Résumé: Introduction: Cette étude s’intéresse à l’expérience de soins de patients aînés de 70 ans et plus atteints de cancer entourant une visite à l’urgence. Elle repose sur plusieurs résultats d’études démontrant que ces personnes présentent des besoins spécifiques non comblés, les amenant à utiliser les services d’urgence pour y répondre. Peu d’études se sont intéressées à leur expérience de soins et encore plus rarement dans le contexte d’une visite à l’urgence. But : Mieux comprendre l’expérience de soins des patients aînés atteints de cancer entourant une visite à l’urgence. Cette étude comprend quatre objectifs soit : 1) établir le profil des patients de 70 ans et plus ayant consulté l’urgence pour un problème lié à leur cancer dans les 12 mois précédant l’étude; 2) identifier les raisons et les facteurs amenant ces patients à consulter les services d’urgence; 3) identifier les stratégies de coping utilisées avant d’aller à l’urgence et 4) décrire l’expérience de soins de ces patients à l’urgence. Méthode: Une étude à devis mixte simultané a été entreprise. Une analyse descriptive des bases de données administratives a été réalisée pour documenter le profil sociodémographique, clinique et l'utilisation des services des patients aînés atteints de cancer de 70 ans et plus qui ont visité l'urgence d'un centre hospitalier au Québec, le Canada (n = 792, Objectifs 1-2). Ensuite, des entrevues semi-structurées ont suivi (n = 11) et ont été analysées par une analyse de contenu en profondeur (Objectifs 2, 3, & 4). Résultats: Un total de 792 patients aînés atteints de cancer ont visité l'urgence pour un total de 1572 visites. Les raisons de consultation les plus fréquentes étaient de nature respiratoire (15,8%), digestive (13,4%) et les troubles cardiovasculaires (8,2%). Plus de la moitié des visites était réalisée de jour. L’anxiété, les problèmes d’accessibilité et la détérioration importante de la santé étaient des facteurs qui influençaient le recours aux services d’urgence. Les patients ont été en mesure de déployer une multitude de stratégies de coping pour faire face à leurs problèmes de santé. Par ailleurs, l’expérience de soins est un processus unique, vécu de manière très individuelle. Conclusion: Cette étude décrit l’expérience de soins de patients aînés atteints de cancer à l’urgence et souligne plusieurs domaines d’amélioration des services en périphérie de l’urgence, mais aussi au sein même du service d’urgence. / Abstract: Introduction: Older cancer patients are known to have specific unmet needs due to the complexity of their health care, leading them to use emergency services. However, it is known that emergency rooms are not well-suited to the needs of the elderly. Few studies have focused on the health care experience of older cancer patients and even less so in the context of emergency room (ER) visits. Purpose: This study aims to better understand the experience of older cancer patients in the context of ER visits for unexpected health deterioration related to cancer. We sought to: 1) establish the profile of patients aged 70 years and older who made ER visits for problems related to their cancer in the 12 months preceding the study; 2) identify the reasons and factors that motivate older patients with cancer to make ER visits; 3) identify coping strategies used by older cancer patients prior to ER visits; and 4) describe the health care experience of older cancer patients in the context of ER visits. Methods: A concurrent mixed-method design was used. Descriptive analysis of administrative databases was first conducted to document the socio-demographic, clinical, and service utilization profile of elderly cancer patients aged 70 years and older who visited the ER of a hospital in Québec, Canada (n = 792, Objectives 1-2). Semi-structured interviews were subsequently conducted (n = 11) and then analysed using in-depth content analysis (Objectives 2, 3, & 4). Results: The sample of 792 older cancer patients made a total of 1,572 ER visits. The most frequent medical reasons for ER visits were respiratory (15.8%) and digestive (13.4%) concerns, and cardiovascular conditions (8.2%). Content analysis of the qualitative data suggested that older cancer patients made most of the ER visits when experiencing high levels of anxiety, when other cancer care services were unavailable, or because of a serious life-threatening health condition. Patients were able to use a variety of coping strategies to deal with health issues. Furthermore, the care process is experienced uniquely for each individual. Conclusion: This study describes the health care experience of older cancer patients in the context of ER visits and suggests areas of improvement both outside of and within emergency services.

La leucémie myéloïde aigue (LMA), cancer du sang causé par une prolifération excessive des précurseurs myéloïdes à un stade précoce de maturation, est associée à une survie variant entre 20 et 30% à cinq ans en dépit des traitements de chimiothérapie les plus intensifs. L’antigène CD33 est exprimé chez les cellules malignes dans 90% des LMA ce qui en fait une cible de choix pour le développement d’immunoconjugué (IC). Trois IC composés d’un anticorps monoclonal anti-CD33 couplé à la maytansine, une toxine s’attaquant aux fuseaux mitotiques, ont été créés. Nous avons étudié l’effet de ces IC sur des cellules primaires et des lignées cellulaires LMA et étudier les mécanismes pouvant expliquer différents niveaux de sensibilité. Les études effectuées ont permis de déterminer que le niveau d’expression du CD33 n’explique pas la variation de sensibilité face aux IC. Il a été démontré que les IC anti-CD33 sont internalisés rapidement par la cellule et que le conjugué est retrouvé au niveau de l’endosome en premier lieu. Il a été confirmé que le lysosome est essentiel à l’effet anti-mitotique induit par le conjugué. Aussi, il est proposé que la protéine SOCS3 pourrait jouer un rôle dans la résistance aux IC anti-CD33 en dirigeant le complexe IC-CD33-SOCS3 vers le protéasome et ainsi empêcher la libération du composé toxique par le lysosome. Nous avons aussi conclu que les variations d’agent de liaison et l’augmentation du nombre de molécules toxiques entre les 3 IC n’ont pas été suffisantes pour augmenter leur efficacité à éliminer les cellules LMA. L’évaluation de ces IC ainsi que l’identification des mécanismes de résistance permettra de cibler les patients les plus susceptibles de bénéficier de ce type de traitement et potentiellement d’identifier de nouvelles voies pour améliorer l’efficacité des traitements. / Acute myeloid leukemia (AML), a cancer where hematopoietic precursors are arrested in an early stage of development, is associated with a poor survival rate of 20 to 30% over five years, despite intensive chemotherapy treatments. In approximately 90% of AML cases the malignant cells express CD33 antigen, which makes it a target of choice for development of immunotoxin based therapy. Three immunoconjugates (IC) composed of anti-CD33 monoclonal antibody coupled with maytansine derivative, which prevent tubulin polymerization and thus formation of mitotic spindle, were designed. These three IC were tested for their activity against several AML cell lines and primary AML patient cells and we investigate mechanisms responsible for variation in sensitivity to IC treatment. In this report, we show that differences in number of CD33 molecules on AML cell surface does not explain the observed differences in IC sensitivity. We demonstrate that binding of huMy9-6 antibody to CD33 induces rapid internalization and that it is first process through endosome. We confirm that lysosomal processing is essential for the antimitotic effect induced by IC treatment. Also, we provide evidence that SOCS3 protein may play a role in resistance of AML cells to anti-CD33 therapy by directing IC-CD33-SOCS3 complex to the proteasome and therefore affecting lysosomal decoupling of IC-CD33 and intracellular release of maytansine derivatives. Finally, the linkers and maytansine derivative modifications were not sufficient to increase sufficiently the efficacy of conjugates to eliminate higher numbers of AML cells. The identification of mechanisms responsible for increased resistance of AML cell lines and primary AMLs may allow us to identify IC responsive AML cells and also identify strategies to improve the efficacy of IC treatment.

Il est reconnu, depuis une centaine d’années, que des désordres de la coagulation, regroupés sous le terme de coagulopathies, sont souvent associés au développement néoplasique. Pendant de nombreuses années, ces coagulopathies furent souvent reconnues comme une simple conséquence du développement du cancer. D’ailleurs, pour les cliniciens, l’apparition de ces anomalies sanguines constitue souvent le premier signe clinique d’un cancer occulte. Toutefois, l’étude approfondie du lien existant entre le système hémostatique et le cancer indique que différents facteurs hémostatiques vont interagir avec soit l’environnement tumoral ou soit la tumeur elle-même et influencer le développement du cancer. Au cours de nos travaux, nous avons porté une attention particulière à deux protéines jouant un rôle primordial dans l’hémostase. Le facteur tissulaire (TF) et l’inhibiteur du facteur tissulaire (TFPI) peuvent jouer des rôles pro- ou anti-néoplasique, et ce indépendamment de leurs fonctions hémostatiques normales. Dans le premier volet de cette thèse, nous avons étudié les propriétés antiangiogéniques de TFPI. L’angiogenèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau pré-existant, est reconnue comme étant une étape clée du développement tumoral. D’après nos travaux, le TFPI peut inhiber la formation de structures de type capillaire des cellules endothéliales (CEs) de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et ce à une IC 50 de 5 nM, soit la concentration physiologique de l’inhibiteur. De plus, le TFPI bloque la migration des cellules endothéliales lorsque ces dernières sont stimulées par la sphingosine-1-phosphate (S1P), une molécule relâchée lors de l’activation des plaquettes sanguines. Cette inhibition de la migration cellulaire s’explique par l’effet du TFPI sur l’adhésion des CEs. En effet, TFPI inhibe la phosphorylation de deux protéines clées participant à la formation des complexes d’adhésion focales soit FAK (focal adhesion kinase) et PAX (paxilin). L’inhibition de ces deux protéines suggère qu’il y ait une réorganisation des complexes focaux, pouvant expliquer la perte d’adhérence. Finalement, des études de microscopie confocale démontrent que les cellules traitées au TFPI changent de morphologie au niveau du cytosquelette d’actine provoquant une désorganisation des structures migratoires (pseudopodes). Les effets du TFPI au niveau de la migration, de l’adhésion et de la morphologie cellulaire sont strictement spécifiques aux cellules endothéliales humaines, puisque aucun n’effet n’est observé en traitant des cellules cancéreuses de glioblastomes (GB) humains, qui sont normalement des tumeurs hautement vascularisées. En résumé, cette première étude démontre que le TFPI est un inhibiteur de l’angiogenèse. Dans le second volet de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux différents rôles de TF, le principal activateur de la coagulation. Cette protéine est également impliquée dans le développement néoplasique et notamment celui des médulloblastomes (MB) chez l’enfant via des fonctions hémostatiques et non-hémostatiques. Nos travaux démontrent que l’expression de TF est induite par la voie de signalisation de HGF (hepatocyte growth factor) et de son récepteur Met. Cet effet de HGF/Met semble spécifique aux MB puisque HGF ne peut stimuler l’expression de TF au niveau des cellules cancéreuses de glioblastomes. TF, exprimé à la surface des cellules médulloblastiques (DAOY), est responsable de l’activité pro-thrombogénique de ces cellules, ainsi qu’un acteur important de la migration de ces cellules en réponse au facteur VIIa (FVIIa). De plus, en étudiant 18 spécimens cliniques de MB, nous avons établi un lien entre l’intensité d’expression de TF et de Met. L’importance de cette corrélation est également suggérée par l’observation que les cellules exprimant les plus forts taux de TF et de Met sont également les plus agressives en termes d’index de prolifération et de dissémination métastatiques. En résumé, ces travaux représentent le point de départ pour la mise au point de TF comme un marqueur diagnostique clinique dans les cas de tumeurs du cerveau pédiatriques. De plus, l’élucidation de la voie de signalisation moléculaire responsable de l’expression de TF permet de mieux comprendre la biologie et le fonctionnement de ces tumeurs et de relier le profil d’expression de TF aux phénotypes agressifs de la maladie. Il est reconnu que HGF peut également jouer un rôle protecteur contre l’apoptose. Dans le troisième volet de cette thèse, nous avons remarqué que cette protection est corrélée à l’expression de TF. En réduisant à néant l’expression de TF à l’aide de la technologie des ARN silencieux (siRNA), nous démontrons que HGF ne protège plus les cellules contre l’apoptose. Donc, TF médie l’activité anti-apoptotique de HGF. TF assume cette protection en inactivant la phosphorylation de p53 sur la sérine 15, empêchant ainsi la translocation de p53 au noyau. Finalement, l’expression de TF et son interaction avec le FVIIa, au niveau des cellules médulloblastiques favorise la survie de ces dernières et ce même si elles sont soumises à de fortes concentrations de médicaments couramment utilisées en cliniques. Ce troisième et dernier volet démontre l’implication de TF en tant que facteur impliqué dans la survie des cellules cancéreuses, favorisant ainsi le développement de la tumeur. Dans son ensemble, cette thèse vise à démontrer que les facteurs impliqués normalement dans des fonctions hémostatiques (TFPI et TF) peuvent contribuer à réguler le développement tumoral. Tout système physiologique et pathologique est dépendant d’un équilibre entre activateur et inhibiteur et la participation de TF et de TFPI à la régulation du développement néoplasique illustre bien cette balance délicate. Par sa contribution anti- ou pro-néoplasique le système hémostatique constitue beaucoup plus qu’une simple conséquence du cancer; il fait partie par l’action de TF des stratégies élaborées par les cellules cancéreuses pour assurer leur croissance, leur déplacement et leur survie, alors que TFPI tente de limiter la croissance tumorale en diminuant la vascularisation. / For more then a century now, haemostatic disorders, also refered as coagulopathies, are recognized to be associated to neoplasia development. At first, these coagulopathies were often seen as the first clinical symptom of an occult malignancy and as such they were foreseen as merely consequence of cancer. However recent studies allowed to determine that a molecular link between haemostasis and cancer exists. Haemostatic protein were found to interact with the tumor environment or the tumor itself. In this thesis, we look at two important haemostatic proteins involved in anti- or pro-tumoral activities. These proteins we looked at were, tissue factor (TF), which as been identified as the main trigger of blood coagulation an its natural inhibitor which is named tissue factor pathway inhibitor (TFPI). In our investigations we focus on the non-haemostatic function of these proteins. First of all, we studied the effect of TFPI on angiogenesis. Angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing ones, is a critical component of cancer. In this first paper we demonstrate that, in addition to its anticoagulant properties, emerging data show that TFPI may also regulate endothelial cell functions via a non-haemostatic pathway. At physiological concentration, TFPI inhibits both endothelial cell migration and their differentiation into capillary-like structures in vitro. These effects were specific to endothelial cells since no inhibitory effect was observed on the migration of tumor (glioblastoma) cells. Inhibition of endothelial cell migration was correlated with a concomitant loss in cell adhesion, suggesting an alteration of focal adhesion complex integrity. Accordingly, we observed that TFPI inhibited the phosphorylation of focal adhesion kinase and paxillin, two key proteins involved in the scaffolding of these complexes and that this effect was specific to endothelial cells. These results suggest that TFPI influences the angiogenic process via a non-haemostatic pathway, by downregulating the migratory mechanisms of endothelial cells. Met, the only known receptor for hepatocyte growth factor (HGF) is a member of the receptor tyrosine kinases (RTKs) family and recently this RTK emerged as one important contributor to human neoplasia. In physiologic and pathologic conditions, Met trigger various cellular functions related to cell proliferation and migration, inhibition of apoptosis and also regulate a genetic program leading to coagulation. Since medulloblastoma (MB) express high level of tissue factor (TF), the main initiator of blood coagulation, we therefore wanted to know if there was a link between Met and TF expression in these pediatric tumors. In this work we demonstrate that stimulation of MB cells in vitro with HGF lead to overt expression of TF. These data correlate with analysis of clinical MB tumors specimens, were tumors expressing high level of Met also express high level of TF. This HGF/Met/TF pathway seems specific to MB only since no effect was observed on glioblastoma cells. TF expression in MB leads to a pro-coagulation state which could initiate thrombosis and the formation of a provisional fibrin matrix. Furthermore, TF can also mediate non-haemostatic function such as cell migration, thus helping cancer cells to form distant metastasis. Taken together these results suggest that HGF/Met pathway is responsible for TF expression in MB and explained how TF participate to tumor aggressiveness. In the third part of this thesis we look at the effect of TF on cell survival as a huge body of evidence suggest a role for TF and its natural ligand FVIIa on cells death (apoptosis) protection. In this study, we show that HGF-induce anti-apoptotic effect on DAOY MB cells is correlated to TF expression. Using TF siRNA we completely reversed this anti-apoptosis activity. TF is responsible of p53 inactivation, thus allowing DAOY to resist to very high concentrations of the chemotherapeutic drug Etoposide. These finding highlights the importance of understanding the molecular biology of MB, to achieve a better clinical management and also find new therapeutic targets. Overall, this thesis demonstrates that normal haemostatic protein such as TF and TFPI are also involved in tumor development. The different activities of TF and TFPI on cancer reflected the fact that every physiological or pathological system is dependent of a balance between activator and inhibitor. Furthermore the molecular link described in this thesis between haemostasis and cancer constitutes an argument against the fact that the haemostatic system is simply a consequence of cancer. Instead we show that TF is part of a strategy designed to improve tumor expansion while TFPI try to restrain the tumor growth by limiting tumor angiogenesis.

Le gène MLL (Mixed-Lineage Leukemia), un homologue du gène trithorax de la Drosophile, localisé à la bande chromosomique 11q23, est fréquemment réarrangé dans plusieurs types de leucémies, essentiellement suite à des translocations chromosomiques. Dans les différentes translocations chromosomiques, la partie N-terminale de MLL est fusionnée avec les séquences d’un gène partenaire. Malgré le grand nombre de partenaires de fusion rapportés, peu de fusions MLL ont été bien caractérisées sur le plan moléculaire. De plus, l’impact pronostique de plusieurs fusions moins fréquentes n’est pas bien établi. L’objectif de mon projet est de caractériser plusieurs translocations MLL qui ont été détectées dans 39 spécimens leucémiques collectés par la Banque de cellules leucémiques du Québec (www.bclq.gouv.qc.ca), et d’établir une corrélation entre les résultats de la cytogénétique et différents paramètres biologiques et cliniques des leucémies respectives. L’identification des gènes partenaires de fusion (GPF) dans notre série (30 échantillons étudiés), a révélé la fusion de MLL à un gène partenaire très récurrent dans 26 leucémies: MLLT3(AF9), AFF1(AF4), MLLT4(AF6), MLLT1(ENL), ELL; à un GPF modérément commun dans 1 leucémie : MLLT6(AF17); et à un partenaire rare de MLL dans 3 leucémies : GAS7 et AF15/CASC5 (2 cas). Nous avons poursuivi notre travail avec la caractérisation des points de cassure de deux fusions, soit MLL-ELL associée à un syndrome myéloprolifératif (une association rare), et MLL-GAS7 (une fusion rare de MLL), associée à une leucémie aiguë myéloïde. L’analyse des transcrits de fusion par RT-PCR et séquençage a révélé respectivement la fusion de l’exon 9 de MLL à l’exon 2 de ELL et des exons 7 ou 8 de MLL (deux transcrits) à l’exon 2 de GAS7. Ce travail permettra d’effectuer des études fonctionnelles et des projets de recherche translationnelle en utilisant ces spécimens de leucémies avec différents réarrangements de MLL, bien caractérisés sur le plan clinique et moléculaire. / The MLL (Mixed-Lineage Leukemia) gene, a human homolog of the Drosophila trithorax gene, located at chromosomal band 11q23, is frequently rearranged in several types of leukemia, mostly by chromosomal translocations. In different chromosomal translocations, the N-terminal part of MLL is fused to sequences of the partner gene. Despite the large number of fusion partners that have been reported, several gene fusions remain poorly characterized at the molecular level. Moreover, the prognostic impact of less frequent fusions is not well established. The aim of my project is to characterize different MLL fusions detected in 39 leukemic samples, collected by the Quebec Leukemia Cell Bank (www.bclq.gouv.qc.ca) and to correlate cytogenetics with the clinical and biological features of the corresponding leukemia. Identification of fusion partner genes in our series (30 samples studied), revealed fusion of MLL to one of the most frequent partners in 26 leukemias: MLLT3(AF9), AFF1(AF4), MLLT4(AF6), MLLT1(ENL), ELL; to a moderately common MLL fusion partner in 1 leukemia: MLLT6(AF17); and to a rare partner in 3 leukemias: GAS7 and AF15/CASC5 (2 cases). We have characterized the breakpoints of two fusions, MLL-ELL in a myeloproliferative syndrome (a rare association) and MLL-GAS7 (a rare MLL fusion) associated with acute myeloid leukemia. Fusion transcripts analysis by RT-PCR and sequencing revealed respectively, a fusion of MLL exon 9 to ELL exon 2 and of MLL exon 7 or exon 8 (two transcripts) to GAS7 exon 2. This study is essential to perform functional studies and translational research projects using these well characterized leukemic specimens with different MLL rearrangements.

Le neuroblastome (NB) est une tumeur fréquente et agressive du jeune enfant. Les tumeurs de haut grade de forme métastatique, généralement développées chez l'enfant de plus de 1 an, sont associées à une importante mortalité malgré un traitement lourd incluant une chimiothérapie à haute dose. La chimiorésistance est donc un problème majeur qui caractérise ces NB de haut grade. Une des hypothèses pour expliquer cette chimiorésistance est celle de l’activation de l’autophagie, un mécanisme auquel recourent les cellules afin de faire face aux situations de stress. D’ailleurs, plusieurs études ont démontré que l'autophagie était activée à la suite des thérapies anticancéreuses. Son inhibition pourrait donc représenter une stratégie thérapeutique très intéressante pour le traitement de cancers. Le but de ce projet de recherche a été de mettre en évidence l'importance de l'autophagie dans les cellules du NB ainsi que l'effet de son inhibition sur la sensibilité des cellules du NB à la chimiothérapie conventionnelle. La présence d'autophagie dans les cellules de NB et sa valeur pronostic ont été évaluées par une étude immunohistochimique et par western blot sur 184 tumeurs patient. Ensuite, dans le but de déterminer l'effet de la chimiothérapie conventionnelle sur le niveau d'autophagie, des études in vitro sur 6 lignées cellulaires ont été effectuées utilisant des tests de mesure d'autophagie (MDC, monodanylcadaverine), de viabilité cellulaire (MTT) et de western blot. Celles ci ont été suivies par des tests d'inhibition de l'autophagie par deux méthodes: l’inactivation du gène ATG5 par un lentivirus contenant un shRNA ciblant ATG5 ou de l'hydroxychloroquine (HCQ), un inhibiteur pharmacologique de l’autophagie. Cette inhibition a été testée seule ou en combinaison avec une chimiothérapie conventionnelle dans le but de déterminer le rôle de l'autophagie dans la sensibilisation des cellules de NB à la chimiothérapie. Ensuite, l’intérêt de l’inhibition de l’autophagie a été évalué sur des modèles murins. Enfin, le niveau d'autophagie a été testé dans des cellules souches de NB. Notre étude a démonté que l'autophagie est présente à un niveau basal dans une majorité des NB mais qu'elle ne représentait pas un facteur pronostic dans ce type de tumeur. Les différentes chimiothérapies testées induisent une augmentation de l'autophagie dans les cellules du NB. Les deux tests d'inhibition ont démontré in vitro que l'autophagie participe à la résistance des cellules aux traitements chimiothérapeutiques classiques du NB. Le blocage de l’autophagie in vivo augmente l’efficacité de la chimiothérapie, cependant certaines données associées au traitement par HCQ devront être complétées. Cette étude démontre que l'inhibition de l'autophagie en combinaison avec la chimiothérapie classique représente une approche thérapeutique prometteuse dans le traitement du NB. / Neuroblastoma (NB) is a common tumor in childhood. Despite major advances in treatments, NB still have a poor prognosis with 40% of mortality. Chemoresistance is a major issue that characterizes aggressive NB. This is a consequence of an autophagic mechanism that tumor cells use to overcome stressful situations encountered during treatments. Autophagy has been the subject of several studies showing its activation in response to anticancer therapies. Its inhibition may therefore represent a very interesting therapeutic strategy for cancer treatment. The purpose of this research was to determine the presence of autophagy in NB cells and the effect of autophagy inhibition in sensitizing NB cells to conventional chemotherapy. The presence of autophagy was verified in 184 NB tumors. To determine the effect of conventional chemotherapy on autophagy, the MTT cell viability test and the autophagy measurement test (MDC, monodansylcadaverine) have been used to study 6 NB cell lines in vitro. An immunohistochemical study also allowed the verification of autophagy activation in tumors grown in mouse models. A lentivirus containing a shRNA against ATG5 was used to generate autophagy deficient cells. Using the MTT and MDC tests, we assessed their sensitivity to chemotherapy. In order to determine the effect of HCQ in sensitizing NB cells to chemotherapy, we used HCQ alone or in combination with conventional chemotherapy. This study demonstrated that autophagy is present at a basal level in NB cells. Unlike for LC3, the results showed that Beclin 1 is a factor of poor prognosis. The MTT and MDC tests have shown that vincristine, doxorubicin, cisplatin, temozolomide, rapamycin, and LY294002 induce autophagy in NB cells. Also, immunohistochemical studies showed that cisplatin treatment increased autophagy in vivo in xenograft model of human NB in mice. ATG5 deficient cells showed greater sensitivity to chemotherapy. Furthermore, the use of these cells in mouse models showed an important role of autophagy in tumor progression as well as an increased sensitivity to vincristine. Finally, combination of HCQ with conventional chemotherapy showed an increased sensitivity of NB cells to chemotherapy compared to cells receiving chemotherapy only. This study demonstrates that inhibition of autophagy in combination with conventional chemotherapy is an attractive therapeutic approach for the treatment of NB.

Les anthracyclines tels que la doxorubicin et la daunorubicin sont une famille de médicaments anticancéreux hydrophiles qui doivent être transportés dans les cellules afin d’exercer leur action par intercalation à l’ADN dans le noyau cellulaire. Ceci mène à la perturbation du métabolisme de l’ADN et entraine la mort cellulaire. Les anthracyclines sont utilisés pour le traitement d’une variété de cancers incluant la leucémie, les lymphomes, le cancer du sein, le cancer des poumons et le cancer des ovaires. Étant donné que le transport actif des anthracyclines dans les cellules a partiellement été démontré, le transporteur spécifique impliqué dans ce processus n’est pas encore connu. En utilisant un modèle de cancer des ovaires, la lignée cellulaire TOV2223G, nous avons démontré que des substrats spécifiques au transporteur de cations organiques 1 (OCT1), notamment la ergothionéine, la thiamine et la phenformin, ont partiellement inhibé l’absorption de la daunorubicin en différence de la carnitine qui est un substrat de haute affinité des transporteurs CT2 et OCTN2. Ces résultats suggèrent que les transporteurs organiques spécifiques au transport de la carnitine ne sont pas impliqués dans le transport des anthracyclines. Ainsi, nos résultats ont démontré que l’absorption de la daunorubicin est orchestrée par le transporteur OCT1 dans les cellules TOV2223G (Km ~ 5 μM) et des concentrations micromolaires de choline ont complètement abolies l’absorption de la drogue. De plus, un ARN sh dirigé contre OCT1 a réprimé son expression protéique, ce qui a été confirmé par la technique d’immuno-buvardage en utilisant un anti-OCT1 anticorps. Les cellules déficientes en OCT1 n’ont pas été capables d’absorber la daunorubicin et ont été plus résistantes à l’action de la drogue par rapport aux cellules contrôle. La transfection des cellules HEK293T avec un plasmide construit de façon à faire exprimer OCT1 comme protéine de fusion avec la protéine fluorescente EYFP a montré que celle-ci est localisée dans la membrane plasmique. Les cellules transfectées ont été capables d’absorber cinq fois plus de daunorubicin comparé aux cellules contrôles. Cette étude est, selon nous, la première à démontrer que OCT1 est un transporteur de haute affinité des anthracyclines. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que des défauts de OCT1 peuvent contribuer à l’efficacité de la réponse des cellules cancéreuses à la chimiothérapie avec les anthracyclines. / Anthracyclines such as doxorubicin and daunorubicin are hydrophilic anticancer agents that must be transported into cells. These drugs accumulate in the nucleus where they intercalate with DNA, thereby interfering with DNA replication in turn leading to cell death. Anthracyclines are used for treating a variety of cancers including leukemia, lymphomas, breast, lung, and ovarian. Despite evidence for active uptake of anthracyclines, the specific transporter has not been identified. Using the ovarian cancer cell line TOV2223G, we show that substrates reported for the organic cation transporter OCT1, such as ergothioneine, thiamine and phenformin, partially compete with uptake of daunorubicin, but not of L-carnitine, i.e., a high affinity substrate transported by hCT2 and OCTN2. These findings exclude the involvement of the L-carnitine organic cation family of transporters in anthracycline uptake. Moreover, we show that OCT1 actively mediates high affinity (Km ~ 5 μM) transport of daunorubicin into TOV2223G cells, whereas micromolar amounts of choline completely abolish drug uptake. shRNA-mediated downregulation of OCT1 causes defective uptake of daunorubicin, as well as significant resistance to the drug, as compared to the vector control. Transfection of HEK293T cells with a plasmid expressing OCT1 as a GFP fusion protein revealed that OCT1-EYFP was predominantly localized to the plasma membrane. These transfected cells manifested nearly 5-fold increased uptake of daunorubicin compared to the empty vector control. In summary, we show for the first time that human OCT1 is a high affinity transporter for anthracyclines. As such, we postulate that OCT1 status represents a critical determinant in the response of cancer cells to chemotherapy with anthracyclines

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Ce travail de thèse s'est axé autour de deux approches technologiques issues du domaine de la microfabrication pour la sélection et la capture de biomarqueurs circulants dans le sang. A l'échelle moléculaire, un module d'assemblage capillaire dirigé a été implémenté dans un automate de tamponnage moléculaire puis validé en utilisant un modèle simple, permettant l'isolement et l'étirement de biomolécules individuelles de manière entièrement contrôlée et automatisée à large échelle. Nous avons ensuite appliqué cette technologie à des biomarqueurs moléculaires d'intérêt tels que les ADN libres contenus dans du sang complet, démontrant la capacité de la technique à isoler des acides nucléiques dans un fluide complexe contenant de nombreux éléments cellulaires . A l'échelle cellulaire, une approche innovante pour la sélection et la capture de Cellules Tumorales Circulantes a été développée. Le microdispositif mis au point est fabriqué par écriture laser à 3 dimensions et permet le piégeage physique de ces cellules dans du sang complet non traité tout en les préservant pour une récupération et analyse ultérieure. Après adaptation du microdispositif pour maximiser son efficacité de capture in vitro, une première preuve de concept de capture sélective de cellules cancéreuses dans du sang complet non traité a été réalisée. U n premier prototype pour une utilisation in vivo a été mi s au point et validé in vitro sur la capture de cellules cancéreuses dans du milieu de culture. / This research project focused on two technological approaches emerging from microfabrication for the selection and capture of circulating biomarkers from blood. At the molecular scale, this work was based on the automation of a directed capillary assembly protocol. A dedicated module was implemented into an automate for molecular stampin g and validated using a simple molecular model, allowing the elongation and large-scale assembly of single biomolecules in a controlled and automatized manner. The developed technology was then used for the assembly of relevant molecular biomarkers such as cell -free DNA (cf DNA) from untreated whole blood , evidencing the capabilities of this technology to single out nucleic acids from complex fluids composed of other cellular elements. At the cellular scale, an innovative concept for Circulating Tumor Cell s (CTCs) selection and capture was developed . The developed microdevice is fabricated using 30 direct laser writing and allows for a physical capture of cell s from untreated whole blood while preserving them for further recovery and analysis. After having optimized the design in vitro to maximize the capture efficiency of the system, a selective capture of cancer cell s from untreated whole blood was achieved . A first prototype for the in vivo use of this system was also developed and validated in vitro with cancer cells spiked into culture medium.

Le gène MLL (Mixed-Lineage Leukemia), un homologue du gène trithorax de la Drosophile, localisé à la bande chromosomique 11q23, est fréquemment réarrangé dans plusieurs types de leucémies, essentiellement suite à des translocations chromosomiques. Dans les différentes translocations chromosomiques, la partie N-terminale de MLL est fusionnée avec les séquences d’un gène partenaire. Malgré le grand nombre de partenaires de fusion rapportés, peu de fusions MLL ont été bien caractérisées sur le plan moléculaire. De plus, l’impact pronostique de plusieurs fusions moins fréquentes n’est pas bien établi. L’objectif de mon projet est de caractériser plusieurs translocations MLL qui ont été détectées dans 39 spécimens leucémiques collectés par la Banque de cellules leucémiques du Québec (www.bclq.gouv.qc.ca), et d’établir une corrélation entre les résultats de la cytogénétique et différents paramètres biologiques et cliniques des leucémies respectives. L’identification des gènes partenaires de fusion (GPF) dans notre série (30 échantillons étudiés), a révélé la fusion de MLL à un gène partenaire très récurrent dans 26 leucémies: MLLT3(AF9), AFF1(AF4), MLLT4(AF6), MLLT1(ENL), ELL; à un GPF modérément commun dans 1 leucémie : MLLT6(AF17); et à un partenaire rare de MLL dans 3 leucémies : GAS7 et AF15/CASC5 (2 cas). Nous avons poursuivi notre travail avec la caractérisation des points de cassure de deux fusions, soit MLL-ELL associée à un syndrome myéloprolifératif (une association rare), et MLL-GAS7 (une fusion rare de MLL), associée à une leucémie aiguë myéloïde. L’analyse des transcrits de fusion par RT-PCR et séquençage a révélé respectivement la fusion de l’exon 9 de MLL à l’exon 2 de ELL et des exons 7 ou 8 de MLL (deux transcrits) à l’exon 2 de GAS7. Ce travail permettra d’effectuer des études fonctionnelles et des projets de recherche translationnelle en utilisant ces spécimens de leucémies avec différents réarrangements de MLL, bien caractérisés sur le plan clinique et moléculaire. / The MLL (Mixed-Lineage Leukemia) gene, a human homolog of the Drosophila trithorax gene, located at chromosomal band 11q23, is frequently rearranged in several types of leukemia, mostly by chromosomal translocations. In different chromosomal translocations, the N-terminal part of MLL is fused to sequences of the partner gene. Despite the large number of fusion partners that have been reported, several gene fusions remain poorly characterized at the molecular level. Moreover, the prognostic impact of less frequent fusions is not well established. The aim of my project is to characterize different MLL fusions detected in 39 leukemic samples, collected by the Quebec Leukemia Cell Bank (www.bclq.gouv.qc.ca) and to correlate cytogenetics with the clinical and biological features of the corresponding leukemia. Identification of fusion partner genes in our series (30 samples studied), revealed fusion of MLL to one of the most frequent partners in 26 leukemias: MLLT3(AF9), AFF1(AF4), MLLT4(AF6), MLLT1(ENL), ELL; to a moderately common MLL fusion partner in 1 leukemia: MLLT6(AF17); and to a rare partner in 3 leukemias: GAS7 and AF15/CASC5 (2 cases). We have characterized the breakpoints of two fusions, MLL-ELL in a myeloproliferative syndrome (a rare association) and MLL-GAS7 (a rare MLL fusion) associated with acute myeloid leukemia. Fusion transcripts analysis by RT-PCR and sequencing revealed respectively, a fusion of MLL exon 9 to ELL exon 2 and of MLL exon 7 or exon 8 (two transcripts) to GAS7 exon 2. This study is essential to perform functional studies and translational research projects using these well characterized leukemic specimens with different MLL rearrangements.

Il est reconnu, depuis une centaine d’années, que des désordres de la coagulation, regroupés sous le terme de coagulopathies, sont souvent associés au développement néoplasique. Pendant de nombreuses années, ces coagulopathies furent souvent reconnues comme une simple conséquence du développement du cancer. D’ailleurs, pour les cliniciens, l’apparition de ces anomalies sanguines constitue souvent le premier signe clinique d’un cancer occulte. Toutefois, l’étude approfondie du lien existant entre le système hémostatique et le cancer indique que différents facteurs hémostatiques vont interagir avec soit l’environnement tumoral ou soit la tumeur elle-même et influencer le développement du cancer. Au cours de nos travaux, nous avons porté une attention particulière à deux protéines jouant un rôle primordial dans l’hémostase. Le facteur tissulaire (TF) et l’inhibiteur du facteur tissulaire (TFPI) peuvent jouer des rôles pro- ou anti-néoplasique, et ce indépendamment de leurs fonctions hémostatiques normales. Dans le premier volet de cette thèse, nous avons étudié les propriétés antiangiogéniques de TFPI. L’angiogenèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau pré-existant, est reconnue comme étant une étape clée du développement tumoral. D’après nos travaux, le TFPI peut inhiber la formation de structures de type capillaire des cellules endothéliales (CEs) de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et ce à une IC 50 de 5 nM, soit la concentration physiologique de l’inhibiteur. De plus, le TFPI bloque la migration des cellules endothéliales lorsque ces dernières sont stimulées par la sphingosine-1-phosphate (S1P), une molécule relâchée lors de l’activation des plaquettes sanguines. Cette inhibition de la migration cellulaire s’explique par l’effet du TFPI sur l’adhésion des CEs. En effet, TFPI inhibe la phosphorylation de deux protéines clées participant à la formation des complexes d’adhésion focales soit FAK (focal adhesion kinase) et PAX (paxilin). L’inhibition de ces deux protéines suggère qu’il y ait une réorganisation des complexes focaux, pouvant expliquer la perte d’adhérence. Finalement, des études de microscopie confocale démontrent que les cellules traitées au TFPI changent de morphologie au niveau du cytosquelette d’actine provoquant une désorganisation des structures migratoires (pseudopodes). Les effets du TFPI au niveau de la migration, de l’adhésion et de la morphologie cellulaire sont strictement spécifiques aux cellules endothéliales humaines, puisque aucun n’effet n’est observé en traitant des cellules cancéreuses de glioblastomes (GB) humains, qui sont normalement des tumeurs hautement vascularisées. En résumé, cette première étude démontre que le TFPI est un inhibiteur de l’angiogenèse. Dans le second volet de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux différents rôles de TF, le principal activateur de la coagulation. Cette protéine est également impliquée dans le développement néoplasique et notamment celui des médulloblastomes (MB) chez l’enfant via des fonctions hémostatiques et non-hémostatiques. Nos travaux démontrent que l’expression de TF est induite par la voie de signalisation de HGF (hepatocyte growth factor) et de son récepteur Met. Cet effet de HGF/Met semble spécifique aux MB puisque HGF ne peut stimuler l’expression de TF au niveau des cellules cancéreuses de glioblastomes. TF, exprimé à la surface des cellules médulloblastiques (DAOY), est responsable de l’activité pro-thrombogénique de ces cellules, ainsi qu’un acteur important de la migration de ces cellules en réponse au facteur VIIa (FVIIa). De plus, en étudiant 18 spécimens cliniques de MB, nous avons établi un lien entre l’intensité d’expression de TF et de Met. L’importance de cette corrélation est également suggérée par l’observation que les cellules exprimant les plus forts taux de TF et de Met sont également les plus agressives en termes d’index de prolifération et de dissémination métastatiques. En résumé, ces travaux représentent le point de départ pour la mise au point de TF comme un marqueur diagnostique clinique dans les cas de tumeurs du cerveau pédiatriques. De plus, l’élucidation de la voie de signalisation moléculaire responsable de l’expression de TF permet de mieux comprendre la biologie et le fonctionnement de ces tumeurs et de relier le profil d’expression de TF aux phénotypes agressifs de la maladie. Il est reconnu que HGF peut également jouer un rôle protecteur contre l’apoptose. Dans le troisième volet de cette thèse, nous avons remarqué que cette protection est corrélée à l’expression de TF. En réduisant à néant l’expression de TF à l’aide de la technologie des ARN silencieux (siRNA), nous démontrons que HGF ne protège plus les cellules contre l’apoptose. Donc, TF médie l’activité anti-apoptotique de HGF. TF assume cette protection en inactivant la phosphorylation de p53 sur la sérine 15, empêchant ainsi la translocation de p53 au noyau. Finalement, l’expression de TF et son interaction avec le FVIIa, au niveau des cellules médulloblastiques favorise la survie de ces dernières et ce même si elles sont soumises à de fortes concentrations de médicaments couramment utilisées en cliniques. Ce troisième et dernier volet démontre l’implication de TF en tant que facteur impliqué dans la survie des cellules cancéreuses, favorisant ainsi le développement de la tumeur. Dans son ensemble, cette thèse vise à démontrer que les facteurs impliqués normalement dans des fonctions hémostatiques (TFPI et TF) peuvent contribuer à réguler le développement tumoral. Tout système physiologique et pathologique est dépendant d’un équilibre entre activateur et inhibiteur et la participation de TF et de TFPI à la régulation du développement néoplasique illustre bien cette balance délicate. Par sa contribution anti- ou pro-néoplasique le système hémostatique constitue beaucoup plus qu’une simple conséquence du cancer; il fait partie par l’action de TF des stratégies élaborées par les cellules cancéreuses pour assurer leur croissance, leur déplacement et leur survie, alors que TFPI tente de limiter la croissance tumorale en diminuant la vascularisation. / For more then a century now, haemostatic disorders, also refered as coagulopathies, are recognized to be associated to neoplasia development. At first, these coagulopathies were often seen as the first clinical symptom of an occult malignancy and as such they were foreseen as merely consequence of cancer. However recent studies allowed to determine that a molecular link between haemostasis and cancer exists. Haemostatic protein were found to interact with the tumor environment or the tumor itself. In this thesis, we look at two important haemostatic proteins involved in anti- or pro-tumoral activities. These proteins we looked at were, tissue factor (TF), which as been identified as the main trigger of blood coagulation an its natural inhibitor which is named tissue factor pathway inhibitor (TFPI). In our investigations we focus on the non-haemostatic function of these proteins. First of all, we studied the effect of TFPI on angiogenesis. Angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing ones, is a critical component of cancer. In this first paper we demonstrate that, in addition to its anticoagulant properties, emerging data show that TFPI may also regulate endothelial cell functions via a non-haemostatic pathway. At physiological concentration, TFPI inhibits both endothelial cell migration and their differentiation into capillary-like structures in vitro. These effects were specific to endothelial cells since no inhibitory effect was observed on the migration of tumor (glioblastoma) cells. Inhibition of endothelial cell migration was correlated with a concomitant loss in cell adhesion, suggesting an alteration of focal adhesion complex integrity. Accordingly, we observed that TFPI inhibited the phosphorylation of focal adhesion kinase and paxillin, two key proteins involved in the scaffolding of these complexes and that this effect was specific to endothelial cells. These results suggest that TFPI influences the angiogenic process via a non-haemostatic pathway, by downregulating the migratory mechanisms of endothelial cells. Met, the only known receptor for hepatocyte growth factor (HGF) is a member of the receptor tyrosine kinases (RTKs) family and recently this RTK emerged as one important contributor to human neoplasia. In physiologic and pathologic conditions, Met trigger various cellular functions related to cell proliferation and migration, inhibition of apoptosis and also regulate a genetic program leading to coagulation. Since medulloblastoma (MB) express high level of tissue factor (TF), the main initiator of blood coagulation, we therefore wanted to know if there was a link between Met and TF expression in these pediatric tumors. In this work we demonstrate that stimulation of MB cells in vitro with HGF lead to overt expression of TF. These data correlate with analysis of clinical MB tumors specimens, were tumors expressing high level of Met also express high level of TF. This HGF/Met/TF pathway seems specific to MB only since no effect was observed on glioblastoma cells. TF expression in MB leads to a pro-coagulation state which could initiate thrombosis and the formation of a provisional fibrin matrix. Furthermore, TF can also mediate non-haemostatic function such as cell migration, thus helping cancer cells to form distant metastasis. Taken together these results suggest that HGF/Met pathway is responsible for TF expression in MB and explained how TF participate to tumor aggressiveness. In the third part of this thesis we look at the effect of TF on cell survival as a huge body of evidence suggest a role for TF and its natural ligand FVIIa on cells death (apoptosis) protection. In this study, we show that HGF-induce anti-apoptotic effect on DAOY MB cells is correlated to TF expression. Using TF siRNA we completely reversed this anti-apoptosis activity. TF is responsible of p53 inactivation, thus allowing DAOY to resist to very high concentrations of the chemotherapeutic drug Etoposide. These finding highlights the importance of understanding the molecular biology of MB, to achieve a better clinical management and also find new therapeutic targets. Overall, this thesis demonstrates that normal haemostatic protein such as TF and TFPI are also involved in tumor development. The different activities of TF and TFPI on cancer reflected the fact that every physiological or pathological system is dependent of a balance between activator and inhibitor. Furthermore the molecular link described in this thesis between haemostasis and cancer constitutes an argument against the fact that the haemostatic system is simply a consequence of cancer. Instead we show that TF is part of a strategy designed to improve tumor expansion while TFPI try to restrain the tumor growth by limiting tumor angiogenesis.