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Avaliação do perfil imunológico e de resistência/susceptibilidade ao óxido nítrico em portadores de leishmaniose cutânea na Terra Indígena Xakriabá, Minas Gerais, Brasil

Gontijo, Raquel Carvalho January 2013 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-06-14T12:31:47Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Raquel Gontijo.pdf: 2958488 bytes, checksum: 8dbc875d07ab2eefcee30117ac6d2fbf (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-14T12:31:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Raquel Gontijo.pdf: 2958488 bytes, checksum: 8dbc875d07ab2eefcee30117ac6d2fbf (MD5) Previous issue date: 2013 / Infecções causadas por Leishmania (Viannia) braziliensisapresentam manifestações clínicas diversas e a leishmaniose cutânea localizada (LCL) é a forma clínica mais comum. Na Terra Indígena Xakriabá, localizada no norte de Minas Gerais, 212 casos autóctones de LCL foram registrados no período de 2001 a 2007. O grande número de casos e as particularidades da área reforçam o interesse de investigar aspectos da resposta imune do hospedeiro em relação à infecção.O óxido nítrico (NO) é um potente agente citotóxico presente na resposta imune anti-Leishmania. Na LCL, um dos mecanismos de produção de NO envolve a ligação de IgE ao receptor CD23 de macrófagos num microambiente de citocinas IFN-γou IL-4. Apesar do papel crucial do NO no curso da infecção, tem sido relatada a existência de isolados de L. (V.) braziliensis resistentes à ação dessa molécula. Assim, os objetivos do presente trabalho foram avaliar por citometria de fluxo, o perfil de expressão do marcador de ativação CD23 e de produção de NO intracelular por monócitose o perfil de expressão das citocinas IFN-γe IL-4 por linfócitos T do sangue periférico de indivíduos não infectados (NI, n=10), Teste de Montenegro positivosem lesão (TM +, n=13) e portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL,n=17), considerando o tempo de evolução da lesão (LCL<60 dias, n=7; LCL>60 dias, n=10). Foi feita também a dosagem dos níveis séricos de IgE dos indivíduos participantes. Além disso, investigou-se a possível presença de L. (V.) braziliensis resistentes/susceptíveis ao NO em isolados de pacientes responsivos (C, n=5) e refratários ao tratamento (FT, n=5) com Glucantime®. Para o estudo imunológico foram realizadas culturas de leucócitos do sangue periférico na ausência (CC) ou presença de formas promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis (LEISH) ou na presença de antígeno solúvel de L. (V.) braziliensis. A dosagem dos níveis séricos de IgE foi feita utilizando-se kit específico baseado na técnica ELISA sanduíche. Para identificação do perfil de resistência dos isolados foram feitos ensaios de viabilidade utilizando-se a técnica do MTT. Os resultados obtidos com o estudo imunológico mostram que o grupo LCL apresentou maior expressão de CD23 e maior produção de NO por monócitos em relação aosgrupos TM + e NI, além de menor expressão de IFN-γe IL-4 por linfócitos T CD4+ em relação ao grupo TM +. Por outro lado, o grupo TM + apresentou aumento relevante no percentual de altoprodutores das citocinas avaliadas, NO e CD23 quando comparadoao grupo NI. Ao dividirmos o grupo LCL por tempo de lesão, observamos no grupo LCL<60 grande frequência de alto produtores de IL-4, NO e CD23, indicando um perfil misto de ativação/modulação da imunidade inata. Os níveis séricos de IgE total foram menores no grupo LCL quando comparado aos grupos NI e TM + , havendo redução do grupo TM + em relação ao grupo NI. Além disso, dos 10 isolados testados, 8 foram resistentes à ação do NO, sendo que, os 2 sensíveis foram provenientes de indivíduos responsivos ao tratamento com Glucantime®. Diante disso, foi possível inferir queo utras fontes celulares, além dos linfócitos T, podem estar envolvidas na produção de citocinas no grupo LCL e que no grupo TM + há forte indício da participação do mecanismo de ativação de monócitos e indução de NO investigado neste estudo, favorecendoo controle da infecção, impedindo assim, o aparecimento de lesões. Além disso, a existência de isolados de L. (V.) braziliensis resistentes à ação do NO corrobora com achados de outros autores e pode estar diretamente relacionada com a resistência à ação do Glucantime®. / Infections caused by Leishmania (Viannia) braziliensis presents many clinical manifestations and localized cutaneous leishmaniasis (LCL) is the most common clinical form. At the Xakriabá Indigenous Land, located in the northern Minas Gerais, 212 autochtone cases of LCL was reported during theperiod of 2001 to 2007. The elevated number of cases and particularities of thearea reinforces the interest to investigate aspects of the host immune response in relation with infection. Nitric oxide (NO) it’s a potent cytotoxical agent present in theanti-Leishmania immune response. In LCL, one of many mechanisms of NO production involves the IgE bind to the macrophages CD23 receptor in a cytokines IFN-γor IL-4 microenvironment. Despite the crucial role of NO in the infection course, hasbeen related the existence of Leishmania (Viannia) braziliensis isolates resistant to NO action. Thus, the aims of this study was evaluate, by flow cytometry, the expression profile of CD23 activation marker and NO production by monocytes, and the expression profile of cytokines IFN-γ and IL-4 by T lymphocytes subpopulations of peripheral blood of noninfected individuals (NI, n=10), Positive Montenegro Skin Test without lesion (TM+, n=13) and patients with Localized Cutaneous Leishmaniasis (LCL, n=17), considering the evolution time of the lesion (LCL<60 days, n=7; LCL>60 days, n=10). Was made too, the seric IgE levels dosage in the participants. Besides this, was investigated the possible presence of the resistant/susceptible L. (V.) braziliensis isolates from responsive (C, n=5) and refractory (FT, n=5) patients to treatment with Glucantime®. For the immunological study, was realized leucocytes cultures of peripheral blood in the absence (CC) or presence of live L. (V.) braziliensis promastigotes/L. (V.) braziliensis soluble antigen (LEISH). The dosage of seric IgE levels was made using a specific kit based on sandwich ELISA technique. For the resistant/susceptible profile investigation, viability assays was made using the MTT technique. The obtained results with immunological study show that the LCL group present higher CD23 expression and higher NO production by monocytes in relation with TM + e NI groups, besides lower expression of IFN-γe IL-4 by CD4+ T lymphocytes when compared to TM + group. On the other side, TM + group presents relevant increase in the percentage of higher producers of evaluated cytokines, NO and CD23 when compared with NI group. Dividing LCL group for lesion evolution time, was observed in LCL<60 increase frequency of higher producers of IL-4, NO and CD23,indicating a mixed profile of activation/modulation of the innate immunity. The total IgE seric levels was lower in the LCL group when compared to the NI and TM + groups, with a reduction of TM + in relation with NI group. Besides this, of 10 isolates tested, 8 was resistant to NO action and the 2 sensible was obtained from individuals that was responsible to the treatment with Glucantime®. In front this, was possible to infer that other cellular sources, besides T lymphocytes, could be involved in the cytokine production in LCL group and in the TM + group there is a strong possibility for the participation of monocytes activation and induction mechanism and NO induction investigated in this study, favoring the infection control, preventing the occurrence of skin lesions.Besides this, the existence of NO resistant L. (V.) braziliensis isolates, corroborates with other authors findings and could be directly related with Glucantime® treatment resistance.
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Desenvolvimento de uma metodologia semi-automatizada para busca denovas drogas utilizando Leishmania amazonensisfluorescente

Rocha, Marcele Neves January 2013 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-07T13:30:22Z No. of bitstreams: 1 Tese_MarceleNevesRocha.pdf: 3850783 bytes, checksum: e18bb3542328e15691057c221725ec86 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-07T13:30:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_MarceleNevesRocha.pdf: 3850783 bytes, checksum: e18bb3542328e15691057c221725ec86 (MD5) Previous issue date: 2013 / As Leishmanioses são doenças negligenciadas. O tratamento dos pacientes é a principal medida de controle, porém a quimioterapia das Leishmanioses apresenta dificuldades incluindo: toxicidade dos medicamentos disponíveis, via de administração parenteral e resistência natural de algumas cepas. O método de teste de drogas clássico in vitro baseado na contagem microscópica de macrófagos infectados apresenta limitações por ser laborioso, não automatizado e sujeito a variações do observador. Deste modo, a busca por novos métodos de triagem de drogas faz-se necessário. O estabelecimento de métodos semi-automatizados contribuiria para aumentar a eficiência da busca de novas drogas contra Leishmania. Neste trabalho, a cepa de Leishmania amazonensis (PH8) foi transfectada com a proteína vermelha fluorescente (RFP). Os parasitos transfectados foram avaliados segundo parâmetros celulares e de susceptibilidade aos fármacos leishmanicidas tradicionais e derivados do propranolol. Os parasitos selvagens (WT) e transfectados (RFP) foram analisados pela Citometria de Fluxo e Microscopia de Fluorescência sendo facilmente discriminados por estas técnicas. Em geral, não foram observadas diferenças na susceptibilidade entre as cepas WT e RFP frente às moléculas testadas. Os parasitos RFPs foram submetidos ao teste de drogas com posterior leitura no fluorímetro para a padronização do método fluorimétrico. O método fluorimétrico se mostrou bastante reprodutível em relação ao método clássico. Entretanto, durante a padronização do método, mudanças na concentração das drogas foram necessárias bem como a determinação de um ponto de corte nos valores de IC50. Este trabalho também avaliou a atividade leishmanicida dos derivados das poliaminas e complexos metálicos de lapachol utilizando-se o método clássico. Não só os derivados do propranolol, mas também os das poliaminas e lapachol se mostraram tóxicos paracélulas de Hepatoma humano (HepG2). Este trabalho possibilitou pela primeira vez a utilização de parasitos RFPs como modelo de um teste de drogas semi-automatizado. / The leishmaniasis are neglected diseases. Patient treatment is the main control measure, however leishmanisasis chemotherapy faces several problems including: drug toxicity, the administration rout and natural drug resistance. Also, the classical in vitro drug testing method, which is based on microscopically counting the number of infected macrophages is rather limited, laborious cannot be automated and is subjected to variations due to observer. For this reason, the search for new methods and establishment of semi-automated methos id necessary to improve the efficiency of new drugs discovery. In this present work, Leishmania amazonensis strain PH8 was transfected with the red fluorescent protein (RFP). Transfected parasites were evaluated for their cellular parameters and susceptibility against traditional drugs and novel propranolol derivates. Wild type (WT) and transfected (RFP) parasites were analyzed by flow citometry and fluorescent microscopy. Overall we did not observe any difference in drug susceptibility between WT and RFP parasites. RFP parasite were then submitted drug susceptibility test and analyzed by fluorimeter. The fluorimetric method showed a comparable reproducibility to the standard method. However, during experimentation, some adjustments on drug concentrations were necessary to determine IC50 threshold values. Additionally, in this work, weevaluated the activity of polyamine derivates and (metalic lapachol complexes) against leishmania by the classical method. Propranolol derivates, polymaine and metalic lapachol complexes were shown to be citotoxic as shown by HepG2 cell cultures. This work was the first to show the use of RFP parasites as a model for drug screening in a semi-automated method.
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Estudo funcional da proteína quinase JNK de Schistosoma mansoniatravés de expressão heteróloga no organismo modelo Caenorhabditis elegans

Gava, Sandra Grossi January 2013 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-11-20T18:45:22Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao-SandraGrossiGava_Final.pdf: 2345943 bytes, checksum: 542baff1ce20827a286564ee6746784b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-20T18:45:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao-SandraGrossiGava_Final.pdf: 2345943 bytes, checksum: 542baff1ce20827a286564ee6746784b (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou / A identificação e caracterização dos mecanismos e moléculas envolvidos em sinalização celular são essenciais para o entendimento da biologia parasitária do S. mansoni. Proteína quinases desempenham papel chave em vias de sinalização e tem sido propostas como potenciais alvos para o desenvolvimento de novas drogas anti-Schistosoma. Visto que a caracterização funcional em S. mansoni é dificultada por limitações nos métodos de transformação genética deste parasito, o presente estudo propõe o uso de C. elegans como um modelo para a expressão heteróloga de genes de S. mansonique codificam proteínas quinases. Genes que codificam proteína quinases em S. mansoni, homólogos aos identificados em C. elegans, foram selecionados pelo nosso grupo a partir do proteoma do parasito através de uma abordagem filogenômica. Inicialmente, foi selecionada a proteína quinase JNK, que participa da via de sinalização das MAP quinases para a realização das análises experimentais. Em C. elegans, a proteína JNK está relacionada ao aumento de longevidade e da resistência aos estresses térmico e oxidativo. Oligonucleotídeos específicos foram desenhados para amplificar a região promotora do gene em C. elegans bem como as regiões codificantes (CDS) em ambos os organismos. A região promotora foi amplificada a partir do DNA genômico extraído de C. elegans adultos. O RNA total foi extraído de esquistossômulos e C. elegans adultos. As CDS foram amplificadas a partir do cDNA sintetizado e os fragmentos de DNA resultantes foram clonados em E. coliDH5α. As construções obtidas foram digeridas com enzimas de restrição selecionadas de forma a linearizar o vetor contendo a região promotora e recuperar as CDS. Posteriormente, foram realizadas subclonagens através da ligação das CDS de C. elegans e S. mansoni com a construção contendo a região promotora. C. elegans N2 receberam as construções finais através de microinjeção. Foram obtidas três linhagens que expressam Ce_JNK-1, denominadas N2 Ex01[Ce_jnk-1], N2 Ex02[Ce_jnk-1]e N2 Ex03[Ce_jnk-1]e duas linhagens expressando Sm_JNK, denominadas N2 Ex04[Sm_jnk] e N2 Ex05[Sm_jnk]. Os níveis de expressão de Sm_JNK e Ce_JNK-1 nas linhagens transgênicas foram avaliados por RT-PCR quantitativo. Apesar do aumento da expressão de JNK observado nas linhagens transgênicas, não houve aumento na longevidade das mesmas. Embora esta seja a primeira utilização de expressão heteróloga em C. elegans para investigar a função de genes de S. mansoni, esta técnica tem sido utilizada com sucesso para nematóides parasitos e pode tornar-se uma abordagem alternativa para os estudos funcionais em outros parasitos. / The identification and characterization ofmechanisms and molecules involved in cell signaling are essential to the understanding of the S. mansoni parasite’s biology. Protein kinases play key roles in signaling pathways and have been proposed as potential targets for the development of new anti-schistosome drugs. Since functional characterization in S. mansoni is hampered by limitations in methods for genetic transformation in this parasite, the present study proposes to use C. elegans as a model for heterologous expression of S. mansoni genes encoding protein kinases. S. mansoniprotein kinase coding genes orthologous to those identified in C. elegans were selected from the parasite’s proteome by using a phylogenomic approach. Initially, the protein quinase JNK that participates in the MAP kinases signaling pathwaywas selected to perform the experimental analyses. In C. elegans, JNK is related to increased longevity and resistance to oxidative and thermal stress. Specific primers were designed to amplify promoter regions of the JNK gene in C. elegans as well as the protein coding regions (CDS) in both organisms. The promoter region was amplified from the adult nematode’s DNA. Total RNA was extracted from schistosomula and mature C. elegans. CDS were amplified from synthesized cDNA and the resulting DNA fragments were cloned in E. coli DH5α. The construction obtained was digested with restriction enzymes to linearize the vector containing the promoter region and recover the CDS. Subsequently, subcloning was performed by ligation of C. elegansand S. mansoni CDS with the final construct containing the promoter region. C. elegansN2 received the final constructions through microinjections. Weobtained three lineages that expresses Ce_JNK-1, named N2 Ex01[Ce_jnk-1], N2 Ex02[Ce_jnk-1]and N2 Ex03[Ce_jnk-1] and two line ages that express Sm_JNK, named N2 Ex04[Sm_jnk] and N2 Ex05[Sm_jnk]. The expression levels of Ce_JNK-1 and Sm_JNK in transgenic lineages were measured by quantitative RT-PCR. Despite the increased expression of the JNK gene in the transgenic lineages, increased longevity was not observed in these organisms. Although this is the first use of heterologous expression in C. elegans to investigate gene functions in S. mansoni, it has been used successfully for nematode parasites and may become an alternative approach to functional studies in other parasites.
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Caracterização de biomarcadores imunológicos em pacientes portadores de Leishmaniose cutânea da comunidade indígena Xakriabá, Minas Gerais, Brasil

Costa e Silva, Matheus Fernandes January 2013 (has links)
Submitted by Éder Freyre (eder.freyre@icict.fiocruz.br) on 2014-05-13T19:05:09Z No. of bitstreams: 1 Tese Matheus Fernandes Costa-Silva VERSÃO FINAL.pdf: 5012766 bytes, checksum: f7f611cddfc11239b281f2bab089aae4 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-13T19:05:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Matheus Fernandes Costa-Silva VERSÃO FINAL.pdf: 5012766 bytes, checksum: f7f611cddfc11239b281f2bab089aae4 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil. / A leishmaniose cutânea (LC) é uma doença inflamatória crônica causada por espécies dermotrópicas pertencentes aos subgêneros Viannia e Leishmania, sendo a L. (V.) braziliensis o principal agente etiológico no Brasil. O estabelecimento e evolução das lesões causadas pela infecção por L. (V.) braziliensis são altamente dependentes da imunidade celular, contudo um estudo que avalia o impacto da interação parasito-monócitos no perfil de resposta imune associado ao estabelecimento/manutenção da infecção em humanos ainda não foi realizado. Nesse contexto, o objetivo do trabalho foi caracterizar biomarcadores imunológicos, no sangue periférico e no infiltrado inflamatório de lesões cutâneas, em indígenas da comunidade Xakriabá portadores de LC (grupo LC) e com teste de Montenegro positivo sem lesão (grupo TM + sL), com intuito de melhor compreender os mecanismos imunológicos envolvidos na progressão dessa patologia, bem como dos eventos associados à resistência à infecção. A análise dos resultados mostrou que pacientes do grupo LC apresentaram menor capacidade em internalizar formas promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis em relação ao grupo TM + sL. Além disso, observou-se que pacientes do grupo LC apresentaram perfil ativado, principalmente pelo maior percentual/Índice de Estimulação (IE) da molécula de ativação CD23, com produção de altos níveis de TNF-, provenientes de monócitos que não fagocitaram e fagocitaram formas promastigotas de L. (V.) braziliensis. Contudo, os níveis de TNF- correlacionaram de forma negativa com a produção de NO, sugerindo que essa citocina estaria muito mais associada ao desenvolvimento das lesões do que controle da doença. Por outro lado, pacientes do grupo TM + sL apresentaram maior equilíbrio entre a produção de citocinas inflamatórias (IL-12, IFN-, IL-17) e moduladoras (IL-10, IL-4) e sintetizaram maiores níveis de NO, indicando que esse perfil de resposta imune balanceada e efetora poderia combater a infecção sem provocar dano tecidual. A análise do perfil fenotípico-funcional de monócitos e linfócitos T CD4 + e CD8 + circulantes e de citocinas e quimiocinas no infiltrado inflamatório das lesões mostrou que o tempo de evolução da lesão teve grande influência no perfil de resposta imune dos pacientes do grupo LC. Nesse contexto, observou-se que monócitos e linfócitos T CD4 + e CD8 + circulantes de pacientes do grupo lesão recente apresentaram menor IE das moléculas de ativação CD23 e co-estimulação CD80, acompanhado pela menor produção das citocinas inflamatórias (TNF-, IL-17) e moduladoras (IL-10, TGF- e IL-4) em relação ao grupo lesão tardia. Por outro lado, observou-se que esses pacientes apresentaram maior capacidade fagocítica juntamente com maior IE de monócitos expressando os receptores CD16, TLR-2 e TLR-4 e produção de NO. A análise da resposta imune localizada mostrou que pacientes do grupo lesão recente apresentaram maiores níveis de transcritos de IL12B, IFNG, TNF, IL10, TGFB1, IL4, CCL2, CCL3, CCL5 e CXCL10, bem como maior carga parasitária em relação ao grupo lesão tardia. Os resultados obtidos no presente estudo forneceram informações importantes sobre a infecção causada pela L. (V.) braziliensis, permitindo a identificação e proposição de potenciais biomarcadores associados à resistência à LC (IL-12, IL-17 e NO) e ao desenvolvimento e manutenção da lesão (TNF-α). Além disso, esse foi o primeiro estudo que avaliou aspectos imunológicos da LC em uma população indígena brasileira. / Cutaneous leishmaniasis (CL) is a chronic inflammatory disease caused by dermotropic Leishmania species belonging to the Viannia and Leishmania subgenera, with Leishmania (V.) braziliensis considered the main agent in Brazil. The establishment and evolution time of the lesions caused by L. (V.) braziliensis infection are highly affected by the cellular immunity. However, a study evaluating the impact of parasite-monocyte interactions in the immune response profile associated with the establishment/maintenance of the infection in humans has not been previously performed. In this context, the aim of this study was to characterize immunological biomarkers in peripheral blood as well as in inflammatory infiltrate of cutaneous lesions from patients with CL (CL group) or with positive Montenegro skin test without injury (TM + sL group) living in the Xakriabá indigenous community, Minas Gerais, Brazil, in order to better understand the mechanisms involved in the disease progression as well as events associated with resistance to the infection. The results showed that CL group presented less ability to internalize promastigotes of L. (V.) braziliensis as compared with the TM + sL group. Furthermore, it was observed that patients of the CL group showed activated profile, with high percentage/Stimulation Index (SI) of CD23, and production of high levels of TNF- by monocytes that non phagocytized and phagocytized promastigotes of L. (V.) braziliensis. However, the levels of TNF- were negatively correlated with NO production, suggesting that this cytokine would be much more related to the development of lesions instead of disease control. On the other hand, patients from TM + sL group showed better balance between the production of inflammatory (IL-12, IFN-, IL-17) and modulatory (IL-10, IL-4) cytokines, and synthesized highest levels of NO, indicating that this balanced immune response profile may contribute to the infection resolution without causing tissue damage. The analysis of the phenotypic-functional profile of circulating monocytes, CD4 + , CD8 + T cells, and cytokines and chemokines in the inflammatory infiltrate of the cutaneous lesions showed that the evolution time of lesions had great influence in the immune response profile of the CL group. In this context, it was observed that circulating monocytes, CD4 + and CD8 + T lymphocytes of theith recent lesion group showed a lower SI of CD23 and CD80, accompanied by lower production of inflammatory (TNF-, IL-17) and modulatory (IL-10, TGF- and IL-4) cytokines as compared with late lesion group. On the other hand, it was observed that these patients showed greater phagocytic capability along with the highest SI of monocytes expressing CD16, TLR-2 and TLR-4, and NO production. The analysis of the localized immune response showed that patients of the recent lesion group presented higher transcript levels of IL12B, IFNG, TNF, IL10, TGFB1, IL4, CCL2, CCL3, CCL5 and CXCL10, as well as higher parasite burden as compared with late lesion group. This study has provided important information about the infection caused by L. (V.) braziliensis allowing the identification of potential biomarkers associated to the resistance to CL (IL-12, IL-17 and NO) and to the development and maintenance of the lesion (TNF-α). Furthermore, this was the first study that evaluated immunological aspects of CL in a Brazilian indigenous population.
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Estudo experimental da resposta imune celular de bovinos vacinados com o peptídeo sintético sbbo23290 no controle da babesiose por Babesia bovis (Babes, 1888) / Experimental study of cellular immune response of bovines immunizated with synthetic peptide sbbo23290 to the control of babesia bovis’s (babes, 1888) babesiosis

Castro, Carolina Cruz Murta de 18 November 2005 (has links)
Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-08T16:45:52Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1089558 bytes, checksum: 71f90b61d1b8e5726e713eaa43b87a19 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-08T16:45:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1089558 bytes, checksum: 71f90b61d1b8e5726e713eaa43b87a19 (MD5) Previous issue date: 2005-11-18 / Bovinos da raça holandesa entre 3-4 meses de idade receberam quatro imunizações subcutâneas com o peptídeo sintético SBbo23290 anti-Babesia bovis mais saponina, e foram desafiados com amostra virulenta de B. bovis, sendo avaliados quanto ao desenvolvimento da resposta imune celular. Para isso, foi determinado o perfil de linfócitos circulantes (CD4 + , CD8 + , CD21 + e WC1 + ) por citometria de fluxo e seguimento dos eventos microscópicos ocorridos em linfonodos através de técnicas diferenciais (Hematoxilina & Eosina e Verde Metil Pironina) e de imunohistoquímica (Peroxidase anti-peroxidase). Os estudos histológicos mostraram reatividade evidente de centros germinativos a partir do quinto dia após a primeira imunização. A hiperplasia dos cordões medulares foi mais evidente aos três dias após a terceira imunização. O antígeno SBbo23290 foi detectado em células SBbo23290 positivas durante todo o experimento, concomitantemente às alterações histológicas em órgãos linfóides. Quando foi determinada a composição fenotípica dos linfócitos de sangue periférico circulantes, observou-se no grupo peptídeo um aumento progressivo de linfócitos WC1+ até os sete dias após a segunda coleta, que decaiu ligeiramente após a terceira inoculação, aumentando novamente após o desafio com a amostra virulenta de B. bovis, o que não aconteceu com os demais grupos experimentais, havendo diferença estatística entre os grupos. Os linfócitos CD4 + e CD21 + decresceram após a primeira inoculação, aumentando após a segunda inoculação, e decaindo nas demais coletas, havendo diferença estatística entre os grupos. A porcentagem de linfócitos T totais no grupo peptídeo foi superior aos demais grupos durante quase todo o experimento, sendo que a maior porcentagem foi obtida após a segunda coleta, não havendo diferença estatística entre os grupos nas diferentes coletas. Sendo assim, pode-se concluir que o peptídeo sintético induz de maneira eficaz uma resposta imunológica antígeno- específica, na qual encontram-se envolvidos mecanismos celulares e humorais. / Tree-four month old bovines of the Holstein Freesan breed received four under–skin immunization of the synthetic peptideo 23290 anti-Babesia bovis plus saponina. They were challenged with an virulent sample of B. bovis and they were evaluated considering the development of the cellular immune answer through identification of CD4 + , CD8 + , CD21 + , and WC1 + T lymphocytes by flow citometry and microscopic evaluation of lymph nodes using the techniques H&E and Pironin Methil Green, such as PAP. The lymphonodes analysis demonstrated germinal centers reactivity at the 5 th day after the first immunization. Medullars cords hyperplasia was more evident three days after the third immunization. SBbo32290 antigen was detected in SBbo23290 positive cells during whole experiment, and simultaneous to the histology alterations in lymphonodes. Evaluating phenotypic composition of the peripheral blood lymphocytes, a progressive increase of WC1 + lymphocytes was detected, which decreased after third immunization, and an increment was observed again after the challenge. It was not observed in the another experimental groups. The CD4 + and CD21 + lymphocytes decreased after first immunization, increased after the second immunization, and decreased again in the following immunizations; the variation was statistically significant between the groups. The variation in total number of lymphocytes wasn’t statistically significant, although an increment of this cells was observed in the peptide group xvalmost whole experiment, comparing with the another groups. We can conclude that the syntetic peptideo induct an effective immunological specific-antigen answer, in with cellular and humoral mechanisms were involved.
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Estudo da Leishmaniose Tegumentar na Terra Indígena Xakriabá: o parasito, os hospedeiros e os vetores

Quaresma, Patrícia Flávia January 2012 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2012-09-11T17:23:49Z No. of bitstreams: 1 Tese_2012_Patricia Quaresma.pdf: 5774019 bytes, checksum: beed1621303399192cb8877058253554 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-11T17:23:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_2012_Patricia Quaresma.pdf: 5774019 bytes, checksum: beed1621303399192cb8877058253554 (MD5) / FAPEMIG (processo Nº: CBB - APQ-00289-10), CNPq (processo Nº: 479408/2010-6), FIOCRUZ (processo Nº: 403562/2008-2), Comunidade Européia (Control Strategies for visceral leishmaniasis and mucocutaneous leishmaniasis in South America: applications of molecular epidemiology) / Neste trabalho foi realizado um estudo multidisciplinar sobre a leishmaniose tegumentar relacionado ao parasito, aos hospedeiros e aos vetores na Reserva Indígena Xakriabá, norte de Minas Gerais, Brasil. Uma amostra populacional das aldeias Imbaúbas I e II foi caracterizada para a identificação dos casos clínicos e assintomáticos. Os casos de LTA provenientes das outras aldeias da Reserva Xakriabá também foram identificados. Todos foram caracterizados quanto às variáveis demográficas, infecções passadas, presença de co-morbidades, características das lesões e aspectos relacionados ao tratamento. Além deste estudo com os humanos, foi desenvolvido um estudo para verificar a infecção por Leishmania em pequenos mamíferos silvestres e cães domésticos, estimando a proporção de infectados. As espécies de flebotomíneos vetores foram determinadas na área. Por fim, foi realizado um estudo sobre a variabilidade genética de Leishmania (Viannia) braziliensis proveniente de diferentes hospedeiros vertebrados. A prevalência da doença nas aldeias Imbaúbas foi estimada em 8,6%. A partir de 92 casos suspeitos foram detectados 87 casos de LTA em toda a Reserva. Destes, 72 foram confirmados por algum exame parasitológico e/ou PCR. A maioria dos pacientes (70,0%) eram portadores de lesões atípicas, somente 27,6% apresentaram úlceras típicas e 2 pacientes eram portadores tanto de úlcera típica quanto de lesões atípicas. Foram identificadas três espécies de Leishmania circulando entre os roedores, marsupiais e cães domésticos: L. braziliensis, L. infantum e L. guyanensis. Um total de 1327 espécimes de flebotomíneos foi obtido. As espécies mais capturadas foram Lutzomyia longipalpis (756 exemplares – 57%) e Lu. intermedia (297 exemplares – 22%). Cabe ressaltar que foi coletado um número considerável de fêmeas de Lu. intermedia (244), principal vetor de LTA causada por L. braziliensis em Minas Gerais. Foi verificada a presença, em número bastante reduzido (3 exemplares), de Lu. whitmani, espécie considerada vetora em importantes focos de LTA no Brasil. O estudo do polimorfismo genético de L. braziliensis mostrou que existem duas populações deste parasito circulando entre os hospedeiros vertebrados. Uma forte associação foi verificada entre as duas populações de L. braziliensis e o tipo de manifestação clínica. Os parasitos que apresentaram um perfil idêntico às cepas referência de L. braziliensis estavam relacionados a lesões do tipo úlcera típica, enquanto os parasitos que apresentaram perfil variante parecem induzir lesões atípicas. A chance de ter lesão típica é cerca de cinco vezes maior entre os pacientes portadores de parasitos com perfil idêntico a L. braziliensis / A multidisciplinary study related to cutaneous leishmaniasis investigated the parasites, the hosts and vectors in Xakriabá Indian Reservation, north of Minas Gerais, Brazil. A sample population of the villages Imbaúba I and II was characterized for the identification of clinical cases and asymptomatic individuals. The cases of LTA from the other villages of the Reserve Xakriabá were also identified. All were analyzed for demographic variables, past infections, presence of comorbidities, lesion characteristics and aspects related to treatment. In addition to this study with humans, a study was developed to verify the Leishmania infection in small wild mammals and domestic dogs, estimating the proportion of infected. The species of sandfly vectors were determined in the area. Finally, a study was conducted on the genetic variability of Leishmania (Viannia) braziliensis from different vertebrate hosts. The prevalence of the disease in Imbaúbas villages was estimated at 8.6%. Eigthy-seven cases of ACL were detected from 92 suspected cases throughout the Reserve. Among the 87 diagnosed cases, 72 were confirmed by a parasitological examination and/or PCR. Most patients (70.0%) had atypical lesions, only 27.6% had typical ulcer and 2 patients had both typical ulcer and atypical lesions. We identified three Leishmania species circulating among rodents, marsupials and domestic dogs: L. braziliensis, L. infantum and L. guyanensis. A total of 1,327 specimens of sandflies were obtained. The most captured species were Lutzomyia longipalpis (756 copies - 57%) and Lu. intermedia (297 copies - 22%). It is noteworthy that was collected a considerable number of females of Lu. intermedia (244), the main vector of ACL caused by L. braziliensis in Minas Gerais. The presence of Lu. whitmani was found in very small number (3 copies), this specie is considered important vector in foci of leishmaniasis in Brazil..The study of genetic polymorphism of L. braziliensis showed that there are two populations of this parasite circulating among vertebrate hosts. A strong association was found between the two populations of L. braziliensis and the type of clinical manifestation. The parasites that showed a profile identical to reference strains of L. braziliensis were related to injuries of the type typical ulcer, while the parasites that appear to induce variant profile showed atypical lesions. The chance of having a typical lesion is about five times higher among patients with parasites with identical profile to L. braziliensis
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Desenvolvimento e padronização de novas metodologias aplicadas ao diagnóstico e monitoração de cura da esquistossomose mansoni na fase inicial (aguda) e crônica

Queiroz, Rafaella Fortini Grenfell e January 2012 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-07T16:58:40Z No. of bitstreams: 1 4. Tese Final RQ3Banca1.pdf: 2857998 bytes, checksum: 113972bf6018f1468776705c406f2b79 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-07T16:58:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4. Tese Final RQ3Banca1.pdf: 2857998 bytes, checksum: 113972bf6018f1468776705c406f2b79 (MD5) / Neste projeto, foram testados diferentes antígenos candidatos a padronização de novos métodos diagnósticos a serem usados nas diferentes fases da infecção esquistossomótica. Inicialmente, foram analisados os antígenos brutos do parasito visto que seu baixo custo e simplicidade de obtenção merecem novas abordagens. Assim, antígenos de vermes adultos, ovos e tegumento de esquistossômulos foram analisados com soro de pacientes submetidos a rigoroso diagnóstico parasitológico para determinação de infecção e/ou diagnóstico clínico e imunológico. Ao serem aplicados no método indireto de ELISA, estes antígenos apresentaram alta sensibilidade e especificidade em fases distintas da infecção murina. Através desses resultados foi possível confirmar que o uso de antígenos obtidos de diferentes formas evolutivas do parasito serve como ferramenta potencial para análise da evolução cronológica da infecção. Quando aplicados em amostras humanas, o uso de antígenos de vermes adultos mostrou-se promissor para o diagnóstico de pacientes residentes de áreas endêmicas que apresentavam baixa carga parasitária, com índices de sensibilidade e especificidade de 95%. Tendo sido, nestas condições, superior aos antígenos de ovos. O estudo de pacientes em fase aguda da infecção permitiu a validação da técnica indireta de ELISA com antígenos de tegumento de esquistossômulos. Esta técnica apresentou uma significativa sensibilidade na identificação de grande parte dos pacientes recentemente infectados. A outra abordagem adotada por este tarbalho envolveu o uso do Antígeno Catódico Circulante (CCA), antígeno este secretado/excretado por vermes jovens e adultos, que foram direcionados para o desenvolvimento de novas e promissoras metodologias diagnósticas. Para este propósito, o CCA foi utilizado em diferentes formas antigênicas: como glicoproteína purificada a partir de vermes, como proteína recombinante e como peptídeos imunogênicos de 20 aminoácidos. Estes antígenos foram usados na padronização do Método de Separação Imunomagnética, denominado IMS. O uso de CCA recombinante no método de IMS indireto levou aos índices mais significativos de sensibilidade e especificidade, sem que qualquer resultado falso-negativo fosse detectado. Por outro lado, o uso da glicoproteína CCA purificada demonstrou ser superior no diagnóstico para monitorização de cura. A partir destes resultados, mais promissores que a ELISA convencional, partimos para a padronização final desta técnica para a detecção direta do CCA nas mesmas amostras, de forma a permitir somente a identificação de infecções ativas. Para isto, anticorpos monoclonais específicos para a glicoproteína CCA foram produzidos e conjugados a marcadores. A escolha do clone foi baseada na reduzida especificidade deste pela porção responsável pelas reações cruzadas do CCA, a porção glicídica Lewis x. O novo método IMS para detecção direta demonstrou alta sensibilidade de 94% e especificidade de 100%, apresentando correlação direta com a carga parasitária destes pacientes determinada pela contagem de ovos nas fezes. Os excelentes resultados na detecção de antígeno circulante obtidos no presente trabalho, que contrapõem os obtidos em outros trabalhos publicados, se devem a nova metodologia empregada que utiliza a concentração destes antígenos ao invés da diluição de amostras. Por fim, idealizamos um último método, denominado FluoIMS, destinado a identificação qualitativa da presença de CCA através da microscopia de fluorescência. Este método, de detecção direta e de execução bastante simples, apresentou significativos índices de sensibilidade quando três lâminas individuais para cada amostra foram analisadas. Nossos resultados trazem grandes expectativas para a melhoria do diagnóstico dos muitos pacientes infectados por baixas cargas do Schistosoma mansoni, em diferentes fases da infecção, e apontam novas perspectivas para aplicação destes métodos no controle de cura pós-tratamento. / In this project, various candidate antigens for standardization of new diagnostic methods were tested for use at different phases of schistosome infection. Initially, the crude antigens of the parasite were analyzed, since their low cost and ease of obtaining deserve new approaches. Thus, antigens of adult worms, egg antigens, and tegument antigens of schistosomula were analyzed by means of sera of patients submitted to a rigorous parasitological diagnosis for determination of infection. When applied to the indirect method of ELISA, these antigens presented high sensitivity and specificity levels at different phases of murine infection. Based on these results, it was possible to confirm that the use of antigens obtained at different evolutive phases of the parasite acts as a potential tool for analysis of the chronological evolution of infection. When applied to human samples, the use of adult worm antigens was promising for diagnosis of patients living in endemic areas, and presenting low worm burden, with sensitivity and specificity levels of 95%. Under these conditions, they were considered superior than the egg antigens. The study related to tourists presenting acute phase of infection allowed the validation of the indirect technique of ELISA, with tegument antigens of schistosomula. This technique showed a significant sensitivity for identification of a large part of recently infected patients. Another approach used in this study involved the use of Circulating Cathodic Antigen (CCA), which was secreted/excreted by juvenile and adult worms, that were directed to development of new and promissing diagnostic methodologies. For this purpose, the CCA was used at different forms of antigens: as purified glycoprotein obtained from worms, as recombinant protein and as immunogenic peptides of 20 aminoacids. These antigens were used for standardization of the Immunomagnetic Separation Method, named IMS. The use of recombinant CCA in the indirect method of IMS showed the most significant levels of sensitivity and specificity, and no false-negative results could be detected. On the other hand, the use of purified glycoproteinCCA demonstrated to be superior for diagnosis of cure control. Based on these results, which were more promissing than the conventional ELISA, we started the final standardization of this technique for the direct detection of CCA in the same samples, in order to allow only the identification of active infections. For this purpose, specific monoclonal antibodies for glycoprotein CCA were produced and conjugated to merchandises. The choice of the clone was based on the lack of its specificity by the portion responsible for the cross-reactions of CCA, the glicidic portion Lewis x, and in order that a low level of cross-reactivity could be detected by this method, in future analyses. The new method IMS demonstrated high levels of sensitivity (94%) and specificity (100%), reaching superior levels than the ones showed by the current immunological methods, as well as presenting a direct correlation with those patients´worm burdens, which were obtained by fecal egg counts. The excellent results obtained in the present study regarding the detection of circulating antigen, that did not corroborate the results obtained in other published papers, are due to the new methodology used, that utilizes the concentration of these antigens and not the dilution of samples. Finally, we planned another method, named FluoIMS, for the qualitative identification of the presence of CCA by means of fluorescence microscopy. This method, offering direct detection and ease of execution, showed significant levels of sensitivity, when three individual glass-plates for each sample were analyzed. Our results offer great expectancy for the improvement of diagnosis of infected patients with low Schistosoma mansoni burdens, at different phases of infection, and indicate new perspectives for application of these methods in the post-treatment cure control
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Avaliação de biomarcadores imunológicos associados à terapêutica específica da fase aguda da esquistossomose mansônica humana

Silveira, Amanda Cardoso de Oliveira January 2011 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-24T18:16:29Z No. of bitstreams: 1 Amanda Cardoso de oliveira Silveira.pdf: 1397539 bytes, checksum: f51baa26b4d3bab7cb78cc4c63ea205a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-24T18:16:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amanda Cardoso de oliveira Silveira.pdf: 1397539 bytes, checksum: f51baa26b4d3bab7cb78cc4c63ea205a (MD5) Previous issue date: 2011 / Nesse estudo foram avaliadas as principais alterações clínico-laboratoriais, ultra-sonográficas e imunofenotípicas induzidas em pacientes portadores da fase aguda da esquistossomose mansoni (AGD-AT) e o impacto que a terapêutica específica com praziquantel teria em um ano (AGD-PT I) e dois anos (AGD-PT II) após o tratamento. Amostras de fezes e sangue periférico dos pacientes foram coletadas para realização do exame parasitológico e hemograma, respectivamente. Posteriormente, os pacientes foram submetidos ao exame ultrasonográfico para avaliar comprometimento hepático e/ou esplênico. Em seguida, foi realizada a determinação dos níveis plasmáticos de IgE total, óxido nítrico (NO), citocinas e quimiocinas. Além disso, foram realizadas avaliações do perfil imunofenotípico de leucócitos circulantes e dosagem de NO, citocinas e quimiocinas em sobrenadantes de cultura de granulócitos do sangue periférico. Os resultados mostraram reduções da concentração de hemoglobina, percentual do hematócrito, número de plaquetas e global de leucócitos no grupo AGD-PT II, com algumas alterações ultra-sonográficas (hepatomegalia e esplenomegalia) persistentes. Em relação às avaliações plasmáticas no grupo AGD-PT II, foi observado redução dos níveis de IgE total quando comparados aos grupos CT, AGD-AT e AGD-PT I, NO em comparação com o grupo AGD-AT, CXCL-8 em comparação com o grupo AGD-AT, GM-CSF em comparação com o grupo AGD-PT I e CCL24 em comparação com o grupo CT. Nos dados referentes à avaliação dos sobrenadantes de cultura de granulócitos do grupo AGD-PT II, frente ao estímulo com SWAP, foi observado redução dos níveis de óxido nítrico quando comparado ao grupo AGD-AT e CXCL-8 em relação ao grupo AGD-PT I. Na avaliação do perfil imunofenotípico do grupo AGD-PT II, os resultados mostraram reduções progressivas nos números absolutos das moléculas CD28, CD80, CD86, CD23, CD25, HLADR, CD69, CD64, CD18, CD44, CD54, CCR2 e CCR3 em eosinófilos, CD80, CD86, CD11 e CCR2 em neutrófilos e número absoluto de linfócitos TCD3+ e suas subpopulações CD4+ e CD8+, bem como os marcadores CD28 e CD18 em comparação ao grupo AGD-PT I. Com base nos achados desse estudo sugere-se que dois anos após terapêutica específica com praziquantel, a grande maioria das alterações observadas nos pacientes portadores da forma clínica aguda da esquistossomose, antes e persistentes um ano após o tratamento, tenham sido normalizadas, sugerindo que o tratamento pode promover, a longo prazo, a reversibilidade das alterações imunofenotípicas das principais populações celulares envolvidas no contexto da infecção esquistossomótica aguda. / In this study was evaluated the main clinical/laboratory, ultrasonographic and immunophenotypic features in patients with the acute phase of schistosomiasis mansoni (ACT-BT) and the impact of the specific therapeutic with praziquantel about these parameters one year (ACT-AT I) and two years (ACT-AT II) after specific therapeutic. Peripheral blood and feces of patients were collected to perform blood and parasitological examinations, respectively. Subsequently, the patients were evaluated by ultrasound to assess hepatic/splenic commitment. Afterwards, we evaluated the plasmatic levels of total IgE, nitric oxide (NO), cytokines and chemokines. Moreover, we evaluated ex vivo immunophenotypic features from circulating leucocytes, and the levels of NO, cytokines and chemokines in supernatant of culture from circulating granulocytes. The results showed a reduction in the concentration of hemoglobin, percentage of hematocrit, number of platelets and total leucocytes as well as ultrasonographic alterations (hepatomegaly and splenomegaly) in the ACT-AT II group. The plasmatic analysis from ACT-AT II revealed a decreased levels of total IgE as compared to CT, ACT-BT and ACT-AT I groups, NO as compared to ACT-BT group, CXCL-8 as compared to ACT-BT group, GM-CSF as compared to ACT-AT I group and CCL24 as compared to CT group. Regarding the analysis in the supernatant culture of granulocytes from ACT-AT II, in the presence of SWAP, there was a reduction in NO levels as compared to ACT-BT as well as in CXCL-8 as compared to ACT-AT I. The immunophenotypic profile from ACT-AT II group showed progressive decrease in the absolute number of CD28, CD80, CD86, CD23, CD25, HLA-DR, CD69, CD64, CD18, CD44, CD54, CCR2 and CCR3 in eosinophils, CD80, CD86, CD11 and CCR2 in neutrophils and CD3+, CD4+, CD8+ and CD28 and CD18 markers in T lymphocytes as compared to ACT-AT I. In summary, the findings of this study suggest that after two years post-treatment specific with Praziquantel, the majority of alterations observed in acute patients of schistosomiasis, before and those persistents after one year post-treatment, returned to the normal levels, suggesting that chemotherapy can promote, a long time, the reversibility of the immunological alterations in the main cell populations involved in the context of acute schistosomiasis infection.
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Estudo do sistema inato de defesa de Biomphalaria tenagophila (d’Orbigny, 1835) frente ao Schistosoma mansoni Sambon, 1907

Mattos, Ana Carolina Alves de January 2011 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-25T10:42:23Z No. of bitstreams: 1 MATTOS, Ana Carolina.pdf: 1283545 bytes, checksum: a4b542c6c88309cd3a7cec32cb5e787f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-25T10:42:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MATTOS, Ana Carolina.pdf: 1283545 bytes, checksum: a4b542c6c88309cd3a7cec32cb5e787f (MD5) Previous issue date: 2011 / A fenoloxidase (PO) é uma enzima envolvida no processo de melanização. A melanização é um mecanismo de defesa contra patógenos, muito importante para diversos invertebrados, inclusive, alguns artigos já descreveram a existência dessa enzima em Biomphalaria glabrata. Utilizando B. tenagophila (linhagem resistente Taim e linhagem susceptível Cabo Frio), tentou-se esclarecer, por meio de experimentos “in vivo” e “in vitro”, a real importância desse sistema enzimático no processo de resistência da Biomphalaria ao S. mansoni. Verificou-se que, apesar do sistema fenoloxidase apresentar, em alguns experimentos, uma atividade significativamente maior, principalmente na linhagem Taim, na presença do S. mansoni, não foi possível afirmar que esse sistema tem importância no mecanismo de resistência da B. tenagophila Taim contra S. mansoni, pois a ativação enzimática ocorreu em todas as linhagens testadas. Quando os testes da atividade enzimática foram realizados, utilizando Echistosoma paraensei (trematódeo, digenea), que infecta a linhagem Taim, os resultados foram semelhantes. Outro aspecto estudado neste trabalho foi a resposta do sistema interno de defesa (SID - hemócitos, fração solúvel e hemolinfa total) da B. glabrata e B. tenagophila (Taim e Cabo Frio), frente aos esporocistos secundários, obtidos de caramujos B. glabrata infectadas. Já foi descrito na literatura o processo de mascaramento/mimetismo molecular como mecanismo de evasão do parasito. Assim, utilizando os esporocistos secundários, foi possível demonstrar que os esporocistos primários são mais afetados pelo SID da Biomphalaria (principalmente Taim) do que os esporocistos secundários. Os esporocistos primários apresentaram maior mortalidade e danos no tegumento do que os esporocistos secundários. No entanto, a inoculação dos esporocistos secundários, provenientes de B. glabrata, obteve sucesso apenas na espécie análoga, resultando na eliminação de cercárias, trinta dias após a inoculação. O mesmo não ocorreu nas linhagen de B. tenagophila Taim e Cabo Frio. Dessa forma, o mimetismo/mascaramento molecular é um mecanismo possível, porém experimentos utilizando esporocistos secundários provenientes da B. tenagophila são necessários para verificar a real importância desse processo como mecanismo de escape do parasito em relação a B. tenagophila Taim. / Phenoloxidase (PO) is an enzyme involved in the process of melanization, which is a defense mechanism against pathogens, being very important for different invertebrates. Several articles have described the presence of this enzyme in Biomphalaria glabrata. Using B. tenagophila (resistant Taim and susceptible Cabo Frio) lineages to Schistosoma mansoni), we carried out “in vivo” and “in vitro” experiments aimed at clarifying the real importance of this enzymatic system in the process of Biomphalaria resistance to S. mansoni. It was observed in some experiments that the phenoloxydase system presented a significantly higher activity, mainly in Taim lineage in the presence of S. mansoni, but it was not possible to confirm whether this system exerts some importance in the resistance mechanism of B. tenagophila Taim against S. mansoni, since the enzymatic activity has occurred in all the lineages tested. When the enzymatic activity was tested using Echistosoma paraensi (Trematode, Digenea), which infects the Taim lineage, the results obtained were very similar. Another aspect investigated in the present work was the response of the internal defense system (IDS – hemocytes, soluble fraction, and total hemolymph) of B. glabrata and B. tenagophila (Taim and Cabo Frio) in the presence of secondary sporocysts derived from infected B. glabrata snails. The process of molecular masking/mimetism as evasion mechanism of the parasite has been described in the literature. Thus, using secondary sporocysts, it was possible to demonstrate that primary sporocysts are more affected by IDS of Biomphalaria (mainly of Taim), presenting higher mortality rate and tegumental damages than the secondary ones. Nevertheless, inoculation of secondary sporocysts derived from B. glabrata was successful only in the analogue species, showing as a result elimination of cercariae thirty days post-inoculation. The same result did not occur with B. tenagophila Taim and Cabo Frio. In this way, the molecular masking/mimetism may be considered a possible mechanism, however, further experiments using secondary sporocysts derived from B. tenagophila are needed in order to verify the real importance of this process as the parasite´s scape mechanism in relation to B. tenagophila Taim.
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Estudo da resistência do Schistosoma mansoni Sambon, 1907 ao praziquantel

Couto, Flávia Fernanda Bubula January 2014 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-15T18:38:01Z No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_FlaviaFernandaBubulaCouto.pdf: 1019436 bytes, checksum: 5193b8188e8f866ddd717bb135bc3fee (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-15T18:38:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_FlaviaFernandaBubulaCouto.pdf: 1019436 bytes, checksum: 5193b8188e8f866ddd717bb135bc3fee (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-15T18:38:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_FlaviaFernandaBubulaCouto.pdf: 1019436 bytes, checksum: 5193b8188e8f866ddd717bb135bc3fee (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T18:38:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_FlaviaFernandaBubulaCouto.pdf: 1019436 bytes, checksum: 5193b8188e8f866ddd717bb135bc3fee (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Atualmente, a droga utilizada no tratamento da esquistossomose é o praziquantel (PZQ). Alguns casos de isolados de S. mansoni resistentes ao PZQ no campo e em laboratório já foram relatados. Estes relatos refletem uma parcela ínfima do problema real, devido às dificuldades para a comprovação dessa resistência em condições de laboratório. Recentemente, nosso grupo conseguiu induzir resistência, em laboratório, a uma cepa de S. mansoni, utilizando sucessivos tratamentos com PZQ em B. glabrata infectadas com o S. mansoni (cepa LE-PZQ). Diante disso, este trabalho teve como objetivo geral avaliar a resistência/ suscetibilidade da cepa LEPZQ ao longo de seu desenvolvimento no hospedeiro vertebrado bem como avaliar a ação do PZQ em cercárias sensíveis e resistentes ao PZQ a fim obter um teste rápido para detecção de resistência e, por fim, estudar o envolvimento das proteínas SMDR2, SmMRP1 e SmMVP na resistência do S. mansoni ao PZQ. Para isso, camundongos infectados com a cepa LE-PZQ ou com a cepa suscetível (LE) foram tratados com PZQ após 2, 6, 16, 23 e 45 dias de infecção. Os resultados mostraram maior recuperação de vermes da cepa resistente tratadas com PZQ após 16 e 23 dias de infecção em comparação com a cepa LE. Outro objetivo do nosso estudo foi avaliar a perda da cauda de cercárias LE e LE-PZQ após 1 e 2 horas de contato com o PZQ em diferentes concentrações. Cercárias LE-PZQ apresentaram uma perda da cauda estatisticamente menor após exposição nas diferentes concentrações de PZQ por 1 ou 2 horas. Artigos sobre resistência à multidrogas (MDR) têm sido importantes para estudo de resistência em diversos organismos. Por isso, investigamos os níveis de RNA de SMDR2 e SMRP1 por qRT-PCR. SMDR2 mostrou níveis maiores em fêmeas quando comparados com machos e vermes em pares na cepa LE. Na cepa LE-PZQ, vermes fêmeas apresentaram níveis maiores quando comparados apenas com vermes machos. Quando comparadas as duas cepas, a resistente apresentou níveis estatisticamente maiores em machos, fêmeas e vermes em pares. SmMRP1 demonstrou expressão significativamente maior em machos e machos e fêmeas nas duas cepas quando comparados com fêmeas. Na comparação entre a cepa sensível e a resistente, a LE-PZQ apresentou maiores níveis de expressão em machos e vermes em pares. Investigamos também os níveis de RNA e proteínas de SmMVP. Foi possível observar que SmMVP está diferencialmente expressa entre machos, fêmeas e vermes em pares quando comparados entre si em cada cepa e quando compara-se cepa sensível e resistente. / Currently, the drug of choice in schistosomiasis treatment is Praziquantel (PZQ). Some cases of S. mansoni resistant strains to PZQ in field and laboratory have been already reported. These cases reports reflect a small parcel of the real problem due to the difficulty to prove this resistance in laboratory conditions. Recently, our group induced resistance in a S. mansoni strain using successive PZQ treatments in B. glabrata infected, under laboratory conditions (LE-PZQ strain). Thus, this work aimed to evaluate the resistance/ susceptibility of the LE-PZQ strain during its development in the vertebrate host as well as to evaluate the PZQ action in susceptible and resistant cercarie in order to obtain a rapid test to detect resistance, and lastly to study the involvement of SMDR, SmMRP1 and SmMVP proteins in the S. mansoni resistance to PZQ. For that, mice were infected with LE-PZQ strain or susceptible strain (LE) and treated with PZQ after 2, 6, 16, 23 and 45 days of infection. The results showed a bigger worm recovery when it was treated after 16 and 23 days of the infection when compared with susceptible strain. We also aimed to evaluate tail loss of LE and LE-PZQ cercarie after exposure to PZQ for 1 or 2 hours in different concentrations. LE-PZQ cercarie showed a statistically smaller tail loss after PZQ exposure in all concentrations for 1 or 2 hours. Works about multidrug resistance (MDR) have been important to studies of resistance in several organisms. Therefore, we investigated levels of RNA for SMDR2, SmMRP1 and SmMVP using RT-PCR. Females showed high levels of expression when compared to males and paired worms in the LE strain. In the LE-PZQ strain, female worms showed high levels of expression only when compared to male worms. When compared both strains, the resistant showed high levels of expression in males, females and paired worms. SmMRP1 showed upregulated in males and paired worms in both strains when compared to females. In the susceptible and resistant strain comparison, LE-PZQ strain showed high levels of expression in male and paired worms. We investigated also RNA and proteins levels for SmMVP. It was possible to observe that SmMVP was found differentially expressed in adult males and females from the susceptible strain.

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