Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Mestrado em Biologia - ICB-UFG - Rodrigo Santos.pdf: 3002708 bytes, checksum: 4989a790c4cb26bc50f51abf0c8cfe16 (MD5) Previous issue date: 2009-05-29 / The fungus Paracoccidioides brasiliensis is a human pathogen with a wide distribution in Latin America. The fungus causes paracoccidioidomycosis when mycelia reachs the lungs. The success of the infection depends on the acquisition of essential micronutrients such as copper, which is required as cofactor for a variety of enzymes important in biological in several processes, such as respiration, growth and acquisition of iron. Previous studies, of the Laboratory of Molecular Biology showed that a high affinity copper transporter (PbCTR3) is a molecule highly expressed and probably necessary for the infection establishment of by P. brasiliensis. In the present study were isolated and characterized the genomic and cDNA sequences encoding for PbCTR3 of P. brasiliensis. The cDNA presented 582 base pairs and encodes for a protein with 193 amino acids, predicted molecular mass of 21.5 kDa and pI of 8.6. The genomic sequence has four exons interrupted by three introns. In silico analysis was performed on the database of the structural genome of P. brasiliensis (http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensisMultiHome.html) , where genes involved in maintaining the homeostasis of copper have been identified and used to design of a model of copper homeostasis in P. brasiliensis. The transcriptional behavior of Pbctr3 and genes involved in copper homeostasis were examined during exposure of yeast cells of P. brasiliensis to copper and iron depletion conditions, by real time qRTPCR. It was demonstrated a significant change in transcription lovel those of genes in the absence of copper, as well as in the combined absence of both metals. qRT-PCR was used to analyze the expression of Pbctr3 and Pbcrp (which encodes a protein responsive to copper) in yeast cells of P. brasiliensis derived from infected lungs and spleen at different time points of infection. The expression of Pbctr3 and Pbcrp was super-regulated during experimental infection. Taken together, these data suggest the importance of PbCtr3 and of absorbing copper / iron during the infectious process / O fungo Paracoccidioides brasiliensis é um patógeno humano com ampla distribuição na América Latina. O fungo causa a paracoccidioidomicose quando propágulos da fase miceliana atingem os pulmões do hospedeiro. O sucesso da infecção depende da aquisição de micronutrientes essenciais como o cobre, o qual é requerido como cofator por uma diversidade de enzimas importantes em processos biológicos essenciais, tais como: respiração, crescimento e aquisição de ferro. Estudos prévios, do Laboratório de Biologia Molecular, demonstraram que um transportador de cobre de alta afinidade (PbCTR3) é uma molécula altamente expressa e provavelmente necessária para o estabelecimento da infecção por P. brasiliensis. No presente estudo foram isoladas e caracterizadas as seqüências genômica e do cDNA que codificam para PbCTR3 de P. brasiliensis. O cDNA apresentou 582 pares de bases e codifica para uma proteína com 193 aminoácidos, massa molecular predita de 21,5 kDa e pI de 8.6. A seqüência genômica apresenta quatro exons interrompidos por três introns. Análises in silico foram realizadas no banco de dados do genoma estrutural de P. brasiliensis (http:www.broad.mit.edu/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/ MultiHome.html), onde genes envolvidos na manutenção da homeostase de cobre foram identificados e as seqüências utilizadas para a elaboração de um modelo de fatores envolvidos na manutenção da homeostase de cobre por P.brasiliensis. O comportamento transcricional do gene Pbctr3 e de genes envolvidos na manutenção da homeostase de cobre foram analisados durante a exposição de células leveduriformes de P. brasiliensis em condições de depleção de cobre e ferro por qRT-PCR em tempo real. Foi demonstrada uma alteração significativa no nível de transcrição dos genes na ausência de cobre, assim como na ausência combinada dos dois metais. qRT-PCR em tempo real foi utilizado para analisar a expressão de Pbctr3 e de Pbcrp (que codifica uma proteína responsiva ao cobre) em células leveduriformes de P. brasiliensis derivadas de pulmão e baço infectados, em diferentes tempos. A expressão de Pbctr3 e Pbcrp foi super-regulada durante a infecção experimental. Tomados em conjunto, esses dados sugerem a importância de Pbctr3 e do sistema de absorção cobre/ ferro durante o processo infeccioso

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica, endêmica na América Latina, causada pelo fungo dimórfico térmico Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), cujo principal componente antigênico é a glicoproteína de 43 kDa (gp43). Diferentes formas clínicas podem ser desenvolvidas e estão diretamente associadas com vários graus de depressão da resposta imune celular. Considerando a importância das células dendríticas na interação dos sistemas imune inato e adaptativo, e na ativação de células T \"naive\", no presente trabalho estudamos se células dendríticas interagem com leveduras de P. brasiliensis, assim como seu principal componente antigênico (gp43). Foi demonstrado pela primeira vez que células dendríticas poderiam ser infectadas por leveduras de P. brasiliensis, e esse fungo permaneceu viável após fagocitose. Analisamos por citometria de fluxo a expressão das moléculas de superfície observando diminuição significativa da expressão das moléculas de MHC-II, CD80 e CD54 em células dendríticas quando estas foram incubadas com leveduras da cepa Pb18 ou com gp43. Esse resultado mostrou que a ação do P. brasiliensis em células dendríticas poderia ser mediada pela gp43. Ao analisarmos a síntese de IL-12, observamos diminuição significativa desta interleucina, quando células dendríticas ativadas com LPS, foram cultivadas na presença de leveduras de P. brasiliensis ou gp43. Esses resultados sugerem que a gp43 pode afetar várias funções das células hospedeiras, indicando que esta inibição pode ser usada pelo P. brasiliensis para reduzir a eficiência da resposta imune, facilitando assim o estabelecimento da infecção primária indivíduos suscetíveis. / Paracoccidioidomycosis, endemic in Latin America, is a progressive systemic mycosis caused by dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, where the major antigenic component is a glycoprotein of 43kDa (gp43). The infection can evolve to different clinical forms that are associated to various degrees of suppressed cell-mediated immunity. The role of dendritic cells (DCs) in P.brasiliensis infection has never been investigated. With the recognition that DCs are able to initiate response in naïve T cells and that they also participate in Th cell education the present study was undertaken to understand whether DCs interact with P. brasiliensis or gp43, as well as to elucidate possible mechanisms and consequences of this interaction. In the present report, it was demonstrated for the first time that DCs could be infected by P. brasiliensis and survive. Our results indicate that P. brasiliensis infection and purified gp43 lead to down-regulation of MHC-II and adhesion properties of immature DCs. The down-regulation was also observed in LPS-induced DCs maturation, where the expression of MHC-II, CD80, CD54 and CD40 were significantly inhibited in the presence of P. brasiliensis or gp43. These data show that the actions of P. brasiliensis on DCs could be mediated by gp43. In addition, an inhibition of IL-12 production by gp43 was observed in LPS-induced DC maturation. These results suggest that gp43 affects many functions of the host cells, indicating that this inhibition might be used by P. brasiliensis to reduce the effectiveness of the immune response, thus facilitating the establishment and fate of primary infection in susceptible host.

Nesse trabalho avaliamos a proteção que o anticorpo monoclonal (AcM) contra CMH e contra Hsp60 fornecem aos animais infectados com as leveduras de Paracoccidioides brasiliensis e P. lutzii em modelo profilático. O tratamento com os AcMs de isotipos IgG2a e IgG2b foram protetores, induzindo a secreção das citocinas IL-12p70, IFN-<font face=\"Symbol\">g e TNF-<font face=\"Symbol\">a, padrão de resposta imune Th1. Nós mostramos por imunomarcação que moléculas de CMH e Hsp60 estão acessíveis na célula. E o anticorpo monoespecífico contra CMH e os anticorpos policlonais contra melanina, gerados nesse trabalho foram eficazes nos ensaios in vitro de proteção. Foram gerados anticorpos monoclonais contra glicoproteina extraída de Pb18, o AcM reconheceu, por imunomarcação, estruturas internas e a parede celular da levedura. Avaliamos um novo modelo de hospedeiro, com o uso da larva Galleria mellonella, o que pode servir de triagem e reduzir desta forma o uso excessivo de camundongos, as leveduras P. lutzii e H. capsulatum são letais para as larvas e evocam resposta celular que se organizam semelhante a um granuloma. / In this work we evaluated the protection that the monoclonal antibody (MAb) against Hsp60 and against CMH provides the animals infected with the yeast Paracoccidioides brasiliensis and P. lutzii in prophylactic model. The treatment with the MAbs of IgG2a and IgG2b isotypes were protective, inducing the secretion of IL-12p70, IFN-<font face=\"Symbol\">g and TNF-<font face=\"Symbol\">a, Th1 pattern of immune response. We show by immunogold that Hsp60 and MHC molecules are accessible on the cell. And the monospecific antibody against HCM and polyclonal antibodies against melanin, generated in this study were effective in in vitro assays of protection. Monoclonal antibodies were generated glycoprotein extracted from Pb18, Mab recognized by immunogold, internal structures and cell wall material. Evaluated a new type of host, using the larvae Galleria mellonella, which can serve as a screening and reduce thus the overuse of mice, yeast P. lutzii and H. capsulatum are lethal to larvae and evoke cellular responses that are organized like a granuloma.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides - P. brasiliensis ou P. lutzii. A alta incidência da PCM no Brasil, somada à gravidade que o quadro clínico pode assumir e ainda à ausência de um antifúngico de baixa toxicidade para tratamento de curta duração, motivaram a avaliação de adjuvantes e caracterização dos componentes antigênicos de P. brasiliensis em um modelo imunoterapêutico de PCM. Assim, inicialmente, avaliou-se o efeito de monofosforil lipídeo A (MPLA) de Salmonella minnesota, PAM3CSK4, hidróxido de alumínio e AS04 em camundongos cronicamente infectados com P. brasiliensis. Quando camundongos da linhagem BALB/c foram infectados pela via intratraqueal com 3 × 105 leveduras de P. brasiliensis, tratados no dia 20 após a infecção com um dos adjuvantes e analisados 30 dias após a administração do tratamento, observou-se que MPLA, ao contrário dos outros adjuvantes, induziu (1) uma redução significativa no número de unidades formadoras de colônias (UFC), (2) uma expressiva diminuição no número de granulomas e células fúngicas no tecido pulmonar e (3) uma resposta imunológica protetora (Th1) quando comparado aos animais controle tratados com PBS. Quanto ao rastreamento de antígenos de P. brasiliensis candidatos a agentes terapêuticos, evidenciou-se que as frações proteicas da preparação de exoantígenos (ExoAg) eram as mais promissoras. Dentre essas frações, a que continha o ExoAg majoritário diidrolipoil desidrogenase induziu maior porcentagem de proliferação de linfócitos T CD3+ esplênicos de camundongos infectados e tratados com MPLA. O gene de diidrolipoil desidrogenase foi clonado em vetor de expressão e a proteína recombinante produzida, purificada e utilizada no protocolo terapêutico da PCM experimental. Surpreendentemente, a administração terapêutica de diidrolipoil desidrogenase recombinante induziu uma redução significativa na contagem de UFC dos animais infectados cronicamente com P. brasiliensis, mesmo na ausência de adjuvantes, o que não foi observado quando foi administrada a preparação de ExoAg nos animais. A localização subcelular de diidrolipoil desidrogenase, por microscopia eletrônica de transmissão, utilizando anticorpos policlonais de camundongos contra essa proteína, mostrou que a mesma está localizada na mitocôndria e também no citoplasma. A análise da expressão gênica diferencial de diidrolipoil desidrogenase em P. brasiliensis mostrou que essa proteína é significativamente mais expressa em leveduras em comparação a hifas e formas de transição. Em conclusão, nossos resultados mostram os efeitos benéficos de MPLA na PCM experimental e sugerem que diidrolipoil desidrogenase é um alvo terapêutico potencial para o tratamento da PCM. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides - P. brasiliensis and P. lutzii. The high incidence of PCM in Brazil, added to the severity of the disease and the absence of an antifungal that brings together low toxicity and short-term treatment, led us to evaluate adjuvants and characterize antigenic components of P. brasiliensis that could be used as immunotherapy in an experimental model of PCM. In this work, firstly, we evaluated monophosphoryl lipid A (MPLA) from Salmonella minnesota, PAM3CSK4, aluminum hydroxide and AS04 in mice chronically infected with P. brasiliensis. When mice were infected intratracheally with 3 × 105 P. brasiliensis yeasts, treated with one of the adjuvants or vehicle on day 20 postinfection, and analyzed 30 days after the treatment, we observed that MPLA, unlike other adjuvants, induced (1) a significant reduction in the number of colony forming units (CFU) in the lungs of the mice, (2) an expressive decrease of granulomas and yeast cells in lung tissue, and (3) a more protective immune response (Th1) when compared with the control mice. Concerning to detection of antigens for PCM therapy, we noticed that among the fractions of a preparation of exoantigens (ExoAg), the one containing the protein identified as dihydrolipoyl dehydrogenase induced a high percentage of proliferation of splenic CD3+ T lymphocytes from mice infected and treated with MPLA. The gene of dihydrolipoyl dehydrogenase was cloned into expression plasmid vector, and the recombinant protein produced, purified and used in the therapeutic protocol of experimental PCM. Surprisingly, the therapeutic administration of recombinant dihydrolipoyl dehydrogenase, but not ExoAg preparation, induced a significant reduction in fungal load in the animals chronically infected with P. brasiliensis, even in the absence of adjuvants. Immunogold labeling and transmission electron microscopy revealed that the dihydrolipoyl dehydrogenase is localized in mitochondria and cytoplasm of P. brasiliensis. The differential expression of dihydrolipoyl dehydrogenase gene in P. brasiliensis showed that yeast had an expression more significant than hyphae, with an intermediate level of gene expression in the transitional forms. In conclusion, our results show that MPLA and dihydrolipoyl dehydrogenase are potential therapeutic targets for the treatment of PCM due to their beneficial effects in a therapy model of PCM.

Diversos dados na literatura têm demonstrado a participação de linfócitos B-1 em diferentes fenômenos imunológicos, tanto na resposta imune inata quanto na resposta imune adaptativa. Para melhor entendermos a ativação da resposta imune eficaz contra fungos patogênicos, pesquisamos a interação entre os linfócitos B-1 e o Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), uma vez que este expressa moléculas antigênicas que podem ser reconhecidas pelo sistema imune. Utilizamos preparação antigênica do P. brasiliensis obtida de sua superfície leveduriforme denominada de CFA (antígeno livre da parede do fungo) e células leveduriforme do fungo. Observou-se que a maioria das células do sobrenadante da cultura celular de 4 dias de células totais aderentes peritoneais eram constituídos por linfócitos B-1; estas células expressam altos níveis de MHC-II (100%) e CD80 (90%). Contudo, não houve expressão significativa da molécula co-estimuladora CD86. Pela análise fenotípica, os linfócitos B-1 podem atuar como células apresentadoras de antígeno pois expressam CD80, CD86 e MHC-II; então realizamos o ensaio de proliferação celular utilizando linfócitos B-1 como células apresentadoras de antígenos e observamos proliferação celular de linfócitos TCD4+ significativa. Em relação às citocinas, analisamos a secreção de IL-10 e TNF-&#945; do sobrenadante da cultura de linfócitos B-1 sem nenhum estímulo e observamos que estas células secretam tanto IL-10 quanto TNF-&#945;; após estímulo de CFA, os valores aumentam significantemente. Analisamos a expressão de TLR-2, TLR-4, MyD88 e IL-10, por RT-PCR, dos linfócitos B-1 na presença de CFA. Encontramos expressão de TLR-2, MyD88 e IL-10 nas células com e sem estímulo. Analisamos a migração dos linfócitos B-1 da cavidade peritoneal de camundongos BALB/c após estímulo intraperitoneal (ip) com leveduras de PB. Decorridas 5 horas, foi observada grande diminuição dos linfócitos B-1 na cavidade peritoneal, que permanecia por 24 horas e 7 dias pós-infecção. Para melhor compreendermos a migração dos linfócitos B-1, foram utilizados camundongos CBA/N Xid (desprovidos de linfócitos B-1), cujo o peritônio foi reconstituído com linfócitos B-1, sendo infectados ip com leveduras de P brasiliensis. Os resultados demonstram que, após a infecção, os linfócitos B-1 migram da cavidade peritoneal para o baço. Também, observou-se aumento no número de células T com fenótipo de célula regulatória (CD4+CD25+Foxp3+). Nossos resultados sugerem que a elevada produção de IL-10 por células B-1, mediada provavelmente pela ligação de TLR-2, juntamente com a capacidade dos linfócitos B-1 em ativar linfócitos T, com a capacidade de migrar do peritônio para o baço e ativar células T regulatórias, poderia favorecer a sobrevivência do fungo no hospedeiro. / Innumerous data published in the literature have shown the involvement of B-1 cells in different immunological phenomena, both in the innate immnune response and the adaptive immune response. To better understand the activation of effective immune response against pathogenic fungi, we researched the interaction between B-1 cells and Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), since it expresses that antigenic molecules can be recognized by the immune system. We used antigenic preparation of P. brasiliensis obtained from the surface of yeast called CFA (cell free antigen) and yeast cells of the fungus. It was observed that most cells in the cell culture supernatant 4 days of total adherent peritoneal cells consisted of B-1 cells, these cells express high levels of MHC-II (100%) and CD80 (90%). However, no significant expression of co-stimulatory molecule CD86 was observed. After phenotypic analysis, the B-1 cells can act as anyigen-presenting cells because they express C80, CD86 and MHC-II, then realized proliferation assay using B-1 cells as antigen presenting cells inducing was performed, and our results showed the significant proliferation of CD4 T cells. Regarding cytokines, we analyzed the IL-10 secretion and TNF-&#945; in culture supernatant of B-1 cells without stimulation and found that these cells secrete both IL-10 and TNF-&#945;, after stimulation of CFA. We analyzed the expression of TLR-2, TLR-4, MyD88 and IL-10 by RT-PCR, of the B-1 cells in the presence of CFA. We found expression of TLR-2, MyD88 and IL-10 cells with and without stimulus. We analyzed the migration of peritoneal B-1 cells after intraperitoneal (ip) infection with yeast from P. brasiliensis. After 5 hours, high decrease of B-1 cells in the peritoneal cavity was observed, which remained for 24 hours and 7 days post-infection. To better understand the migration of B-1 cells, we used mice CBA/N Xid (destitute of B-1 cells), reconstituted with B-1 cells, and infected with yeast P. brasiliensis. The results show that after the infection, the B-1 cells migrate from the peritoneal cavity to the spleen. Also, there was an increase in the number of T cells with regulatory cell phenotype (CD4+CD25+Foxp3+). Our results suggest that high production of IL-10 by B-1 cells, probably mediated by the binding of TLR-2, along with the ability of B-1 cells in activating T lymphocytes, with the ability to migrate from the peritoneum to the spleen and activate T regulatory cells, could favor the survival of the fungus in the host.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 patricia de sousa.pdf: 7071029 bytes, checksum: 82c8213b4442879d206467555a97c3c4 (MD5) Previous issue date: 2010-01-29 / Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic disorder geographically restricted to Central and South America, and one of the most important endemic mycoses in these regions, especially among the male rural populations. The disease is most likely caused by the inhalation of asexual spores (conidia) produced by the mycelia form of the fungus, propagules that once in the lungs undergo differentiation towards the parasitic yeast form. The cell wall of P. brasiliensis is a dynamic structure, essentially composed of branched glucan (&#946;-1,3 and &#946;-1,6 glucans), chitin, lipids and mannoproteins. Many enzymes are responsible for cell wall remodeling. One of them is the Beta-1,3- glucanosyltransferase 2 (PbGel2p) presented here. The amino acid deduced sequence of PbGel2p presented similarity to others proteins involved in fungal cell wall biosynthesis and morphogenesis and it was characterized as a member of GH72 family, GH72_ subfamily. The recombinant rPbGel2p was overexpressed in Escherichia coli and the polyclonal antibody was obtained. The PbGel2p mRNA, as well as the protein, were detected at the highest level in the mycelium phase. The potencial role of PbGel2p in cell wall biosynthesis and morphogenesis was analyzed by assessing its ability to rescue the phenotype of the Saccharomyces cerevisiae GAS1&#916;. The results indicated that PbGel2p is a cell wall-associated protein that probably works as a &#946;-1,3-glucan elongase capable of mediating fungal cell wall integrity. In addition, predicted protein-protein interactions between PbGel2p and others proteins of the fungus P. brasiliensis were assessed by using a S. cerevisiae two hybrid system and pull-down assay. The proteins that were found to interact with PbGel2p are: anthranilate synthase component 2 (involved in the tryptophan pathway), MYND domain protein SamB (related to fungal morphogenesis), mitotic spindle checkpoint protein Mad2B (required of the organization of the cytoskeleton and control of cell cycle), G protein complex beta subunit CpcB (organize the cytoskeleton of actin), WD repeat protein (involved in the control of cell cycle), phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase its3 (required of the organization of the actin cytoskeleton), Hsp60 (related of stress conditions like temperature) and ATPase (localized in the plasma membrane / involved in the glucose metabolism). This suggested the relation of PbGel2p in other process to maintenance of cell wall integrity. / Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), prevalente em países da América Central e do Sul sendo considerada uma das mais importantes micoses endêmicas, especialmente entre a população rural masculina. A doença é causada pela inalação dos esporos assexuais (conídios) produzidos pela forma miceliana do fungo. Nos pulmões, os propágulos tendem à diferenciação para a forma leveduriforme parasitária. A parede celular de P. brasiliensis é uma estrutura dinâmica, composta essencialmente por glicanas ramificadas (ligações &#946;-1,3 e &#946;-1,6), quitina, lipídeos e manoproteínas. Muitas enzimas estão envolvidas no seu remodelamento. Uma delas é a Beta-1,3-glicanosiltransferase 2 (PbGel2p), apresentada aqui. A sequência deduzida de aminoácidos de PbGel2p mostrou similaridade com outras proteínas envolvidas na morfogênese e biossíntese da parede celular fúngica e foi caracterizada como parte da família GH72, subfamília GH72_ . A proteína recombinante rPbGel2p foi superexpressa em Escherichia coli e o anticorpo policlonal obtido. Os níveis de transcritos que codificam para PbGel2p, assim como os de proteína, foram detectados em maior teor na fase miceliana do fungo. O papel de PbGel2p na morfogênese e biossíntese da parede celular foi analisado pela habilidade da proteína em resgatar o fenótipo mutante para GAS1&#916; de Saccharomyces cerevisiae. Os resultados indicaram que PbGel2p é uma proteína associada à parede celular que provavelmente atua no alongamento da &#946;-1,3- glicana mediando a integridade da parede celular. Ainda, as interações proteína-proteína preditas entre PbGel2p e outras proteínas de P. brasiliensis usando o sistema de duplo híbrido e pull-down foram: componente 2 da antranilato sintase (envolvida na via do triptofano), proteína SamB com domínio MYND (relacionada com a morfogênese fúngica), proteína Mad2B (requerida na organização do citoesqueleto e controle do ciclo celular), subunidade beta da CpcB (organiza o citoesqueleto de actina), proteína com repetição WD (envolvida no controle do ciclo celular), fosfatidilinositol-4-fosfato-5-quinase (requerida para organização do citoesqueleto de actina), Hsp60 (relacionada à condições de estresse como temperatura) e ATPase (localizada na membrana plasmática/ involvida no metabolismo de glicose). Essas interações sugerem a relação de PbGel2p em outros processos celulares para manutenção da integridade da parede celular.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:25:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 patricia kott.pdf: 7658177 bytes, checksum: ad9ad7831fb8596c7e55d3b1f0eee117 (MD5) Previous issue date: 2010-02-26 / Paracoccidioides brasiliensis is a thermo-dimorphic human pathogenic fungus that lives at 23&#148;C in the mycelium phase (infecting phase) and at 37&#148;C in the yeast phase (parasite phase). In attempt to survive, the cell wall of fungi can change its composition and/or structure in response to environmental stress by compensatory mechanisms. The molecules involved in these mechanisms are possible target for the development of effective antifungal agents. In P. brasiliensis, the main components of the cell wall are glucans and chitin polymers. These polymers make a primary barrier that is responsible for the structural integrity and form of the cell wall. In this work the behavior of P. brasiliensis was evaluated against stress conditions with the aim of study, for the first time, the mechanisms used by this fungus in the maintenance of the cell wall integrity. Our results shown that P. brasiliensis yeast cells are sensitive to cell wall stressors calcofluor white (CFW), congo red (CR), SDS, KCl, NaCl and sorbitol. There was an increase in the PbFKS1 transcripts expression and in the content of cell wall &#946;- 1,3-glicana after treatment with all stressor agents. After treatment with SDS and KCl the PbGFA1 transcripts expression and the cell wall GlcNAc residues also increased. The transcript expression of PbGEL3 was also evaluated being increased after treatment with CFW, NaCl and sorbitol. Thus we showed that these molecules are involved in the maintenance of the cell wall against stress conditions. Apart from these analyses we obtained the active recombinant protein PbFks1pc. Through the anti-PbFks1pc antibody we performed immunocitolocalization assays. These experiments revealed the localization of PbFks1p in regions of apical growth in the mycelium phase and in the cell surface in yeast phase. / Paracoccidioides brasiliensis &#138; um fungo patog&#137;nico e termodim&#130;rfico que se apresenta na forma de mic&#138;lio a 23&#148;C (forma infectante) e na forma de levedura a 37&#148;C (forma parasit&#128;ria). A parede celular de fungos &#138; capaz de alterar sua composi&#131; o e at&#138; mesmo sua estrutura em resposta a condi&#131;&#149;es ambientais de estresse atrav&#138;s de mecanismos compensat&#130;rios. As prote&#133;nas envolvidas nestes mecanismos s o poss&#133;veis alvos para o desenvolvimento de agentes antif&#136;ngicos espec&#133;ficos. Em P. brasiliensis, os principais pol&#133;meros que constituem a parede celular s o glicanas e quitina. Estes pol&#133;meros formam uma barreira prim&#128;ria que &#138; respons&#128;vel pela integridade estrutural e forma da parede celular. Neste trabalho, o comportamento de P. brasiliensis diante de situa&#131;&#149;es de estresse foi investigado com o intuito de estudar, pela primeira vez, os mecanismos utilizados por este fungo na manuten&#131; o da integridade da parede celular. Nossos resultados mostram que c&#138;lulas leveduriformes de P. brasiliensis s o sens&#133;veis aos agentes estressores da parede celular calcofluor white (CFW), congo red (CR), SDS, NaCl, KCl e sorbitol. Houve um aumento na express o de transcritos de PbFKS1 e no conte&#136;do do pol&#133;mero de &#946;-1,3-glicana na parede celular ap&#130;s tratamento com todos os agentes estressores. Ap&#130;s tratamento com SDS e KCl a express o de transcritos de PbGFA1 assim como o conte&#136;do de res&#133;duos de GlcNAc na parede celular tamb&#138;m aumentaram. A express o dos transcritos de PbGEL3 tamb&#138;m foi avaliada estando aumentada ap&#130;s tratamento com CFW, NaCl e sorbitol. Desta forma, mostramos que estas mol&#138;culas est o envolvidas na manuten&#131; o da parede celular diante de situa&#131;&#149;es de estresse. Al&#138;m destas an&#128;lises, a prote&#133;na recombinante PbFks1pc ativa foi obtida. Atrav&#138;s do anticorpo anti-PbFks1pc realizamos ensaios de imunocitolocaliza&#131; o. Estes experimentos revelaram a presen&#131;a de PbFks1p em regi&#149;es de crescimento apical no mic&#138;lio e na superf&#133;cie celular em c&#138;lulas leveduriformes.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese sabrina.pdf: 5211450 bytes, checksum: 0bc9c15d9e2f434943a2738627937629 (MD5) Previous issue date: 2009-03-31 / Paracoccidioides brasiliensis causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis presenting clinical manifestations ranging from mild to severe forms. A P. brasiliensis cDNA expression library was produced and screened with pooled sera from PCM patients adsorbed against antigens derived from in vitro-grown P. brasiliensis yeast cells. Sequencing DNA inserts from clones reactive with PCM patients sera indicated 35 open reading frames presenting homology to genes involved in metabolic pathways, transport, among other predicted functions. The complete cDNAs encoding aromatic L-amino acid decarboxylase (Pbddc), lumazine synthase (Pbls) and a homologue of the high affinity copper transporter (Pbctr3) were obtained. Recombinant proteins PbDDC and PbLS were obtained; a peptide was synthesized for PbCTR3. The proteins and the synthetic peptide were recognized by sera of patients with confirmed PCM and not by sera of healthy patients. Using the vivo-induced antigen technology (IVIAT) we identified immunogenic proteins expressed at high levels during infection. Quantitative real - time RT-PCR demonstrated high transcript levels of Pbddc, Pbls and Pbctr3 in yeast cells infecting macrophages. Transcripts in yeast cells derived from spleen and liver of infected mice were also measured by qRT-PCR. Our results suggest a putative role for the immunogenic proteins in the infectious process of P. brasiliensis. / Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica, prevalente nos países da América Latina. Uma biblioteca de cDNA de expressão de Paracoccidioides brasiliensis foi construída e rastreada com soros de pacientes acometidos por paracoccidioidomicose (PCM). Foram identificados 35 clones de cDNAs que codificam proteínas relacionadas com metabolismo celular, transporte, energia, transcrição, endereçamento de proteínas, transdução de sinal e componentes celulares. Os cDNAs codificantes da L- aminoacido aromatico - descarboxilase (Pbddc), da lumazina sintase (Pbls) e do transportador de cobre de alta afinidade foram obtidos. As proteínas recombinantes PbDDC e PbLS e o peptídio sintético PbCTR3 foram reconhecidos por soros de pacientes com PCM e não reagiram com soros controle. A técnica de IVIAT (tecnologia de antígenos induzidos in vivo) propiciou a identificação de proteínas imunogênicas mais expressas durante o processo infecçioso. RT-PCR em tempo real quantitativa (qRT-PCR) demostrou altos níveis de transcritos de Pbddc, Pbls e Pbctr3 em células leveduriformes infectando macrófagos. O transcritos de células leveduriformes de P. brasiliensis recuperadas de fígado e baço de camundongos foram medidos por qRT-PCR. Estes resultados sugerem o provável papel das proteínas imunogênicas no processo infeccioso de P. brasiliensis.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:10:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Wesley de Almeida Brito.pdf: 6161747 bytes, checksum: 6249a08f73180f831c2df168246efa67 (MD5) Previous issue date: 2009-11-18 / Paracoccidioides brasiliensis is a thermal-dimorphic fungus, the causative agent of Paracoccidioidomycosis (PCM), an important endemic mycosis in Latin America. A protein species preferentially expressed in yeast cells with a molecular mass of 80kDa and isoeletric point (pI) of 7.79 was isolated from the proteome of P. brasiliensis and characterized as an aconitase (E.C. 4.2.1.3). Aconitase is an enzyme that catalyzes the isomerization of citrate to isocitrate in both the Krebs cycle (KC) and the glyoxylate cycle (GC). We report the cloning and characterization of the cDNA encoding the aconitase of P. brasiliensis (PbACO). The cDNA showed a 2337 bp open reading frame (ORF) and encoded a predicted protein with 779 amino acids. A polyclonal antibody against the purified recombinant PbACO was obtained in order to analyze the subcellular localization of the molecule in P. brasiliensis. The protein is present in the extracellular fluid, cell wall, mitochondria, cytosol and peroxisomes of yeast cells as demonstrated by western blot and immunocytochemistry analysis. The expression analysis of the Pbaco gene was performed through quantitative real time RT-PCR and results demonstrated increasing expression during differentiation from mycelium to yeast cells. Real time RT-PCR assays was also used to evaluate the Pbaco expression when the fungus grows on media with acetate and ethanol as sole carbon sources and in different iron levels. The results demonstrated that Pbaco transcript is over expressed in acetate and ethanol as sole carbon sources and in highiron conditions. / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, agente causador de uma importante micose sistêmica na América Latina, a paracoccidioidomicose (PCM). Uma proteína apresentando massa molecular de 80kDa e ponto isoelétrico (pI) de 7,79, preferencialmente expressa em células leveduriformes, foi isolada do proteoma de P. brasiliensis e caracterizada como uma aconitase (EC 4.2.1.3). Aconitase é uma enzima que catalisa a isomerização do citrato em isocitrato tanto no ciclo de Krebs (CK) quanto no ciclo glioxalato (CG). No presente estudo reportamos a clonagem e caracterização do cDNA da aconitase de P. brasiliensis (PbACO). O cDNA apresentou um quadro aberto de leitura (ORF) com 2337 pares de bases, codificando uma predita proteína com 779 resíduos de aminoácidos. Objetivando a localização da aconitase de P. brasiliensis foi produzida e purificada uma proteína recombinante a qual foi utilizada para a produção de um anticorpo policlonal anti-PbACO. A proteína foi localizada no fluído extracelular, parede celular, mitocôndria, citosol e nos peroxissomos de células leveduriformes, como demonstrado por ensaios de Western blotting e por imunocitoquímica. A análise da expressão do gene Pbaco foi realizada através RT-PCR em tempo real e os resultados demonstraram um aumento da expressão durante a diferenciação celular de micélio para levedura. A expressão Pbaco também foi avaliada quando o fungo é cultivado em meios de cultura contendo acetato e etanol como única fonte de carbono bem como em diferentes concentrações de ferro. Os resultados demonstraram que o transcrito de Pbaco é mais expresso em acetato e etanol como única fonte de carbono e em altas concentrações de ferro.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Renata Silva do Prado.pdf: 1314483 bytes, checksum: 0832c7a22af0d5f60e10293a7d47b2d0 (MD5) Previous issue date: 2010-11-20 / The fungus Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomicosys (PCM), the most prevalent human systemic mycosis in Latin America. The toxicity of drugs and the appearance of resistant strains have imposition the search for new therapeutic approaches. Plants with reputed antimicrobial uses represent a rich source for the screening of potential antifungal compounds. In this work, we investigated the inhibitory action of argentilactone, extracted from the essential oil of Hyptis ovalifolia, and its analogues on P. brasiliensis yeast cells, during the differentiation from mycelium to yeast, on native and recombinant PbICL. Sensitivity tests on plates, which assessed the activity of argentilactone on yeast cells of P. brasiliensis showed both argentilactone as reduced argentilactone interfered in fungus growth, affecting the cells in a dose-dependent way. The experiments evaluating the minimum inhibitory concentration (MIC), which evaluated the influence of the compounds during the transition from mycelium to yeast in P. brasiliensis showed that argentilactone and reduced argentilactone interferes in this process, also in a dose-dependent way. A specific activity of isocitrate lyase of the fungus, both recombinant as native, as measured by tests of enzyme activity was also affected by the compounds. The type of inhibition promoted by argentilactone and reduced argentilactone was defined as inhibition of mixed type through tests of enzyme kinetics. Different carbon sources (acetate and glucose) have directly influence on the processs of inhibition. The analogues epoxy argentilactone and diol argentilactone not inhibit the growth and differentiation of P. brasiliensis. In addition, it not inhibited the enzyme isocitrate lyase native or recombinant. / O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), micose humana sistêmica de maior prevalência na América Latina. Devido à toxicidade dos antifúngicos existentes, e ao aparecimento de isolados resistentes, estudos em busca de novas terapias tem adquirido relevância. Plantas com propriedades terapêuticas representam uma fonte em potencial para descoberta de novos antifúngicos. Neste trabalho, foi investigada a influência de argentilactona, extraída do óleo essencial de Hyptis ovalifolia, e seus análogos obtidos sinteticamente sobre células leveduriformes de P. brasiliensis, durante o processo de diferenciação de micélio para levedura e sobre a enzima isocitrato liase recombinate (PbICLr) e nativa. Os testes de sensibilidade em placas, que avaliaram a atividade de argentilactona sobre células leveduriformes de P. brasiliensis, mostraram que tanto argentilactona como argentilactona reduzida interferiram no crescimento do fungo, afetando as células de modo dose-dependente. Os experimentos de avaliação de concentração inibitória mínima (CIM), que avaliaram a influência dos compostos durante a transição de micélio para levedura em P. brasiliensis mostraram que argentilactona e argentilactona reduzida interferem nesse processo, também de modo dose-dependente. A atividade específica da isocitrato liase do fungo, tanto recombinante como nativa, mensurada por testes de atividade enzimática, também foi afetada pelos compostos. O tipo de inibição promovida pela argentilactona e argentilactona reduzida foi definido como inibição do tipo mista, através de testes de cinética enzimática. Diferentes fontes de carbono (acetato e glicose) influenciaram diretamente o processo de inibição. Os análogos epoxi argentilactona e diol argentilactona não inibiram o crescimento de células leveduriformes e o processo de diferenciação de P. brasiliensis. Em adição, também não inibiram a atividade da enzima isocitrato liase recombinante e nativa.