O Brasil é o maior produtor mundial de maracujá azedo (Passiflora edulis f. flavicarpa) sendo esta a espécie de maior expressão comercial dentre as passifloras cultivadas. A bacteriose do maracujazeiro, causada por Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Xap), é uma das doenças mais severas da cultura, acarretando grandes prejuízos aos produtores. Atualmente, é incipiente o conhecimento sobre a interação maracujá azedo-Xap. Diante disso, a identificação e a caracterização dos genes envolvidos no processo de defesa são passos importantes para dar suporte ao desenvolvimento de variedades resistentes. Assim, o objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar genes de maracujá azedo diferencialmente expressos durante a resposta de defesa à Xap, bem como mensurar a sua expressão. Para isso, foram construídas duas bibliotecas subtrativas de cDNA (forward e reverse) usando o método SSH a partir de transcritos de folhas, que foram inoculadas com o patógeno ou solução salina (controle). Após o sequenciamento dos clones, o processamento e a montagem das sequências, as unisequências foram anotadas através da Plataforma PLAZA e do programa computacional Blast2GO. Genes envolvidos em diversos processos biológicos foram selecionados para a validação das bibliotecas por PCR quantitativo. Usando a Plataforma PLAZA, 78 % (764) das unisequências mostraram similaridade com proteínas de Arabidopsis thaliana, enquanto 87 % (866) delas apresentaram similaridade com proteínas putativas de diversas espécies vegetais, quando se utilizou Blast2GO. Na biblioteca forward, foram identificadas 73 proteínas relacionadas à resposta de defesa, dentre as quais estão proteínas envolvidas na sinalização intracelular, na ativação da transcrição e regulação da expressão de genes de defesa, bem como proteínas de defesa, de resistência e relacionadas à patogênese (PRs). Dentre os 22 transcritos validados, 95 % foram diferencialmente expressos em pelo menos um dos três períodos avaliados; os genes mais expressos em resposta à infecção pelo patógeno são os que codificam as enzimas lipoxigenase, (+)-neomentol desidrogenase e quitinase, as quais participam diretamente nas respostas de defesa vegetal. Dos genes cuja expressão foi mais reprimida, dois codificam proteínas relacionadas à fotossíntese e dois codificam proteínas envolvidas na detoxificação da amônia e do H2O2. Nossos resultados sugerem que a planta utiliza um arsenal de transcritos para responder à infecção; entretanto, este arsenal não é eficiente para impedir a ação do patógeno e, consequentemente, o desenvolvimento da bacteriose nas condições estudadas. Nosso estudo é inédito e gerou informações sobre a reprogramação transcricional durante a interação maracujá azedo-Xap, o que constitui um importante passo para o melhor entendimento sobre este patossistema. / Brazil is the main producer of yellow passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa) worldwide, which is the most widely commercialized crop among the cultivated passifloras. The bacterial leaf spot induced by Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Xap) is one of the most severe diseases of the crop, causing great losses to producers. Currently, we understand very little about the yellow passion fruit-Xap interaction. Therefore, the identification and characterization of genes involved in the defense process are important steps to support the development of resistant varieties. Thus, the objective of this study was identify and characterize differentially expressed genes during the defense response to Xap, as well as to measure their expression. For that, we constructed two subtractive cDNA libraries (the forward and the reverse) by performing the SSH method from leaf transcripts, which were inoculated with the pathogen or saline solution (control). After sequencing the clones and sequence data processing, sequences were assembled into unique sequences, which were annotated using the PLAZA Platform and the computational program Blast2GO. Genes involved in several biological processes were selected to validate the libraries by quantitative PCR. When PLAZA was used for sequence similarity searches, 78 % (764) of the yellow passion fruit unique sequences showed similarity to proteins of Arabidopsis thaliana; when Blast2GO was used, 87 % (866) of the unique sequences showed similarities to putative proteins of several plant species. For the forward library, 73 proteins related to defense response were identified, such as those involved in intracellular signaling, transcription activation and regulation of defense gene expression, as well as defense and resistance proteins, and pathogenesis-related proteins (PRs). Of the 22 validated transcripts, 95 % were differentially expressed during at least one of the three periods evaluated; the genes up-regulated in response to the pathogen infection were those that code for the enzymes lipoxygenase, (+)-neomenthol dehydrogenase and chitinase, which participate directly in plant-defense responses. Out of down-regulated genes, two code for photosynthesis-related proteins, and two for ammonia and H2O2 detoxification. Our results suggest the plant uses an arsenal of transcripts to respond to infection; however, this arsenal is not effective to prevent pathogen action and consequently the occurrence of bacterial leaf spot under the evaluated conditions. The present study is the first to produce information on the transcriptional reprogramming during the passion fruit-Xap interaction, which represents an important step for a better understanding of this pathosystem.

As Escherichia coli produtoras da toxina Shiga (STEC) são importantes patógenos humanos, causando desde diarréias até a síndrome hemolítica urêmica (SHU). Há diversos sorotipos associados a SHU, tais como O157:H7 e O113:H21. No Brasil o sorotipo O113:H21 ainda não aparece associado a SHU, embora seja frequentemente isolado de carcaças e fezes bovinas. Nosso grupo já investigou comparativamente as redes de coexpressão gênica (RCG) de STEC EH41 (associado à SHU) e Ec472/01 (isolado de fezes bovinas). A análise comparativa do perfil transcricional de EH41 e Ec472/01 revelou que somente EH41 expressa um conjunto de genes que inclui o regulador transcricional dicA. A maioria destes genes está situada em um único módulo transcricional e podem estar associados a fatores de virulência. Assim, este trabalho centrou-se numa abordagem de biologia de sistemas, integrando análises genômica e fenotípica da resposta de enterócitos Caco-2 à EH41 e Ec472/01. A análise genômica baseou-se no estudo temporal de RCG para compreender os mecanismos moleculares envolvidos na patogenicidade desses dois isolados. As alterações fenotípicas ocorridas nas células Caco-2 ao longo da exposição a cada um dos isolados de STEC foram visualizadas através de MEV. A análise genômica mostrou que o mecanismo molecular da resposta de Caco-2 durante a interação com EH41 ou Ec472/01 é claramente distinto. Nas redes do grupo Caco-2/EH41 as alterações topológicas incluíram a perda do status scale free e a sua recuperação, com o estabelecimento de uma nova hierarquia de genes na rede. Esses resultados se enquadram no modelo de redes para transição saúde-doença: a nova rede representa a resposta adaptativa da célula ao patógeno, o que não significa um retorno à normalidade. Já no grupo Caco-2/Ec472 as redes, após a perda do status scale free, não recuperam esse status até o final do período estudado, o que sugere um estado de transição mais prolongado para reorganização da hierarquia da rede. Mais ainda, através da caracterização dos módulos transcricionais, foi possível compreender dinamicamente os mecanismos moleculares envolvidos na resposta diferencial de Caco-2 aos dois isolados aqui estudados. STEC EH41 induz rapidamente a resposta inflamatória e apoptótica a partir da primeira hora de interação enterócito-bactéria. Por outro lado, células Caco-2 em contato com Ec472/01 ativam, a partir de uma hora, a fagocitose e, a partir da segunda hora, expressam moduladores da homeostase imune. A análise fenotípica das células Caco-2 mostrou, de forma nítida, uma maior destruição dos microvilos dos enterócitos em contato com EH41 do que com Ec472/01. Integrando os resultados genômicos e fenotípicos pode-se concluir que EH41 induz em Caco-2 - em comparação com Ec472/01 - maiores e mais rápidas alterações na expressão gênica global, além de uma resposta inflamatória e apoptótica excessiva, levando assim a alterações morfológicas mais pronunciadas nas células Caco-2. Em seu conjunto, esses resultados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na patogenicidade das STECs associadas à SHU. Assim, as perspectivas de desenvolvimento deste trabalho deverão incluir a investigação de fatores de virulência e vias moleculares envolvidas na indução das respostas imunes que podem conduzir à SHU / Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) O113:H21 strains are associated with human diarrhea and some of these strains may cause hemolytic uremic syndrome (HUS). In Brazil O113:H21 strains are commonly found in cattle but, so far, were not isolated from HUS patients. Previously, our group conducted comparative gene co-expression network (GCN) analyses of two O113:H21 STEC strains: EH41, isolated from a HUS patient in Australia, and Ec472/01, isolated from bovine feces in Brazil. Differential transcriptome profiles for EH41 and Ec472/01 revealed a gene set exclusively expressed in EH41, which includes the dicA putative virulence factor regulator. GCN analysis showed that this set of genes constitutes an EH41 specific transcriptional module which may be associated to virulence factors. Therefore, in the present work a system biology approach was conducted to investigate the differential Caco-2 response - genomic and phenotypic - to EH41 (Caco-2/EH41) or to Ec472/01 (Caco- 2/Ec472) along enterocyte-bacteria interaction. The genomic analysis was based on temporal GCN data in order to gain a better understanding on the molecular mechanisms underlying the capacity to cause HUS. The phenotypic alterations in Caco-2 during enterocyte-bacteria interaction were assessed by scanning electronic microscopy (SEM). The genomic analysis showed that the molecular mechanism of Caco-2 response to EH41 or to Ec472/01 during enterocyte-bacteria interaction is clearly different. The GCN topological analyses for Caco-2/EH41 group revealed loss of the scale-free status after one hour of interaction, persistence of this condition along the second hour and establishment of a new gene hierarchy thereafter. These events resemble the network mechanism of health-disease transition. The new established network represents an adaptive cell response to the pathogen and not the return to a \"normal\" state. Conversely, the networks for Caco-2/Ec472 group showed a slow and progressive loss of the scale-free status without its restoration at the end of the time interval here studied. Through transcriptional module characterization it was possible to reveal the dynamic of the molecular mechanism involved in the Caco-2 differential responses to the STEC isolates. EH41 induces a rapid inflammatory and apoptotic response just after the first hour of enterocyte-bacteria interaction. Instead, the Caco-2 response to Ec472/01 is characterized by phagocytosis activation at the first hour, followed by the expression of immune response modulators after the second hour. SEM phenotypic analysis of Caco-2 cells along enterocyte-bacteria interaction showed more intense microvilli destruction in cells exposed to EH41, when compared to cells exposed to Ec472/01. The integration of genomic and phenotypic data allowed us to conclude that EH41, comparatively to Ec472/01, induces greater and precocious global gene expression alterations in Caco-2, what is related to excessive inflammatory and apoptotic responses. These responses are associated with the pronounced morphological alterations observed by SEM in Caco-2 cells exposed to EH41. Altogether, these results contribute for a better understanding of the molecular mechanism involved in STEC pathogenicity associated to HUS. Therefore, the future perspectives for the development of the present work should include the investigation of virulence factors and molecular pathways involved in the induction of immune responses leading to HUS

A citricultura destaca-se dentro do agronegócio brasileiro gerando dividendos diretos com exportações e empregos, e indiretos com arrecadação de impostos. No entanto, ainda padece com problemas fitossanitários, com destaque para o HLB (Huanglongbing, HLB, ex-greening), que nos últimos dez anos tem dizimado pomares e provocado o abandono da cultura por muitos produtores. Causada no Brasil pelas bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus e Ca. Liberibacter americanus, é uma doença sistêmica, restrita aos vasos do floema, e induz ao aparecimento de sintomas semelhantes àqueles causados por deficiência de nutrientes em folhas e ramos, frutos com tamanhos reduzidos e assimétricos e coloração amarelada das plantas, tornando-as economicamente inviáveis. A transmissão da doença acontece naturalmente pelo inseto Diaphorina citri, e artificialmente por meio de borbulhas contaminadas. Todas as variedades de citros e rutáceas próximas são comprovadamente suscetíveis ao HLB; entretanto, há diferenças marcantes entre níveis de suscetibilidade entre os genótipos, como Poncirus trifoliata, que apresenta certa resistência ou tolerância à doença. Os mecanismos de patogenicidade de Ca. Liberibacter spp. e a resposta molecular da planta à infecção ainda não estão bem definidos e o estudo da ativação dos mecanismos de defesa da planta induzidos por hormônios vegetais é um importante foco na elucidação deste complexo patossistema. Diante deste panorama, este estudo propôs avaliar o perfil de expressão de genes associados às vias do jasmonato e do etileno em plantas de Citrus sinensis L. Osb. (suscetível) e Poncirus trifoliata (L.) Raf. (resistente ou tolerante) em resposta à infecção pelas duas espécies de bactérias causadoras do HLB no Brasil, separadamente. Os perfis transcricionais dos genes avaliados não foram estatisticamente distintos, mas mereceram destaque os genes de biossíntese e metabolismo de jasmonato LOX2, AOC3 e JMT, os genes sinalizadores da via de jasmonato JAZ2 e MYC2, o gene de biossíntese de etileno SAM1, os receptores de etileno ETR1, ERS1 e EIN4, o regulador negativo de etileno CTR1, o regulador positivo da sinalização de etileno EIN2, os fatores de transcrição EIN3, EIL1, ERF1, ERF2, ERF/AP2, uma MAPkinase MAPK6 e uma proteína PR PR-4. Estes resultados mostram que as vias sinalizadas por jasmonato e etileno são modificadas pelas bactérias Ca. Liberibacter spp. No entanto, não foi possível comprovar a importância destas vias na resposta diferencial de genótipos suscetível e resistente/ tolerante de citros ao HLB. / The citrus industry stands out in the Brazilian agribusiness generating direct and indirect jobs and significant revenues. However, the citrus crop faces several diseases, especially the HLB (Huanglongbing, ex-greening), which, in the last ten years, have caused severe losses to growers. In Brazil, HLB is caused by the bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus and Ca. Liberibacter americanus, which are restricted to the phloem and induce symptoms similar to those caused by nutrient deficiency in citrus leaves and branches. Fruits are of reduced size and asymmetrical, and the plants tend to show overall yellowing. These symptoms altogether lead to the economical death of the plant. Transmission of the pathogens occurs naturally by the Asian citrus psyllid Diaphorina citri, or by contaminated buds. All citrus varieties and relatives are considered susceptible to HLB; however, there are clear differences in levels of susceptibility among genotypes. Poncirus trifoliata, for instance, exhibits some resistance or tolerance to the disease. The mechanisms involved in the pathogenesis of Ca. Liberibacter spp. and the molecular responses of the hosts to the infection are still unknown, but emphasis has been given to the defense mechanisms induced by plant hormones in order to try to elucidate the interactions of such complex pathosystem. Based on this scenario, this study aimed to evaluate the expression profile of Citrus sinensis (L.) Osb. (susceptible) and Poncirus trifoliata (L.) Raf. (resistant or tolerant) genes associated with the jasmonate and ethylene pathways in response to infection by both species of Ca. Liberibacter spp. causing HLB in Brazil, separately. The transcriptional profiles did not differ statistically, for the evaluated genes, including those in the jasmonate biosynthesis and metabolism (LOX2, AOC3 and JMT), signaling pathway (JAZ2 and MYC2), biosynthesis of ethylene (SAM1), ethylene receptors (ETR1, ERS1 and EIN4), negative regulator of ethylene (CTR1), positive regulator of ethylene signaling (EIN2), transcription factors (EIN3, EIL1, ERF1, ERF2, ERF/AP2), a MAPkinase (MAPK6) and a PR protein (PR-4). These results suggest that the jasmonate and ethylene pathways exhibit some modulation caused by the bacteria Ca Liberibacter spp. However, it does not seem that these pathways are relevant for the differential response of susceptibility or resistance/ tolerance of the citrus genotypes to HLB.

As Escherichia coli produtoras da toxina Shiga (STEC) são importantes patógenos humanos, causando desde diarréias até a síndrome hemolítica urêmica (SHU). Há diversos sorotipos associados a SHU, tais como O157:H7 e O113:H21. No Brasil o sorotipo O113:H21 ainda não aparece associado a SHU, embora seja frequentemente isolado de carcaças e fezes bovinas. Nosso grupo já investigou comparativamente as redes de coexpressão gênica (RCG) de STEC EH41 (associado à SHU) e Ec472/01 (isolado de fezes bovinas). A análise comparativa do perfil transcricional de EH41 e Ec472/01 revelou que somente EH41 expressa um conjunto de genes que inclui o regulador transcricional dicA. A maioria destes genes está situada em um único módulo transcricional e podem estar associados a fatores de virulência. Assim, este trabalho centrou-se numa abordagem de biologia de sistemas, integrando análises genômica e fenotípica da resposta de enterócitos Caco-2 à EH41 e Ec472/01. A análise genômica baseou-se no estudo temporal de RCG para compreender os mecanismos moleculares envolvidos na patogenicidade desses dois isolados. As alterações fenotípicas ocorridas nas células Caco-2 ao longo da exposição a cada um dos isolados de STEC foram visualizadas através de MEV. A análise genômica mostrou que o mecanismo molecular da resposta de Caco-2 durante a interação com EH41 ou Ec472/01 é claramente distinto. Nas redes do grupo Caco-2/EH41 as alterações topológicas incluíram a perda do status scale free e a sua recuperação, com o estabelecimento de uma nova hierarquia de genes na rede. Esses resultados se enquadram no modelo de redes para transição saúde-doença: a nova rede representa a resposta adaptativa da célula ao patógeno, o que não significa um retorno à normalidade. Já no grupo Caco-2/Ec472 as redes, após a perda do status scale free, não recuperam esse status até o final do período estudado, o que sugere um estado de transição mais prolongado para reorganização da hierarquia da rede. Mais ainda, através da caracterização dos módulos transcricionais, foi possível compreender dinamicamente os mecanismos moleculares envolvidos na resposta diferencial de Caco-2 aos dois isolados aqui estudados. STEC EH41 induz rapidamente a resposta inflamatória e apoptótica a partir da primeira hora de interação enterócito-bactéria. Por outro lado, células Caco-2 em contato com Ec472/01 ativam, a partir de uma hora, a fagocitose e, a partir da segunda hora, expressam moduladores da homeostase imune. A análise fenotípica das células Caco-2 mostrou, de forma nítida, uma maior destruição dos microvilos dos enterócitos em contato com EH41 do que com Ec472/01. Integrando os resultados genômicos e fenotípicos pode-se concluir que EH41 induz em Caco-2 - em comparação com Ec472/01 - maiores e mais rápidas alterações na expressão gênica global, além de uma resposta inflamatória e apoptótica excessiva, levando assim a alterações morfológicas mais pronunciadas nas células Caco-2. Em seu conjunto, esses resultados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na patogenicidade das STECs associadas à SHU. Assim, as perspectivas de desenvolvimento deste trabalho deverão incluir a investigação de fatores de virulência e vias moleculares envolvidas na indução das respostas imunes que podem conduzir à SHU / Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) O113:H21 strains are associated with human diarrhea and some of these strains may cause hemolytic uremic syndrome (HUS). In Brazil O113:H21 strains are commonly found in cattle but, so far, were not isolated from HUS patients. Previously, our group conducted comparative gene co-expression network (GCN) analyses of two O113:H21 STEC strains: EH41, isolated from a HUS patient in Australia, and Ec472/01, isolated from bovine feces in Brazil. Differential transcriptome profiles for EH41 and Ec472/01 revealed a gene set exclusively expressed in EH41, which includes the dicA putative virulence factor regulator. GCN analysis showed that this set of genes constitutes an EH41 specific transcriptional module which may be associated to virulence factors. Therefore, in the present work a system biology approach was conducted to investigate the differential Caco-2 response - genomic and phenotypic - to EH41 (Caco-2/EH41) or to Ec472/01 (Caco- 2/Ec472) along enterocyte-bacteria interaction. The genomic analysis was based on temporal GCN data in order to gain a better understanding on the molecular mechanisms underlying the capacity to cause HUS. The phenotypic alterations in Caco-2 during enterocyte-bacteria interaction were assessed by scanning electronic microscopy (SEM). The genomic analysis showed that the molecular mechanism of Caco-2 response to EH41 or to Ec472/01 during enterocyte-bacteria interaction is clearly different. The GCN topological analyses for Caco-2/EH41 group revealed loss of the scale-free status after one hour of interaction, persistence of this condition along the second hour and establishment of a new gene hierarchy thereafter. These events resemble the network mechanism of health-disease transition. The new established network represents an adaptive cell response to the pathogen and not the return to a \"normal\" state. Conversely, the networks for Caco-2/Ec472 group showed a slow and progressive loss of the scale-free status without its restoration at the end of the time interval here studied. Through transcriptional module characterization it was possible to reveal the dynamic of the molecular mechanism involved in the Caco-2 differential responses to the STEC isolates. EH41 induces a rapid inflammatory and apoptotic response just after the first hour of enterocyte-bacteria interaction. Instead, the Caco-2 response to Ec472/01 is characterized by phagocytosis activation at the first hour, followed by the expression of immune response modulators after the second hour. SEM phenotypic analysis of Caco-2 cells along enterocyte-bacteria interaction showed more intense microvilli destruction in cells exposed to EH41, when compared to cells exposed to Ec472/01. The integration of genomic and phenotypic data allowed us to conclude that EH41, comparatively to Ec472/01, induces greater and precocious global gene expression alterations in Caco-2, what is related to excessive inflammatory and apoptotic responses. These responses are associated with the pronounced morphological alterations observed by SEM in Caco-2 cells exposed to EH41. Altogether, these results contribute for a better understanding of the molecular mechanism involved in STEC pathogenicity associated to HUS. Therefore, the future perspectives for the development of the present work should include the investigation of virulence factors and molecular pathways involved in the induction of immune responses leading to HUS

A citricultura destaca-se dentro do agronegócio brasileiro gerando dividendos diretos com exportações e empregos, e indiretos com arrecadação de impostos. No entanto, ainda padece com problemas fitossanitários, com destaque para o HLB (Huanglongbing, HLB, ex-greening), que nos últimos dez anos tem dizimado pomares e provocado o abandono da cultura por muitos produtores. Causada no Brasil pelas bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus e Ca. Liberibacter americanus, é uma doença sistêmica, restrita aos vasos do floema, e induz ao aparecimento de sintomas semelhantes àqueles causados por deficiência de nutrientes em folhas e ramos, frutos com tamanhos reduzidos e assimétricos e coloração amarelada das plantas, tornando-as economicamente inviáveis. A transmissão da doença acontece naturalmente pelo inseto Diaphorina citri, e artificialmente por meio de borbulhas contaminadas. Todas as variedades de citros e rutáceas próximas são comprovadamente suscetíveis ao HLB; entretanto, há diferenças marcantes entre níveis de suscetibilidade entre os genótipos, como Poncirus trifoliata, que apresenta certa resistência ou tolerância à doença. Os mecanismos de patogenicidade de Ca. Liberibacter spp. e a resposta molecular da planta à infecção ainda não estão bem definidos e o estudo da ativação dos mecanismos de defesa da planta induzidos por hormônios vegetais é um importante foco na elucidação deste complexo patossistema. Diante deste panorama, este estudo propôs avaliar o perfil de expressão de genes associados às vias do jasmonato e do etileno em plantas de Citrus sinensis L. Osb. (suscetível) e Poncirus trifoliata (L.) Raf. (resistente ou tolerante) em resposta à infecção pelas duas espécies de bactérias causadoras do HLB no Brasil, separadamente. Os perfis transcricionais dos genes avaliados não foram estatisticamente distintos, mas mereceram destaque os genes de biossíntese e metabolismo de jasmonato LOX2, AOC3 e JMT, os genes sinalizadores da via de jasmonato JAZ2 e MYC2, o gene de biossíntese de etileno SAM1, os receptores de etileno ETR1, ERS1 e EIN4, o regulador negativo de etileno CTR1, o regulador positivo da sinalização de etileno EIN2, os fatores de transcrição EIN3, EIL1, ERF1, ERF2, ERF/AP2, uma MAPkinase MAPK6 e uma proteína PR PR-4. Estes resultados mostram que as vias sinalizadas por jasmonato e etileno são modificadas pelas bactérias Ca. Liberibacter spp. No entanto, não foi possível comprovar a importância destas vias na resposta diferencial de genótipos suscetível e resistente/ tolerante de citros ao HLB. / The citrus industry stands out in the Brazilian agribusiness generating direct and indirect jobs and significant revenues. However, the citrus crop faces several diseases, especially the HLB (Huanglongbing, ex-greening), which, in the last ten years, have caused severe losses to growers. In Brazil, HLB is caused by the bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus and Ca. Liberibacter americanus, which are restricted to the phloem and induce symptoms similar to those caused by nutrient deficiency in citrus leaves and branches. Fruits are of reduced size and asymmetrical, and the plants tend to show overall yellowing. These symptoms altogether lead to the economical death of the plant. Transmission of the pathogens occurs naturally by the Asian citrus psyllid Diaphorina citri, or by contaminated buds. All citrus varieties and relatives are considered susceptible to HLB; however, there are clear differences in levels of susceptibility among genotypes. Poncirus trifoliata, for instance, exhibits some resistance or tolerance to the disease. The mechanisms involved in the pathogenesis of Ca. Liberibacter spp. and the molecular responses of the hosts to the infection are still unknown, but emphasis has been given to the defense mechanisms induced by plant hormones in order to try to elucidate the interactions of such complex pathosystem. Based on this scenario, this study aimed to evaluate the expression profile of Citrus sinensis (L.) Osb. (susceptible) and Poncirus trifoliata (L.) Raf. (resistant or tolerant) genes associated with the jasmonate and ethylene pathways in response to infection by both species of Ca. Liberibacter spp. causing HLB in Brazil, separately. The transcriptional profiles did not differ statistically, for the evaluated genes, including those in the jasmonate biosynthesis and metabolism (LOX2, AOC3 and JMT), signaling pathway (JAZ2 and MYC2), biosynthesis of ethylene (SAM1), ethylene receptors (ETR1, ERS1 and EIN4), negative regulator of ethylene (CTR1), positive regulator of ethylene signaling (EIN2), transcription factors (EIN3, EIL1, ERF1, ERF2, ERF/AP2), a MAPkinase (MAPK6) and a PR protein (PR-4). These results suggest that the jasmonate and ethylene pathways exhibit some modulation caused by the bacteria Ca Liberibacter spp. However, it does not seem that these pathways are relevant for the differential response of susceptibility or resistance/ tolerance of the citrus genotypes to HLB.

O Brasil é o maior produtor mundial de maracujá azedo (Passiflora edulis f. flavicarpa) sendo esta a espécie de maior expressão comercial dentre as passifloras cultivadas. A bacteriose do maracujazeiro, causada por Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Xap), é uma das doenças mais severas da cultura, acarretando grandes prejuízos aos produtores. Atualmente, é incipiente o conhecimento sobre a interação maracujá azedo-Xap. Diante disso, a identificação e a caracterização dos genes envolvidos no processo de defesa são passos importantes para dar suporte ao desenvolvimento de variedades resistentes. Assim, o objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar genes de maracujá azedo diferencialmente expressos durante a resposta de defesa à Xap, bem como mensurar a sua expressão. Para isso, foram construídas duas bibliotecas subtrativas de cDNA (forward e reverse) usando o método SSH a partir de transcritos de folhas, que foram inoculadas com o patógeno ou solução salina (controle). Após o sequenciamento dos clones, o processamento e a montagem das sequências, as unisequências foram anotadas através da Plataforma PLAZA e do programa computacional Blast2GO. Genes envolvidos em diversos processos biológicos foram selecionados para a validação das bibliotecas por PCR quantitativo. Usando a Plataforma PLAZA, 78 % (764) das unisequências mostraram similaridade com proteínas de Arabidopsis thaliana, enquanto 87 % (866) delas apresentaram similaridade com proteínas putativas de diversas espécies vegetais, quando se utilizou Blast2GO. Na biblioteca forward, foram identificadas 73 proteínas relacionadas à resposta de defesa, dentre as quais estão proteínas envolvidas na sinalização intracelular, na ativação da transcrição e regulação da expressão de genes de defesa, bem como proteínas de defesa, de resistência e relacionadas à patogênese (PRs). Dentre os 22 transcritos validados, 95 % foram diferencialmente expressos em pelo menos um dos três períodos avaliados; os genes mais expressos em resposta à infecção pelo patógeno são os que codificam as enzimas lipoxigenase, (+)-neomentol desidrogenase e quitinase, as quais participam diretamente nas respostas de defesa vegetal. Dos genes cuja expressão foi mais reprimida, dois codificam proteínas relacionadas à fotossíntese e dois codificam proteínas envolvidas na detoxificação da amônia e do H2O2. Nossos resultados sugerem que a planta utiliza um arsenal de transcritos para responder à infecção; entretanto, este arsenal não é eficiente para impedir a ação do patógeno e, consequentemente, o desenvolvimento da bacteriose nas condições estudadas. Nosso estudo é inédito e gerou informações sobre a reprogramação transcricional durante a interação maracujá azedo-Xap, o que constitui um importante passo para o melhor entendimento sobre este patossistema. / Brazil is the main producer of yellow passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa) worldwide, which is the most widely commercialized crop among the cultivated passifloras. The bacterial leaf spot induced by Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Xap) is one of the most severe diseases of the crop, causing great losses to producers. Currently, we understand very little about the yellow passion fruit-Xap interaction. Therefore, the identification and characterization of genes involved in the defense process are important steps to support the development of resistant varieties. Thus, the objective of this study was identify and characterize differentially expressed genes during the defense response to Xap, as well as to measure their expression. For that, we constructed two subtractive cDNA libraries (the forward and the reverse) by performing the SSH method from leaf transcripts, which were inoculated with the pathogen or saline solution (control). After sequencing the clones and sequence data processing, sequences were assembled into unique sequences, which were annotated using the PLAZA Platform and the computational program Blast2GO. Genes involved in several biological processes were selected to validate the libraries by quantitative PCR. When PLAZA was used for sequence similarity searches, 78 % (764) of the yellow passion fruit unique sequences showed similarity to proteins of Arabidopsis thaliana; when Blast2GO was used, 87 % (866) of the unique sequences showed similarities to putative proteins of several plant species. For the forward library, 73 proteins related to defense response were identified, such as those involved in intracellular signaling, transcription activation and regulation of defense gene expression, as well as defense and resistance proteins, and pathogenesis-related proteins (PRs). Of the 22 validated transcripts, 95 % were differentially expressed during at least one of the three periods evaluated; the genes up-regulated in response to the pathogen infection were those that code for the enzymes lipoxygenase, (+)-neomenthol dehydrogenase and chitinase, which participate directly in plant-defense responses. Out of down-regulated genes, two code for photosynthesis-related proteins, and two for ammonia and H2O2 detoxification. Our results suggest the plant uses an arsenal of transcripts to respond to infection; however, this arsenal is not effective to prevent pathogen action and consequently the occurrence of bacterial leaf spot under the evaluated conditions. The present study is the first to produce information on the transcriptional reprogramming during the passion fruit-Xap interaction, which represents an important step for a better understanding of this pathosystem.

Los fenilpropanoides constituyen un grupo de metabolitos secundarios producidos y utilizados por las plantas como parte de la respuesta defensiva tanto constitutiva como inducible. Un gran número de ellos están implicados en la resistencia frente a la enfermedad a diferentes niveles: señalización (ácido salicílico), agentes antimicrobianos (fitoalexinas), y endurecimiento de la pared celular (lignina). Las amidas derivadas del ácido hidroxicinámico (HCAAs) son un conjunto de metabolitos, pertenecientes al grupo de los fenilpropanoides, que desempeñan un importante papel en la defensa de las plantas frente a patógenos y predadores. Las HCAAs se forman a partir de la condensación de tioésteres de hidroxicinamoil-CoA con feniletilaminas, tales como la tiramina. El último paso en la biosíntesis de las HCAAs está catalizado por el enzima tiramina hidroxicinamoil transferasa (THT). En la presente tesis se muestra la identificación y el estudio de cuatro HCAAs, p-cumaroildopamina, feruloildopamina, p-cumaroiltiramina y feruloiltiramina, asociadas a la infección de tomate con la bacteria Pseudomonas syringae pv. tomato. Su identificación y caracterización estructural se han llevado a cabo mediante técnicas de cromatografía líquida de alta resolución y espectrometría de masas (HPLC-MS). Se ha analizado la posible implicación del ácido salicílico y del etileno en la inducción patogénica de dichas moléculas y del enzima responsable de su biosíntesis (THT). Además, se ha estudiado la actividad antioxidante y antibacteriana in vitro de las cuatro HCAAs identificadas. Por último, se han obtenido líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana y de tomate que sobreexpresan el gen de la THT, y se han analizado los perfiles cromatográficos de dichas líneas. / Zacarés Sanmartín, L. (2008). Nuevas aportaciones al metabolismo secundario del tomate. Identificación y estudio de moléculas implicadas en la respuesta a la infección con pseudomonas syrinagae pv. tomato [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/3021

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Deyze Alencar Soares.pdf: 632456 bytes, checksum: 33012995df8eabb3f4b7509fe372764d (MD5) Previous issue date: 2010-03-26 / Paracoccidioides brasiliensis, a thermodimorphic fungus, is the causative agent of the most prevalent systemic mycosis in Latin America, paracoccidioidomycosis. The phospholipase B (PLB) enzyme is considered an important virulence factor in this dimorphic fungus, involved in the immune response of the host-pathogen interaction. Our objective was to determine whether a P. brasiliensis (Pb18) PLB is involved in adhesion / internalization of yeast and evasion of host immune responses. The effect of PLB was analysed using specific inhibition of PLB (alexidine dihydrochloride) and pulmonary surfactant in an ex vivo model (Pb18) of alveolar macrophage (MHS cells) infection. PLB enzyme assays and real time RT-PCR (qRTPCR) analysis of genes differentially expressed in the process of evasion: plb1 (phospholipase B1), icl1 (isocitrate lyase) and sod3 (Cu, Zn dismutase) and immune responses: clec2 (C-type lectin domain 2), cd14 (cluster of differentiation 14), tlr2 (toll-like receptor 2), nfkb (nuclear factor kappa B), nkrf (NF-kappaB repressing factor), il1β (inteleukin-1β) and tnfα (tumor necrosis factor alpha) were carried out using selective inhibition of PLB activity and pulmonary surfactant. The levels of cytokines inteleukin 10 (IL-10), IL-12 and TNF-α) were also determined by ELISA. PLB activity under adhesion conditions of P. brasiliensis (Pb18) to alveolar macrophage cells was found at high levels up to 6 hours post-infection. In the conditions of exposure to pulmonary surfactant and alexidine dihydrochloride, PLB activity and the level of transcripts of genes related to phagocytosis and inflammatory response were measured. We found that PLB activity had an influence on the phagocytic activity of alveolar macrophages. Alexidine dihydrochloride (0,25 μM) selectively inhibited PLB activity by 66% and decreased significantly the adhesion and internalization of yeast on MHS cells. Genes involved in phagocytosis (trl2 and cd14) and inflammatory response (nrkf, tnfα and il1β) were down-regulated in the presence of the PLB inhibitor. In contrast, the PLB activity and internalization of fungal yeast cells increased significantly in the presence of pulmonary surfactant (100 μg/mL) and genes such as clec2, important for effective phagocytosis by MHS cells, and the pro-inflammatory inhibitor (nkrf) were up-regulated. Also, the pulmonary surfactant did not alter cytokine production, while alexidine dihydrochloride decreased the levels of IL-10 and increased the levels of IL-12 and TNF-α. In addition, through simultaneous analyses of gene expression for the pathogen, P. brasiliensis, we found upregulation of the genes sod3, icl1 and plb1, required for the evasion of alveolar macrophages. P. brasiliensis PLB is important for the binding and internalization of yeast at macrophage surfaces. The specific effect of inhibiting PLB enzyme activity indicates that adhesion may be facilitated indirectly via fatty acid release from phospholipids of the membrane of host cells. This is the first study to show that PLB activity may modulate immune responses to P. brasiliensis infection. / Paracoccidioides brasiliensis, fungo dimórfico, é o agente etiológico principal micose sistêmica da América Latina, paracoccidioidomicose. A enzima fosfolipase B (PLB) é considerada um importante fator de virulência nesse fungo dimórfico e está envolvida na resposta imune da interação patógeno-hospedeiro. Nosso objetivo foi determinar se a PLB de P. brasiliensis (Pb18) está envolvida na adesão e internalização de leveduras e na evasão da resposta imune hospedeira. O efeito da PLB foi analisado usando o inibidor seletivo de PLB (alexidine dihydrochloride) e o surfactante pulmonar (Survanta) em um modelo ex vivo de infecção de macrófagos alveolares (MHS) com Pb18. Ensaio enzimático de PLB e análise de genes diferencialmente expressos por RT-PCR em tempo real (qRT-PCR) no processo de evasão: plb1 (fosfolipase B1), icl1 (isocitrato liase) e sod3 (Cu, Zn dismutase); e na resposta imune: clec2 (lecitina tipo-C 2), cd14 (cluster de diferenciação 14), tlr2 (receptor toll-like 2), nfkb (fator nuclear kappaB), nkrf (repressor fator nuclear kappaB), il1β (interleucina- 1 beta) e tnfα (fator de necrose tumoral alfa) foram realizados usando o inibidor seletivo da atividade de PLB e surfactante pulmonar. Os níveis de citocinas interleucina 10 (IL-10), IL-12 e TNF- α) foram determinados por ELISA. A atividade de PLB usadas em baixas condições para a adesão de P. brasiliensis (Pb18) obteve altos níveis em 6 horas pós-infecção. Na presença do surfactante pulmonar e alexidine dihydrochloride, a atividade da PLB e os níveis de transcritos dos genes relacionados à fagocitose e à resposta inflamatória foram quantificados. A PLB teve influência na atividade fagocítica dos macrófagos. Alexidine dihydrochloride (0,25 μM) inibiu seletivamente a atividade PLB em 66% e diminuiu significativamente a adesão e internalização de leveduras por macrófagos alveolares (MHS). Genes envolvidos na fagocitose (trl2 e cd14) e resposta inflamatória (nrkf, tnfα e il1β) foram reprimidos na presença do inibidor de PLB. Em contraste, a atividade PLB e internalização de leveduras aumentou significativamente na presença do surfactante pulmonar (100 μg/mL) e genes assim como clec2, importante para uma fagocitose efetiva pelos macrófagos alveolares (MHS), e o inibidor pró-inflamatório (nkrf) foram induzidos. Entretanto, o surfactante pulmonar não alterou a produção de citocinas, enquanto que alexidine dihydrochloride diminuiu os níveis de IL-10 e aumentou os níveis de IL-12 e TNF-α. Em adição, nas análises simultâneas de expressão de genes, P. brasiliensis, houve indução dos genes sod3, icl1 e plb1, requeridos para a evasão dos macrófagos alveolares. A PLB de P. brasiliensis é importante na adesão e internalização de leveduras pelos macrófagos alveolares. O efeito específico da inibição da atividade da PLB indica que a adesão pode ser facilitada indiretamente via liberação de ácidos graxos dos fosfolipídeos de membrana das células hospedeiras. Esse é o primeiro estudo mostrando que a atividade da PLB pode modular a resposta imune à infecção pelo P. brasiliensis.

[EN] Rice (Oryza sativa L) is the main staple food for over 3 billion people (almost half the world population), and rice blast, caused by the fungus Magnaporthe oryzae, is the major threat for this crop worldwide, triggering also important losses in Spain some years. Some resistant cultivars have been released, mainly with complete resistance genes (Pi genes), but their resistance has not lasted long, due to the emergence of new virulent isolates. Therefore, the efforts for obtaining effective and durable resistance are focused nowadays on the use of partial resistance or a combination of partial and complete resistance. Partial resistance is a quantitative character, controlled by numerous genes of small effects (QTLs), that can interact among them, and usually also strongly with the environment. For a better knowledge of the population of M. oryzae in the Albufera region, and of the resistance genes and QTLs that might be effective in various Spanish rice growing regions, we tested along four years 31 differential varieties (isogenic lines carrying one different Pi gene each); these studies showed that fungus population can significantly change from one year to the other. On the other hand, we analyzed the genetics of resistance to M. oryzae in two populations derived from crosses between local and well adapted, although moderately susceptible, varieties (Sivert, JSendra), and allegedly resistant but poorly adapted varieties (CAN-6159, Gigante Vercelly. In F3 lines of both populations, the leaf and panicle susceptibility was determined in field trials under conditions that favour the infection: SixCNA lines were tested in a plot in the Albufera region, and those of JSxGV in four locations of Valencia, the Ebro River Delta, and Seville; inoculations in controlled conditions were also carried out in the second population. We compare the different methodologies for assessing susceptibility, and we discuss the environmental influence on it. 22 QTLs were detected in SIxCNA, and 61 in JSxGV, most of them in only one location. All four parents displayed partial resistance QTLs; but some QTLs showed small additive effects and, often, high dominance. At the same time, most of these QTLs exhibit significant interactions with other QTLs; and many of them co-localize with QTLs found in other studies. We have discovered substantial coincidences between QTLs that control incidence in panicle and those that determine leaf severity, thus supporting the hypothesis that there are common defence mechanisms in both organs. Chromosomal regions of interest for marker assisted breeding of resistant genotypes have been identified. / [ES] El arroz (Oryza sativa L.) es la principal fuente de alimentación para más de 3.000 millones de personas, casi la mitad de la población mundial, y la "piriculariosis", causada por el hongo Magnaporthe oryzae Couch, es la enfermedad que más pérdidas causa en este cultivo a escala mundial; también en España ha causado pérdidas importantes algunos años. Se han obtenido diversas variedades resistentes, principalmente al incorporar genes de resistencia completa (genes Pi), pero la mayoría se han vuelto susceptibles en pocos años al aparecer nuevos aislados más virulentos. Actualmente, para conseguir una resistencia efectiva y duradera, se busca incorporar resistencia parcial, o una combinación de ambos tipos de resistencia. La resistencia parcial es un carácter cuantitativo, controlado por numerosos genes de efecto pequeño (o QTLs), que pueden interaccionar entre ellos y que, con frecuencia, también lo hacen intensamente con el ambiente. Para conocer mejor la población del patógeno presente en la zona de la Albufera, y qué genes y QTLs de resistencia pueden ser efectivos en ésta y otras zonas arroceras de España, por un lado se ensayaron durante varios años 31 variedades diferenciales (líneas con un gen Pi diferente cada una); esto demostró que la estructura de la población del hongo puede variar significativamente con los años. Por otro lado, realizamos estudios genéticos sobre la resistencia a M. oryzae en dos poblaciones, procedentes del cruzamiento entre variedades locales, bien adaptadas pero moderadamente susceptibles (Sivert y JSendra) y variedades resistentes, pero no adaptadas (CNA-6159 y Gigante Vercelli). En líneas F3 de ambas poblaciones se determinó la resistencia en campo, en condiciones favorables para el ataque del hongo, en hojas y órganos productivos: en SixCNA, en una parcela de la Albufera, y en JSxGV, en 4 localidades de Valencia, el Delta del Ebro y Sevilla; en JSxGV, además, se realizaron inoculaciones en condiciones controladas. Se comparan los diferentes sistemas de medida de la susceptibilidad, y se discute la influencia ambiental en ella. Se detectaron 22 QTLs en SixCNA, y 61 QTLs en JSxGV, la mayoría de los cuales sólo se expresan en una localidad. Todos los parentales aportan alelos de resistencia; pero la mayoría de los QTLs identificados son de efectos pequeños y, a menudo, con un notable componente dominante. Al mismo tiempo, gran parte de estos QTLs presentan interacciones significativas con otros QTLs; y muchos de ellos co-localizan con QTLs identificados en otros estudios. Hemos encontrado bastantes coincidencias entre QTLs que controlan la incidencia en panículas y los que determinan la severidad en las hojas, apoyando la hipótesis de que existen mecanismos de defensa comunes en ambos órganos. Se han localizado regiones cromosómicas de interés que podrían ser utilizadas para la selección de genotipos resistentes. / [CA] L'arròs (Oryza sativa L.) és la principal font d'alimentació per a més de 3.000 millions de persones, quasi la meitat de la població mundial, i la "piriculariosi", causada pel fong Magnaporthe oryzae Couch, és la malaltia que més pèrdues origina en aquest conreu a escala mundial; també a Espanya ha causat pèrdues importants alguns anys. S'han obtès diverses varietats resistents, principalment en incorporar gens de resistència completa (gens Pi), però la majoria s'han tornat susceptibles en pocs anys en aparèixer nous aïllats més virulents. Actualment, per aconseguir una resistència efectiva i duradora, es cerca incorporar resistència parcial, o una combinació de tots dos tipus de resistència. La resistència parcial és un caràcter quantitatiu, controlat per nombrosos gens d'efecte reduït (o QTLs), els quals poden interaccionar entre sí i que, sovint, també ho fan intensament amb l'ambient. Per conéixer millor la població del patògen present a la zona de l'Albufera, i quins gens i QTLs de resistència poden ser efectius a aquesta i a d'altres zones arrosseres d'Espanya, per una banda s'assajaren durant diversos anys 31 varietats diferencials (línies amb un gen Pi diferent cadascuna); això demostrà que l'estructura de la població del fong pot variejar significativament amb els anys. Per altra banda, realitzàrem estudis genètics sobre la resistència a M. oryzae en dues poblacions, procedents del encreuament entre varietats locals, adaptades però moderadament susceptibles (Sivert i JSendra) i varietats resistents però no adaptades (CNA-6159 i Gigante Vercelli). En línies F3 d'ambdues poblacions es determinà la resistència en camp, en condicions favorables per a l'atac del fong, en fulles i òrgans productius: en SixCNA, en una parcel·la de l'Albufera, i en JSxGV en quatre localitats de València, el Delta de l'Ebre i Sevilla; en JSxGV, a més a més, es realitzaren inoculacions en condicions controlades. Es comparen els diversos sistemes de mesura de la susceptibilidad, i es discuteix la influència ambiental en aquesta. Es detectaren 22 QTLs en SixCNA i 61 QTLs en JSxGV, la major part dels quals solament s'expressen a una localitat. Tots els parentals aporten al·lels de resistència; però alguns dels QTLs identificats són d'efectes reduïts i, freqüentment, amb un notable component dominant. Paral·lelament, gran part d'aquestos QTLs presenten interaccions significatives amb altres QTLs; i molts d'aquestos co-localitzen amb QTLs identificats en altres estudis. Hem trobat bastants coincidències entre QTLs que controlen la incidència en panícules i els que determinen la severitat a les fulles, recolzant la hipòtesi que existeixen mecanismes de defensa comuns en ambdós òrgans. S'han localitzat regions cromosòmiques d'interès que podrien ser emprades per a la selecció de genotipus resistents / Pérez Lotz, J. (2016). Análisis genético de la resistencia parcial a Magnaporthe oryzae en arroz (Oryza sativa) en varias poblaciones y ambientes [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62582