Atualmente, a única alternativa viável para pacientes que possuem um quadro de doença hepática em estágio final é o transplante total ou parcial de fígado. Devido à crescente defasagem entre doadores disponíveis e pacientes em fila de espera, o desenvolvimento de abordagens de engenharia tecidual hepática (ETH) se tornou uma necessidade crescente. As células pluripotentes induzidas (iPS) são uma atraente alternativa para servirem como fonte celular para aplicações de engenharia tecidual por serem capazes de produzir todos os fenótipos celulares. Dentre as principais abordagens de EHT podemos citar as técnicas de bioimpressão 3D, organóides hepáticos e descelularização/recelularização. Este trabalho buscou avaliar a utilização de células iPS no desenvolvimento das três tecnologias descritas. Visando avaliar como imprimir um tecido hepático funcional com células iPS, testamos a impressão com hepatócitos dispersos em células únicas em comparação com a impressão de esferóiedes hepáticos. Os esferóides hepáticos mostraram maior viabilidade e funcionalidade hepática por preservarem o fenótipo epitelial ao longo do tempo. A composição de células não parenquimáticas derivadas de iPS ou células primárias para a formação de organóides hepáticos foi testada neste trabalho. Os resultados indicam que, utilizando células mesenquimais primárias e endoteliais derivadas de iPS, obtém-se uma maturação hepatica mais eficiênte devido a inibição das vias de sinalização TGF-β? e modulação da via Wnt. A recelularização do tecido aórtico descelularizado de ratos com células derivadas de iPS mostrou ser capaz de prover função hepática em cultura assistida por biorreator, porém os resultados indicam a necessidade de aprimoramento do protocolo de recelularização. Este trabalho comprovou a viabilidade da aplicação de células iPS nas abordagens EHT testadas e contribuiu para o desenvolvimento de alternativas terapêuticas viáveis para pacientes em fila de espera de transplante hepático / Currently, the only feasible alternative for patients with end-stage liver disease is total or partial liver transplantation. Due to the growing gap between available donors and patients in waiting list, the development new tissue engineering technologies have become a growing need. Induced pluripotent cells (iPS) are an attractive alternative to serve as cell source for tissue engineering applications due to their ability to differentiate into all cellular phenotypes. Among the main liver tissue engineering technologies, 3D bioprinting, hepatic organoids and decellularization/recellularization of biological matrixes have generated much expectation. Thus, this work aimed to evaluate the use of iPS cells in the development of the aforementioned technologies. In order to evaluate how to bioprint a functional liver tissue using iPS-derived cells, we tested the effect of printing a single cell dispersion of hepatocytes versus printing hepatic spheroids. Hepatic spheroids showed greater viability and liver function, due to preserved epithelial phenotype over time. The composition of non-parenchymal cells using iPS-derived cells or primary adult cells for hepatic organoid formation was tested. The results indicated that, using primary mesenchymal cells and iPS-derived endothelial cells, we obtained a more efficient hepatic maturation due to the inhibition of TGF-β? and modulation Wnt signaling pathway. Recellularization of rat aortic decellularized scaffold with iPS-derived cells displayed hepatic function over time in a bioreactor-assisted culture, but the results indicate the need for improvements in the recellularization protocol. In conclusion, this work demonstrated the feasibility of use of iPS-derived cells for liver tissue engineering approaches and contributed to the development of the investigated technologies in order to generate future therapeutic alternatives for patients in waiting list for liver transplantation

O Transtorno Depressivo Maior (TDM) é uma condição neuropsiquiátrica que resulta em um substancial sofrimento pessoal, incapacidade e custos sociais. Devido à inacessibilidade ao encéfalo humano por questões práticas, éticas e às limitações encontradas pelo uso de modelos animais, o desenvolvimento de modelos in vitro acurados torna-se fundamental para o estudo desta doença. Neste aspecto, o surgimento da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) apresenta-se como uma importante ferramenta, uma vez que permite a recapitulação da diversidade genética dos pacientes e possibilita a produção de tipos celulares de interesse para o estudo da doença, como neurônios e glia. Entretanto, até o momento, não há registros da produção de modelos in vitro a partir de hiPSCs de pacientes com TDM. Visando preencher esta lacuna, o presente estudo teve por objetivo a produção e caracterização de dois tipos de modelos in vitro a partir de hiPSCs de pacientes com TDM: neurônios serotoninérgicos, uma cultura celular em monocamada, e organóides cerebrais, uma cultura celular em suspensão. 5 linhagens de hiPSCs de pacientes foram diferenciadas em neurônios com sucesso e no ensaio de imunocitoquímica, expressaram os marcadores 5-HT (serotonina), T5-HT (transportador de serotonina), nestina (presente em diferentes tipos de células neuronais) e Tuj1 (proteína do citoesqueleto, neurônio-específica), confirmando o fenótipo de neurônios serotoninérgicos. As céluas diferenciadas obtiveram também resultados positivos nos testes de imageamento de cálcio e de medidas da alteração no potencial de membrana, indicando que os neurônios diferenciados eram fisiologicamente funcionais. De 5 linhagens de hiPSCs (sendo uma controle e as outras 4 de pacientes com TDM), somente 1 linhagem sobreviveu ao processo de diferenciação, originando organóides cerebrais e apresentou expressão dos marcadores Sox2 (progenitoras neurais) e Tuj1 (neurônios maduros), indicando ainda uma estruturação correta da citoarquitetura, com as progenitoras localizadas mais internamente, na zona ventricular, ao redor dos lúmens preenchidos com líquido e com os neurônios maduros localizados na placa cortical, região mais externa dos agregados celulares. Apesar de o processo de produção dos organóides cerebrais necessitar de aperfeiçoamento e melhor padronização, a produção destes dois tipos de modelos in vitro, feitos a partir de hiPSCs de pacientes com TDM configura-se como um importante passo para a futura redução do uso de modelos animais em pesquisa, elucidação de mecanismos subjacentes à doença, identificação de biomarcadores diagnósticos e triagem de fármacos de maneira personalizada, visando permitir tratamentos mais baratos, adequados e eficientes para o TDM / Major Depressive Disorder (MDD) is a neuropsychiatric condition that results in substantial personal distress, disability, and social costs. The inaccessibility to the human brain due to practical and ethical issues and the limitations encountered by the use of animal models turn the development of accurate in vitro models into an essential factor to study this disease. In this regard, the emergence of human induced pluripotent stem cell technology (hiPSCs) is an important tool, since it allows the recapitulation of patient\'s genetic diversity and allows the production of cell types of interest for studying the disease, such as neurons and glia. However, to date, there are no records of the production of in vitro models from hiPSCs of patients with MDD. In order to fill this gap, the present study aimed at the production and characterization of two types of in vitro models from hiPSCs of patients with MDD: serotonergic neurons, a monolayer cell culture, and cerebral organoids, a suspension cell culture. 5 patients\' hiPSCs lines were successfully differentiated into neurons and, in the immunocytochemistry assay, they expressed the 5-HT (serotonin), T5-HT (serotonin transporter), nestin (present in several neuronal cell types) and Tuj1 (cytoskeleton protein, neuron-specific), confirming the phenotype of serotonergic neurons. Differentiated cells also obtained positive results in calcium imaging tests and measurements of membrane potential changes, indicating that differentiated neurons were physiologically functional. Of 5 hiPSCs lines (one control and the other 4 of patients with MDD), only 1 survived to the differentiation process, originating cerebral organoids which presented expression of Sox2 (neural progenitor) and Tuj1 (mature neurons) markers and a correct structuring of the cytoarchitecture, with the progenitors located more internally in the ventricular zone, around the lumens filled with liquid and with the mature neurons located in the cortical plate, the outermost region of the cellular aggregates. Although the cerebral organoids production process needs improvement and better standardization, the production of these two types of in vitro models, made from hiPSCs of patients with MDD, is an important step for the future reduction of animal models use, elucidation of disease underlying mechanisms, identification of diagnostic biomarkers and drug screening in a personalized manner, in order to allow cheaper, more adequate and more efficient treatments for MDD

Retinal ganglion cells (RGCs) serve as a vital connection between the eye and the brain with damage to their axons resulting in loss of vision and/or blindness. Retinal organoids are three-dimensional structures derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) which recapitulate the spatial and temporal differentiation of the retina, providing a valuable model of RGC development in vitro. The working hypothesis of these studies is that hPSC-derived RGCs are capable of extensive outgrowth and display target specificity and pathfinding abilities. Initial efforts focused on characterizing RGC differentiation throughout early stages of organoid development, with a clearly defined RGC layer developing in a temporally-appropriate manner expressing a compliment of RGC-associated markers. Beyond studies of RGC development, retinal organoids may also prove useful to investigate and model the extensive axonal outgrowth necessary to reach post-synaptic targets. As such, additional efforts aimed to elucidate factors promoting axonal outgrowth. Results demonstrated significant enhancement of axonal outgrowth through modulation of both substrate composition and growth factor signaling. Furthermore, RGCs possessed guidance receptors that are essential in influencing outgrowth and pathfinding. Subsequently, to determine target specificity, aggregates of hPSC-derived RGCs were co-cultured with explants of mouse lateral geniculate nucleus (LGN), the primary post-synaptic target of RGCs. Axonal outgrowth was enhanced in the presence of LGN, and RGCs displayed recognition of appropriate targets, with the longest neurites projecting towards LGN explants compared to control explants or RGCs grown alone. Generated from the fusion of regionally-patterned organoids, assembloids model projections between distinct regions of the nervous system. Therefore, final efforts of these studies focused upon the generation of retinocortical assembloids in order to model the long-distance outgrowth characteristic of RGCs. RGCs displayed extensive axonal outgrowth into cortical organoids, with the ability to respond to environmental cues. Collectively, these results establish retinal organoids as a valuable tool for studies of RGC development, and demonstrate the utility of organoid-derived RGCs as an effective platform to study factors influencing outgrowth as well as modeling long-distance projections and pathfinding abilities.

To optimize neoadjuvant radiochemotherapy of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), the value of new irradiation modalities such as proton therapy needs to be investigated in relevant preclinical models. We studied individual treatment responses to RCT using patient-derived PDAC organoids (PDO). Four PDO lines were treated with gemcitabine, 5-fluorouracile (5FU), photon and proton irradiation and combined RCT. Therapy response was subsequently measured via viability assays. In addition, treatment-naive PDOs were characterized via whole exome sequencing and tumorigenicity was investigated in NMRI Foxn1nu/nu mice. We found a mutational pattern containing common mutations associated with PDAC within the PDOs. Although we could unravel potential complications of the viability assay for PDOs in radiobiology, distinct synergistic effects of gemcitabine and 5FU with proton irradiation were observed in two PDO lines that may lead to further mechanistical studies. We could demonstrate that PDOs are a powerful tool for translational proton radiation research.

The rubella virus (RV) was the first virus shown to be teratogenic in humans. The wealth of data on the clinical symptoms associated with congenital rubella syndrome is in stark contrast to an incomplete understanding of the forces leading to the teratogenic alterations in humans. This applies not only to RV, but also to congenital viral infections in general and includes (1) the mode of vertical transmission, even at early gestation, (2) the possible involvement of inflammation as a consequence of an activated innate immune response, and (3) the underlying molecular and cellular alterations. With the progress made in the development of pluripotent stem cell-based models including organoids and embryoids, it is now possible to assess congenital virus infections on a mechanistic level. Moreover, antiviral treatment options can be validated, and newly emerging viruses with a potential impact on human embryonal development, such as that recently reflected by the Zika virus (ZIKV), can be characterized. Here, we discuss human cytomegalovirus (HCMV) and ZIKV in comparison to RV as viruses with well-known congenital pathologies and highlight their analysis on current models for the early phase of human development. This includes the implications of their genetic variability and, as such, virus strain-specific properties for their use as archetype models for congenital virus infections. In this review, we will discuss the use of induced pluripotent stem cells (iPSC) and derived organoid systems for the study of congenital virus infections with a focus on their prominent aetiologies, HCMV, ZIKV, and RV. Their assessment on these models will provide valuable information on how human development is impaired by virus infections; it will also add new insights into the normal progression of human development through the analysis of developmental pathways in the context of virus-induced alterations. These are exciting perspectives for both developmental biology and congenital virology.

Les hormones thyroïdiennes (HTs) contrôlent plusieurs aspects du développement et de l’homéostasie intestinale. Elles agissent via des récepteurs nucléaires (TRs), facteurs de transcription modulés par la T3. Le paradigme est la métamorphose des amphibiens où elles sont responsables du remodelage du tube digestif et de l’émergence des cellules souches (Ishizuya-Oka et al, 2009). Des études précédentes ont montré que les HTs jouent un rôle fondamental en régulant la balance entre prolifération et différenciation des précurseurs épithéliaux murins. Du point de vue moléculaire, le récepteur nucléaire TRα1 contrôle plusieurs gènes du cycle cellulaire/prolifération ainsi que les voies de signalisation Wnt et Notch (rev. in Sirakov et al, 2104; Skah et al, 2017). En accord avec ces fonctions, l’expression ciblée de TRα1 dans l’épithélium intestinal (souris vil-TRα1) est suffisante pour induire des cryptes aberrantes, hyper-prolifératives et confère une sensibilité accrue au programme de tumorigénèse intestinale dépendant de la mutation dans le gène Apc (vil-TRα1/Apc+/1638N mice) (Kress et al, 2010). Le but de mon travail a été d’étudier le contrôle des cellules souches intestinales, dépendant des HTs/TRs. En effet, j’ai utilisé des souris Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 permettant de traquer, trier et cibler les cellules souches (Barker et al, 2007) que j’ai croisées avec le modèle murin inductible au tamoxifène TRα1-LOF (Loss-of-function) (Quignodon et al, 2007). J’ai étudié les effets de l’altération de la voie HTs/TRα1 in vivo et dans des organoïdes intestinaux (ex vivo). Nos résultats indiquent que les HTs et la modulation de l’expression ou de l’activité de TRα1 affectent rapidement et fortement les cellules souches intestinales. Ce travail ouvre de nouvelles perspectives dans l’étude des signaux dépendants des HTs/ TRα1 dans la physiopathologie des cellules souches intestinales / Thyroid hormones (THs) control several aspects of gut development and homeostasis. They act through the thyroid hormone nuclear receptors (TRs) that are T3-modulated transcription factors. The paradigm is the amphibian metamorphosis, where they are responsible for gut remodeling and emergence of the stem cells (Ishizuya-Oka et al, 2009). In previous studies we showed that THs play a fundamental role in regulating the balance between cell proliferation and cell differentiation of the murine intestinal epithelial precursors. From a molecular point of view the nuclear receptor TRα1 controls several proliferation/cell-cycle genes as well as the Wnt and Notch pathways (rev. in Sirakov et al, 2104; Skah et al, 2017). In accordance with these functions, targeted expression of TRα1 in the intestinal epithelium (vil-TRα1 mice) is sufficient to induce aberrant and hyper-proliferative crypts and confers increased susceptibility to Apc-mutation dependent intestinal tumorigenic program (vil-TRα1/Apc+/1638N mice) (Kress et al, 2010). The aim of my work was to study TH- and TRα1-dependent control of intestinal stem cells. Indeed, I used the Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 mice enable tracking, sorting and targeting the stem cells (Barker et al, 2007) crossed with tamoxifen inducible TRα1 loss-of-function (Quignodon et al, 2007) mouse model (TRα1-LOF). I studied the effect of TH/TRα1 alteration in vivo and in intestinal organoids (ex vivo). In conclusion, our results indicate that HTs and modulating TRα1 expression or activity have a rapid and strong effect on the intestinal stem cells. This work opens a new perspective in the study of TH/TRα1-dependent signal on the physiopathology of the intestinal stem cells

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Los fotorreceptores de los mamíferos, las células externas de la retina que detectan la luz, carecen de capacidad de autorregeneración tras una lesión. En los estadios avanzados de las IRD, los fotorreceptores se pierden pero la estructura interna de la retina se conserva durante largos periodos de tiempo, aunque con una importante remodelación sináptica y gliosis. Para estas condiciones, las terapias regenerativas dirigidas a reemplazar los fotorreceptores y establecer sinapsis funcionales con las neuronas internas de la retina viables restantes podrían permitir la recuperación de la visión en pacientes que de otro modo serían ciegos. En otras palabras, la terapia con células madre está dirigida al tratamiento de las degeneraciones de la retina en aquellas situaciones en las que se han perdido los fotorreceptores y, por lo tanto, no es posible restaurar la funcionalidad a través de enfoques más comunes como la terapia de reemplazo de genes. Se han desarrollado y caracterizado células madre embrionarias humanas (hESC) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de células precursoras de fotorreceptores (PRPC) contenidas en organoides de retina (RO) para terapias experimentales regenerativas. Aunque la terapia con células madre es un campo que ha mostrado resultados prometedores en animales de laboratorio, no hay informes que evalúen la seguridad y eficacia de su uso en perros. Con un inyector subretiniano que fue modificado para acomodar el gran tamaño de los agregados celulares, inyectamos con éxito las células en el espacio subretiniano (SRS) canino utilizando un procedimiento quirúrgico sencillo (inyección manual en bolo sin vitrectomía previa). Pudimos monitorizar la supervivencia y las características de las células injertadas a lo largo del tiempo utilizando un enfoque de imagen multimodal que incluía la detección mediante fotografía del fondo de ojo y/o cSLO de los genes reporteros fluorescentes (tdTomato o GFP) expresados por las PRPC. Esto nos permitió superar un reto importante encontrado en otros estudios, donde las células donantes no fluorescentes fueron seguidas sólo por OCT o detectadas por histología después de la terminación. La visualización de las PRPC fluorescentes en el animal vivo nos permitió diferenciarlas de las células del huésped. En consonancia con lo descrito anteriormente, observamos dos patrones temporales de pérdida de células del donante: una reducción temprana del número de células injertadas en la primera semana del trasplante que no dependía del estado de la inmunosupresión (IS), y un rechazo retardado del injerto, observado en aquellos perros que no estaban inmunosuprimidos. De hecho, hasta donde sabemos, no hay estudios que evalúen el tiempo de pérdida de fotorreceptores tras el trasplante, con y sin IS, controlando simultáneamente la transferencia de material citoplasmático entre las células del donante y del huésped. Aquí observamos signos compatibles con el rechazo del trasplante en animales que no recibieron IS sistémico, así como en un único perro cuyo tratamiento con IS se interrumpió. El grado de inflamación clínica variaba entre los animales, pero la vasculitis retiniana, el vítreo turbio y la inflamación de la retina eran comunes en todos los perros con rechazo de las células del donante. Estos signos se detectaron por primera vez entre 1-2 y 12 semanas después del trasplante, lo que respalda la necesidad de un seguimiento frecuente de las retinas tratadas en los meses siguientes al trasplante para detectar posibles signos tempranos de rechazo y ofrecer la oportunidad de ajustar el régimen inmunosupresor. Dado que el rechazo del trasplante en el SRS también puede producirse sin inflamación clínica manifiesta, se justifica la identificación de nuevos biomarcadores que puedan detectar la inflamación subclínica temprana para modular la respuesta inmunitaria y prolongar la supervivencia del injerto. Aunque se desconocen todos los factores que promueven la supervivencia de las células del donante, descubrimos que el IS sistémico desempeñaba un papel fundamental en la supervivencia de las hESC-PRPCs administradas por vía subretiniana, como se había informado anteriormente. En el presente estudio, algunas PRPC desarrollaron estructuras similares a pedículos, expresaron la proteína presináptica sinaptofisina y establecieron contactos con las células bipolares del anfitrión. Estos resultados alentadores preparan ahora el terreno para la evaluación funcional de estas xenosinapsis. La retinosis pigmentaria es un grupo de enfermedades genéticas que provocan una pérdida progresiva de la visión, siendo una de las principales causas de ceguera en los países desarrollados. Está bien documentado que en pacientes con retinosis pigmentaria, existe una disfunción vascular asociada que conduce al adelgazamiento de los vasos; sin embargo, las implicaciones de esta disfunción vascular en la degeneración de los fotorreceptores no se comprenden completamente. Los modelos caninos de degeneraciones retinianas hereditarias han sido de gran relevancia en el desarrollo traslacional de terapias de reemplazo génico para múltiples formas de retinosis pigmentaria, Amaurosis congénita de Leber, y enfermedad de Best. De manera similar a lo que ocurre en pacientes con retinosis pigmentaria, los perros afectados con las mismas mutaciones también experimentan remodelación vascular, sin embargo, la cinética de esta remodelación vascular en enfermedades retinianas hereditarias caninas no se ha estudiado y no se han establecido los parámetros normales en el perro. La angiografía por tomografía de coherencia óptica (OCTA) es un método novedoso de obtención de imágenes sin necesidad del uso de contraste intravenoso que permite la visualización detallada de la circulación retiniana, lo que permite el estudio de los distintos plexos vasculares por separado. Esta importante extracción de imágenes de los diferentes plexos, junto con la alta resolución de estos angiogramas, permite una cuantificación más precisa de la densidad vascular y otros parámetros, teniendo muchas aplicaciones en sujetos sanos y en pacientes con diferentes enfermedades oculares y sistémicas. Con el uso de modernas técnicas de imagen, este trabajo ha confirmado la presencia de cuatro plexos retinianos distintos. Aunque muchos estudios han informado de los datos cuantitativos de las imágenes OCTA en retinas humanas, no se han descrito parámetros vasculares caninos. Este estudio proporciona datos normativos para el SVP+ICP, DCP y WR, estableciendo con éxito un rango de referencia que puede ser consultado y comparado en futuros estudios. En los ojos humanos, el número de plexos retinianos y sus densidades disminuyen hacia la periferia, y esto es similar a lo que Engerman et al. describieron previamente en perros. Nuestro trabajo no sólo confirma este hallazgo, sino que ahora proporciona datos cuantitativos para cuatro parámetros que se utilizan frecuentemente para caracterizar las redes vasculares. En nuestra evaluación, los angiogramas de OCTA tenían una mayor resolución en comparación con las imágenes de AF en la misma localización. Al igual que en el caso de los seres humanos, la angiografía por OCT en perros permitió identificar lechos capilares (ICP y DCP) que no se identificaban con la AF. Sin embargo, la AF proporcionó un mayor campo de visión y los artefactos que se encontraron en algunas de las exploraciones de OCTA (artefactos de movimiento y anormalidades de descorrelación debido al artefacto de proyección) no se observaron en las imágenes de AF. Cuando se compara con las imágenes obtenidas por IHC en montajes completos de retina, nuestro estudio confirma que la OCTA proporciona una buena visualización de la SVP y la DCP. También encontramos que había una subrepresentación de los vasos de pequeño calibre en la OCTA, especialmente los situados en capas altamente reflectantes (ICP). Cuando se compara con las imágenes adquiridas en las mismas localizaciones por microscopía confocal/IHC, nuestros resultados sugieren que la OCTA es una técnica valiosa para visualizar y cuantificar la vasculatura retiniana en perros, especialmente para el análisis de la VD en el DCP. Además, por IHC encontramos que el ICP se fusiona con el SVP pero no con el DCP como ocurre en las retinas humanas. Nuestro estudio ha confirmado la viabilidad del uso de OCTA en perros, proporcionando imágenes resueltas en profundidad de diferentes capas retinianas segmentadas que permiten la evaluación de plexos individuales. Esto allana el camino para otros análisis in vivo de la vasculatura de la retina canina en un amplio número de patologías de la retina con un fenotipo vascular. Además, evaluamos los cambios vasculares en el area centralis de perros afectados por varias formas de IRD que fueron visualizados por OCTA en diferentes etapas de la enfermedad. Identificamos que la DCP está más afectada que las redes vasculares más superficiales en una etapa temprana de la enfermedad. Además, confirmamos que existe una fuerte asociación entre el VD en el DCP y el grosor de la ONL, lo que sugiere que la evaluación de la vascularización en este plexo puede utilizarse como un marcador indirecto para la evaluación de los requisitos metabólicos de la retina externa. Por último, hemos validado mediante el análisis de los vasos en los montajes planos de la retina los hallazgos de la OCTA, y hemos descubierto que en los modelos caninos de IRD la migración de las células del RPE también desempeña un papel en las alteraciones vasculares de la fase posterior que se producen en los pacientes con RP. Encontramos que los cambios microscópicos observados en los vasos con degeneración eran diferentes en las distintas redes retinianas. En la DCP, se confirmó un estrechamiento y una pérdida progresiva de vasos, que acabó con la desaparición completa de esta red. En el SVP de los tres modelos, los vasos presentaban un mayor grosor de la pared debido a la deposición de material que rodea la pared vascular que, en las fases finales, conduce al estrechamiento y la oclusión vascular. En la fase final de la enfermedad, se observó que múltiples vasos de la SVP estaban rodeados de estructuras pigmentadas. El marcaje específico de RPE65 reveló que se trataba de células del PRE que habían migrado para rodear estos vasos internos de la retina. Aquí caracterizamos dos tipos diferentes de degeneración vascular que se producen en los plexos retinianos SVP y DCP, lo que podría aportar información para futuros estudios que evalúen específicamente la fisiopatología de esta degeneración vascular. Un animal del modelo crd2/NPHP5 fue tratado con terapia de reemplazo génica unilateralmente con una inyección subretiniana que cubría el area centralis. En este perro, la pérdida de ONL en el momento de la intervención de terapia génica era inferior al 50%. Al comparar las fotografías del fondo de ojo del ojo no tratado y el tratado, se identificó fácilmente una marcada preservación de la vascularización en el área que fue cubierta por la terapia génica. Las imágenes OCTA se procesaron con el programa AngioTool, y la evaluación cualitativa de las imágenes esqueletizadas mostró una regresión vascular en el ojo no tratado y una notable preservación de la integridad vascular en el ojo tratado. También demostramos que en estas enfermedades naturales, así como en un modelo de degeneración aguda de fotorreceptores inducido por la luz, el DCP se ve afectado antes que los otros plexos vasculares de la retina. La posterior disminución de la VD en el SVP+ICP que se produce en las últimas fases de la degeneración, es probablemente una respuesta al marcado adelgazamiento de la retina externa y a la capacidad de que el oxígeno transportado por los vasos coroideos llegue a las localizaciones internas de la retina, como se ha confirmado previamente en modelos animales felinos utilizando perfiles espaciales de oxigenación de la retina.

Kolorektale Karzinome (CRC) zeigen eine heterogene Ätiologie. Die Progression prämaligner Vorläufer zu CRC unterscheidet (U) sich in Morphologie, molekularen Veränderungen und Interaktion mit der Tumorumgebung. CRC weisen oft onkogene Mutationen in KRAS und BRAF auf. Diese steigern die MAPK Signalwegaktivität (Mpa). Obwohl sie im selben Signalweg wirken, sind KRAS und BRAF auf die CRC-Entitäten U verteilt. Dabei ist KRAS häufiger im sogenannten konventionellen und BRAF im serratierten Weg zu CRC mutiert. In dieser Studie nutzte ich murine intestinale Organoide (iO), die induzierbare (Ind) KRAS oder BRAF Onkogene exprimieren. Große U zwischen KRAS und BRAF zeigten sich sowohl in Signaltransduktion (ST) als auch im Phänotyp. Phosphoprotein-, ERK-Reporter-, scRNA-Seq und EM-Analysen ergaben eine starke Mpa durch BRAF, die zu hoher Expression von MAPK-Zielgenen und Verlust der epithelialen Integrität führte. iO nach KRAS-Ind blieben intakt, korrelierend mit moderater, zelltypspezifischer (ZS) Mpa in sekretorischen und undifferenzierten Zellen. Die meisten Enterozyten waren Mpa-negativ. ERK-Reporter zeigten: Das ZS Muster der Mpa ist nicht nur gegenüber KRAS, sondern auch dem Entzug von Wachstumsfaktoren stabil. Dies spricht für eine intrinsische, robuste Regulierung der Mpa. BRAF-Ind Mpa setzte die ZS Regulierung der MAPK außer Kraft und schädigte das Gewebe, im Einklang mit einer oberen Grenze tolerabler Mpa. Die ZS Mpa wurde in CRC-Zelllinien bestätigt, deren Mpa durch KRAS aber nicht BRAF U ausfiel. Ferner, nutzte ich iO mit bCatenin+KRAS-Ind, um den konventionellen Weg zu CRC zu modellieren. Die Kombination führte zu synergistischen Effekten, die sich in EGFR-unabhängigem Wachstum und der Aufhebung der ZS Mpa-Blockade äußerten, die durch eine Verschiebung der Differenzierung zu mehr Progenitorzellen bewirkt wurde. Zusammenfassend konnte ich U in der Mpa durch KRAS oder BRAF im Darmepithel feststellen, was dazu beiträgt, deren Rollen in der CRC-Genese zu bestimmen. / Colorectal cancer (CRC) is a disease with heterogeneous etiology. Premalignant lesions follow distinct routes of progression to carcinoma reflected by differences in morphology, molecular alterations and the tumor environment. Mutant KRAS and BRAF are frequent, leading to MAPK pathway activation (Mpa), which is relevant for CRC therapy. Despite acting in the same pathway, mutant KRAS and BRAF segregate to different entities, as KRAS is more frequent in the conventional- and BRAF being specific for the serrated route to CRC. I used murine intestinal organoids (iO) expressing inducible oncogenic KRAS or BRAF to study the impact of oncogenes in primary cells. I found marked differences in signal transduction and phenotype. Phospho-protein, ERK-reporter, scRNA-seq and EM data showed strong Mpa upon BRAF induction followed by ERK-target gene expression leading to tissue disruption. In contrast, KRAS left the tissue intact resulting in less and cell type-dependent Mpa limited to secretory cells, a subset of late-stage enterocytes and undifferentiated crypt cells. Most enterocytes were irresponsive to KRAS. The pattern of Mpa was robust towards KRAS or growth factor depletion arguing in favor of intrinsic, resilient MAPK regulation. In iO, BRAF-induced Mpa could break this cell type-specific regulation, indicating an upper limit of tolerable Mpa. I validated these findings in CRC cell lines that differed in Mpa in response to oncogenic KRAS but not BRAF. Finally, I used iO expressing an inducible form of stabilized bCatenin in combination with KRAS to mimic events frequently found in the conventional pathway to CRC. Expression of KRAS and bCatenin synergized in driving EGFR independent growth and breaking the villus-specific block of Mpa by altering differentiation towards progenitor cell types. In summary, this study emphasizes differences between Mpa induced by oncogenic KRAS or BRAF which helps clarifying their nature in different etiological routes to CRC genesis.