Orientadores: Sophie Françoise Mauricette Derchain, Liliana Aparecida Lucci De Angelo Andrade / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T03:21:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Olimpio_AdrianaYoshida_M.pdf: 1413013 bytes, checksum: ed127b0f937e9350f9e3b1ab1d8d780c (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Introdução: A hipótese mais aceita atualmente na carcinogênese ovariana é a da ovulação incessante. O traumatismo causado pela ruptura do folículo ovulatório no epitélio ovariano requer uma reparação imediata, levando a uma reação inflamatória. A Ciclo-oxigenase-2 (COX-2), enzima envolvida na inflamação e outros processos patológicos, catalisa a formação de prostaglandinas a partir do ácido araquidônico e parece estar relacionada à carcinogênese de diversas neoplasias, entre elas a de ovário. Objetivos: Avaliar se os tumores serosos e mucinosos de ovário expressam a COX-2 de maneira crescente quando se comparam tumores benigno, borderline e maligno, e investigar se existe alguma relação entre a expressão da COX-2 e a proliferação celular do tumor avaliada pela expressão do Ki67. Sujeitos e métodos: Para este estudo de corte transversal foram selecionados os blocos cirúrgicos das pacientes submetidas à laparotomia por tumor de ovário seroso ou mucinoso, benigno, borderline ou maligno entre janeiro de 1997 a dezembro de 2003. O estudo foi realizado nos Departamentos de Anatomia Patológica e de Tocoginecologia, da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), em São Paulo, Brasil. Foram incluídos neste estudo 113 tumores serosos de ovário (67 benignos, 15 borderline e 31 malignos) e 85 tumores mucinosos de ovário (48 benignos, 28 borderline e 9 malignos). Todas as lâminas obtidas dos espécimes cirúrgicos foram revisadas por um patologista para confirmar o diagnóstico histológico. As expressões da COX-2 e do Ki67 foram obtidas através de reações de imunoistoquímica nestes cortes de tumores epiteliais ovarianos conservados em parafina. Resultados: Houve um aumento da expressão da COX-2 na progressão dos tumores benigno para maligno, tanto no seroso quanto nos mucinoso, mais evidente no mucinoso (p<0,001). Comparando os tipos histológicos, a expressão da COX-2 foi mais acentuada nos tumores benignos serosos do que nos mucinosos (p<0,01), mas esta diferença não foi significativa para os tumores borderline (p=0,11) ou malignos (p=0,71). Houve um aumento progressivo na expressão do Ki67 de acordo com o aumento do gradiente histológico para os tumores serosos (p<0,01) e mucinosos (p<0,01), mas esta maior expressão não se correlacionou com a da COX-2 no presente estudo (p=0,78). Conclusões: Houve uma maior expressão de COX-2 em tumores de ovário seroso do que no mucinoso. A positividade da COX-2 aumenta com a progressão do gradiente morfológico, do benigno para o maligno em ambos os tipos histológicos, mas foi mais acentuada no tumor mucinoso, sugerindo diferentes vias oncogênicas relacionados aos diferentes tipos histológicos. Como a COX-2, a expressão do Ki67 também mostrou maior positividade do tumor benigno para maligno, mas uma correlação entre a expressão da COX-2 e Ki67 não foi encontrada, sugerindo que a COX-2 pode ser necessária para a carcinogênese, mas esta via não é responsável pela proliferação celular em carcinomas ovarianos / Abstract: Introduction: Incessant ovulation is the most accepted hypothesis for ovarian carcinogenesis. The trauma caused by rupture of the ovulation follicle needs an immediate repair of the wound in the ovarian epithelium, which causes an inflammatory response. Cyclooxygenase-2 (COX-2) is an enzyme involved in the inflammatory process and catalyses the reaction that produces prostaglandins from arachidonic acid and has been implicated in various neoplasias, including ovarian cancer. Objectives: To evaluate if there is a progressive enhance in COX-2 expression in serous and mucinous ovarian tumors, comparing benign, borderline and malignant tumors and to investigate whether there is a correlation between COX-2 expression and tumor cell proliferation represented by Ki67 expression. Materials and methods: For this cross-sectional study, paraffin blocks were selected from women who were submitted to laparotomy and had diagnosis of benign, borderline and malignant serous and mucinous tumors between January 1997 and December 2003. The study was conducted in the Departments of Pathology and Gynecology, in the Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), in São Paulo, Brasil. One hundred and thirteen ovarian serous tumors (67 benign, 15 borderline and 31 malignant) and 85 mucinous ovarian tumors (48 benign, 28 borderline and 9 malignant) were included. All the slides were reviewed by a pathologist to assure the histological diagnosis and COX-2 and Ki67 expressions were obtained in immunohistochemical reactions in these tumor samples. Results: From benign to malignant tumors, there was a progressive positive trend in COX-2 expression, in both serous and mucinous tumors, more evident in mucinous ones (p<0.001). Comparing histological types, COX-2 expression was more prominent in serous than in mucinous benign tumors (p<0.01), but this difference was not significant in borderline (p=0.11) or in the malignant categories (p=0.71). There was a progressive Ki 67 positivity in line with the tumor histological gradient for both serous (P<0.01) and mucinous lesions (p<0.01), but this increasing expression did not correlate with COX-2 expression in the present series (p=0.78). Conclusions: There was a higher COX-2 expression in serous ovarian tumors than in mucinous ones. COX-2 positivity increases in line to the morphologic gradient, from benign to malignant in both histological types, but it was more prominent in mucinous lesions, pointing to different oncogenic pathways related to different histological types. Like COX-2, Ki67 also showed an increasing positivity from benign to malignant tumors but a correlation between COX-2 and Ki67 expressions was not found, suggesting that COX-2 may be required for carcinogenesis, but this pathway is not responsible for cell proliferation in ovarian cancers / Mestrado / Tocoginecologia / Mestre em Tocoginecologia

Memoria para optar el título de Bioquímico / El componente nervioso simpático regula la función ovárica y su actividad nerviosa aumenta al final del periodo reproductivo, lo que supone una relación entre envejecimiento ovárico y aumento del tono simpático. Este componente nervioso tiene una porción extrínseca y otra intrínseca, las que podrían participar de manera complementaria en la regulación de la función ovárica normal y en especial en el proceso de envejecimiento del ovario. Este trabajo tiene por objeto demostrar que células ováricas tipo-neuronas, que forman parte del componente nervioso intrínseco, participan en el aumento del tono adrenérgico, observado al final del periodo reproductivo. Para esto se midió la capacidad de incorporación y liberación de norepinefrina tritiada en ovarios completos, células ováricas obtenidas por punción y ovario residual posterior a la punción de ratas controles y ratas desnervadas de entre 6 a 12 meses de edad. Con el objeto de evaluar la participación de transportadores de catecolaminas se pre-incubó con una solución de cocaína 10 μM. Para determinar la presencia de células tipo-neurona en el ovario, se realizaron ensayos de inmunohistoquímica para los marcadores nerviosos DAT y Snap-25 en cortes de ovario pertenecientes a ratas de 6,10 y 14 meses de edad. Los resultados muestran que en la senescencia existe un aumento sostenido del tono adrenérgico intrínseco del ovario, representando hasta un 30% del tono simpático total. Además, este componente intrínseco estaría conformado por células tipo-neuronas pertenecientes al tejido intersticial, las que poseen transportadores de catecolaminas que participarían en la homeostasis adrenérgica del ovario. Finalmente, los ensayos de inmunoreactividad para DAT y Snap-25 mostraron la presencia de estos marcadores en células de la granulosa y tejido intersticial, avalando la existencia de células tipo-neuronas en el ovario. Lo anterior da luces sobre la participación de un componente celular distinto a los descritos anteriormente en el envejecimiento ovárico y permite plantear nuevas interpretaciones sobre los eventos que ocurren al final del periodo reproductivo tanto en ratas como en la mujer / The nervous component that modulates ovarian function increases its activity at the end of reproductive period, implying a relationship between ovarian aging and an increase of the sympathetic tone. This nervous component has two portions, an extrinsic one and other intrinsic, which could participate in a complementary manner in the normal modulating ovarian function particularly in the ovary aging process. This paper aims to demonstrate that ovarian neuron-like cells belonging to intrinsic nervous component are involved in the increase adrenergic tone observed at the end of reproductive period. For this, we measured the capability of releasing radiolabeled noradrenalin previously incorporated of full ovaries, ovarian cells obtained by puncture and remaining ovaries after puncture in controls and denervate rats between 6-12 months of age. In order to evaluate the participation of catecholamine carriers, the tissues were previously incubated with cocaine 10 μM solution. To determine the presence of neuron-like cells in the ovary an immunohistochemical assay was performed for the nervous markers DAT and Snap-25 in ovary slides of 6, 10 and 14 months of age control rats. The results show that during senescence there is an increase in the intrinsic adrenergic tone of the ovary, representing 30% of the total sympathetic tone. In addition, this component would consist of intrinsic cells neuron-like belonging to the interstitial tissue, which possesses catecholamine transporters, involved in adrenergic ovarian homeostasis. Finally, immunoreactivity assays for DAT and Snap-25 showed the presence of these markers in granulosa cells and interstitial tissue, supporting the existence of neuron-like cells in the ovary. This sheds light on the involvement of a different cellular compartment during ovarian aging and can suggest new interpretations of the events occurring at the end of the reproductive period in both rats and women

El estrés crónico, en combinación con la sobrealimentación y la falta de ejercicio, contribuye al desarrollo del síndrome metabólico, aumentando el riesgo de enfermedades cardiovasculares y diabetes tipo 2. Se ha demostrado que el estrés afecta a cada componente del síndrome metabólico y entre ellos, al síndrome de ovario poliquístico (SOP), principal causa de infertilidad en mujeres en edad fértil. Hemos descrito que el estrés por frío crónico en ratas provoca cambios morfológicos en los folículos ováricos similares a los encontrados en el SOP. Para conocer si este modelo de estrés está asociado a cambios metabólicos, determinamos la sensibilidad a insulina y el efecto de esta hormona sobre la actividad nerviosa ovárica (factor involucrado en la génesis y mantención del SOP) y por ende, si el estrés es un factor potencial en el desarrollo del SOP. A nivel metabólico, los animales sometido a estrés por frío crónico aumentaron la sensibilidad a la insulina, determinada mediante el clamp hiperinsulinémico euglicémico. Al mismo tiempo, estos animales aumentaron su ingesta alimenticia, manteniendo la misma ganancia de peso que sus respectivos controles. La actividad nerviosa simpática ovárica aumentó cuando los ovarios de animales control fueron incubados con insulina, sin embargo, no hubo cambio en los ovarios de ratas estresadas. Estos resultados sugirieron una resistencia a la insulina tejido específico, la cual fue apoyada al determinar el nivel de mRNA y proteína IRS-1 y GLUT-4. Ambas moléculas de la ruta de señalización intracelular de insulina, disminuyeron en los ovarios de las ratas sometidas a estrés, siendo las células de la teca-intersticial en las que se observó preferencialmente esta disminución. Al administrar insulina intracerebroventricular (ICV), la actividad nerviosa ovárica no fue modificada, ni ocurrieron cambios en el desarrollo folicular, sin embargo, las ratas estresadas infundidas con insulina ICV no disminuyeron la ganancia de peso, la glicemia ni la insulinemia, como lo hicieron sus respectivos controles, apoyando una pérdida de sensibilidad a insulina hipotalámica inducida por el estrés. Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que el estrés por frío crónico intermitente provoca una resistencia a la insulina que es tejido específica, y que la insulina tiene un efecto estimulador de la actividad nerviosa simpática ovárica. Probablemente, la resistencia insulínica en ovario e hipotálamo son en parte responsables de los cambios en la función reproductiva y metabólica de la condición poliquística inducida por estrés crónico.

La formación de vasos sanguíneos a partir de otros preexistentes, o angiogénesis, es un proceso esencial en el desarrollo del tejido normal. La mayor parte de la angiogénesis fisiológica ocurre en la etapa embrionaria, y en el adulto, el endotelio vascular es un tejido con un bajo índice de proliferación. Sin embargo, los ovarios presentan cíclicamente procesos asociados a angiogénesis. En el ovario, la angiogénesis acompaña al desarrollo folicular y a la formación del cuerpo lúteo, y de no existir concepción, esta red vascular involuciona. La extraordinaria rapidez con que los vasos sanguíneos aparecen y son reabsorbidos en cada ciclo ovárico, hace de este sistema un modelo ideal para el estudio de los elementos regulatorios de la angiogénesis, por lo que su mejor comprensión podría significar un gran avance para la investigación de la angiogénesis en eventos fisiológicos y patológicos. Distintos elementos regulan la angiogénesis en el ovario y otros tejidos. Entre ellos, el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) y el factor de crecimiento transformante beta (TGF[beta]) han sido asociados a eventos importantes en la angiogénesis ovárica fisiológica y patológica. El factor de crecimiento nervioso (NGF) también se ha relacionado con angiogénesis en otros tejidos, como el ganglio cervical superior en ratas neonatas. Además este factor gatilla la proliferación de células endoteliales humanas. NGF, a través de sus receptores trkA y p75, ejerce acciones esenciales tanto en el desarrollo ovárico como en la función del ovario. De hecho, NGF está presente en el ovario humano desde la etapa fetal. Sin embargo, se desconoce si NGF participa en la angiogénesis ovárica. Por otra parte, NGF modula la expresión de TGF[beta]1 y VEGF en distintos tipos celulares, pero tampoco se sabe si en el ovario dicha expresión es regulada por esta neurotrofina. En esta Tesis se propuso estudiar la participación de NGF como factor angiogénico en el ovario, y su acción en los niveles de proteína y mRNA de los factores VEGF y TGF[beta]1. Para cumplir con este objetivo, se trabajó con ovarios de ratas neonatas cultivados con NGF, ovarios de ratones neonatos NGF-deficientes (NGF KO), ratas prepúberes con niveles ováricos elevados de NGF, inducidos por denervación, y ratones transgénicos prepúberes que sobreexpresan NGF en el ovario. Se analizaron los niveles de mRNA y/o proteína de VEGF y TGF[beta]1 en los ovarios de estos animales. También se cultivaron células de granulosa humana y se estimularon con NGF, para luego determinar los contenidos de mRNA de VEGF y TGF[beta]1 y los niveles de proteína secretada en el medio de cultivo. Los resultados obtenidos en ovario de roedores y en el cultivo de células de granulosa indican que NGF incrementa tanto el mRNA como la proteína de VEGF. Los niveles de TGF[beta]1 no se modificaron por NGF en los modelos estudiados. Con el objetivo de conocer el mecanismo mediante el cual NGF induce los cambios observados en el ovario, se estudió la participación de trkA, el receptor de alta afinidad para NGF. Se analizaron ovarios de ratones neonatos trkA-deficientes (trkA KO). Se determinó que en estos animales el contenido de mRNA de VEGF y TGF[beta]1 es similar al encontrado en ratones silvestres, probablemente por un sistema de compensación que involucra el aumento de la expresión p75, el receptor de baja afinidad para NGF. También se analizó el efecto de K252a, inhibidor del receptor trkA, en células de granulosa humana tratadas con NGF. La preincubación con el inhibidor revirtió en forma significativa el aumento de mRNA y proteína de VEGF inducido por NGF. A continuación, se quiso saber si NGF inducía la activación de MAPK asociadas a la fosforilación del receptor trkA en el ovario, y si la producción del mensajero o proteína de VEGF y TGF[beta]1 dependía de esta vía de señalización. Para estudiar esto se utilizó el modelo de células de granulosa humana en cultivo. Análisis de western blot mostraron que hubo un incremento significativo en la proporción de proteínas ERK 2 fosforiladas respecto de ERK 2 totales, luego de 5 minutos de estimulación con NGF. Además, el incremento en la expresión de mRNA y proteína de VEGF fue prevenido por la incubación previa con U0126, un inhibidor de la proteína MEK, responsable de la fosforilación de ERK 1/2. El factor de transcripción HIF1 es uno de los responsables de la activación transcripcional de VEGF como respuesta a la hipoxia, pero también frente al estímulo con factores de crecimiento. No se produjo un cambio en el contenido de mRNA de la isoforma inducible de HIF1, HIF1[alfa] en células de granulosa humana estimuladas con NGF 50 ng/ml por 8 horas. Sin embargo, en ovario de rata neonata en cultivo, el contenido de mRNA de HIF1[alfa] aumenta en los tejidos estimulados con NGF por 2 horas. Finalmente, se quiso verificar si existían acciones indirectas de NGF sobre la proliferación de células endoteliales, a través del aumento en los niveles de VEGF. Para esto se realizó un ensayo de angiogénesis in vitro, en el cual el medio condicionado de células de granulosa tratadas con NGF se utilizó para estimular células endoteliales provenientes de cordón umbilical humano (células HUVEC). El medio condicionado no indujo mayor proliferación de células endoteliales, probablemente debido a que la concentración de VEGF en éste era muy baja para estimular la proliferación en las células HUVEC. Sin embargo, es muy importante destacar que estudios in vivo realizados en ratas con niveles ováricos elevados de NGF, inducidos por denervación, y en ratones transgénicos que sobreexpresan NGF en el ovario, demostraron que esta neurotrofina es capaz de incrementar la vascularización en ovario de roedores prepúberes. Los resultados aquí reportados no permiten establecer si el efecto de NGF sobre la vascularización ovárica es una consecuencia del aumento de VEGF. La señalización de NGF es esencial para la ovulación. Por otra parte, se produce un marcado aumento de la expresión ovárica de VEGF en la etapa periovulatoria. Los resultados presentados indican que NGF es capaz de aumentar la expresión de VEGF y la vascularización ovárica. De acuerdo con lo anterior, existiría una asociación entre el alza periovulatoria de NGF, y el aumento de VEGF y de los capilares ováricos. Esto podría tener importantes aplicaciones en el área de la medicina reproductiva y las terapias contra el cáncer, ya que amplía la información acerca de los elementos reguladores de la angiogénesis en el ovario.

Memoria para optar el título de Bioquímico / El síndrome de ovario poliquístico (SOP) es una patología endocrino metabólica que afecta entre el 5% - 10% de mujeres que se encuentran en período reproductivo. Un número elevado de estas mujeres son infértiles, acentuando además la posibilidad de desarrollar hiperplasia y cáncer endometrial. Dentro de las mujeres que presentan SOP, existe un alto porcentaje de ellas que son obesas u obesas mórbidas. En este contexto, se sabe que la adiponectina, una adipoquina marcadora de la obesidad, es secretada principalmente por los adipocitos, y juega un rol importante dentro de la señalización celular, activando a los receptores AdipoR1 y AdipoR2 en diversos tejidos del organismo. La hormona adiponectina juega un papel fundamental en el metabolismo de la glucosa y ácidos grasos contribuyendo a la homeostasis energética de los tejidos sensibles a insulina. Además, se ha detectado un efecto anti-neoplásico de la adiponectina, y se han reportado que bajos niveles de adiponectina aumentan el riesgo de cáncer de mama, endometrio y próstata. En cuanto a los componentes de la vía de señalización, APPL1 es una proteína adaptadora que transduce la señal inducida por la activación de los receptores de adiponectina. La mayoría de estos antecedentes experimentales han sido generados de estudios en el tejido adiposo y en líneas celulares de adipocitos. Sin embargo, se ha reportado en células C2H2 de musculo esquelético que la unión de APPL1 a receptores de adiponectina estimula la activación de la isoforma α de p38-MAPK a través de las quinasas TAK1/MKK3. Por otro lado, se ha reportado que en mujeres con obesidad, las concentraciones de adiponectina disminuyen a nivel sérico. Debido a estos antecedentes que la hipótesis propuesta en este estudio es: “La condición SOP sumada a la obesidad promueve una inhibición de la vía de señalización de adiponectina en endometrios de estas mujeres, disminuyendo la activación de APPL1-TAK1- MEK3-p38 MAPK”. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar si las condiciones endocrinometabólicas de las pacientes con SOP más la condición de obesidad, modifican la expresión y/o activación de moléculas de la vía de señalización de adiponectina. Para llevar a cabo este estudio, se consideró la obtención de sangre y endometrios de cuatro grupos experimentales (mujeres delgadas, mujeres delgadas con SOP, mujeres con obesidad, mujeres con obesidad y SOP). Los resultados en tejido endometrial mostraron la presencia de adiponectina y sus receptores en este tejido, los cuales no presentaron diferencias significativas entre los grupos de estudio. En relación a moléculas de la vía de señalización de adiponectina, como APPL1, pTAK1 y pMEK3, sus niveles proteicos se encuentron disminuidos en condiciones de obesidad y SOP, a partir de estos datos podemos inferir que la vía de señalización activada por Adiponectina estaría disminuida en estas condiciones. Los niveles de α-p38MAPK, no mostraron una disminución en condiciones de obesidad y SOP, como se esperaba. Por el contrario, en estas mujeres la activación de α-p38MAPK estaba aumentada. Lo anterior puede ser posible ya que la literatura nos indica que esta MAPK puede estar aumentada por condiciones de estress o un ambiente inflamatorio constante, como es el caso de las mujeres SOP con obesidad. Esto podría inducir a otras MAPK a la estimulación de α-p38MAPK, sin embargo esta activación no estaría dada por el estímulo de adiponectina a través de la vía de señalización en estudio. Por último, se evidenció la concentración proteica y génica de NF-κB, el cual puede ser activado por α-p38MAPK. Los resultados se relacionan con los expresados anteriormente. La activación de NF-κB estaba aumentada en condiciones de obesidad y SOP, manifestado por el mayor porcentaje de núcleos positivos en condiciones de obesidad y SOP en comparación a los demás grupos experimentales. En consecuencia, no existe evidencia previa de esta vía de señalización en tejido endometrial y en condiciones de obesidad y SOP. Por lo tanto, la relevancia de este estudio radica en que esta vía podría tener importancia para la mantención de las condiciones óptimas del endometrio, es decir, mantener una homeostasis energética esencial para el correcto funcionamiento de este tejido / Polycystic Ovary Syndrome (PCOS) is an endocrine metabolic disease that affects between 5% - 10% of women in reproductive period. A large number of these women are infertile, with increased possibility of developing endometrial hyperplasia and cancer. Also, a high percentage of women with PCOS, are obese or obese morbid. In this context, it is known that adiponectin, an adipokine marker of obesity, is mainly secreted by adipocytes and plays an important role in cell signaling, activating the AdipoR1 and AdipoR2 receptors in various tissues. Adiponectin hormone plays a key role in the metabolism of glucose and fatty acids contributing to energy homeostasis in insulin-sensitive tissues. In addition, adiponectin has an anti-neoplas effect and it has been reported that low levels of adiponectin increase breast, endometrial and prostate cancer. As for the signaling pathway component, APPL1 is an adaptor protein that transduces signal upon activation of the adiponectin receptor. Most of these previous studies were generated in adipose tissue and in adipocyte cell lines. However, it has been reported in skeletal muscle cells C2H2 that APPL1 binding to adiponectin receptor after its activation stimulates the α-isoform of p38 MAPK through the TAK1 / kinases MKK3. Furthermore, it has been reported that in women with obesity, serum adiponectin concentration decrease. Therefore, the proposed hypothesis is as follows: “The SOP condition together with obesity promotes inhibition of adiponectin signaling pathway in endometria of these women decreasing activation of APPL1-TAK1-MEK3- p38MAPK". The aim of this study was to assess whether endocrine-metabolic conditions of PCOS besides their obesity status, modify the expression and / or activation of molecules involved in the adiponectin signaling pathway. To conduct this study, blood and endometria from four experimental groups (lean women, lean women with PCOS, obese women, women with obesity and PCOS) were considered. The results showed the presence at the endometrial level of adiponectin receptors in all studied groups, and no significant differences were obtained between groups. Regarding molecules of the signaling pathway, protein levels of Adiponectin, as well as, APPL1, pTAK1 and pMEK3 were reduced in conditions of obesity and SOP. Therefore, it can be infer that Adiponectin signal transduction is abnormal under these conditions. Also, levels of p38MAPK showed a decrease in SOP obesity and conditions, as expected. However, in these women the α-p38MAPK activation was increased. This result could be explained since the literature indicates that MAPK may be increased by stress conditions or constant inflammatory environment, as is the case of obese PCOS women. Therefore, the MAPK stimulation of α-p38MAPK, could be through a pathway different from Adiponectin signaling. Finally, the protein and gene concentration of NF-kB, which can be activated by α- p38MAPK, was evident. The results clearly show that activation of NF-kB is increased in obesity and PCOS conditions, evidenced by the highest percentage of positive nuclei in terms of obesity and PCOS compared to the other experimental groups. Consequently, there is no previous evidence of this signaling pathway in endometrial tissue or in obesity and PCOS conditions, and the relevance of this study is that this pathway might be important for maintaining optimum conditions of the endometrium, that is, normal homeostasis energy essential for the proper functioning of this tissue / Fondecyt

Memoria para optar al título de Bioquímica / La función del ovario es regulada por dos ejes: El Hipotálamo-Pituitaria-Ovario (HPO) y el Sistema Nervioso Simpático (SNS). Hoy se sabe que la regulación ejercida por el SNS, a través del nervio ovárico superior (SON) es tan importante como la vía endocrina regulada por el eje HPO. Es más, durante el envejecimiento reproductivo y en algunas condiciones patológicas, la vía simpática toma un rol protagónico. En la actualidad, la mujer posterga la maternidad hacia el periodo de subfertilidad lo que hace necesario investigar los procesos que ocurren a nivel local en el ovario durante este periodo con el propósito de aumentar el éxito de los programas de fertilización in vitro y/o bien retrasar el inicio de la subfertilidad. En el periodo de subfertilidad la actividad del SNS se encuentra espontáneamente aumentada, lo que se ha correlacionado con alteraciones en el desarrollo folicular y disminución de la fertilidad. En estudios en modelo de rata fértil, donde se induce un aumento de la actividad simpática, se ha demostrado que se altera la funcionalidad ovárica y que la simpatectomía quirúrgica permite revertir este efecto. Por otro lado, se ha demostrado que el ovario de rata fértil, tiene cierta plasticidad, dada por su capacidad de recuperar la inervación a los 28 días después de la simpatectomía. Sin embargo, se desconoce si durante el periodo de subfertilidad (8-12 meses de edad de la rata) el ovario aún conserva esta capacidad. Teniendo en consideración estos antecedentes es que se ha planteado la siguiente hipótesis: “El ovario recupera la inervación simpática después de la simpatectomía bilateral del nervio ovárico superior durante el periodo de subfertilidad de la rata”. El objetivo general de este trabajo fue evaluar la recuperación de la inervación simpática en el ovario en ratas de 5 meses (periodo óptimo de fertilidad) y de 9 meses de edad (periodo de subfertilidad), tras la denervación quirúrgica bilateral del SON. Para ello se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1) Evaluar la recuperación de la inervación simpática mediante la determinación de los niveles de NA y NGF en el ovario a los 14 y 28 días post-simpatectomía, tanto en el período fértil como subfértil y 2) Evaluar la relación entre NGF y E2 en el proceso de reinervación mediante la determinación de los niveles séricos del estrógeno a los 14 y 28 días post-simpatectomía del ovario en período fértil y subfértil. Adicionalmente, se registró el peso y ciclicidad estral de las ratas para evaluar otros posibles efectos de la cirugía. Los resultados mostraron que la denervación no afectó la ciclicidad estral de la rata ni los niveles séricos de E2 determinados a los 14 y 28 días post cirugía, en el periodo fértil y subfértil, pero sí hubo variaciones en el contenido de NA y NGF ováricos, aunque de manera diferencial dependiendo del periodo estudiado. A ambas edades, en los grupos sonx14 (14 días post denervación), se observó una disminución importante en el contenido de NA (cercana al 60 %), sin embargo, mientras el grupo sonx28 de 5 meses de edad recuperó el contenido de la catecolamina en torno al 90%, el grupo de 9 meses de edad sólo recuperó el 60%, en comparación a sus respectivos grupos sham. En cuanto a NGF, en las ratas fértiles se observó una tendencia al aumento en el grupo sonx14, mientras que en las ratas subfértil hubo un aumento significativo en el grupo sonx28. El análisis de los resultados, sugiere que en edad fértil (5-6 meses de edad de la rata), el ovario es capaz de recuperar la inervación y que el proceso tomaría alrededor de 28 días, pero durante el periodo subfértil (9-10 meses de edad de la rata), el ovario responde tardíamente a la denervación, permaneciendo la interrogante de si una eventual reinervación ocurre y en caso de efectuarse si es total o parcial / The function of the ovary is regulated by two axes: The Hipothalamus-Pituitary-Ovary (HPO) and the Sympathetic Nervous System (SNS). Today, it is known that the regulation exerted by the SNS, through the Superior Ovarian Nerve (SON) is as important as the endocrine pathway regulated by the HPO axis. Moreover, during the reproductive aging and in some pathological conditions, the ovarian sympathetic system takes a protagonist role. Currently, women postpone motherhood to the period of subfertility which makes it necessary to investigate the processes that occur at the local level in the ovary during this period in order to increase the success of in vitro fertilization programs and/or delay the onset of subfertility. In the period of subfertility the activity of the SNS is spontaneously increased, which has been correlated with alterations in the follicular development and decrease in fertility. Studies in fertile rat model, where an increase in sympathetic activity is induced, it has been demonstrated that ovarian functionality is altered and the surgical sympathectomy allows to reverse this effect. On the other hand, it has been shown that the fertile rat ovary has a certain plasticity, given its ability to recover the innervation 28 days after the sympathectomy. However, it is unknown if during the period of subfertility (8-12 months of age of the rat) the ovary still retains this capacity. Taking this background into consideration, the following hypothesis has been stated:”The ovary recovers sympathetic innervation after bilateral sympathectomy of the superior ovarian nerve during the period of subfertility in the rat”. The aim of this work was to evaluate the recovery of sympathetic innervation in the ovary in rats of 5 months old (optimal fertility period) and 9 months old (subfertility period), after bilateral denervation of the SON. For this, the following specific objectives were proposed: Determine at 14 (sonx14) and 28 (sonx28) days post-sympathectomy: 1) the recovery of sympathetic innervation by determining the levels of NA and NGF in the ovary and, 2) the possible relationship between NGF and E2 in the reinnervation process by determining the serum levels of the estrogen. Additionally, the weight and cyclicity of the rats were recorded to evaluate other possible effects of the surgery. The results showed that the denervation did not affect the estrous cyclicity of the rat, nor the plasma levels of Estradiol determined at 14 and 28 days after surgery in the fertile and subfertile periods. But there were variations in the content of NA and NGF ovarian, although differentially depending on the period studied. At both ages, in the groups sonx14 (14 days after denervation), a significant decrease in NA content was observed (close to 60%), however while sonx28 group of 5 months old recovered the content of catecholamine around the 90% , the group of 9 months old only recovered the 60% compared to their respective sham groups . As to NGF in the fertile rats a tendency to increase was observed in the sonx14 group, while in the subfertile rats there was a significant increase in the sonx28 group. The analysis of the results suggest that in fertile age (5-6 months of age of the rat), the ovary is able to recover the innervation and that the process would take around 28 days, but during the subfertile period (9-10 months of age of the rat), the ovary responds late to the denervation, remaining the question of whether an eventual reinnervation occurs and if is carried out totally or partially / Fondecyt 1120147

La resistencia a la insulina (RI) ha sido implicada en la carcinogénesis, pero no hay consenso con respecto a su participación en el cáncer de ovario. Realizamos una revisión sistemática y meta-análisis para evaluar la asociación entre RI y cáncer de ovario. MÉTODOS: Se realizaron búsquedas en cinco bases de datos evaluando marcadores de RI y riesgo de cáncer de ovario. Tres investigadores realizaron de forma independiente selección de estudios, extracción de datos y evaluación del riesgo de sesgo. Las asociaciones entre los marcadores de RI y cáncer de ovario se cuantificaron como diferencias de medias (MD) o MD estandarizados (SMD) y sus IC del 95% utilizando modelos de efectos aleatorios. RESULTADOS: Catorce estudios de casos y controles cumplieron con nuestros criterios de inclusión (n = 8130). Había poca información sobre los marcadores de RI, con la excepción del sistema de IGF. El cáncer de ovario se asoció con niveles más bajos de IGF-1 de IGFBP-3. Sin embargo, el cáncer de ovario se asoció con niveles más altos de IGFBP-2 e IGFBP-1. Los análisis de subgrupos según el estado de la menopausia y la edad (≤55 vs> 55y) para IGF-1 e IGFBP-3 mostraron que los subgrupos eran similares, aunque la heterogeneidad se mantuvo alta. CONCLUSIÓN: La evidencia sugiere que los niveles de IGF-1 e IGFBP-3 son más bajos en pacientes con cáncer de ovario. Por el contrario, se encuentran niveles más altos de IGBP-2 e IGBP-1 en pacientes con cáncer de ovario. / BACKGROUND: Insulin resistance (IR) has been implicated in carcinogenesis, but there is no consensus regarding its involvement in ovarian cancer. We performed a systematic review and meta-analysis to evaluate the association between IR and ovarian cancer. METHODS: Searches were conducted in five databases for studies evaluating IR markers (levels of serum insulin, C peptide, insulin growth factor [IGF] 1 and IGF-binding proteins [IGFBPs], homeostatic model assessment insulin resistance, and quantitative insulin-sensitivity check index) and ovarian cancer risk. Study selection, data extraction and an assessment of risk of bias were performed independently by three researchers. The associations between IR markers and ovarian cancer were quantified as mean differences (MDs) or standardized MDs (SMDs) and their 95% CIs using random-effects models. RESULTS: Fourteen case-control studies satisfied our inclusion criteria (n=8130). There was little information on IR markers with the exception of the IGF system. Ovarian cancer was associated with lower IGF-1 levels, and lower IGFBP-3 levels. However, ovarian cancer was associated with higher levels of IGFBP-2 and IGFBP-1. Subgroup analyses by menopausal status and age (≤55 vs >55y) for IGF-1 and IGFBP-3 showed the subgroups were similar, although heterogeneity remained high. CONCLUSION: The evidence suggests that levels of IGF-1 and IGFBP-3 are lower in patients with ovarian cancer. In contrast, higher levels of IGBP-2 and IGBP-1 are found in patients with ovarian cancer. / Tesis

Doctora en Bioquímica / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento hasta diciembre de 2015 / El endometrio es un tejido que requiere de la acción de los esteroides para su correcta función; de modo que patologías que alteren la concentración de esteroides inducen fallas en la fisiología endometrial, como es el caso del Síndrome de Ovario Poliquístico (PCOS). Los endometrios de mujeres con PCOS (PCOSE) presentan un incremento de los procesos de proliferación celular, caracterizados por altos niveles de proteínas ciclina D1, Ki67 y disminución de p27. En este contexto, se sabe que los estrógenos generan efectos pro-proliferativos en el tejido endometrial. Los esteroides pueden ser originados por la metabolización intratisular (origen intracrino) desde precursores como la DHEAS que son convertidos en esteroides con actividad estrogénica y/o androgénica. Para esto se requiere que los precursores sulfatados ingresen a las células a través de transportadores de las familias OATPs y OATs. Además, se necesita la expresión y actividad de enzimas que metabolizan los esteroides. Previamente, hemos reportado que en PCOSE existe un incremento en la metabolización de DHEA a androstenediol, un metabolito con actividad estrogénica. En el presente trabajo se propuso como objetivo general evaluar si el ingreso a la célula de esteroides sulfatados a través de transportadores y su metabolización intracelular está alterado en endometrio de mujeres con PCOS. Además, establecer si esto genera altas concentraciones intracelulares de esteroides que permitan el incremento del proceso de proliferación celular. Para ello, se propuso dos modelos, uno ex vivo y un modelo in vitro con células de la línea T-HESC, St-T1b y células endometriales obtenidas desde cultivo primario. Para el primer objetivo específico se determinó que existe un incremento de los niveles de androstenediol en PCOSE al compararlo con controles (CE) (p=0,002). Además, se evaluó la actividad de la enzima 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD) en los tejidos en estudio, no detectándose diferencias significativas. En el segundo objetivo específico se analizó la expresión y actividad de los transportadores OATP-B, D y E, y OAT4 en el modelo ex vivo e in vitro, por western blot, RT-PCR convencional y ensayo de captación de DHEAS. En el modelo in vitro se utilizó estímulos con androstenediol, testosterona y estradiol. Se determinó que los niveles proteicos de los transportadores OATP-B y OATP-E están incrementados en PCOSE versus CE (p=0,049 y p=0,007, respectivamente). Los ensayos in vitro de la actividad de transportadores nos permitieron determinar que existe un menor ingreso de DHEAS en células estimuladas con testosterona (p=0,02). Los niveles proteicos de OATP-E se ven disminuidos con los estímulos de androstenediol y testosterona (p=0,04 y p=0,04, respectivamente). El tercer objetivo tenía la finalidad de determinar si altas concentraciones de esteroides (androstenediol, testosterona y estradiol) por 48 h modifican los procesos de proliferación celular en células de la línea T-HESC y St-T1b. Para esto se utilizó las técnicas de western blot, inmunocitoquímica y citometría de flujo. Se determinó que estímulos con estradiol y androstenediol incrementan los niveles de ciclina D1 (p<0,05) y disminuyen los niveles del represor de ciclo celular p27 (p<0,05); además, androstenediol aumenta el porcentaje de núcleos positivos a Ki67 en células St-T1b (p=0,05). Por otro lado, el estímulo con testosterona por 48 h disminuye los niveles de Ki67 y de ciclina D1, e incrementa los de p27 (p<0,05). Sin embargo, estos estímulos no modifican el porcentaje de células en las distintas fases del ciclo celular, evaluado por citometría de flujo. Finalmente, con el cuarto objetivo se evaluó los posibles mecanismos involucrados que generarían los cambios en las moléculas reguladoras del ciclo celular dadas en el modelo in vitro. Para eso, mediante la técnica de western blot, se evaluó las vías de MAPK (ERK1/2) y PI3K/Akt, además se utilizó inhibidores de estas vías, antagonistas de receptores de estrógenos y andrógenos, y un inhibidor de RNA polimerasa II. Se determinó que androstenediol es capaz de incrementar los niveles de fosforilación de ERK1/2 y de Akt con los estímulos de 48 h (p<0,05), pero no así con estímulos de 20 min. Por otro lado, testosterona por 48 h disminuye la activación de la vía PI3K-Akt (p<0,05). La utilización de antagonistas de receptores de estrógenos (ICI 182,780 y MPP dihidrocloruro), nos permitió determinar que el efecto sobre p27 y ciclina D1 sería a través del receptor de estrógenos (ER) α (p<0,05). Adicionalmente, los cambios en las fosforilaciones desaparecen cuando está presente un inhibidor de la RNA polimerasa II (α-amanitina) (p<0,05), por lo que probablemente requiere de la transcripción de alguna o algunas proteína/s que permitan los cambios observados en los reguladores del ciclo celular. Para determinar si se requiere las vías de PI3K/Akt ó MAPK (ERK1/2), se utilizó inhibidores de PI3K (LY-194,002) y MEK1/2 (U-0126). La presencia de LY-194,002 inhibe los cambios dados por androstenediol en ciclina D1 y p27 (p<0,05), mientras que U-0126 evita solo el incremento de ciclina D1 dado por androstenediol (p<0,05). Por lo tanto, la fosforilación de Akt sería relevante para la modulación de ambas vías reguladoras del ciclo, mientras que la fosforilación de ERK1/2 sería necesaria solo para ciclina D1. El presente trabajo propone diversas metodologías para caracterizar a través de qué mecanismo se genera el incremento en la proliferación celular presente en PCOSE y el rol que tiene la intracrinología en estas alteraciones, donde androstenediol tendría un rol relevante. Los resultados obtenidos en los estudios in vitro nos permiten concluir que androstenediol potenciaría la proliferación celular, actuando como un estrógeno en nuestro modelo, a través del ER α, y que río abajo se activen las vías de MAPK (ERK1/2) y PI3K-Akt. Esto explicaría, en parte, la desregulación del proceso proliferativo ocurrido en PCOSE y la fisiopatología de la hiperplasia y adenocarcinoma endometrial de alta prevalencia en las mujeres con este síndrome / The endometrium is a tissue that requires the action of steroids for its adequate function; therefore, pathologies altering the concentration of steroids induced endometrial physiology failures, as seen in polycystic ovary syndrome (PCOS). Previous reports have indicated that the endometrium of women with PCOS (PCOSE) show increased cell proliferation processes, characterized by high levels of cyclin D1 protein, Ki67 and p27 decreased. In this context, it is known that estrogens enhance proliferation of endometrial tissue. The intratisular steroid metabolism (intracrine) from precursors such as DHEAS could convert into steroids with oestrogenic and/or androgenic activity. This requires sulfated precursors entering the cells through transporters OATs and OATPs families. Furthermore, expression and activity of steroid metabolizing enzymes is needed. We have previously reported in PCOSE an increased DHEA metabolism to androstenediol, a metabolite with estrogenic activity. In this work, it was proposed as a general objective to evaluate whether DHEAS entry the cell via sulfated steroid transporters and if intracellular metabolism is altered in the endometrium of women with PCOS. Furthermore, to establish whether this generates high intracellular concentrations of steroids that could allow the increased in the cell proliferation process. To achieve this, we proposed two models, an ex vivo and an in vitro cell line model of T-HESC and St-T1b and also, endometrial cells obtained from primary cultures. The results of the first specific objective show a significative increase in PCOSE androstenediol levels compared to controls (EC) (p=0.002). Moreover, no significant differences were detected in the activity of the enzyme 3β-HSD in the tissues under study. In the second objective, the expression and activity of transporters OATP-B, D and E, and OAT4 was tested in the model ex vivo and in vitro, western blot, RT-PCR and conventional DHEAS uptake assay. In the in vitro model, stimuli with androstenediol, testosterone and estradiol were used. It was determined that the protein levels of the transporters OATP-B and OATP-E are increased in CE versus PCOSE (p=0.049 and p=0.007, respectively). In vitro activity of transporters assays allowed us to determine that there is less uptake of DHEAS in testosterone stimulated cells (p=0.02). Protein levels of OATP-E are diminished with androstenediol and stimuli of testosterone (p=0.04 and p=0.04, respectively). The third objective aimed to determine whether high levels of steroid (androstenediol, testosterone and estradiol) for 48 h modified the cell proliferation process in T-HESC and St-T1b cell lines. To achieve this purpose, western blot, immunocytochemistry and flow cytometry techniques were used. It was determined that estradiol and androstenediol stimuli increase levels of cyclin D1 (p<0.05) and lower levels of the cell cycle repressor p27 (p<0.05); additionally, androstenediol increases the percentage of positive nuclei for Ki67 in St-T1b cells (p=0.05). On the other hand, stimulation with testosterone for 48 h affected negatively the levels of Ki67 and Cyclin D1 and positively p27 levels (p<0.05). However, these stimuli do not modify the percentage of cells in the different phases of the cell cycle assessed by flow cytometry. Finally, the fourth objective evaluated some possible mechanisms involved in changes in cell cycle regulatory molecules given in the in vitro model. For this, MAPK (ERK1/2) and PI3K/Akt levels and activity were evaluated by Western blotting. We used inhibitors of these pathways, estrogens and androgens receptors antagonists, and an inhibitor of RNA polymerase II. Androstenediol was able to increase the levels of ERK1/2 and Akt phosphorylation with the stimulus of 48 h (p<0.05), but not with stimuli of 20 min. Moreover, 48 h-testosterone stimulation decreased the activation of the PI3K-Akt (p<0.05) pathway. The use of estrogen receptor antagonists (ICI 182,780 and MPP dihidrocloruro), allowed us to determine that the effect on p27 and cyclin D1 would be through the estrogen receptor α (p<0.05). Additionally, those changes in phosphorylation disappeared when an inhibitor of RNA polymerase II (α-amanitin) was used (p<0.05). These data indicate requirement of transcription or some protein/s that allow the observed changes in cell cycle regulators. To determine whether PI3K/Akt or MAPK (ERK1/2) is required, PI3K (LY-194.002) and MEK1/2 (U-0126) inhibitors were used. The presence of LY-194.002 inhibits changes given by androstenediol in cyclin D1 and p27 (p<0.05), while U-0126 only prevents the increase of cyclin D1 given androstenediol (p<0.05). Therefore, the phosphorylation of Akt could be relevant for both modulation cycle regulatory pathways, while phosphorylation of ERK1/2 would be required only for cyclin D1. This paper proposes several methods to characterize the mechanism involved in the increased cell proliferation observed in PCOSE, where intracrinology has a role in these alterations, particularly androstenediol could have a significant role. The results obtained in the in vitro studies allow us to conclude that androstenediol could enhance cell proliferation, acting as an estrogen in our model, through estrogen receptor α, where MAPK (ERK1/2) and PI3K-Akt pathways are activated. This could explain, in part, the deregulation occurred in PCOSE proliferative process and the pathophysiology of high prevalence of endometrial hyperplasia and adenocarcinoma in women with this pathology / Conicyt Fondecyt

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctor en Ciencias Farmacéuticas / El Síndrome de Ovario Poliquístico (SOP) es una condición familiar, fuertemente apoyada en factores genéticos y ambientales. Bioquímicamente se caracteriza por una secreción alterada de gonadotrofinas, altos niveles de andrógenos libres, insulino resistencia (IR) y un bajo grado crónico de inflamación. Entre las estrategias farmacológicas empleadas en el SOP destaca la metformina, un sensibilizante de la acción de la insulina, que es administrada comúnmente a estas pacientes obteniendo resultados metabólicos favorables. En el año 2005 fue aprobado el uso de metformina en pacientes con SOP embarazadas, ya que en la práctica clínica este fármaco permite mejorar las complicaciones gestacionales propias del SOP. Aunque la fisiopatología del SOP es compleja y pobremente comprendida, se ha sugerido que las mujeres con SOP presentan una actividad simpática aumentada. Modelos de condición quística en ratas dan lugar a una hiperactivación de neuronas simpáticas periféricas que inervan el ovario y a un aumento en la incorporación de Norepinefrina (NE) dentro del mismo, lo que finalmente resulta en el desarrollo y mantención de una condición quística que parece ser reversible si se atenúa la actividad simpática. Un estudio realizado en mujeres con SOP, a las cuales se les midió la actividad simpática del músculo del lecho vascular, mostraron una elevada actividad relacionada positivamente a altos niveles de testosterona. La NE, efector simpático, es un potente mediador de eventos fisiológicos y patofisiológicos en todo el organismo, por lo que su concentración extracelular se encuentra altamente regulada, principalmente por transportadores a nivel de membrana plasmática y a nivel intracelular en la membrana de vesículas de almacenamiento. Estudios en animales y humanos sugieren que el SOP se desarrolla en la vida fetal, por tanto, perturbaciones en el compartimiento materno programan al feto, vía adaptación placentaria y fetal, para desarrollar enfermedades en la vida adulta. Evidencias experimentales indican que la expresión del transportador de NE (NET) a nivel placentario, se encuentra disminuida en enfermedades gestacionales como preeclampsia, de ahí que se ha sugerido una función protectora para NET en placenta. Aunque las mujeres con SOP presentan un alto riesgo de padecer preeclampsia, no existe evidencia de las posibles alteraciones en la expresión de este transportador en placenta de mujeres con SOP. Para resolver nuestra hipótesis de trabajo empleamos muestras de plasma y placenta de término de mujeres con SOP con y sin tratamiento con metformina y mujeres control. Al evaluar los niveles plasmáticos de NE observamos que a las 24 semanas de gestación hubo un significativo incremento en la concentración plasmática de NE en mujeres con SOP que disminuyó significativamente a la semana 35, lo que podría estar dando cuenta de una desregulación en la actividad del sistema nervioso autónomo en estas pacientes durante el embarazo y de posibles mecanismos compensatorios frente a una hiperactividad adrenérgica. El tratamiento con metformina permitió disminuir significativamente los niveles plasmáticos de NE tanto en la semana 24 como 35 de gestación. En placenta de término de gestantes con SOP observamos una marcada disminución de la proteína NET en ambas caras placentarias, que está inversamente relacionada con los niveles de GLUT4. Sin embargo, el tratamiento con metformina restauró los niveles de proteína NET alcanzando niveles aún mayores que las mujeres control sólo en la cara materna placentaria, lo que sugiere que la actividad nerviosa autonómica no solo modifica la exposición fetal a catecolaminas, sino que el hecho de que responda al tratamiento con metformina también sugiere que está relacionada con alteraciones metabólicas asociadas con el síndrome. Por otro lado, componentes río abajo de la señalización del receptor de insulina, IRS1 y GLUT4, se encontraron alterados en placenta de término de pacientes con SOP. Sin embargo, el tratamiento con metformina durante el embarazo permitió corregir estas alteraciones principalmente en la cara materna de la placenta, lo que sugiere que el mejoramiento del estado hiperinsulinémico en la madre permite restablecer parcialmente la homeostasis metabólica placentaria. El conjunto de estos resultados muestra que las mujeres con SOP presentan un componente simpático alterado durante el embarazo, responsable de producir respuestas adaptativas placentarias a nivel de la proteína NET. Dicha respuesta adaptativa en conjunto con las alteraciones en la señalización insulínica placentaria, podrían ser responsables de la perpetuación del fenotipo SOP en la descendencia de estas pacientes. Por otro lado, la metformina ha demostrado ser una herramienta farmacológica útil que permite corregir las alteraciones simpáticas y metabólicas a distintos niveles, presentes en pacientes con SOP embarazadas, apareciendo como un agente integrador de patologías que involucran componentes metabólicos, circulatorios y neuroendocrinos / Polycystic Ovary Syndrome (PCOS) is a familial status, strongly supported by genetic and environmental factors. Biochemically characterized by an altered secretion of gonadotropins, high levels of free androgens, insulin resistance (IR) and chronic low -grade inflammation. Among the pharmacological strategies employed in PCOS stands metformin, sensitizer of insulin action, which is commonly administered to these patients obtaining favorable metabolic results. In 2005 was approved the use of metformin in pregnant patients with PCOS because in clinical practice this drug improves pregnancy complications of PCOS. Although the pathophysiology of PCOS is complex and poorly understood, it has been suggested that women with PCOS have increased sympathetic activity. Models of cystic condition in rats leading hyper activation to peripheral sympathetic neurons innervating the ovary and an increase in the uptake of norepinephrine (NE) therein, which ultimately results in the development and maintenance of a cystic condition that seems reversible if sympathetic activity is attenuated. A study in women with PCOS, to which muscle sympathetic activity of the vascular bed were measured, showed high sympathetic activity positively related to high levels of testosterone. The NE, sympathetic effector, is a potent mediator of physiological and pathophysiological events throughout the organism, so its extracellular concentration is highly regulated, primarily at the level of conveyor plasma membrane and intracellular level in the membrane of storage vesicles. Studies in animals and humans suggest that PCOS is developed in fetal life, therefore, disruptions in the maternal compartment programming to the fetus, via the placenta and fetal adaptation, for developing diseases in adulthood. Evidence indicates that expression of the NE transporter (NET) to placental level is decreased in gestational diseases as preeclampsia, there has been suggested a protective function for NET in placenta. Although women with PCOS are at high risk for preeclampsia, there is no evidence of possible alterations in the expression of this transporter in placenta of women with PCOS. To solve our working hypothesis, we use plasma samples and term placenta of women with PCOS with or without treatment with metformin and control women. In assessing plasma levels of NE we note that at 24 weeks of gestation was a significant increase in the plasma concentration of NE in PCOS women and then decreased significantly at week 35, which could account for deregulation in activity of autonomic nervous system in these patients during pregnancy and compensatory mechanisms against adrenergic hyperactivity. Metformin allowed significantly decrease plasma levels of NE in both 24 and 35 week of gestation. In term placenta of pregnant PCOS women we observed a marked decrease in NET levels in both placental faces and is inversely related to levels of GLUT4. However, metformin restored levels of NET protein reaching even higher levels than control women only in placental maternal face, suggesting that the autonomic nervous activity not only modifies fetal exposure to catecholamines, but the fact to respond to treatment with metformin also suggests that it is related with metabolic disorders associated with this syndrome. On the other hand, we found altered levels of downstream components of the insulin receptor signaling, IRS1 and GLUT4. However, treatment with metformin during pregnancy was able to correct these alterations mainly in the maternal side of the placenta, suggesting that the improvement of hyperinsulinemic state in the mother can partially restore the placental metabolic homeostasis. All of these results shows that women with PCOS have a sympathetic component altered during pregnancy and it is responsible for producing adaptive responses in placental protein NET. Such adaptive response in conjunction with alterations in placental insulin signaling could be responsible for the perpetuation of PCOS phenotype in the offspring of these patients. Furthermore, metformin has proven be a useful pharmacological tool to correct the sympathetic and metabolic alterations at different levels, present in PCOS pregnant woman, appearing as an integrator agent for pathologies involving metabolic, circulatory and neuroendocrine components / FONDECYT 1090036; FONDECYT 1110864

Magíster en biología de la reproducción / El Síndrome de Ovario Poliquístico (SOP), es una disfunción endocrino-ginecológica de alta prevalencia en mujeres en edad fértil (5 al 10%). Se estima que el 64% de estas pacientes pueden presentar hiperandrogenismo e hiperinsulinemia. Antecedentes de literatura sugieren que elevados niveles de andrógenos e insulina conducirían a una desregulación en la señalización de FSH, lo que explicaría en parte la disfunción en los procesos de esteroidogénesis y angiogénesis en el SOP. Las vías de señalización activadas por FSH no han sido completamente dilucidadas en esta patología, por esto su evaluación podría contribuir a explicar la disfunción en el desarrollo folicular de las mujeres con SOP. La hipótesis de este trabajo propone: “FSH activa las vías de señalización PKA, MAPK, PI3K y PKC modulando la esteroidogénesis y el potencial angiogénico en células de la granulosa luteinizadas humanas. El efecto estimulatorio de FSH sobre las vías de señalización esta desregulado en las células de la granulosa luteinizadas cultivadas en condiciones hiperinsulínicas e hiperandrogénicas, disminuyendo la esteroidogénesis y aumentando la angiogénesis”. Este estudio se realizó en células de la granulosa (CG) provenientes de mujeres normales que participan del Programa IVF debido a infertilidad por factor masculino exclusivo. Las CG, fueron cultivadas en medio control y en medio hiperinsulínico e hiperandrogénico (medio I+T), y estimuladas con FSH a diferentes tiempos. Los resultados muestran que FSH estimula la fosforilación de las vías PKA y MAPK, y la secreción de progesterona, las cuales disminuyeron significativamente en CG cultivadas en medio I + T comparado con el medio control (P<0,05). La presente investigación destaca que el potencial angiogénico y los niveles del factor pro-angiogénico, VEGF, fueron significativamente mayores en CG estimuladas con FSH en medio I + T comparándolas con el medio control (P<0,05). FSH regula el potencial angiogénico, la secreción de VEGF y progesterona, a través de la vía de señalización MAPK, mientras que la vía de señalización PKA, dependiente de FSH, solo estaría regulando la producción de progesterona. Estos resultados sugieren, que el exceso de andrógenos e insulina alteran el microambiente folicular, modificando el efecto de FSH sobre las vías de señalización que regulan la esteroidogénesis y la angiogénesis. / Polycystic Ovarian Syndrome (PCOS) is an endocrine-gynecological dysfunction with high prevalence in fertile women (5 to 10%). It is estimated that 64% of these patients may present hyperandrogenism and hyperinsulinemia. Is believed that high levels of androgens and insulin would lead to deregulation of FSH signaling. This notion could explain a dysfunction in the processes of steroidogenesis and angiogenesis in PCOS. The signaling pathways activated by FSH have not been completely elucidated in this pathology, therefore its evaluation could contribute to explain the dysfunction in the follicular development of women with PCOS. The hypothesis of this work was: "FSH activates the signaling pathways PKA, MAPK, PI3K and PKC that are involved in steroidogenesis and angiogenic potential in human luteinized granulosa cells. The FSH stimulatory effect on signaling pathways is deregulated in luteinized granulosa cells cultured under hyperinsulinic and hyperandrogenic conditions, decreasing steroidogenesis and increasing angiogenesis ". This study was performed on granulosa cells (GC) collected from normal women participating in the IVF Program due to exclusive male factor infertility. GC, were cultured in control medium and in hyperinsulinic and hyperandrogenic medium (I + T medium), and stimulated with FSH at different times. The results show that FSH stimulates phosphorylation of the PKA and MAPK pathways, and progesterone secretion, which decreased significantly in GC cultivated in I + T medium compared to the control medium (P <0.05). Interestingly, angiogenic potential and VEGF, pro-angiogenic factor levels, were significantly higher in GC stimulated with FSH in I + T medium compared to the control medium (P <0.05). FSH regulates the angiogenic potential, secretion of VEGF and progesterone through the MAPK signaling pathway, whereas the PKA signaling pathway, FSH dependent, only regulates the production of progesterone. These results suggest that excess androgens and insulin alter the follicular microenvironment, modifying the effect of FSH on the signaling pathways that regulate steroidogenesis and angiogenesis.