to be genotoxic analogous to polycyclic aromatic hydrocarbons [3]. In the latest draft of a German ‘Mineral Oil Regulation’ the following limits for the migration of MOH from recycled fiber are proposed: for MOSH C16-20 4.0 mg/kg, MOSH C21-35 2.0 mg/kg and for MOAH 0.5 mg per kg food [4]. Functional barriers reducing the migration of undesirable compounds from recycled cardboards (such as MOH and other contaminants) could be a part of the solution for this issue. Supporting that approach in this study, the boxes of recycled cardboard featuring a barrier layer on the internal surface or an integrated adsorbent available early in 2014 were investigated for their efficiency in reducing migration of mineral oil hydrocarbons into dry food. A practice-oriented one-year storage test was performed with wheat flakes in seven configurations: a box of virgin fibers, two boxes of unprotected recycled cardboard, three cardboards with barrier layers (a flexo-printed polyacrylate layer, a polyvinyl alcohol coating and a multilayer involving polyester) and a cardboard containing activated carbon. The highest migration of MOH (C16-24) was observed in the boxes of unprotected recycled cardboard (MOSH: 11.4 mg/kg, MOAH: 2.4 mg/kg). Of the three investigated barrier layers only two reduced migration of MOH into food below the limits of the 3rd draft of the German mineral oil ordinance (2014) until the end of shelf life. The cardboard box involving active carbon as adsorbent prevented detectable migration of mineral oil hydrocarbons (<0.1 mg/kg). In the case of virgin fiber, which was virtually free of MOH (<1 mg/kg), migration close to the proposed limits was detected (C16-24, MOSH: 1.5 mg/kg, MOAH: 0.4 mg/kg). Therefore, it has been proven that the transport box (corrugated board) substantially contributed to the transfer of MOH into food. Plastic FCM can also release hydrocarbons, such as polyolefin oligomeric hydrocarbons (POH), into food. These POH are of synthetic nature and are formed during the polymerization process of polyolefins (150 – 3000 mg/kg in granulates of homo/hetero polymers involving ethylene and propylene). This group of synthetic contaminants contain also saturated hydrocarbons (POSH) analogous to mineral oils, but contrary no aromatic hydrocarbons. Further, a significant amount (10 – 50%) of monounsaturated hydrocarbons (POMH) was determined in the oligomeric fraction of polyolefins, which are not detectable in mineral oil products. Therefore, these POMH can be used as a marker for POH migration. A method based on two-dimensional high performance liquid chromatography on-line coupled to gas chromatography (on-line HPLC-HPLC-GC) was developed to enable the separate analysis of saturated, monounsaturated and aromatic hydrocarbons in extracts of packaging materials like polyolefins or paperboard and foods, repectively. It is an extension of the HPLC-GC method for MOSH and MOAH [1] using an additional argentation HPLC column, since normal-phase HPLC on silica gel did not preseparate saturated from monounsaturated hydrocarbons. Further, this method and comprehensive two-dimensional GC (GCxGC) was used to investigate the concentration of different oligomer types in polypropylene (PP) and polyethylene (PE) based sealing layers as well as their corresponding granulates. The analyzed sealing layers contained 180-995 mg/kg POSH and 90-435 mg/kg POMH (C16-35). Only in sealing layers involving low-density PE, oxidized polyolefin oligomers as well as cyclic oligomers (alkylated cyclopentanes and hexanes) have been detected. The transfer of POH (C16-35) from the investigated sealing layers into food can be substantial (>50%) and can reach more than 2 mg per kg food. The level of contamination depends on the oligomer content of the sealing layer, the fat content of the food, the processing temperature and the surface-volume ratio. Hot melt adhesives are widely utilized to glue cardboard boxes used as food packaging material. The analysed raw materials of hot melts mainly consisted of paraffinic waxes, hydrocarbon resins and polyolefins. The hydrocarbon resins, functioning as tackifiers, were the predominant source of hydrocarbons of sufficient volatility to migrate via gaseous phase into dry foods. The 18 hydrocarbon resins analyzed contained 8.2-118 g/kg saturated and up to 59 g/kg aromatic hydrocarbons (C16-24). These synthetic tackfier resins, especially the oligomers ≤C24, have been characterized structurally and migration into food was estimated using a food simulant and by the analysis of real food samples. About 0.5-1.5 % of the potentially migrating substances (C16 24) of a hot melt were found to be transferred into food under storage conditions, which can result in a food contamination of approximately 1 mg/kg food in this case. The order of magnitude depends on the absolute amount of potentially migrating substances from the hot melt, the hot melt surface, contact time, amount and type of foods.

Au cours des dix dernières années, des composés oligomères intéressants à base de l’acide cholique ont été synthétisés et caractérisés par nos collaborateurs du groupe de Julian X.X. Zhu à l’Université de Montréal (UdeM). Dans un travail récent, ils ont synthétisé un dimère d'acide cholique qui pouvait former de façon réversible une cavité moléculaire lorsqu'il était dissous dans des milieux de polarité différente ; dans l'eau, le dimère forme une cavité hydrophobe, et dans des milieux organiques, le dimère forme une cavité hydrophile. Ainsi, ce type de composés amphiphiles, lorsqu'ils sont en solution, démontre un comportement de cavité moléculaire qui dépend des conditions du solvant, formant une cavité de polarité opposée à celle du milieu dans lequel ils se trouvent. Le comportement d'inversion de la cavité résulte de la flexibilité conformationnelle du lieur chimique entre les monomères d'acide cholique. La capacité des cavités de piéger des sondes moléculaires en fonction de leur polarité suggère que ce type d’oligomères d’acide cholique pourrait constituer des phases stationnaires intéressantes pour la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC), où la séparation est basée sur la polarité du soluté par rapport à la phase mobile. Puisqu’ils peuvent constituer des cavités hydrophobes et hydrophiles, ils pourraient donc être exploités en chromatographie en phase normale (NPC) et en chromatographie en phase inverse (RPC). La possibilité d'avoir une phase stationnaire réversible avec une affinité bimodale appropriée pourrait être avantageuse en biosciences, en sciences de l'environnement et favoriser la séparation de mélanges complexes en élargissant le champ d'application d’une seule colonne chromatographique. L’affinité bimodale pourrait notamment permettre d'éviter de changer le mode de fonctionnement du HPLC; un processus long, coûteux et nécessitant une grande quantité de solvant pour rééquilibrer et passiver le système fluidique de l’instrument. Ce mémoire est une étude exploratoire qui vise à déterminer si ce type d’oligomères d’acide cholique, une fois liés à des particules de gel de silice (6 μm de diamètre), montre la formation de cavités moléculaires dans diverses conditions de phase mobile et s’il pourrait être utilisé pour effectuer des séparations comme phase stationnaire bimodale. À notre connaissance, il n’existe pas encore de phase stationnaire réversible à base d’oligomères d’acide cholique capables d’interagir avec des composés hydrophiles et hydrophobes, en fonction de la polarité ii de l’éluant. Ce type de phase stationnaire se compare à d’autres phases stationnaires bimodales pouvant être utilisées en NPC ou en RPC, parmi lesquels on trouve entre autres des copolymères amphiphiles, des structures organométalliques et des macromolécules comme les cyclodextrines (CD). La nature bimodale de la phase stationnaire à base de CD rapporté dans la littérature est assez similaire aux phases stationnaires des oligomères d’acide cholique de cette étude, grâce à leur cavité hydrophobe naturelle et un extérieur hydrophile, mais sans toutefois que la cavité soit réversible à cause de la rigidité de l’anneau CD. Les particules de silice greffées avec des oligomères d’acide cholique ont été empaquetées par suspension dans un tube capillaire en silice fondue de diamètre intérieur (ID) de 250 μm pour former des colonnes capillaires de 10 cm de long. Les performances chromatographiques en phase liquide des phases stationnaires ont été étudiées à l'aide d'un instrument HPLC adapté aux colonnes capillaires et muni d’un détecteur d’absorption. Plusieurs sondes-analytes sont étudiées dans ce mémoire pour caractériser la rétention causée par les phases stationnaires dans diverses phases mobiles eau/organique. Des comportements en RPC et d'interaction hydrophile (HILIC) ont été observés dans différentes plages de composition de phase mobile eau/organique. Les tests ont montré que les matériaux étaient capables de retarder des analytes non polaires avec une diminution du pourcentage organique (% org) sur une large plage de compositions (45% à 0% org dans le cas des alkylbenzènes). Les cavités hydrophobes semblent quant à elles être responsables de la rétention aux % org moins que 10% et pour seulement une faible partie de la plage totale de la rétention hydrophobique. Le comportement en phase inverse a été comparé aux colonnes classiques à base de chaînes alkyles (C3, C4, C8 et C18) pour évaluer l’importance des interactions hydrophobes. Inversement, une augmentation du % org, en particulier de l'acétonitrile, a entraîné la rétention de composés polaires sur une courte plage de composition de solvant à partir de 85% org. Cette dernière rétention est toutefois principalement imputable aux mécanismes HILIC avec le support de silice gel découvert et non aux cavités hydrophiles du dimère d’acide cholique. / Over the past ten years, interesting oligomeric compounds based on cholic acids have been synthesized and characterized by our collaborators from the Julian X.X Zhu group at the Université de Montréal (UdeM). In a recent work, they synthesized a cholic acid dimer and showed that it could form invertible molecular pockets when dissolved in media of different polarity; in water, the dimer forms hydrophobic pockets, and in organic media, the dimer forms hydrophilic pockets. Therefore, these amphiphilic compounds, when in solution, demonstrate molecular pocket behavior depending on solvent conditions to form a cavity of opposite polarity of the media in which they are located. The inversion behavior results from the conformational flexibility of the chemical linker between the bile acid monomers. The ability of the pockets to trap probe species based on their polarity suggests that the cholic acid oligomers might be interesting stationary phases for high-performance liquid chromatography (HPLC), where separation is based on solute polarity relative to the mobile phase. Since these materials can produce hydrophobic and hydrophilic pockets, they could be exploited in both normal-phase chromatography (NPC) and reversed-phase chromatography (RPC). The ability to have an invertible stationary phase with suitable bimodal affinity could be advantageous in biosciences, environmental sciences, and for the separation of complex mixtures by widening the field of application of the same chromatographic column. The bimodal affinity may, in particular, make it possible to avoid changing the operating mode of the HPLC; a costly and lengthy process requiring a large amount of solvent to re-equilibrate and passivate all fluidic paths of the instrument. This memoir is an exploratory study that sets out to evaluate whether this type of cholic acid oligomer, once bonded to silica gel particles (6 μm diameter), shows the formation of molecular pockets in various mobile phase conditions and if they can be used to perform separations as bimodal stationary phases. To the best of our knowledge, invertible stationary phases based on cholic acid oligomers that are capable of selective binding and release of both hydrophilic and hydrophobic compounds depending on the polarity of the eluent do not yet exist. This type of stationary phase can be compared to the other bimodal stationary phases that can be used in either NPC or RPC that includes amphiphilic copolymers, organometallic structures and macromolecules like cyclodextrins (CD). The bimodal nature of the CD-based iv stationary phases are quite similar to the cholic acid oligomers stationary phases of this study, thanks to a natural hydrophobic cavity and a hydrophilic exterior, but without the invertibility of the cavity due to the rigidity of the CD ring. The grafted particles were slurry-packed into 250 μm inner diameter (ID) fused silica tubing to make 10 cm long capillary columns. The liquid chromatographic performance of the stationary phases was investigated using a capillary HPLC instrument with a UV absorbance detector. Several probe analytes were investigated to characterize the molecular pocket-based retention in various water/organic mobile phases. RPC and hydrophilic interaction (HILIC) behaviors were observed in distinctive composition ranges of water/organic mobile phases. The tests showed that the materials were able to retain nonpolar compounds gradually with the decrease of percentage organic (% org) over a wide range of compositions (45% to 0% org for alkylbenzenes). The hydrophobic pockets seem to be responsible for the retention at % org less than 10% and only for a small extent of the total range of the hydrophobic retention. The reversed phase behavior was compared to classical alkyl-chain-based columns (C3, C4, C8 and C18) to assess the importance of the hydrophobic interactions. Conversely, an increase in % org, especially acetonitrile, resulted in the retention of polar compounds over a smaller range of % org starting at 85% org. This latter retention is mainly attributable to HILIC mechanisms with the uncapped silica gel support and not the cholic acid dimer hydrophilic pockets.

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